羧酸酯酶、其編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的羧酸酯酶、編碼上述羧酸酯酶的基因、包含上述基因的重組載體、包含上述基因的重組菌株和上述羧酸酯酶在鄰苯二甲酸二異丁酯降解中的應(yīng)用。本發(fā)明的羧酸酯酶基因CarEW來源于溫泉環(huán)境，并證實其在45℃條件下具有很好的活性和穩(wěn)定性，可用于環(huán)境中酞酸酯類化合物(鄰苯二甲酸酯)，如鄰苯二甲酸二異丁酯的降解，在環(huán)境污染治理方面具有重要意義。
【專利說明】羧酸酯酶、其編碼基因及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種羧酸酯酶、其編碼基因及其應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸二異丁酯（diisobutyl phthalate, DIBP)屬于酞酸酯類化合物，是塑 料工業(yè)中廣泛應(yīng)用的增塑劑和軟化劑，其作用是增加塑料的可塑性和韌性，提高塑料強度 (趙振華，環(huán)境化學(xué)，1991，10 (3) :64-68)。此外，DIBP在涂料、印染、化妝品和香料的生產(chǎn)過 程中應(yīng)用也較為廣泛。近年來研究表明，DIBP僅靠分子間作用與高分子塑料結(jié)合，隨著時 間的推移該類物質(zhì)可以通過食品包裝材料直接遷移到食品中，也可通過含有該物質(zhì)的塑料 制品遷移到環(huán)境中，從而對空氣、水、土壤和食品等造成污染，并可通過呼吸、飲食和皮膚進 入人體內(nèi)，對人體造成危害（Zhang et al·，Environ Geochem Health, 2014, 36:505-515)。 因此，尋找合理、有效的降解DIBP的方法和途徑逐漸成為各國研究者所關(guān)注的問題。由于 生物降解是處理環(huán)境中DIBP類污染物的主要途徑，因此篩選高效專性或兼性的DIBP類有 機污染物降解菌或降解酶成為研究的熱點。
[0003] 羧酸酯酶（Carboxylesterases, EC3. L L 1)是一類能夠催化水解羧酸酯生成 羧酸和醇的非特異性酯酶，與脂肪酶同屬于α/β水解酶家族成員，其氨基酸序列含 有Ser-Asp-His三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，Ser，Asp, His構(gòu)成了羧酸酯酶的催化活性中心（Nardini et al·，Current Opinion in Structural Biology, 1999, 9:732-737)。羧酸酯酶廣泛 分布于動物、植物和微生物中（Melloney et al·，Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2005, 32:261-270),在催化酯水解、酯合成和酯交換等過程中具有重要應(yīng)用 價值，具有良好的區(qū)域選擇性和立體選擇性（Ramos et al·，Agricultural and Biological Chemistry, 1987, 51:1833-1838)。但迄今為止，關(guān)于羧酸酯酶對酞酸酯類化合物降解的研 究甚少。
[0004] 利用微生物降解酞酸酯類化合物大多數(shù)是依靠胞內(nèi)酶解作用，但由于野生菌株產(chǎn) 酶能力有限、發(fā)酵周期長、純化復(fù)雜、難以大量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本高，限制了其推廣應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種羧酸酯酶。
[0006] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述羧酸酯酶的基因。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述羧酸酯酶在鄰苯二甲酸二異丁酯降解中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所述羧酸酯酶CarEW可得自芽孢桿菌（Bacillus sp.)，如Bacillus sp. ATCC31072,羧酸酯酶CarEW的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 本發(fā)明的羧酸酯酶CarEW總共含有488個氨基酸，理論分子量為53. 76kDa。該酶 以4-硝基苯丁酸酯（pNPC4)為最適底物；最適溫度45°C ;最適pH值7. 5 ;終濃度ImM的金 屬離子K+、Cu2+、Na+和Zn2+對羧酸酯酶CarEW有激活作用，Ag+、Hg 2+等對羧酸酯酶CarEW有 較強的抑制作用；在37°C和45°C下保溫60min，羧酸酯酶的酶活分別保持在54%和58%以 上；在pH值5. 0?10. 0的緩沖液中處理60min，羧酸酯酶的酶活在pH值7. 0?8. 0之間比 較穩(wěn)定，保持80%以上的酶活力；在pH值7. 5及45°C反應(yīng)時，羧酸酯酶CarEW對0. 6mmol/ L的pNPC4比活力為636U±0. 01U/mg。此外，羧酸酯酶CarEW對α -乙酸萘酯、β -乙酸萘 酯、乙酸-4-硝基苯酯（pNPC2)、己酸-4-硝基苯酯（pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯（pNPC 8)、對 硝基苯酚癸酸酯（pNPC1(l)、月桂酸-4-硝基苯酯（pNPC12)等底物也具有很好的降解作用。
