專利名稱：脂解酶在粘性物控制中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及某些脂解酶在由回用紙(recycled paper)制造紙和紙制品中的應用。通過利用這些酶，減少了與來源于廢紙的所謂粘性物(stick)有關的問題。
背景技術：
在整個工業(yè)領域(造紙，紡織等等)中，包含醋酸乙烯酯的聚合物最常用作粘合劑和涂料。然而，由于它們具有粘結性能(adhesive property)，所以這些聚合物經常在隨后的處理階段產生問題。
例如，在造紙工業(yè)中，包含醋酸乙烯酯的聚合物被用作粘合劑和涂料。在再循環(huán)期間，這些聚合物往往會與纖維和其它物質聚集在一起，形成所謂的“粘性物”，后者降低了紙制品的質量并明顯增加停機時間。
WO 00/34450，WO 01/92502和US5,176,796報道了某些脂肪酶和角質蛋白酶(cutinases)在造紙中的應用，即用于樹脂(pitch)控制的應用。根據(jù)上述美國專利，樹脂是木材的天然組成，并且其主要組分是三酸甘油酯。
WO 01/98579披露了在紙張再循環(huán)期間脂肪酶和/或酯酶在控制粘性物所產生的問題中的應用。在其中的實施例1-3中，為進行對比，包括了商品名為RESINASE A2X和NOVOCORADL的脂肪酶。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一類脂解酶在由再生紙張造紙中的應用，以及利用該類脂解酶的造紙方法。該類脂解酶通過參考針對包含醋酸乙烯酯的聚合物水解活性的某些測試而確定。
發(fā)明詳述粘性物根據(jù)the Thesaurus of Pulp and Paper Terminology，1991(由Institute ofPaper Science and Technology編輯，Atlanta，US)，將術語粘性物稱為在后處理期間粘附紙機部件的具有粘合劑特征(adhesive character)的廢紙雜質。作為上述雜質的實例，可以提及的有油墨、焦油和膠乳。
另外的粘性物實例是纖維、粘合劑、涂料、粘結劑和其它材料的粘性(tacky)聚集物，它們在循環(huán)造紙過程中形成。因此，粘性物主要關系到利用再生紙張的造紙過程。
粘性物是水不溶性的并且往往引起聚集并沉積至造紙設備的各種部件上，由此造成紙張質量問題，使紙幅斷裂，并且為了清洗設備而采取昂貴的停工期。例如，粘性物可沉積至成紙毛毯(paper forming felt)上，由此使得從形成紙幅的排水不太有效，這又可能造成上述的問題。
粘性物可用不同的方式區(qū)分，例如通過大小或通過比重來區(qū)分原始粘性物很小，所以通常不會造成任何問題，而次級粘性物或宏觀粘性物較大，并且往往會發(fā)生沉積。宏觀粘性物通常具有留在細篩上的尺寸。細篩的實例是具有約50-200，60-190，或70-180，或80-170，或80-160，或約80-150微米狹長篩孔的那些。
在一定條件下，通過各種型式的機械設備可以除去高密度和密度低的粘性物，但是，特別是在所謂中等范圍密度粘性物的情況下，即比重約0.9-1.1，或約0.95-1.05，或約0.98-1.02的粘性物，仍然存在這樣的問題。
來自世界各地的粘性物的化學組成可能不同，這主要取決于本地造紙方法的特性。出于相同的理由，粘性物的組成在不同工廠之間也可能不同。
下列組分是所述組分的實例，其中一種或多種組分通常在歐洲粘性物中發(fā)現(xiàn)丙烯酸樹脂、聚醋酸乙烯酯(PVAc)、苯乙烯丁二烯樹脂(SBR)、聚乙烯(PE)和聚丙烯(PP)。
在本發(fā)明中，關注的是包含醋酸乙烯酯的聚合物，這些粘性物是上述聚合物的一個實例。包含醋酸乙烯酯單體的聚合物可以是包含醋酸乙烯酯單體的聚醋酸乙烯酯均聚物(PVAc)，或者它可以是包含醋酸乙烯酯及其他單體如乙烯、丙烯酸甲酯、月桂酸乙烯酯和叔-癸酸、乙烯基酯的共聚物。各種各樣聚合物的摻混物和混合物也包括在本發(fā)明中使用的定義“包含醋酸乙烯酯的聚合物”中，其中至少一種聚合物包含醋酸乙烯酯單體。這也適用于其與其它聚合物的混合物，而且還適用于其與其它化合物的混合物。
業(yè)已開發(fā)出了各種控制粘性物的方法，如控制進入回用紙張的質量，各種機械篩選和離心法，以及利用各種化學劑的分散法。另外，還建議使用酶(例如參見上述的WO01/98579)。
然而，仍然存在著嚴重的問題，根據(jù)本發(fā)明，通過利用某些脂解酶減少了上述問題，本發(fā)明的脂解酶優(yōu)越于為此目的的前述的酶。
脂解酶在本發(fā)明中，術語“脂解”酶指的是具有統(tǒng)一的和特征化特征的一類酶，它們能夠水解包含醋酸乙烯酯單體的聚合物。
為確定所給出的酶是否落入本發(fā)明脂解酶的范圍內，可利用下列測試的任一種(a)在45℃于分散的PVAc底物(substrate)上18小時之后，通過毛細管電泳確定水解度，其中分散的PVAc底物通過將1.5毫升于甲醇中6％的PVAc注入40毫升緩沖劑pH 6或8中而制得并且其中PVAc的分子量約為12800；或(b)在均包含醋酸乙烯酯單體的如下三種聚合物制劑的至少之一上確定所述酶的水解活性(i)PVAc均聚物制劑，(ii)醋酸乙烯酯乙烯共聚物制劑，或(iii)醋酸乙烯酯叔癸酸(tert-decanoic acid)乙烯基酯(ethenyl ester)共聚物制劑。在一種、兩種或所有三種底物上的水解活性表明該酶為本發(fā)明中定義的“脂解”酶。
對于上述測試(a)如果根據(jù)本發(fā)明中實施例8所確定的水解度至少為0.1，則所述酶(enzyme in question)定量為用于根據(jù)本發(fā)明的脂解酶。約12800的PVAc分子量指的是通過凝膠滲透色譜法(GPC)測量的平均分子量。關于這一點，“約12800”意味著在10000和20000之間的平均分子量。緩沖劑pH 6或8的可以是pH 6或pH 8。合適緩沖劑的實例是5mM的Hepes緩沖劑(pH8)，和5mM的MES(pH6)。在特定的實施方案中，水解度至少為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9或至少2.0。
