專利名稱：睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-羥基類固醇脫氫酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種利用分子生物學(xué)技術(shù)，從睪丸酮叢毛單胞菌中克隆到一個(gè)新的基因，在降解環(huán)境污染物睪丸酮、膽固醇上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
，17 P -羥基類固醇脫氫酶(3，17 ^ -HSD)是睪丸酮叢毛單胞菌(C. testosteroni) 中降解類固醇等物質(zhì)的系列酶中的關(guān)鍵酶，阿根廷科學(xué)家利用Northern的分子生物學(xué)手段研究發(fā)現(xiàn)，此酶受部分類固醇激素誘導(dǎo)(Identification of a novel steroid inducible gene associated with The ^hsd locus of Comamonas testosteroni,Jose Luis Pruneda-Paz and so on, Argentina),然而對(duì)于其基因結(jié)構(gòu)及功能未進(jìn)行研究，國內(nèi)未見報(bào)道。尤其是在C. testosteroni以及假單胞桿菌中未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種睪丸酮叢毛單胞菌3，17 0 -羥基類固醇脫氫酶及其用途，3，17 ^ -HSD基因是首次從C. testosteroni中克隆得到的，并對(duì)它進(jìn)行了序列測(cè)定與分祈。同時(shí)在大腸桿菌中進(jìn)行了該基因的高表達(dá)以及生物功能的確定。此酶是由254個(gè)氨基酸殘基組成的，SDS-PAGE顯示分子量為29. 5KD。研究發(fā)現(xiàn)3，17 P -HSD對(duì)睪丸酮、膽固醇有高效降解作用(降解率達(dá)90%以上)，是ー種可作用于多種類固醇的酶，該酶的研究、開發(fā)和應(yīng)用在檢測(cè)和降解環(huán)境中睪丸酮、膽固醇及其衍生物具有極大的價(jià)值。本發(fā)明的睪丸酮叢毛單胞菌3，17 0 -羥基類固醇脫氫酶(3，17 ^-HSD)是
Xho I起始密碼子
GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAGGGTAAGGTGGCGCTGGTCACTGGTGGTGCCAGCGGTGTGGGTCTTGA
GGTGGTGAAGCTGCTTCTTGGCGAAGGCGCCAAGGTCGCATTCAGCGATATCAATGAAGCGGCGGGGCAGCAACTGG
CGGCTGAACTGGGCGAACGCTCCATGTTTGTCCGCCATGACGTGAGCAGCGAGGCGGACTGGACGCTTGTGATGGCG
GCGGTGCAGCGGCGTCTGGGCACGCTCAATGTGCTGGTCAACAATGCCGGCATCCTGCTGCCTGGTGACATGGAAAC
AGGGCGTCTGGAGGATTTCAGCCGCCTGCTCAAGATCAACACCGAGTCAGTCTTCATTGGTTGCCAGCAGGGCATTG
CGGCGATGAAGGAGACAGGAGGCTCCATCATCAATATGGCCTCGGTATCGAGCTGGCTGCCCATAGAGCAATACGCC
GGCTATAGCGCCAGCAAGGCCGCCGTGTCGGCACTGACCCGCGCCGCTGCACTGAGCTGTCGAAAGCAAGGCTATGC
GATTCGCGTCAATTCCATTCATCCCGATGGCATCTATACGCCCATGATGCAGGCTTCGCTGCCAAAGGGCGTGAGCA
AGGAAATGGTCTTGCATGACCCCAAGCTCAACCGTGCCGGCCGCGCCTATATGCCCGAGCGTATCGCGCAGCTGGTG
TTGTTCCTGGCCAGCGACGAGTCCAGTGTCATGAGCGGTAGCGAGCTGCATGCAGATAACTCGATTCTGGGCATGGG
GCTATAGGGATCCTTAT
終止密碼子BamH I
本發(fā)明的睪丸酮叢毛單胞菌3，17 P -羥基類固醇脫氫酶(3，17 ^ -HSD)制取方法是
I.以C. testosteroni基因組為模板，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增了末端含有Xho I和BamH I 酶切位點(diǎn)的DNA片段，對(duì)其進(jìn)行了亞克隆及測(cè)序，用軟件Vector nti 11.5. I對(duì)所測(cè)定序列進(jìn)行開放閱讀框分析，為ー個(gè)完整的開放閱讀框，基因全長765bp (如下所示)，通過所測(cè)定序列做BLAST分析，確定該基因?yàn)?，17 P -HSD。通過XboI和BamHI進(jìn)行雙酶切，使3，17 ^ -HSD基因連接在大腸桿菌高表達(dá)載體 pET-15b的Xho I和BamH I酶切位點(diǎn)上構(gòu)建重組質(zhì)粒p3/17 P-HSD，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21 (DE3) (Studier F W，et al. J. Mol. Biol. 1986, 189:113),進(jìn)行 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)此酶是由254個(gè)氨基酸殘基組成的(如下所示)，SDS-PAGE顯示分子量為29. 