[0012] 本發(fā)明提供了編碼上述羧酸酯酶的基因 CarEW，該基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0013] 本發(fā)明通過PCR的方法克隆了羧酸酯酶基因 CarEW，其全長1464bp，起始密碼為 ATG，終止密碼為TGA。
[0014] 本發(fā)明還提供了包含上述羧酸酯酶基因 CarEW的重組載體，優(yōu)選為 pEASY?-E2-CarEW。將本發(fā)明的羧酸酯酶基因與pEASY?-E2進行T-A連接，使其核苷酸序列 與表達調(diào)控序列相連接，得到重組大腸桿菌表達質(zhì)粒pEASY?-E2-CarEW。
[0015] 本發(fā)明還提供了包含上述羧酸酯酶基因 CarEW的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸 桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株BL21 (DE3)/CarEW。
[0016] 本發(fā)明制備羧酸酯酶CarEW的方法按以下步驟進行：
[0017] 1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到重組菌株；
[0018] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組羧酸酯酶表達；
[0019] 3)回收并純化所表達的羧酸酯酶CarEW。
[0020] 其中，優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大 腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21 (DE3) /CarEW。
[0021] 本發(fā)明提供了羧酸酯酶基因 CarEW，其編碼的羧酸酯酶CarEW以4-硝基苯丁酸酯 (pNPC4)為最適底物；最適溫度45°C ;最適pH7. 5 ;終濃度為ImM的金屬離子K+、Cu2+、Na+和 Zn2+對羧酸酯酶CarEW有激活作用，Ag+、Hg2+等對羧酸酯酶CarEW有較強的抑制作用；在 37°C和45°C下保溫60min，酶活分別保持在54%和58%以上；在pH5. 0-10. 0緩沖液中處 理60min，羧酸酯酶的酶活在pH7. 0-8. 0之間比較穩(wěn)定，保持80 %以上的酶活力；在pH7. 5 及45°C反應(yīng)時，羧酸酯酶CarEW對0. 6mmol/L pNPC4的比活力為636U±0. 01U/mg。此外， 羧酸酯酶CarEW對α -乙酸萘酯、β -乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯（pNPC2)、己酸-4-硝基 苯酯（pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯（pNPC 8)、對硝基苯酚癸酸酯（pNPC1(l)、月桂酸-4-硝基苯 酯（pNPC12)等底物也具有很好的降解作用。
[0022] 本發(fā)明的羧酸酯酶CarEW在鄰苯二甲酸二異丁酯降解中的應(yīng)用，其中，鄰苯二甲 酸二異丁酯為增塑劑。
[0023] 其應(yīng)用方法如下：
[0024] 取1U羧酸酯酶CarEW加入到含有濃度為30mg/L的增塑劑鄰苯二甲酸二異丁酯的 10mmol/L、pH值7. 5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，總反應(yīng)體系為0. 5mL，37°C反應(yīng)，即可 對增塑劑鄰苯二甲酸二異丁酯進行降解。
[0025] 取抽提液于氣質(zhì)聯(lián)用（6(：/^5)上進行定量分析，結(jié)果表明，9〇1^11內(nèi)有77%的鄰苯 二甲酸二異丁酯被降解。
[0026] 本發(fā)明的羧酸酯酶基因 CarEW來源于溫泉環(huán)境，并證實其在45°C條件下具有很好 的活性和穩(wěn)定性，可用于環(huán)境中酞酸酯類化合物（鄰苯二甲酸酯）的降解，尤其可高效降解 鄰苯二甲酸二異丁酯，在環(huán)境污染治理方面具有重要意義。此外，酞酸酯類化合物對生物和 環(huán)境的危害近年來才逐漸被認知，相關(guān)研究報道較少，而生物降解是處理環(huán)境中DiBPs的 主要途徑，因此本發(fā)明對開發(fā)微生物來源的羧酸酯酶對酞酸酯類化合物降解的應(yīng)用具有重 要意義。同時，本發(fā)明具有培養(yǎng)周期短、易于獲得純蛋白等優(yōu)點。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為在大腸桿菌中表達的重組羧酸酯酶CarEW的SDS-PAGE分析，其中，Μ :低分 子量蛋白質(zhì)Marker ;1 :純化的重組羧酸酯酶CarEW ;