令人驚奇的是，為了減少粘性物的粘性，似乎需要相對小的水解度。在特定的實施方案中，水解度在10％以下，或9％以下，或8％以下，或7％以下，或6％以下，或5％以下，或4％以下。在另外特定的實施方案中，水解度在可由上述上限和下限值得出的任何范圍內。
對于根據(jù)上述(b)的測試，使聚合物底物乳化，并根據(jù)所述酶的特性，對反應條件如pH、溫度和溫育(incubation)時間進行選擇。
反應溫度的實例是10，20，30，35，37，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100℃。
反應pH值的實例是pH 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或pH 12。
反應時間的實例是30秒，1分鐘，2，3，4，5，10，20，30，60，90，120或180分鐘。
在第一特定實施方案中，在由50mM的NaCl、0.5mM的KH2PO4、9％(v/v)甘油和0.1％(w/v)阿拉伯膠(Gum Arabicum)組成的乳液中，將5％(w/v)聚醋酸乙烯酯(PVAc)均聚物制劑作為底物，在35℃，pH 8進行4分鐘時，酶可以具有(優(yōu)選具有)水解活性。在一特定的實施方案中，聚醋酸乙烯酯均聚物制劑(也稱為PVAc均聚物)是干物質含量(dry matter content)在46至50％范圍內，粘度在5800至7200mPas范圍內(Brookfield，20℃)的均聚PVAc分散體膠液(dispersion glue)。優(yōu)選的底物得自GLUDAN A/S公司(Vesterlundvej 5-7，DK-2730Herlev，Denmark)的產品GLUDANTM150-6.500(在本發(fā)明實施例1中使用)。在該第一實施方案中，水解活性可稱為“PVAc水解活性”。
在第二特定實施方案中，在由50mM的NaCl、0.5mM的KH2PO4、9％(v/v)甘油和0.1％(w/v)阿拉伯膠組成的乳液中，將5％(w/v)醋酸乙烯酯乙烯共聚物制劑作為底物，在35℃、pH 7進行4分鐘，酶具有水解活性。在一特定的實施方案中，醋酸乙烯酯乙烯共聚物是總固含量在56至60％范圍內，粘度在6000至7000mPas范圍內(Brookfield，20℃)的PVAc乙烯共聚物分散體膠液。優(yōu)選的底物得自GLUDAN A/S公司(Vesterlundvej 5-7，DK-2730Herlev，Denmark)的產品GLUDANTM534-6.500(在本發(fā)明實施例2中使用)。
在第三特定實施方案中，在由50mM的NaCl、0.5mM的KH2PO4、9％(v/v)甘油和0.1％(w/v)阿拉伯膠組成的乳液中，將5％(w/v)醋酸乙烯酯叔癸酸乙烯基酯共聚物制劑作為底物，在35℃、pH 7進行4分鐘，酶具有水解活性。在該特定的實施方案中，醋酸乙烯酯叔癸酸乙烯基酯共聚物制劑是總固含量在55±1％范圍內，粘度在1000至4000cP范圍內(Brookfield，20℃)的醋酸乙烯酯-Veova共聚物分散體膠液。優(yōu)選的底物是得自CHE MARKApS公司(Noerregade 10A，2.t.v.，DK-4600 Koege，Denmark)的產品NOREMULTMVW 1501(實施例3中使用)。為了確定粘度，合適的粘度計是Brookfield LVF型。轉速為60rpm，可以使用3號錠子。
在這些條件下，通過將溶解在相當于A280＝0.15的去離子水中的、200微升脂解酶添加至15毫升底物乳液中而確定脂解酶的水解活性(例如PVAc的水解活性)，并且將一單位的水解活性(例如PVAc水解活性)定義為通過pH-stat測量的1微摩爾乙酸酯(acetate)的釋放。一般地，A280＝0.15相當于約0.10-0.40毫克酶蛋白/毫升，這取決于所述酶的消光系數(shù)。對于大多數(shù)用于實施例的酶，A280＝0.15可能相當于約0.20-0.30毫克酶蛋白/毫升，例如0.25毫克酶蛋白/毫升。在特定的實施方案中，試驗中使用的酶蛋白量(即包含在添加至15毫升底物乳液中的200微升中的)約為40-60，或約為45-55，或約50微克酶蛋白。
在特定的實施方案中，脂解酶可以具有(優(yōu)選具有)大于0.2單位、特別是0.4單位，更特別是0.6單位的PVAc水解活性。
在另一特定的實施方案中，每毫升A280為0.15的脂解酶溶液，脂解酶的PVAc水解活性至少為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.2，2.4，2.6，2.8，3.0，3.2，3.4，3.6，3.8，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0，11.5，12.0，12.5，13.0，或至少13.5單位。
在另一特定的實施方案中，每毫升A280為0.15的脂解酶溶液，脂解酶對醋酸乙烯酯乙烯共聚物底物的水解活性至少為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，或至少1.2單位。
在另一特定的實施方案中，每毫升A280為0.15的脂解酶溶液，脂解酶對醋酸乙烯酯叔癸酸乙烯基酯共聚物底物的水解活性至少為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0或至少2.1單位。
在各種各樣其它的實施方案中，脂解酶(iv)在LAS存在下是活性的(“活性的”指的是，在試驗(i)-(iii)的任一個中，通過將50或200ppmLAS添加至反應中，當與不添加LAS的對照試驗中的活性相比時，活性(以單位/毫升測量)至少為50％；在另外特定的實施方案中，當與對照物相比時，活性至少為55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，120或至少130％；