5KD。對(duì)大腸桿菌中3,17 0-HSD的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了 western blotting驗(yàn)證。確定構(gòu)建的重組表達(dá)宿主菌可進(jìn)行高表達(dá)3，17 ^ -HSD。對(duì)大腸桿菌中3，17 ^ -HSD的表達(dá)產(chǎn)物做生物活性測(cè)定。以睪丸酮和膽固醇為底物，以高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行殘留量測(cè)定，研究發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)睪丸酮和膽固醇的生物活性都很強(qiáng)。采用Ni-柱親和層析，對(duì)3，17 P-HSD的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，獲得了高純度 (99. 5%)的3，17 P -HSD。同時(shí)它保持了很高的生物活性。本發(fā)明的睪丸酮叢毛單胞菌3，17 P -羥基類固醇脫氫酶(3，17 ^ -HSD)用途是 利用本發(fā)明構(gòu)建的工程菌及其產(chǎn)生的酶降解環(huán)境中的睪丸酮、膽固醇及其衍生物，改
善環(huán)境，它與其他的降解方法相比更高效、經(jīng)濟(jì)、安全。本發(fā)明的有益效果是3，17 P-HSD基因是首次從C. testosteroni中克隆得到的， 并對(duì)它進(jìn)行了序列測(cè)定與分析。同時(shí)在大腸桿菌中進(jìn)行了該基因的高表達(dá)以及生物功能的確定。研究發(fā)現(xiàn)此酶是由254個(gè)氨基酸殘基組成的，SDS-PAGE顯示分子量為29. 5KD。研究發(fā)現(xiàn)3，17 ^ -HSD對(duì)睪丸酮、膽固醇有高效降解作用(降解率達(dá)90%以上)，是ー種可作用于多種類固醇的酶，該酶的研究、開發(fā)和應(yīng)用在檢測(cè)和降解環(huán)境中睪丸酮、膽固醇及其衍生物具有極大的價(jià)值。


圖I質(zhì)粒p3/17@-HSD的構(gòu)建過程示意圖2 SDS-PAGE檢測(cè)3，17 ^ -HSD基因在大腸桿菌中的表達(dá)，
Line I、line 10 :蛋白質(zhì)低分子量標(biāo)準(zhǔn)，
Line 2 BL21 (DE3)/pET_15b 菌體蛋白提取物，
Line 3-9 BL21 (DE3) /p3/17 ^ -HSD 菌體蛋白提取物；
圖3 western blotting檢測(cè)3,17 0-HSD基因在大腸桿菌中的表達(dá),
Line I:蛋白質(zhì)低分子量標(biāo)準(zhǔn)，
Line 2 DAB 顯色 3，17 P -HSD ；
圖4 :3，17 P -HSD降解睪丸酮的HPLC圖譜，
4. I :ImM睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，
4.2 :3,17^ -HSD降解睪丸酮色譜圖5 :3，17 P -HSD降解膽固醇的HPLC圖譜，
5.I lmM膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，
5.2 :3,17^ -HSD降解膽固醇色譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I.睪丸酮叢毛單胞菌3，17 0-羥基類固醇脫氫酶的獲得及其用于對(duì)睪丸酮的降解
1.1睪丸酮叢毛單胞菌3，17 0-羥基類固醇脫氫酶的獲得 I. I. I C. testosteroni 基因組的提取
1)按照I50的比例接種C. testosteroni于IOmlLB培養(yǎng)基中，27°C，180rpm培養(yǎng)過
夜；
2)取過夜培養(yǎng)的菌液Iml于I.5ml Eppendorf管中，13000rpm,4°C離心30s,倒掉上清， 收集沉淀；
3)向管中加入500ul經(jīng)過高壓滅菌的雙蒸水，徹底懸浮菌體；
4)加入500ul酹氯仿(I1)混合均勻，室溫下放置5min ; 13000rpm,室溫離心5min ； 小心吸取上層于新的I. 5mlEppendorf管中；
5)重復(fù)步驟4)一次；
6)小心吸取上層于新的I.5mlEppendorf管中，加入1/20V 5M NaCl和2V無水こ醇，震蕩混勻，放置-20°C, 30min ; 13000rpm, 4°C,離心 IOmin ；
7)將上清倒掉，加入Iml70%こ醇徹底懸浮沉淀；
8)倒掉上清，將離心管放置數(shù)分鐘，晾干；
9)加入20-50ul高壓滅菌的雙蒸水溶解沉淀，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或者_(dá)20°C保存。，17 3-HSD基因片段的PCR擴(kuò)增
