專利名稱：一種新型酯酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種從海底泥中提取的新型酯酶及其表達載 體、重組酯酶及重組酯酶在降解擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是繼有機氯、有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥后根據(jù)天然除蟲菊素 的結(jié)構(gòu)人工合成的一類仿生殺蟲劑，其出現(xiàn)代表殺蟲劑工業(yè)進入了超高效殺蟲劑時代。擬 除蟲菊酯類農(nóng)藥的殺蟲機理主要是影響昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，殺蟲活性強，殺蟲效力一般比有 機磷殺蟲劑大100倍以上，且速效性好同時用量少、低殘留，被廣泛用于糧食、蔬菜和果樹 等多種作物。長期接觸擬除蟲菊酯類農(nóng)藥即使是低劑量也會引起慢性疾病，有些類型還有致 畸、致癌作用。而且菊酯類農(nóng)藥對水生動物的毒性較大，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和《聯(lián)邦食品安全 法》已對其多種農(nóng)藥作出了進出口限制。隨著人們生活水平的提高、環(huán)護意識的增強以及殘 留農(nóng)藥分析技術(shù)的進步，人們迫切的需要無農(nóng)藥殘留污染的安全食品。因此，尋找一種有效 方法消除或降低在農(nóng)作物、食品和環(huán)境基質(zhì)中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留已成為當前迫切需要 解決的問題。目前，有關(guān)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解主要有物理、化學和生物三種方法。由于生物 法較物理和化學法處理殘留農(nóng)藥具有經(jīng)濟、高效、無二次污染等優(yōu)點，成為當今的主要研究 熱點。利用微生物降解殘留農(nóng)藥大多數(shù)是依靠胞內(nèi)酶的酶解作用，降解酶去除殘留農(nóng)藥降 解具有作用底物濃度低、環(huán)境適應(yīng)能力強和安全無毒等優(yōu)點，但由于野生菌株大多產(chǎn)酶能 力有限、發(fā)酵周期長、純化復雜。因此，克隆農(nóng)藥降解酶基因，并利用工程菌作生物反應(yīng)器來 生產(chǎn)農(nóng)藥降解酶是將來主要的研究方向。目前已從可培養(yǎng)微生物中克隆到多種農(nóng)藥降解酶 基因，然而這些降解酶基因在工程菌中表達時存在不可溶表達或表達條件要求苛刻問題， 而且重組降解酶的低溫酶活性和穩(wěn)定性無法滿足實際應(yīng)用要求，不能達到快速有效降解殘 留農(nóng)藥的目的。為了解決這些問題，迫切需要從自然界中尋找更有潛力的菊酯類農(nóng)藥降解 酶。宏基因組學(Metagenomics)是以特定生態(tài)環(huán)境中微生物群體基因組的總和作為 研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，通過宏基因組文庫的構(gòu)建及基因克隆、 異源表達等基本研究策略，篩選出有用的新基因及其產(chǎn)物，近年來隨著微生物學和現(xiàn)代生 命科學的迅猛發(fā)展而興起的一門新興學科。宏基因組學技術(shù)在挖掘和利用未培養(yǎng)微生物資 源和篩選新穎生物活性物質(zhì)方面表現(xiàn)出巨大的潛力，為生命科學提供了強有力的新方法， 已成為當前國際上微生物學研究的前沿領(lǐng)域和熱點。至今國內(nèi)外學者已經(jīng)通過該技術(shù)克隆 到如淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、酯酶等新基因，這些酶具有新穎的酶學特性及工業(yè)應(yīng)用 潛力。因此，采用該方法使充分利用環(huán)境中蘊藏的大量寶貴基因資源成為可能。到目前為 止，國內(nèi)外尚未有利用宏基因組技術(shù)從海底泥中發(fā)現(xiàn)新型廣譜高效降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥 降解酶的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種新型酯酶的DNA。本發(fā)明的第二個目的在于提供上述新型酯酶的宏基因組學克隆方法。本發(fā)明的第三個目的在于提供含有上述新型酯酶的DNA的表達載體。本發(fā)明的第四個目的在于提供利用上述表達載體構(gòu)建的重組酯酶及其制備方法。本發(fā)明的最后一個目的在于提供上述重組酯酶在降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中 的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種新型酯酶的DNA，它的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明提供的上述新型酯酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本發(fā)明的第二個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種新型酯酶的宏基因組學 克隆方法，提取海底泥的總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)BamHI酶切，連接pUC118載體， 電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α高效感受態(tài)建立宏基因組文庫，通過點平板和滴加底物顯色法快 速篩選得到陽性克隆子，經(jīng)測序和BLAST比較并設(shè)計引物，從而克隆到目的片段。本發(fā)明的第三個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種含有上述新型酯酶的 DNA的表達載體。