(v)在LAS存在下是穩(wěn)定的(“穩(wěn)定的”指的是，利用試驗(i)-(iii)的任一個，在pH6或8，溫度45℃，對酶(A280＝0.15)預溫育1、2或3小時之后，在50或200ppmLAS(剩余緩沖劑的pH為6或8)中的剩余活性(以單位/毫升測量)，與對照物相比，至少為55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，120或至少為130％)；(v)在35、45或55℃和pH＝8(利用5mM的Hepes緩沖劑)，在PVAc底物上作用20分鐘之后，與對照物相比顯示出更高的濁度(turbidity)，其中所述底物是通過將0.15毫升2％w/v的PVAc(Mw≈113000)的甲醇溶液注入30毫升緩沖劑(參見表4-6)中而制備；(v)是耐過氧化氫的，即在加或不加15ppm過氧化氫的情況下，獲得了基本相同的濁度/酶劑量(enzyme dosage profile)(參見表9)；和/或(vi)是耐LAS的，即利用50和200ppm LAS，45℃，pH 7，20分鐘之后，獲得了基本相同的濁度(參見表11)。
在特定的實施方案中，脂解酶是定義明確的(well-defined)意味著僅僅存在一種主要的酶組分。在可供選擇的實施方案中，術語定義明確意味著僅僅存在一種主要脂解酶組分。上述定義明確的或提純的或高度提純的脂解酶，可按照現(xiàn)有技術中已知的手段獲得，或根據(jù)與所述具體酶有關的出處物所述來獲得。在合適尺寸排阻柱上定義明確酶的餾分揭示只有一種為所述脂解酶的主要的酶組分；或在另一可供選擇的方案中，揭示了只有一種是所述的脂解酶的主要的脂解酶組分。
就界定主峰的峰而言，該峰的面積應當?shù)扔?0，或55，或60，或65，或70，或75，或80，或85，或90，或92，或94，或96，或至少98％的總峰面積/總脂解峰面積。
本領域普通技術人員知道怎樣選擇合適尺寸排阻色譜柱。他可能通過在HiLoad26/60 Superdex75pg柱(得自Amersham Biosciences UK Limited，Amersham Place，Little Chalfont，Buckinghamshire HP7 9NA，UK)上對制劑進行分餾而開始操作。如果峰不能清楚地分離，他將嘗試不同的柱(例如，利用改進的柱粒徑(particle size)和/或柱長)，和/或他將改進試樣的體積。具體內容參見實施例11。
在另外特定的實施方案中，使脂解酶脫鹽，即基本上不含低分子量材料如鹽。凝膠過濾層析法是合適的脫鹽技術。優(yōu)選的柱填充材料是SephadexG-25，以便保證Mr大于5000和Mr小于1000的蛋白質/肽的組分離。Mr指的是相對分子質量(分子量)，并且單位為道爾頓。合適的柱是例如得自Amersham，裝填有Sephadex G-25M的PD-10柱，或NAP5柱。使用供應廠商指定的標準程序，并將脫鹽水(MilliQ)用于平衡化和洗脫。
為了確定如上所述的脂解活性，優(yōu)選使用定義明確的和/或脫鹽的脂解酶制劑。優(yōu)選酶制劑是定義明確的和脫鹽的。如在材料和方法部分中所述，為了進行脂解活性測試，首先將酶制劑稀釋至A280為0.15。
如上所述脂解酶的實例通常在根據(jù)酶命名法分類如EC 3.1.1羧酸酯水解酶的酶中找到(可在http//www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme得到，或者根據(jù)酶命名法1992(Academic Press，San Diego，California，以及相應的Supplement 1(1993)，Supplement 2(1994)，Supplement 3(1995)，Supplement 4(1997)和Supplement 5(分別在Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250；1-6，和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650中)，它們是能夠水解羧酸酯鍵的酶。該脂解酶可以有具有活性的底物特異性，如EC3.1.1.3三?；视王ッ富駿C 3.1.1.74角質蛋白酶。
角質蛋白酶可來源于真菌。特別是，角質蛋白酶可得自腐質菌屬菌株(strain of Humicola)，特別是H.insolens，更特別是H.insolens DSM 1800(US5,827,719)，或得自鐮刀菌屬菌株(strain of Fusarium)，例如F.roseumculmorum，或特別是F.solani pisi(WO 90/09446；WO 94/14964；WO94/03578)。真菌角質蛋白酶也可以得自絲核菌屬菌株(strain of Rhizoctonia)，例如茄屬絲核菌(R.solani)，或鏈格孢屬菌株(strain of Alternaria)，例如甘藍鏈格孢(A.brassicicola)(WO 94/03578)。此外，脂解酶也可以是母體角質蛋白酶的變種，如WO 00/34450或WO01/92502中所述的那些。
SEQ ID NO1是Humicola insolens角質蛋白酶的氨基酸序列(相當于US 5,827,719的SEQ ID NO2的成熟部分)，而SEQ ID NO2是根據(jù)WO94/14964

圖1D的Fusarium Solani pisi的氨基酸序列。