以 5’ -GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAG-3’ 和 5’ -ATAAGGATCCCTATAGCCCCATGCC-3 ’ 為引物，以I. I提取的C. testosteroni基因組為模板，在以下條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增
反應(yīng)體系
模板 3ul，引物 I 2ul，引物 2 2ul, 10X PCR buffer 5ul，聚合酶(Taq+pfu) lul，dNTP 2ul,雙蒸水35ul。擴(kuò)增條件
a.95°C變性 5min ；
b.95°C變性lmin,54°C退火lmin,72°C延伸lmin,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；
c.72°C延伸 IOmin ；
d.4°C保存，放置至室溫，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
I.I. 3目的基因的序列測(cè)定及分析
將1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到的大小合適的片段，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段的回收，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收片段的濃度及純度，之后在T4 DNA連接酶的作用下，與購自上海生エ生物技術(shù)有限公司的PUCm-T載體，22°C連接16h，構(gòu)建重組質(zhì)粒 T-3/17 3 HSD0采用CaC12轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 a (TaKaBa),進(jìn)行氨芐青霉素抗性篩選，挑取平板上的單菌落進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定，挑出測(cè)序所用的亞克隆，送往測(cè)序公司進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果出來后，利用Vector nti 11. 5. I軟件對(duì)所測(cè)定序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所克隆的DNA片段為ー完整的開放閱讀框，其基因全長765bp，編碼254個(gè)氨基酸殘基。重組質(zhì)粒p3/17@-HSD的構(gòu)建(如圖I)質(zhì)粒T-3/17 ^ HSD以Xho I和BamH I酶切，回收765bp的小片段，連接到經(jīng)Xho I和 BamH I酶切的質(zhì)粒pET_15b上(Novagen)，得到了正確的重組質(zhì)粒，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌 BL21 (DE3)。，17 P-HSD基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
將含有質(zhì)粒P3/17 ^ -HSD的BL21 (DE3)菌株按照I :50的比例接種在LB液體培養(yǎng)基中(含有終濃度為100ug/ml氨芐青霉素)，37°C恒溫震蕩搖床培養(yǎng)過夜(180rpm)，作為種子液使用。將種子液按照I :20的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中(含有終濃度為 100ug/ml氨芐青霉素)，37攝氏度，180rpm搖床培養(yǎng)2_3h。加入IPTG(終濃度ImM)，繼續(xù)搖床培養(yǎng)5h。于IOOOOrpm下離心lOmin，取沉淀(菌體)。用于SDS-PAGE、western blotting檢測(cè)目的蛋白帶的表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果(圖 2)和western blotting檢測(cè)結(jié)果(圖3)均表明在29. 5KD附近有一條目的蛋白帶，與預(yù)期
大小一致。，17 ^ -HSD的分離純化
采用I. 5的方法誘導(dǎo)表達(dá)工程菌,在4°C條件下，IOOOOrpm, IOmin離心收集菌體；菌體沉淀用0. 2M pH7. 0磷酸緩沖液懸浮，加入溶菌酶(100ug/ml)進(jìn)行細(xì)胞超聲波破碎(200w， 20min), IOOOOrpm,離心15min,取上清,得到酶儲(chǔ)備液。 酶儲(chǔ)備液進(jìn)行Ni-柱親和層析。分別以10倍柱體積的ImM和20mM的咪唑進(jìn)行洗滌，最后用50mM的咪唑洗脫，以SDS-PAGE檢測(cè)純度。結(jié)果表明，經(jīng)過以上純化過程，獲得了純度高(99. 5%)的3，17 P-HSD目的蛋白。，17 @ -HSD用于降解睪丸酮
1.2. I所需培養(yǎng)基及睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)樣
無機(jī)鹽培養(yǎng)基MgS04. 7H20 0. 2g/L;KH2P04 0. 5g/L; (NH4) 2S04 0. 5g/L;K2HP04. 3H20
I.96g/L: 121 °C濕熱滅菌20min ;加1%微量元素溶液；加底物S.