[0028] 圖2為羧酸酯酶的溫度和酶活的曲線圖；
[0029] 圖3為羧酸酯酶的溫度穩(wěn)定性的曲線圖；
[0030] 圖4為羧酸酯酶的pH值和酶活的曲線圖；
[0031] 圖5為羧酸酯酶的pH穩(wěn)定性試驗結(jié)果；
[0032] 圖6為羧酸酯酶CarEW的1/[S]與1/V的關(guān)系曲線圖；
[0033] 圖7為增塑劑鄰苯二甲酸二異丁酯的標準曲線；
[0034] 圖8為重組羧酸酯酶CarEW對鄰苯二甲酸二異丁酯的降解曲線。 【具體實施方式】
[0035] 實驗材料和試劑
[0036] 1、菌株及載體：芽孢桿菌（Bacillus sp.)同文獻報道菌種性質(zhì)，如Bacillus sp.ATCC31072;大腸桿菌 Escherichia coli BL21(DE3)購于 Novagen 公司；表達載體 pEASY?-E2購于全式金生物有限（TransGen)公司。
[0037] 2、酶類及其它生化試劑：限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶和dNTP購自TaKaRa公司；T4 連接酶購自Promega公司；α -乙酸萘酯、β -乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯（pNPC2)、4_硝 基苯丁酸酯（pNPC4)、己酸4-硝基苯酯（pNPC 6)、4-硝基苯基辛酸酯（pNPC8)、對硝基苯酚癸 酸酯（pNPC1Q)、月桂酸4-硝基苯酯（pNPC 12)購自Sigma公司；鄰苯二甲酸二異丁酯溶液標 準品購自北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；其它試劑均購自國藥集團。
[0038] 3、培養(yǎng)基：
[0039] LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化鈉1%，ρΗ自然（約為7.0)。固體培 養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2.0% (w/v)瓊脂。
[0040] 說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進行。
[0041] 實施例1 :羧酸酯酶基因 CarEW的克隆
[0042] 采用天根細菌基因組提取試劑盒（DP302)提取芽孢桿菌K91基因組DNA。
[0043] 根據(jù)芽孢桿菌K91全基因組測序及基因注釋分析羧酸酯酶基因 CarEW并設(shè)計表達 引物 CarEW F 和 CarEW R :
[0044] 上游引物 CarEW F: 5，-ACTCATCAAATAGTAACGAC-3，
[0045] 下游引物 CarEW R:5, -TTCTCCTTTT GAAGGGAATA G-3'
[0046] 上游引物 T7:5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3 '
[0047] 下游引物 T7ter:5' -TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
[0048] T7和T7ter為PCR檢測陽性克隆子引物。
[0049] 以嗜熱芽孢桿菌K91基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)參數(shù)為：94°C預(yù) 變性lmin30sec ;然后94°C變性30sec ;58°C退火（每個循環(huán)降0· 5°C )30sec ;72°C延伸 lmin40sec ;28 個循環(huán)后 94°C變性 30sec ;44°C退火 30sec ;72°C延伸 lmin30sec ;7 個循環(huán) 后 72°C保溫 lOmin。
[0050] 取4 μ L PCR產(chǎn)物與1 μ L表達載體pEASY?-E2進行T-A連接，25°C連接lOmin，連 接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)入Trans-I感受態(tài)細胞中，37°C溫箱過夜培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化板上挑取幾株單菌落， 使用引物（本基因上游引物，T7ter)進行菌落PCR擴增，篩選正向連接的陽性克隆子。對 菌落PCR驗證正確的克隆子采用T7和T7ter引物測序，由北京華大基因測序完成。對于測 序正確的陽性克隆子接種并提取質(zhì)粒pEASY?-E2-CarEW，取0. OluL pEASY?-E2-CarEW質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化到lOOuL BL21(DE3)表達感受態(tài)細胞中，涂布于含Απ^的LB固體平板上，37°C溫箱過 夜培養(yǎng)，從轉(zhuǎn)化板上挑取幾株單菌落，進行菌落PCR擴增篩選陽性克隆子，從而獲得重組大 腸桿菌菌株 BL21 (DE3) /CarEW。