另一實例是如EC 3.1.1.3分類的脂肪酶。更準確地說，脂肪酶源自假單胞菌屬(Pseudomonas)，如惡臭假單胞菌(P.putida)ATCC 53552(WO88/09367；WO 89/09263)，蔥頭假單胞菌(P.cepacia)(US 4,876,024)，門多茜娜假單胞菌(P.mendocina)(US 5,389,536)，P.alkaligenes(US 6,313,283)，唐菖蒲假單胞菌(P.gladioli)(EP 205 208；EP 206 390)或Pseudomonas sp.(US5,942,431)。此外，脂解酶也可以是母體脂肪酶的變種，如EP 0 943 678、US5,352,594或WO 94/25578中所述的那些。
另外的實例是得自Candida antarctica的脂肪酶B(US 5,273,898)或氨基酸序列與得自Candida antarctica的脂肪酶B(US 5,273,898)至少有60％，特別是65％，更準確地說70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或92％，或95％，或97％，或至少99％的同源性的酶，如得自Hyphozyma的脂肪酶(US5,856,163)。該脂肪酶具有SEQ ID NO3。
另外的實例是氨基酸序列與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2可具有至少70％的同源性的酶，特別是75％，或80％，90％，92％，95％，97％或至少99％的同源性。
在本發(fā)明中，同源性(homology)根據(jù)表示由第二序列衍生出的第一序列的兩個序列之間的相似度來確定。相似性通過GCG程序包中提供的計算機程序GAP確定(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Joumal of MolecularBiology，48，443-453，利用具有下列多肽序列比較設定的GAPGAP creationpenalty of 3.0和GAP extension penalty of 0.1)。在特定的實施方案中，同源性利用上述程序和設置的相同性程度來確定，在本發(fā)明用途的這種情況下，“同源性”可以用“相同性”替代，而“同源的”可以用“相同的”替代。
造紙方法本發(fā)明涉及一種造紙方法，包括a)由包含回用紙張的材料制備紙漿；b)用脂解酶對該紙漿進行處理，所述酶能夠水解包含醋酸乙烯酯單體的聚合物；c)由處理過的紙漿制備紙張。
對于本發(fā)明的目的，可涉及到任一種造紙方法以及/或者能夠使用任一種造紙紙漿，只要其包含回用紙張就可以。在特定的實施方案中，相對于紙漿總量，基于回用紙的紙漿量至少為2％，或至少4％，或至少6％，或至少8％，或至少10％，或至少15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90或至少95％。在另外特定的實施方案中，相對于紙漿總量，基于回用紙的紙漿量不多于25％，或不多于30％，或35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或不多于98％。在另外特定的實施方案中，相對于紙漿總量，基于回用紙的紙漿量位于可由上述上限和下限組合二得到的任何間隔之內。優(yōu)選的是，用干重來確定紙漿量。
不由回用紙衍生得到的紙漿部分可以由機械漿、化學漿及其任意混合物如化學-機械漿、熱-機械漿、化學-熱-機械漿等等衍生得到。
為了由包含回用(或廢)紙，也稱為二次纖維的材料制備紙漿，將所述材料在水中混合、分散或懸浮。這就是稱為制漿的過程。因此，油墨和其它雜質如膠液，粘合劑，涂料等等的至少一部分將從纖維中除去。造紙紙漿常包含回用紙和新鮮的即所謂的原始紙漿。紙漿可具有高(在18％以上)、中等(7-10％)或低(低于7％)的稠度。在特定的實施方案中，本發(fā)明的方法和用途是在高、中等、或低紙漿稠度下進行的。
回用纖維的來源可是本領域已知的任何等級的回用配料或其混合物，以及回用纖維與原始纖維的混合物?；赜美w維配料的主要等級例如有MOW(混合辦公室廢紙)，SOW(分類的辦公室廢紙)，ONP(舊新聞紙)，WM(廢雜志)和OCC(舊瓦欏紙箱)。
供本發(fā)明的方法和用途使用的脂解酶披露于本發(fā)明中標題為“脂解酶”的部分中。
表述“處理紙漿”主要指的是將所述酶添加至紙漿中。處理在合適的條件下進行。處理條件可取決于特定的造紙過程參數(shù)或要求，以及取決于所述酶的特性，如pH-活性和pH-穩(wěn)定性范圍，溫度活性和溫度-穩(wěn)定性范圍，水解速率等等而改變。處理條件的實例描述于標題為“工藝條件”的部分中。在特定的實施方案中，條件為適合于減少粘性物的量和/或適合于獲得脫墨作用的條件(見下文)。
由處理過的紙漿進行造紙包括用酶處理的纖維形成紙張或紙板制品。
除步驟a)-c)以外，還可以非強制地包括，例如下列步驟之一或更多個步驟d)脫墨，例如通過在堿性水溶液存在下對纖維進行制漿，其中非強制地包含過氧化物，如過氧化氫；e)例如通過篩選(粗篩和/或細篩)，將纖維與雜質分離；f)離心凈化；g)浮選，例如利用一種或更多種表面活性劑；h)洗滌，例如利用一種或更多種表面活性劑；
i)分散，例如利用一種或更多種表面活性劑；和/或j)如果需要的話，例如通過熱處理步驟，使酶滅活。
可以包括任何數(shù)量的這些附加步驟，并且其順序不必如a-b-c-d-e-f-g-h-i-j那樣。在特定的實施方案中，包括步驟d)和/或j)。在本文中定義的脂解酶也可有利地用于脫墨步驟d)中。
酶可以在制漿之前，制漿階段期間，備料階段期間或之前、優(yōu)選剛好在備料階段之前，或在浮選或脫墨階段之后引入。在特定的實施方案中，將酶引入紙機網前箱中，或引入紙機白水中。
所述方法可以是封閉循環(huán)方法(至少一部分水回用，例如至少10％，15，20，25，30，40，50，60，70或至少80％的水回用(vol/vol))。