微量元素Na2EDTA. 2H20 12g/L;FeS04. 7H20 2g/L;CaC12 lg/L;ZnS04. 7H20 0. 4g/ L;MnS04. H20 0. 4g/L;CuS04. 5H20 0. I g/L;Na2Mo04. 2H20 0. lg/L:pH 7.0，115°C濕熱滅菌15min，冷卻后4°C保存?zhèn)溆?。睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)樣按照2010版《中國藥典》配制。上述培養(yǎng)基中無機(jī)鹽均為分析純，睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品購自sigma公司。實(shí)驗(yàn)方法
將0. 5mg酶液加入到50ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基(睪丸酮濃度為IuM)中，27°C，180rpm震蕩2h， 采用IOOOOrpm離心lOmin，收集無機(jī)鹽培養(yǎng)基，采用HPLC色譜(色譜柱為C18反相色譜柱； 流動(dòng)相為水甲醇=45 55 ;流速為I. 0ml/mim;檢測(cè)波長為250nm ;進(jìn)樣量為50ul ;柱溫為 40°C)分析睪丸酮的殘留量。結(jié)果(圖4)表明，本發(fā)明構(gòu)建的3，17 ^-HSD表達(dá)工程菌表達(dá)的酶對(duì)降解睪丸酮(降解率達(dá)到90%以上)活性高。實(shí)施例2.睪丸酮叢毛單胞菌3，17 P -羥基類固醇脫氫酶的獲得及其用于對(duì)膽固醇的降解
2.I睪丸酮叢毛單胞菌3，17 P -羥基類固醇脫氫酶的獲得及其分離純化參照實(shí)施例2.2 3，17 P -HSD用于降解膽固醇
2.2. I所需培養(yǎng)基及膽固醇標(biāo)準(zhǔn)樣
無機(jī)鹽培養(yǎng)基MgS04. 7H20 0. 2g/L;KH2P04 0. 5g/L; (NH4) 2S04 0. 5g/L;K2HP04. 3H20 I. 96g/L: 121 °C濕熱滅菌20min ;加1%微量元素溶液；加底物S.
微量元素Na2EDTA. 2H20 12g/L;FeS04. 7H20 2g/L;CaC12 lg/L;ZnS04. 7H20 0. 4g/ L;MnS04. H20 0. 4g/L;CuS04. 5H20 0. I g/L;Na2Mo04. 2H20 0. lg/L:pH 7.0，115°C濕熱滅菌15min，冷卻后4°C保存?zhèn)溆?。膽固醇?biāo)準(zhǔn)樣按照2010版《中國藥典》配制。上述培養(yǎng)基中無機(jī)鹽均為分析純，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品購自sigma公司。實(shí)驗(yàn)方法
將0. 5mg酶液加入到50ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基(膽固醇濃度為IuM)中，27°C，180rpm震蕩 2h，采用IOOOOrpm離心lOmin，收集無機(jī)鹽培養(yǎng)基，采用HPLC色譜(色譜柱為C18反相色譜柱；流動(dòng)相為100%こ腈；流速為0.檢測(cè)波長為205nm ;進(jìn)樣量為50ul ;柱溫為
35°C)分析睪丸酮的殘留量。結(jié)果(圖5)表明，本發(fā)明構(gòu)建的3，17 ^-HSD表達(dá)工程菌表達(dá)的酶對(duì)降解膽固醇(降解率達(dá)到90%以上)活性高。
權(quán)利要求
1.ー種睪丸酮叢毛單胞菌3，17 P -羥基類固醇脫氫酶，其特征是Xho I起始密碼子GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAGGGTAAGGTGGCGCTGGTCACTGGTGGTGCCAGCGGTGTGGGTCTTGAGGTGGTGAAGCTGCTTCTTGGCGAAGGCGCCAAGGTCGCATTCAGCGATATCAATGAAGCGGCGGGGCAGCAACTGGCGGCTGAACTGGGCGAACGCTCCATGTTTGTCCGCCATGACGTGAGCAGCGAGGCGGACTGGACGCTTGTGATGGCGGCGGTGCAGCGGCGTCTGGGCACGCTCAATGTGCTGGTCAACAATGCCGGCATCCTGCTGCCTGGTGACATGGAAACAGGGCGTCTGGAGGATTTCAGCCGCCTGCTCAAGATCAACACCGAGTCAGTCTTCATTGGTTGCCAGCAGGGCATTGCGGCGATGAAGGAGACAGGAGGCTCCATCATCAATATGGCCTCGGTATCGAGCTGGCTGCCCATAGAGCAATACGCCGGCTATAGCGCCAGCAAGGCCGCCGTGTCGGCACTGACCCGCGCCGCTGCACTGAGCTGTCGAAAGCAAGGCTATGCGATTCGCGTCAATTCCATTCATCCCGATGGCATCTATACGCCCATGATGCAGGCTTCGCTGCCAAAGGGCGTGAGCAAGGAAATGGTCTTGCATGACCCCAAGCTCAACCGTGCCGGCCGCGCCTATATGCCCGAGCGTATCGCGCAGCTGGTGTTGTTCCTGGCCAGCGACGAGTCCAGTGTCATGAGCGGTAGCGAGCTGCATGCAGATAACTCGATTCTGGGCATGGGGCTATAGGGATCCTTAT終止密碼子BamH I。
