銅綠假單胞菌在降解伏馬菌素中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種銅綠假單胞菌的新用途，即銅綠假單胞菌在降解伏馬菌素中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 伏馬菌素是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物，根據(jù) 結(jié)構(gòu)差異，伏馬菌素被分為4族:A、B、C和G，B族伏馬菌素(FB)毒性最強(qiáng)。伏馬菌素主要由串 珠鐮刀菌(Fusarium verticillioides)在玉米、小麥、高粱、大豆及某些飼料中生長代謝產(chǎn) 生。伏馬菌素可引起多種動物疾病，如馬腦白質(zhì)軟化?。╡quine leukoencephalomalacia， ELEM)、豬肺水腫綜合征(porcine pulmonary edema，PPE)、實驗性大鼠腎癌和肝癌等，并被 認(rèn)為與人類食管癌和神經(jīng)管缺陷病高發(fā)有關(guān)。伏馬菌素污染對人類和動物健康及食品安全 構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，與瘋牛病病毒、二噁英、0-157大腸桿菌和氯丙醇五種污染物被當(dāng)今世界 認(rèn)為危機(jī)人類食品安全的五大熱點。因此，開展伏馬菌素抑制與去除技術(shù)研究，對于保護(hù)人 類和動物健康，確保國家食品安全和糧食安全具有重大的意義。
[0003] 伏馬菌素去毒方法可分為物理、化學(xué)和生物三大類，其中生物法因具有效率高、特 異性強(qiáng)以及對食品、飼料和環(huán)境沒有污染的特點，利用生物手段進(jìn)行伏馬菌素的降解則成 為近年來伏馬菌素毒素降解研究的熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種銅綠假單胞菌的新用途，即銅綠假單胞菌在降解伏馬菌 素中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明保護(hù)銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產(chǎn) 物在降解伏馬菌素中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明還保護(hù)銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或銅綠假單胞菌代謝 產(chǎn)物在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用;所述產(chǎn)品的用途為降解伏馬菌素。
[0007] 本發(fā)明還保護(hù)一種降解伏馬菌素的方法，為使用銅綠假單胞菌對伏馬菌素進(jìn)行降 解處理。
[0008] 所述方法中，降解處理的方式為將銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或 銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物與含有伏馬菌素的樣品混合。
[0009] 本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成分為銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液 和/或銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物;所述產(chǎn)品的用途為降解伏馬菌素。
[0010] 以上任一所述銅綠假單胞菌，具體為保藏編號為:CGMCC No.8511的銅綠假單胞菌 N17-1。
[0011] 以上任一所述伏馬菌素，具體可為B族伏馬菌素。所述B族伏馬菌素具體可為伏馬 菌素 Βι。
[0012] 本發(fā)明通過實驗證明，銅綠假單胞菌可高效降解伏馬菌素，銅綠假單胞菌作為伏 馬菌素降解的生物材料，在開發(fā)新的生物降解菌劑和生物降解無菌制劑方面都具有很好的 應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0013]圖1為實施例1中LC/MS/MS檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0014] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。
[0015] 銅綠假單胞菌N17-1 (Pseudomonas aeruginosa):保藏編號：CGMCC No .8511。記載 并保護(hù)"銅綠假單胞菌Ν17-Γ的專利的申請?zhí)枮椋?01410001212.1，授權(quán)公告號為CN 103710292 B(授權(quán)公告日為2016.01.20)。
[0016] ppm：mg/L〇
[0017] 伏馬菌素 B1 (FBI)標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-Aldrich，產(chǎn)品編號：32936。
[0018] 伏馬菌素免疫親和柱:美國VICAM公司，產(chǎn)品編號:G1008。
[0019] lX〇.l%Tween PBS緩沖液：美國VICAM公司，產(chǎn)品編號:G1112〇
[0020] 伏馬菌素出的結(jié)構(gòu)式如下：
[0021]

[0022]實施例1、銅綠假單胞菌N17-1對伏馬菌素出的降解作用
[0023] NB液體培養(yǎng)基：由溶劑和溶質(zhì)組成;溶質(zhì)為蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶劑為水;蛋白 胨在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為lg/100ml，牛肉膏在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為0.3g/100ml， NaCl在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為0.5g/100ml。
[0024] 1、將銅綠假單胞菌N17-1接種于液體NB培養(yǎng)基中至初始0D6QQnm = 0.05,37°C條件 下，200rpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)震蕩培養(yǎng)24h，收集全部菌液（即含有菌體和上清在內(nèi)的整個培 養(yǎng)體系）。