在本發(fā)明的方法和用途的另外特定的實施方案中，酶起控制粘性物的作用?？刂普承晕镏傅氖牵c不用酶處理的對照物相比，粘性物量減少。在優(yōu)選的實施方案中，與對照物相比，用所述酶處理的試樣中粘性物的量最多為95％，或90％，或80％，或75％，或70％，或60％，或50％，或40％，或30％，或最多為20％(w/w)。披露在WO01/98579實施例1-6中的任一種方法均可來進行該測定。
在本發(fā)明的方法和用途的其它特定的實施方案中，酶起脫墨作用。酶可用于通過任何印刷方法，例如膠印，照相凹版印刷和凸版印刷進行印刷的脫墨回用紙中。酶的作用是改善所得到的紙張的白度或亮度和/或降低油墨量。這可根據(jù)本領域通常已知的方法來測量，例如根據(jù)披露于JP專利號96014078中的方法來測量。
存在于原始紙漿中的甘油酯往往會與來自回用紙漿、包含醋酸乙烯酯單體的聚合物聚集成粘性物。因此，在另一實例中，本發(fā)明的方法可包括能夠使包含醋酸乙烯酯單體的聚合物水解的脂解酶和能夠使甘油酯中的酯鍵水解的脂肪酶，如由EC 3.1.1.3分類的那些。
因此，本發(fā)明的方法和用途可以利用酶的組合進行，以便使酶促方法對于更寬范圍的雜質都有效，所述雜質如蛋白類雜質、含淀粉雜質、包含三酸甘油酯的雜質以及包含半纖維素和果膠的雜質。因此，根據(jù)本發(fā)明使用的脂解酶可與至少一種另外的酶組合，所述酶選自蛋白酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、脂肪酶、半纖維素酶、葡聚糖內切酶、角質蛋白酶和果膠酶。這些酶可以是野生型酶，或具有相關酶活性的其突變體或變異體，所述酶活性即催化在用于相應酶分類的下列網頁上指明的至少一種反應http://www.expasy.ch/enzyme/。
合適蛋白酶的實例是ALCALASE，ESPERASE，SAVINASE，NEUTRASE和DURAZYM蛋白酶。其它優(yōu)選的絲氨酸-蛋白酶是來自Nocardiopsis，曲霉屬(Aspergillus)，根霉屬(Rhizopus)，嗜堿芽孢肝菌(Bacillusalcalophilus)，蠟狀芽孢肝菌(B.cereus)，納豆芽孢桿菌(B.natto)，B.vulgatus，蕈狀芽孢桿菌(B.mycoide)的蛋白酶，以及得自芽孢肝菌屬(Bacillus)的枯草桿菌蛋白酶(subtilisins)，特別是得自Nocardiopsis sp.和Nocardiopsisdassonvillei種的蛋白酶，如披露于WO88/03947中的那些，特別是得自Nocardiopsis sp.，NRRL 18262和Nocardiopsis dassonvillei，NRRL 18133的蛋白酶。其它優(yōu)選的蛋白酶是得自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)突變體的絲氨酸蛋白酶，例如披露于WO91/00345和EP415296中的那些。合適的淀粉酶的實例是BAN，AQUAZYM，TERMAMYL，和AQUAZYM Ultra淀粉酶。脂肪酶的實例是RESINASE A2X脂肪酶。半纖維素酶的實例是PULPZYMEHC半纖維素酶。葡聚糖內切酶的實例是NOVOZYM 613、342和476酶產物。果膠酶的實例是NOVOZYME 863酶產品。支鏈淀粉酶的實例是PROMOZYM支鏈淀粉酶。用大寫字母的酶是商品酶，可得自NovozymesA/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark。
特別是，本發(fā)明的方法可用于存在于紙中和/或紙上存在的包含醋酸乙烯酯單體的聚合物。更準確地說，本發(fā)明的方法可用來水解回用紙張的造紙紙漿中的包含醋酸乙烯酯單體的聚合物，從而減少涉及粘性物的問題。另外，本發(fā)明還可用來除去標簽(label)，如郵件和瓶的標簽。在另一實例中，本發(fā)明方法可以用于紙張循環(huán)期間粘性物的控制。本發(fā)明的方法可以在攪拌或機械攪拌下進行。
工藝條件對于造紙方法和在本文中所述的至少一種脂解酶在造紙過程中的應用，所述脂解酶不必是如上所述那樣純。首先，它不必是定義明確的酶制劑。其次，酶制劑可以不是脫鹽的酶制劑。
然而，在特定的實施方案中，酶制劑是定義明確的。這主要是因為定義明確的制劑是有利的，例如考慮到結果的一致性和再現(xiàn)性。
工藝條件將隨所用酶、反應時間和所給定的條件而改變。通常，酶的劑量在足以控制紙漿中粘性物的量。然而，可以預期的是，酶的總劑量可以是以每克包含醋酸乙烯酯單體的聚合物計為0.1-5000單位，特別是每克包含醋酸乙烯酯單體的聚合物為0.5-1000單位，更特別的是，每克包含醋酸乙烯酯單體的聚合物為1-500單位，其中一個單位指的是如上所述的PVAc水解活性。
在特定的實施方案中，脂解酶的劑量為每噸紙漿從約100-100000單位。在特定的實施方案中，這些單位指的是(i)PVAc水解活性；(ii)對醋酸乙烯酯乙烯共聚物的活性；或(iii)對醋酸乙烯酯叔癸酸乙烯基酯共聚物的活性(利用在此描述的方法)。在優(yōu)選的實施方案中，該單位指的是(i)PVAc水解活性。有關特定劑量范圍的另外的實例(所有范圍均為“從約”和“至約”，并且以每噸紙漿為單位200-100,000；400-100,000；600-100,000；800-100,000；1000-100,000；1200-100,000；1500-100,000；2000-100,000；100-90.000；100-80.000；100-70.000；100-60.000；100-50.000；100-40.000；100-30.000；100-20.000；100-10.000；以及在此包括的上限和下限值的任何組合。