本發(fā)明的第四個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種重組酯酶的制備方法， 包括用上述表達載體轉(zhuǎn)化寄主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酯酶。上述重組酯酶的制備方法中，寄主細胞是大腸桿菌。上述重組酯酶的制備方法，其具體過程為包括用上述表達載體的目的片段經(jīng) BamHI, HindIII雙酶切，與pET_28a(+)載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘 導，得到高效可溶性表達。所述的IPTG終濃度為0. 1-1. 3mM，誘導溫度為18_37°C。本發(fā)明提供的重組酯酶，包括用上述表達載體轉(zhuǎn)化寄主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng) 物中獲得重組酯酶的步驟的方法制備。本發(fā)明的最后一個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的本發(fā)明所述重組酯酶在降 解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果①.本發(fā)明從海底泥樣品構(gòu)建好的宏基因組文庫中得到一個新的酯酶的DNA序 列，通過基因工程技術(shù)對其功能研究，發(fā)現(xiàn)該序列在大腸桿菌中高效可溶表達，經(jīng)蛋白純化 及SDS-PAGE電泳，得到一條單一的蛋白條帶，初步確定分子量約為31. 2KDa。②.本發(fā)明將SEQ ID NO. 1所示的DNA序列克隆到原核表達載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌感受態(tài)細胞，通過對陽性克隆子的誘導表達得到重組蛋白，研究其酶學性質(zhì)，結(jié)果如下(1)在大腸桿菌表達體系中，該重組蛋白具有高效可溶性表達。(2)用對硝基苯酚乙酸酯為底物，測得重組蛋白的最適反應(yīng)溫度為40°C，在溫度 低于60°C非常穩(wěn)定，60°C保溫2h后，相對酶活性保持在80%以上，在20°C和10°C條件下， 分別為最高酶活性的76%和37%，表明該酶具有熱穩(wěn)定和冷適應(yīng)性；最適反應(yīng)pH為7. 0， 在pH 5. 5-9.0，酶的相對活力保持在80%以上，說明其有較寬的pH酶解范圍；測定金屬離子和生化試劑對酶活力影響時發(fā)現(xiàn)，ImM Al3+對重組酯酶F816的酶活力有明顯提高作用； 1% (w/v)的TritonX-100和Tween-80對其酶活力均有不同程度的提高作用；Hg2+、Ag+和 SDS則明顯的抑制酶活力，其它離子和生化試劑對酶活性沒有明顯的影響。③.本發(fā)明通過測定其酶學性質(zhì)時發(fā)現(xiàn)對lmg/L的氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊 酯和溴氰菊酯有強降解作用，測定重組蛋白降解氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊 酯，結(jié)果表明其降解率均超過90%，因此在去除果蔬擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留方面有廣闊的 應(yīng)用前景。


圖1為實施例1中的SDS-PAGE電泳圖；其中，M為標準蛋白分子量maker，1為重組蛋白粗提物，2為純化的重組蛋白；圖2為重組蛋白降解底物對硝基苯酚乙酸酯的最適溫度和熱穩(wěn)定性結(jié)果折線圖；其中1為最適溫度折線圖，2為熱穩(wěn)定性折線圖；圖3為重組蛋白降解底物對硝基苯酚乙酸酯的最適pH和pH穩(wěn)定性結(jié)果折線圖；其中1為最適pH折線圖，2為pH穩(wěn)定性折線圖；圖4為氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解氣相色譜圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實施例1宏基因組文庫的建立和陽性克隆子的獲得、基因克隆與表達1、總DNA的提取稱取6g 樣品，加入 13. 5mL DNA 提取緩沖液(0. IM Tris,0. IM EDTA-Na,0. IM Na3PO4,1. 5M NaCl，CTAB，pH值8. 0)，劇烈振蕩 3_5min，加入 200 μ L溶菌酶(100mg/ml)， 反復顛倒5-6次，37°C水浴30min，加入1. 5ml 20% SDS，65°C水浴Ih (期間每隔15min上 下顛倒幾次)，8000r/min離心5min，取上清液，用等體積氯仿抽提2次，16000r/min離心 IOmin,取上清，加入0. 6倍體積的異丙醇，室溫放置2h，20000r/min離心20min，棄上清，沉 淀加5mL預(yù)冷的70%乙醇，20000r/min離心lOmin，收集DNA沉淀，風干，用適量TE緩沖液 溶解。2、試劑盒法純化DNA 按照膠回收試劑盒說明書進行。3、宏基因組電泳檢測用瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA的純度和質(zhì)量。4、酶切總DNA 用限制性內(nèi)切酶BamHI部分酶切總DNA，回收2_8kb的酶切片段，方 法同試劑盒法純化DNA。5、酶切片段的電泳檢測方法同宏基因組電泳檢測。6、酶切片段的鏈接將回收得到的酶切片段和pUC118/BamHI (BAP)載體連接過 夜，向連接產(chǎn)物中加入0. 6倍體積的異丙醇，室溫沉淀1. 5h，14000r/min離心20min，棄上清 并向沉淀中加入70%無水乙醇洗滌2次，風干并加入適量dd H2O重溶。7、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化吸取5yL的連接產(chǎn)物加入到IOOyL的大腸桿菌DH5a高效感受態(tài)中，2500V/ cm(Eppdorf2510 電擊儀)電擊 1 次，46°C熱激 6min，37°C，180rpm 搖床培養(yǎng) 45_60min，吸取30-40μ L涂布于LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜。根據(jù)平板上菌落數(shù)目將剩余的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布 含氨芐青霉素(100 μ g/ml)、IPTG(ImM)和X_gal (24 μ g/ml)的LB平板。由此構(gòu)建了一個 庫容量達15000個轉(zhuǎn)化子、多樣性好的宏基因組文庫。8、文庫篩選和陽性克隆子的鑒定將文庫中所有的白板單菌落點種至兩塊含氨芐青霉素(100yg/ml)、IPTG(ImM) 的LB固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24-48h，選擇其中一塊平板并將X-cap(80y g/ml)滴至菌落 表面及周圍，37°C放置30min后觀察顏色反應(yīng)。產(chǎn)生藍色反應(yīng)的即為陽性克隆。通過篩選 得到一株陽性克隆子。從另一塊平板中將陽性克隆子挑出并接種至IOmL含氨芐青霉素(100 μ g/ml)的 LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220r/min搖床培養(yǎng)過夜，取2mL菌體進行質(zhì)粒提取，對插入片段測 序，將測定的序列經(jīng)過NCBI的BLASTn軟件分析比較，發(fā)現(xiàn)該DNA由825個堿基組成，其核酸 序列如SEQ ID NO. 1所示，該DNA編碼的多肽，含274個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDN0. 3 所示，將其命名為F816。其中SEQ ID NO. 2為SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 3的對照圖。9、基因片段的克隆根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計一對引物F1和F2，引物兩端引入能插入pET_28a(+)載體的 HindIII和BamHI酶切位點，引物序列如下Fl 5' -CGCGGATCC ATG AGT GAG CTG ACA TCA ATC TCC GF2 5' -CCCAAGCTT TCA GGG GGC CAG CAA CTC利用兩條引物，以質(zhì)粒pUC118-F816為模板進行PCR擴增反應(yīng)，PCR體系如下
溶液體積(μ )
模板(IOOng)1
dNTPMix (2.5 mM)4
引物 Fl(IOpM)1 引物 F2(10pM)權(quán)利要求
一種新型酯酶的DNA，其特征是它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一種新型酯酶，其特征是它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的新型酯酶的宏基因組學克隆方法，其特征是提取海底泥的 總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)BamHI酶切，連接pUCl 18載體，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 高效感受態(tài)建立宏基因組文庫，通過點平板和滴加底物顯色法快速篩選得到陽性克隆子， 經(jīng)測序和BLAST比較并設(shè)計引物，從而克隆到目的片段。
4.一種包含權(quán)利要求1所述的新型酯酶的DNA的表達載體。
5.一種重組酯酶的制備方法，其特征是包括用權(quán)利要求4所述的表達載體轉(zhuǎn)化寄主 細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酯酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組酯酶的制備方法，其特征是其中寄主細胞是大腸桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組酯酶的制備方法，其特征是其具體過程為包括用權(quán)利 要求4所述的表達載體的目的片段經(jīng)BamHI、HindIII雙酶切，與pET_28a(+)載體連接，轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導，得到高效可溶性表達。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組酯酶的制備方法，其特征是所述的IPTG終濃度為 0. 1-1. 3mM，誘導溫度為 18-37°C。
9.一種重組酯酶，其特征是包括用權(quán)利要求4所述的表達載體轉(zhuǎn)化的寄主細胞，培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酯酶的步驟的方法制備。
10.權(quán)利要求9所述的重組酯酶在降解擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型酯酶的DNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。還公開了含上述新型酯酶DNA的表達載體和重組酯酶及重組酯酶在降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用，該新型酯酶及重組酯酶在大腸桿菌表達體系中具有高效的可溶性表達，且該重組酯酶對氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等具有高效降解作用。
文檔編號A62D101/04GK101985627SQ20101054720
公開日2011年3月16日 申請日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者劉孝龍, 劉玉煥, 梁衛(wèi)驅(qū), 范新炯 申請人:中山大學