[0025] 2、將lmg伏馬菌素&$81)標(biāo)準(zhǔn)品溶解于10ml色譜純甲醇中獲得濃度為lOOpprn的 伏馬菌素出溶液。
[0026] 3、制備實驗組溶液：
[0027]取0.5ml步驟1收集的菌液，置于1.5ml離心管中，向離心管中加入5yL步驟2得到的 伏馬菌素也溶液，充分混勻后37°C靜置72h，然后10000g離心10min并收集上清，得到實驗組 溶液。
[0028] 4、制備對照組溶液：
[0029]按照步驟3的方法，取0.5ml液體NB培養(yǎng)基替代0.5ml步驟1收集的菌液，其余操作 不變，得到對照組溶液。
[0030] 5、效果檢測：
[0031 ]實驗組溶液和對照組溶液分別作為待測溶液，進(jìn)行如下步驟：
[0032] 1、向4體積份待測溶液中加入1體積份無水甲醇，室溫振蕩提取5分鐘，12000r/min 離心5分鐘，取上清液用于下一步凈化操作。
[0033] 2、取步驟1得到的上清液，使用伏馬菌素免疫親和柱進(jìn)行除雜，具體操作過程如 下：
[0034] 取步驟1得到上清液，使其通過伏馬菌素免疫親和柱，調(diào)節(jié)流速為1-2滴/s，直至空 氣完全通過免疫親和柱。然后用l〇ml的1X0. l%Tween PBS緩沖液以1-2滴/s的流速通過親 和柱，對親和柱進(jìn)行清洗，然后重復(fù)清洗1次。最后用lml無水甲醇以1-2滴/s的流速淋洗親 和柱，將此洗脫液收集于1.5ml的離心管中，用0.22μπι有機(jī)相尼龍膜過濾后，將濾液裝入2ml 色譜進(jìn)樣小瓶中，得到樣品液。
[0035] 3、取步驟2得到的樣品液，進(jìn)行LC/MS/MS(液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜）。
[0036]液相色譜相關(guān)參數(shù)：
[0037] 儀器：agilent 6460LC/MS/MS;
[0038] 色譜柱：agilent XDB-SB-C18(2.1x50mm，1·8μπι);
[0039] 上樣體積：2yL;
[0040] 柱溫：30°C;
[0041] 洗脫過程(梯度洗脫）：第〇_lmin，A液在洗脫液中所占的體積百分含量為80%;第 l-5min，A液在洗脫液中所占的體積百分含量為10% ;第5-6min，A液在洗脫液中所占的體積 百分含量為80%;后運行7min，后運行過程繼續(xù)保持A液在洗脫液中所占的體積百分含量為 80 % ;流速為0.3mL/min;洗脫液由A液和B液組成，A液為體積百分含量為0.1 %的甲酸水溶 液，B液為體積百分含量為0.1%的乙腈水溶液。
[0042]質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)：ESI+MRM(多反應(yīng)監(jiān)測）；霧化氣溫度為300°C，霧化氣流速為6L/ min;氣簾氣溫度為350°C，氣簾氣流速為10L/min，氣簾氣壓力為45psi;電力電壓為4000v; 檢測離子對:722 > 334，722 > 352;碰撞電壓均為30ev。
[0043]用伏馬菌素 Bl(FBl)標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋液代替樣品液進(jìn)行上述步驟。
[0044]計算伏馬菌素 B1 (FBI)降解率，計算方法為：
[0045] FBI降解率（％ )=(對照組FBI含量-實驗組FB!含量)/對照組FB!含量X 100。
[0046]實驗重復(fù)五次，結(jié)果取平均值。
[0047] LC/MS/MS檢測結(jié)果如圖1所示。圖1中，A為伏馬菌素也標(biāo)準(zhǔn)品的分析結(jié)果，B為對照 組溶液的分析結(jié)果，C為實驗組溶液的分析結(jié)果。結(jié)果表明，銅綠假單胞菌N17-1對伏馬菌素 Βι有較好的降解效果，經(jīng)過統(tǒng)計降解率為80.1 ±4.5 %。
【主權(quán)項】
1. 銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物在降解伏馬 菌素中的應(yīng)用。2. 銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物在制備產(chǎn)品 中的應(yīng)用;所述產(chǎn)品的用途為降解伏馬菌素。3. 如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述銅綠假單胞菌的保藏編號為CGMCC No.8511〇4. 如權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述伏馬菌素為B族伏馬菌素。5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述B族伏馬菌素為伏馬菌素 m。6. -種降解伏馬菌素的方法，包括如下步驟:使用銅綠假單胞菌對伏馬菌素進(jìn)行降解 處理。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述降解處理的方式為將銅綠假單胞菌和/ 或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物與含有伏馬菌素的樣品混合。8. 如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述伏馬菌素為B族伏馬菌素。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述B族伏馬菌素為伏馬菌素 m。10. -種產(chǎn)品，其活性成分為銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或銅綠假單 胞菌代謝產(chǎn)物;所述產(chǎn)品的用途為降解伏馬菌素。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種銅綠假單胞菌的新用途，即銅綠假單胞菌在降解伏馬菌素中的應(yīng)用。本發(fā)明通過實驗證明銅綠假單胞菌可高效降解伏馬菌素，銅綠假單胞菌作為伏馬菌素降解的生物材料，在開發(fā)新的生物降解菌劑和生物降解無菌制劑方面都具有很好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A62D3/02, A62D101/28
【公開號】CN105709362
【申請?zhí)枴緾N201610266551
【發(fā)明人】趙月菊, 劉陽, 王瑤, 蘭茨納·桑格, 邢福國, 王龑
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所