在其它特定的實施方案中，脂解酶的劑量為每噸紙漿w約0.1毫克酶蛋白至約100,000毫克酶蛋白。酶蛋白可以根據(jù)本發(fā)明實施例11所述來確定。特定劑量范圍的另外實例如下(所有范圍均為“從約”和“至約”，并以每噸紙漿為單位)0.5-100,000；1-100,000；5-100,000；10-100,000；20-100,000；40-100,000；60-100,000；80100,000；100-100,000；150-100,000；200-100,000；500-100,000；0.1-90,000；0.1-80,000；0.1-70,000；0.1-60,000；0.1-50,000；0.1-40,000；0.1-30,000；0.1-20,000；0.1-10,000；0.1-8,000；0.1-6,000；0.1-4,000；0.1-2,000；0.1-1,000；以及在此所包括的上限和下限的任何組合。
酶促處理可以在約10℃至約100℃進行。溫度范圍的另外實例如下(所有范圍均為“從約”和“至約”)20-100，30-100，35-100，37-100，40-100，50-100，60-100，70-100，10-90，10-80，10-70，10-60，和30-60℃，以及在此所述上限和下限的任何組合。
酶促處理可以在約2至約12的pH下進行。PH范圍的另外實例如下(所有范圍均為“從約”和“至約”)3-12，4-12，5-12，6-12，7-12，8-12，9-12，2-11，2-10，2-9，2-8，4-10，5-8，以及在此所述上限和下限的任何組合。
酶促處理合適的持續(xù)時間可以進行幾秒至若干小時，例如從約30秒至約48小時，或從約1分鐘至約24小時，或從約1分鐘至約18小時，或從約1分鐘至約12小時，或從約1分鐘至5小時，或從約1分鐘至約2小時，或從約1分鐘至約1小時，或從約1分鐘至約30分鐘。
添加劑除脂解酶以外，各種各樣的添加劑可用于本發(fā)明的方法或用途中。例如，可用滑石、粘土及其他無機顆粒使粘性物的粘性變得更小，并且可用分散劑、表面活性劑、聚合物和溶劑來降低粘性物的尺寸和/或使其保持分散或懸浮狀態(tài)。
表面活性劑和/或分散劑經常存在于造紙紙漿中和/或添加至造紙紙漿中。因此，本發(fā)明的方法可以在常用于造紙紙漿的陰離子、非離子、陽離子和/或兩性離子表面活性劑和/或分散劑的存在下進行。能夠水解包含醋酸乙烯酯單體的聚合物的酶可以是這樣的酶其在常用于造紙紙漿中或在紡織物洗滌期間的陰離子、非離子、陽離子性和/或兩性離子表面活性劑和/或分散劑存在下是具有活性的和穩(wěn)定的。
陰離子表面活性劑的實例是烷基、取代烷基或芳基的羧酸鹽、硫酸鹽、磺酸鹽或磷酸鹽。非離子表面活性劑的實例是聚氧乙烯化合物，如醇乙氧基化物、丙氧基化物或混合的乙氧基化物/丙氧基化物，聚甘油及其它多元醇，以及某些嵌段共聚物。陽離子表面活性劑的實例是水溶性陽離子聚合物，如硫酸四價銨和某些胺，例如表氯醇/二甲胺聚合物(EPI-DMA)及其交聯(lián)溶液、聚二烯丙基二甲基氯化銨(DADMAC)、DADMAC/丙烯酰胺共聚物和紫羅烯聚合物，如披露于US 5,681,862和5,575,993中的那些。兩性離子表面活性劑或兩性表面活性劑的實例是甜菜堿、氨基乙酸鹽、氨基丙酸鹽、亞氨基丙酸鹽和各種各樣的咪唑啉衍生物。另外，還可以使用披露于US5,256,252的聚合物。
另外，根據(jù)本發(fā)明，如上述的表面活性劑，包括其任何混合物，也可以與在本發(fā)明中所述的至少一種脂解酶一起用于造紙過程中，并與上述酶一起包括在組合物中。在上述組合物中各表面活性劑的量可以為組合物重量的約8至約40％重量。在特定的實施方案中，每種表面活性劑的量從約10至約38，或從約12至約36，或從約14至約34，或從約16至約34，或從約18至約34，或從約20至約34，或從約22至約34，或從約24至約34，或從約26至約34，或從約28至約32％(w/w)。
在另一特定的實施方案中，上述各種范圍指的是表面活性劑的總量。
組合物優(yōu)選是用于制造紙張的添加劑。在特定的實施方案中，組合物是非-構造(non-build)組合物，即它們不含構造劑(builders)。構造劑的實例是常用于洗滌劑組合物的某些磷酸鹽，沸石等等。
組合物可以包含選自下列酶的至少一種另外的酶蛋白酶，淀粉酶，支鏈淀粉酶，脂肪酶，半纖維素酶，葡聚糖內切酶，角質蛋白酶，和果膠酶；以及它們任何的組合。
組合物可以利用在例如US 5,356,800；5,780,283中描述的配方而穩(wěn)定化。
本發(fā)明還涉及(I)通過用角質蛋白酶處理而水解包含醋酸乙烯酯單體的聚合物的方法；根據(jù)上述的方法，其中角質蛋白酶源自于真菌；根據(jù)上述的方法，其中角質蛋白酶源自于Humicola insolens或Fusarium solani pisi；通過用源自假單胞菌屬(Pseudomonas)的脂肪酶處理而水解包含醋酸乙烯酯單體的聚合物的方法；通過用氨基酸序列與源自Candida antarctica SEQ ID NO.3的脂肪酶B具有至少60％的同源性的脂肪酶處理而水解包含醋酸乙烯酯單體的聚合物的方法；通過用氨基酸序列與SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2具有至少70％的同源性的脂解酶處理而水解包含醋酸乙烯酯單體的聚合物的方法；(II)一種用酶對包含醋酸乙烯酯單體的聚合物進行處理而使聚合物水解的方法，該酶在由50mM NaCl、0.5mM的KH2PO4、9％(v/v)甘油和0.1％(w/v)阿拉伯膠組成的乳液中，以5％(w/v)聚醋酸乙烯酯(PVAc)均聚物作為底物，在35℃、pH8時持續(xù)4分鐘時具有水解活性；和(III)酶在造紙中的應用，所述酶具有a)在45℃于分散的PVAc底物上18小時之后，通過毛細管電泳測定的水解度至少為0.1，其中分散的PVAc底物通過將1.5毫升于甲醇中6％的PVAc注入40毫升緩沖劑，pH 6或8，中而制得，并且其中PVAc的分子量約為12800；和/或b)在由50mM的NaCl、0.5mM的KH2PO4、9％(v/v)甘油和0.1％(w/v)阿拉伯膠組成的乳液中，將5％(w/v)的包含醋酸乙烯酯聚合物制劑作為底物，在35℃、pH7持續(xù)4分鐘的水解活性，其中所述聚合物是(i)PVAc均聚物制劑并且反應pH為8；