2.ー種睪丸酮叢毛單胞菌3，17 P -羥基類固醇脫氫酶的用途是利用睪丸酮叢毛單胞菌3，17 P -羥基類固醇脫氫酶降解環(huán)境中的睪丸酮、膽固醇及其衍生物。
3.如權(quán)利要求I所述的ー種睪丸酮叢毛單胞菌3，170-羥基類固醇脫氫酶的制取方法是a.以C.testosteroni基因組為模板，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增了末端含有Xho I和BamH I酶切位點(diǎn)的DNA片段，對(duì)其進(jìn)行了亞克隆及測(cè)序，用軟件Vector nti 11. 5. I對(duì)所測(cè)定序列進(jìn)行開放閱讀框分析，為ー個(gè)完整的開放閱讀框，基因全長765bp，通過所測(cè)定序列做BLAST 分析，確定該基因?yàn)?，17 P-HSD ；b.通過XboI和BamHI進(jìn)行雙酶切，使3，17P-HSD基因連接在大腸桿菌高表達(dá)載體 pET-15b的Xho I和BamH I酶切位點(diǎn)上構(gòu)建重組質(zhì)粒p3/17 P-HSD，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21， 進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；此酶是由254個(gè)氨基酸殘基組成的，SDS-PAGE顯示分子量為29. 5KD ；MTNRLQGKVALVTGGASGVGLEVVKLLLGEGAKVAFSDINEAAGQQLAAELGERSMFVRHDVSSEADWTLVM AAVQRRLGTLNVLVNNAGILLPGDMETGRLEDFSRLLKINTESVFIGCQQGIAAMKETGGSIINMASVSSWLPIEQY AGYSASKAAVSALTRAAALSCRKQGYAIRVNSIHPDGIYTPMMQASLPKGVSKEMVLHDPKLNRAGRAYMPERIAQL VLFLASDESSVMSGSELHADNSILGMGL ；c.對(duì)大腸桿菌中3,170-HSD的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了 western blotting驗(yàn)證；確定構(gòu)建的重組表達(dá)宿主菌可進(jìn)行高表達(dá)3，17 ^ -HSD ；d.對(duì)大腸桿菌中3，17^ -HSD的表達(dá)產(chǎn)物做生物活性測(cè)定；以睪丸酮和膽固醇為底物， 以高效液相色譜法進(jìn)行殘留量測(cè)定，該酶對(duì)睪丸酮和膽固醇的生物活性都很強(qiáng)；e.采用Ni-柱親和層析，對(duì)3，17P-HSD的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，獲得了高純度的3， 17 3 -HSD。
全文摘要
一種睪丸酮叢毛單胞菌3，17β-羥基類固醇脫氫酶及其用途，屬于應(yīng)用環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，其特征是通過分子生物學(xué)技術(shù)從睪丸酮叢毛單胞菌(C.testosteroni，ATCC11996)中克隆到一個(gè)新的基因，其編碼的產(chǎn)物是3，17β-羥基類固醇脫氫酶，本發(fā)明對(duì)其進(jìn)行了克隆、表達(dá)及功能研究發(fā)現(xiàn)3，17β-HSD對(duì)睪丸酮、膽固醇有高效降解作用，在降解環(huán)境中睪丸酮、膽固醇及其衍生物有極大的應(yīng)用價(jià)值。有益效果是3，17β-HSD基因是首次從C.testosteroni中克隆得到的，在大腸桿菌中進(jìn)行了該基因的高表達(dá)以及生物功能的確定。3，17β-HSD對(duì)睪丸酮、膽固醇有高效降解作用，是一種可作用于多種類固醇的酶，該酶在檢測(cè)和降解環(huán)境中睪丸酮、膽固醇及其衍生物具有極大的價(jià)值。
文檔編號(hào)A62D101/28GK102604905SQ20121011344
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者于化東, 于源華, 張昊, 張曉 , 王保學(xué) 申請(qǐng)人:長春理工大學(xué)