[0051] 實施例2 :重組羧酸酯酶CarEW的制備
[0052] 取含有重組質(zhì)粒pEASY?-E2-CarEW的BL21 (DE3)菌株和只含有pEASY?-E2的空質(zhì) 粒BL21(DE3)菌株，以0. 1%的接種量接種于LB (含100ug/mL Amp。培養(yǎng)液中，37°C快速振 蕩16h。然后將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB (含100ug/mL AmpO培養(yǎng)液中， 快速振蕩培養(yǎng)約2 - 3h (0D6(KI達到0. 4-0. 7)后，加入終濃度0. 7mM的IPTG進行誘導(dǎo)，于20°C 繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20h。12000rpm離心lOmin，收集菌體。用適量的pH7. 0檸檬酸-Na2HP04緩 沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內(nèi)濃縮的粗酶液經(jīng)12, OOOrpm離 心lOmin后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose純化目的蛋白。對其進行SDS-PAGE分析， 結(jié)果參見圖1，圖1為在大腸桿菌中表達的重組羧酸酯酶CarEW的SDS-PAGE分析，圖1表 明，重組羧酸酯酶在大腸桿菌中得到了表達，經(jīng)Nickel-NTA Agarose純化后為單一條帶。
[0053] 實施例3 :純化的重組羧酸酯酶CarEW的性質(zhì)測定
[0054] 1、重組羧酸酯酶CarEW的活性分析
[0055] 純化的重組酯酶CarEW采用對硝基苯酚法（p-ni tropheno 1)進行活性測定：取 4只1. 5mL離心管，分別編號1、2、3、4,其中1、2、3號試管為實驗組（3個重復(fù)），4號為對 照組。向四只離心管中分別加入420 μ L pH7. 5的由50mM檸檬酸-Na2HP04緩沖液、0. 4% Trion-100、0. 1 %阿拉伯膠組成的乳化液和30 μ LlOmM底物pNPC4, 37°C預(yù)熱5min后，每隔 l〇s分別向1、2和3號管中加入50 μ L稀釋適當倍數(shù)的酶液，4號對照管加等量水，37°C反 應(yīng)5min后每隔10s向1、2、3實驗管中加入50yL0. 1M Na2C03終止反應(yīng)，4號對照管同樣加 入等體積終止液后立即將4只離心管插到冰上，酶標儀405nm讀取0D值。1個酶活單位（U/ mL)定義為一定條件下，每分鐘分解底物pNPC4生成1 μ m〇L對硝基苯酚所需要的酶量。以 pNPC2、pNPC6、pNPC8、pNPC1(l、pNPC 12、α -乙酸萘酯和β -乙酸萘酯為底物測定方法及酶活力 計算同pNPC4。
[0056] 結(jié)果表明，在ρΗ7·5及45°C反應(yīng)時，羧酸酯酶CarEW對0.6mmol/L ?即(；的比活力 為636U±0.01U/mg。同時，羧酸酯酶CarEW對α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、乙酸-4-硝基 苯酯（pNPC2)、己酸-4-硝基苯酯（pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯（pNPC 8)、對硝基苯酚癸酸酯 (pNPC1(l)、月桂酸-4-硝基苯酯（pNPC12)等底物也具有很好的降解作用。
[0057] 2、重組羧酸酯酶CarEW的最適溫度和熱穩(wěn)定性的測定
[0058] 酶的最適溫度測定：將重組羧酸酯酶CarEW在50mM pH7. 5的檸檬酸-Na2HP04緩 沖液條件下，分別在 〇°C、10°C、20°C、30°C、37°C、45°C、50°C、60°C、70°C、75°C下進行酶促反 應(yīng)。結(jié)果參見圖2,圖2為羧酸酯酶的溫度和酶活的曲線圖，由圖2可知，羧酸酯酶CarEW的 最適溫度為45 °C。
[0059] 溫度穩(wěn)定性的測定：將重組酯酶CarEW在50mM pH7. 5的檸檬酸-Na2HP04緩沖液條 件下，在 37°C、45°C和 55°C三個溫度下分別保溫 10min、20min、30min、40min、50min 和 60min 后進行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。以pNPC4為底物，反應(yīng)5min，測定重組羧酸酯 酶CarEW的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果參見圖3,圖3為羧酸酯酶的溫度穩(wěn)定性的曲線圖，由圖3可知， 該酶在37°C和45°C處理60min后仍剩余50%以上的活性；55°C保溫60min后，酶活性保持 在30%以上。