(ii)醋酸乙烯酯 乙烯共聚物制劑并且反應pH是7；和/或(iii)醋酸乙烯酯 叔癸酸 乙烯基酯共聚物制劑并且反應pH為7；以及上述(III)的應用，其中在(i)的條件下水解活性大于0.2單位，優(yōu)選大于0.4單位，更優(yōu)選大于0.6單位；其中酶的PVAc水解活性至少為0.7單位/毫升；其中在(ii)的條件下水解活性至少為0.2單位/毫升；其中在(iii)的條件下水解活性至少為0.2單位/毫升；其中為了根據(jù)a)確定水解度和為了根據(jù)步驟i)-iii)任一項確定水解活性，所述酶是定義明確的；其中為了根據(jù)a)確定水解度和為了根據(jù)步驟i)-iii)任一項確定水解活性，所述酶是脫鹽的；其中為了根據(jù)步驟i)-iii)任一項確定水解活性，將A280＝0.15或50微克酶蛋白的200微升酶溶液添加至15毫升底物乳膠中；為了進行粘性物控制和/或為了至少部分基于回用紙張制備的紙張或其制備；其中為了制造紙張，酶劑量以每克包含醋酸乙烯酯單體的聚合物計為0.1至5000單位的PVAc水解活性；其中每噸紙漿的酶劑量是(i)根據(jù)(III)的(i)為約100至約100000單位；或(ii)為約0.1至約100000毫克酶蛋白；其中在LAS和/或過氧化氫存在下，酶是活性的和穩(wěn)定的另外還包括至少一種另外酶的應用，該另外的酶選自如下的酶蛋白酶，淀粉酶，支鏈淀粉酶，脂肪酶，半纖維素酶，葡聚糖內切酶，角質蛋白酶和果膠酶；和/或另外還包括至少一種陰離子，非離子，陽離子性和/或兩性離子表面活性劑和/或分散劑的應用。
在此描述并要求保護的本發(fā)明并不局限于具有實施方案中所披露的范圍，這是因為這些實施方案只是對本發(fā)明若干方面的說明。任何等效的實施方案均落入本發(fā)明的范圍。實際上，除在此示出并描述的那些實施方案以外，本發(fā)明的各種改進對于本領域普通技術人員來說根據(jù)上面的描述將是顯而易見的。
所述改進也將落入權利要求書的范圍內。在有分岐的情況下，將參考包括定義在內的本發(fā)明的內容。
在此引證了各種參考文獻，應將內容全文引入作為參考。
材料和方法酶A)根據(jù)US 5,827,719，源自于Humicola insolens的角質蛋白酶。
B)A)的熱穩(wěn)定的變種。
C)根據(jù)WO 00/34450的A)的熱穩(wěn)定變種。
D)根據(jù)WO 94/14964，源自Fusarium solani pisi的角質蛋白酶。
E)根據(jù)US 5,273,898，源自Candida antarctica的脂肪酶B。
F)根據(jù)US 4,876,024，源自洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)的脂肪酶。
G)根據(jù)US 5,942,431，源自Pseudomonas sp.的脂肪酶。
H)源自豬胰臟(Porcine Pancreas)的磷脂酶。
I)NOVOCOR ADL脂肪酶。
J)RESINASE A 2X脂肪酶。
K)根據(jù)WO 00/32758，具有脂肪酶和磷脂酶活性的J)的變種。
L)源自黑色曲霉(Aspergillus niger)的阿魏酸酯酶(Ferulic acid esterase)。
NOVOCOR ADL和RESINASE A 2X脂肪酶是得自Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark的商品酶產品。
在下表A中示出的Humicola insolens角質蛋白酶的變異體根據(jù)WO00/34450和WO 01/92502中的描述進行制備，并如下所述進行脂解活性的測試。對這兩種變異體的測試結果，在實施例中作為B)和C)列出。
表A


試劑/底物0.025M NaOH5mM MES緩沖劑pH 6-6.50.98g MES 2-[N-嗎啉代]乙磺酸水合物0.44g CaCl2，2H2O0.246g MgSO4，7H2OMilli Q水加至1升用稀(weak)NaOH或HCl調節(jié)pH5mM Hepes緩沖劑 pH 7-9
1.19g Hepes(N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸])0.44g CaCl2，2H2O0.246g MgSO4，7H2OMilli Q 水加至1升用稀NaOH或HCl調節(jié)pH6％w/v在MeOH溶液中的聚醋酸乙烯酯PVAc在約50℃溶解于約80毫升甲醇中的6g PVAc Mw≈12800(GPC)(AldrichChemical Company.Inc.Cat.No.43，043-9)，并使之冷卻。
添加甲醇至100毫升。
2％w/v在MeOH溶液中的聚醋酸乙烯酯PVAc在約50℃溶解于約80毫升甲醇中的2g PVAc Mw≈113000(AldrichChemical Company.Inc.Cat.No.18.948-0)，并使之冷卻。
添加甲醇至100毫升。
LAS(LAS Nansa 1169A，十二烷基苯磺酸鈉鹽，Alright & Wilson)。
乳液試劑17.9g NaCl0.41g KH2PO4540毫升甘油6.0g阿拉伯膠在強烈攪拌下添加阿拉伯膠之前，將NaCl、KH2PO4、甘油和400毫升DI水混合。在完全溶解以前，連續(xù)進行攪拌。用DI水添加至1升。
用于實施例1-3的底物乳液15g PVAc均聚物或共聚物(Gludan，Denmark)(分別是實施例1和實施例2-3)50毫升乳液試劑235毫升DI水對該溶液攪拌約30分鐘，直至所有底物溶解。
設備滴定儀Radiometer Titralab(Vit 90)電極Orion 8103 Ross-Semi micro Combination pH電極，玻璃體。