[0060] 3、重組羧酸酯酶CarEW的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定
[0061] 酶的最適pH的測定：將重組羧酸酯酶CarEW在37 °C，分別在ρΗ5· 0、6. 0、7. 0、7. 5、 8. 0的50mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、ρΗ8. 0、9. 0的50mM Tris-HCL緩沖液以及 pH9. 35、10. 0的50mM硼酸-硼砂的緩沖液中進行酶促反應(yīng)。結(jié)果參見圖4,圖4為羧酸酯 酶的pH值和酶活的曲線圖，由圖4可知，羧酸酯酶CarEW的最適pH值為7. 5。
[0062] pH穩(wěn)定性的測定：將重組羧酸酯酶CarEW用ρΗ5· 0、6· 0、7· 0、7· 5、8· 0的50mM檸檬 酸-Na2HP04 緩沖液；pH8. 0、9. 0 的 50mM Tris-HCL 緩沖液；pH9. 35、10. 0、的 50mM 硼酸-硼 砂緩沖液稀釋適當倍數(shù)后分別在37°C下耐受60min后進行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為 對照。以pNPC 4為底物，反應(yīng)5min，測定純化的重組羧酸酯酶CarEW的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果參見 圖5,圖5為羧酸酯酶的pH穩(wěn)定性試驗結(jié)果，由圖5可知，經(jīng)pH7. 0、7. 5、8. 0的50mM檸檬 酸-Na2HP04緩沖液；pH8. OTris-HCl緩沖液37°C條件下處理60min后仍然保持80%以上的 活性，重組羧酸酯酶CarEW在pH7. 0-8. 0之間酶學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定。
[0063] 4、不同金屬離子及化學(xué)試劑對重組羧酸酯酶CarEW活性的影響
[0064] 在酶促反應(yīng)體系中加入終濃度ImM的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對酶活性的影 響。以pNPC 4為底物，在45°C，pH7. 5條件下，反應(yīng)5min，測定純化的重組羧酸酯酶CarEW的 酶活力。結(jié)果參見表1和表2,表1為不同金屬離子及化學(xué)試劑對羧酸酯酶活性影響的檢測 結(jié)果，表2為不同有機試劑對羧酸酯酶活性影響的檢測結(jié)果。
[〇〇65] 表1不同金屬離子及化學(xué)試劑對羧酸酯酶活性影響的檢測結(jié)果 [0066]
【權(quán)利要求】
1. 一種羧酸酯酶，其特征在于，其具有（I)或（II)所示的氨基酸序列中任意一個： (I)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； (Π )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸 獲得的氨基酸序列。
2. -種編碼如權(quán)利要求1所述的羧酸酯酶的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示或者由 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個或幾個堿基獲得。
4. 包含權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體。
5. 含有權(quán)利要求4所述載體的宿主細胞。
6. 包含權(quán)利要求2或3所述基因的菌株。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的菌株，其特征在于，所述菌株為重組菌株。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的菌株，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌 或乳酸桿菌。
9. 權(quán)利要求1所述的羧酸酯酶在鄰苯二甲酸二異丁酯降解中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，其具體方法為：將羧酸酯酶加入到含有 鄰苯二甲酸二異丁酯的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中進行反應(yīng)。
【文檔編號】A62D101/28GK104109659SQ201410352516
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】黃遵錫, 丁俊美, 王超凡, 李俊俊, 慕躍林, 楊云娟 申請人:云南師范大學(xué)