濁度計帶有USEPA過濾器的HACH濁度計2100AN(Cat.30312-00)，包括裝配該儀器的特制玻璃(樣品管Cat.20849-00)水浴包括磁性攪拌器的水浴(長方形攪拌棒，15毫米)水浴帶有溫度控制的水浴。
過濾器0.22微米的過濾器(Millipore的Millex-GV單用途過濾器)毛細管電泳帶有Chemstation軟件的Hewlett Packard 3D CEAgilent緩沖劑用于HPCE的Agilent的堿性陰離子緩沖劑，Part.No.5064-8209Agilent毛細管Agilent，熔融硅石，CE ext.Light path cap.，內徑50微米，有效長度104厘米，總長112.5厘米，Part.no.G1600-64232張力儀KSV Sigma 70Model 6000，配備有鉑Wilhelmy板(尺寸10mm×20mm)，溫度調節(jié)和溶液攪拌實施例實施例1-3在通過酶釋放乙酸酯下，在恒定pH使包含醋酸乙烯酯單體的聚合物制劑水解。作為時間函數(shù)的乙酸酯的釋放通過pH-stat滴定用堿進行中和來測量。
打開滴定儀(參見設備)，將水浴設置在35℃，并用常規(guī)的校準緩沖劑對電極進行校準。將15毫升底物乳液添加至各燒杯中并對其加熱3分鐘，以獲得正好的溫度(在使用之前始終應對底物進行攪拌，以避免沉淀)。用新鮮制得的稀氫氧化鈉溶液(25mM)調節(jié)pH。根據(jù)相應于酶A)-L)的高度提純的和脫鹽的酶，制備酶溶液(于去離子水中)。該溶液對應于A280＝0.15的吸收率，并將其的200微升溶液添加至底物乳液中并利用25mM的NaOH開始滴定。4分鐘之后停止滴定。對于2-4分鐘的周期，計算每分鐘NaOH的平均消耗量(毫升)，并將該值用于下面單位的計算。
1單位酶定義為在給定條件下通過水解底物，每分鐘釋放1微摩爾可滴定乙酸酯所需的酶量。如在下表中列出的單位/毫升指的是A280＝0.15的酶溶液的毫升數(shù)。
實施例1PVAc均聚物的水解如上所述，測量不同脂解酶降解PVAc均聚物制劑的能力。在將酶添加至底物乳液中之前，將pH調節(jié)至8。結果列于表1中。
表1

實施例2醋酸乙烯酯共聚物的水解如上所述，測量脂解酶降解由醋酸乙烯酯和乙烯組成的醋酸乙烯酯共聚物制劑的能力。在將酶添加至底物乳液中之前，將pH調節(jié)至7。結果列于表2中。
表2

實施例3膠乳基醋酸乙烯酯共聚物的水解如上所述，測量脂解酶降解由醋酸乙烯酯叔癸酸乙烯基酯組成的醋酸乙烯酯共聚物制劑的能力。在將酶添加至底物乳液中之前，將pH調節(jié)至7。結果列于表3中。
表3

實施例4-10在實施例4-10中，將純的聚醋酸乙烯酯(縮寫為PVAc)用作底物。PVAc不溶于水但溶于甲醇。當將溶解于甲醇中的少量PVAc注入水中時，PVAc立即以極小的顆粒沉淀，并使液體變得混濁。由于它們具有粘性，所以這些顆粒往往會聚集成大得多的顆粒，從而使?jié)岫葴p小。利用顯示具有脂解活性的酶(例如PVAc水解活性)，能夠防止這種聚集。因此，以隨時間而變的PVAc分散體的濁度，可直接測量脂解酶的作用。濁度以NTU-單位(比濁法濁度單位(Nephelometric Turbidity Units))測量。數(shù)值低表明試樣是透明的，而數(shù)值高表明試樣是混濁的(即，酶起作用而降低了粘性)。在這些實施例中，酶劑量以ppm(w/w)酶蛋白給出。
實施例4凝聚PVAc的能力在玻璃杯中加上攪拌棒和30毫升緩沖劑。將玻璃杯放入水浴中，并等待調節(jié)至預定的溫度。磁性攪拌器的速度保持不變。除去相當于待添加酶溶液量的緩沖劑量(以保證體積恒定)。添加酶。將0.15毫升2％w/v的PVAc(Mw≈13000)注入甲醇溶液中，并開啟定時器。在攪拌10秒之后，將時間調零，并測量濁度。以時間為函數(shù)測量濁度。
分別在35、45或55℃，和pH＝8(利用5mM的Hepes緩沖劑)，利用10ppm的酶B)的結果分別示于下表4-6中。
表4

表5

表6

表7示出了利用5mM的Hepes緩沖劑，在45℃、pH＝8時兩種脂解酶的劑量-響應圖。在20分鐘之后測量濁度。這些數(shù)值是三個實驗的平均值。
表7

表8示出了脂解酶對pH的作用(45℃；20分鐘后的濁度；酶劑量，10ppm酶B)。這些數(shù)值是三個實驗的平均值。
表8

實施例5對過氧化氫的耐性使用與實施例4相同的裝備。在20分鐘之后測量濁度，但在該實施例中，以恒定速率將15ppm的過氧化氫添加至不同酶劑量的酶B)中；溫度為48℃；pH＝8.5，利用5mM的Hepes緩沖劑。結果列于下表9中。
表9

在另一實驗中，將0.5ppm酶B)的恒定酶劑量與不同用量的過氧化氫(0-1000ppm)相結合。結果列于下表10中。
表10

實施例6對LAS(直鏈烷基苯磺酸鹽)的耐性使用與實施例4相同的裝備。緩沖劑為5mM的Hepes，pH＝7；45℃；在20分鐘之后測量濁度。將兩種不同用量的LAS加入該實驗50和200ppm。結果列于下表11中。
表11

實施例7測量醋酸乙烯酯均聚物的水解度借助檢測釋放入溶液中的乙酸酯，可測量包含醋酸乙烯酯單體的聚合物的水解度(脫乙酰作用)?？蓹z測到低濃度的乙酸酯，并通過毛細管電泳分析進行定量。
在加熱的水浴上，于封閉的錐形燒瓶中，將40毫升5mM的Hepes緩沖劑(pH＝8)加熱至50℃。根據(jù)下表的用量，將酶計量加入緩沖劑中。然后，根據(jù)下表的用量，將于甲醇中的6％w/v的PVAc(Mw≈12800)注入緩沖劑中。18小時后取樣，并過濾通過0.22微米的過濾器。利用Agilent緩沖劑并使用Agilent毛細管(參見設備清單)，通過毛細管電泳檢測這些試樣的乙酸酯數(shù)量。
程序溫度30℃，電壓-30kV。用緩沖劑沖洗4分鐘。以50毫巴注入試樣，6秒鐘；以50毫巴注入緩沖劑，10秒鐘。洗脫20分鐘。檢測信號350/20納米。參考信號275/10納米。
0-450ppm乙酸酯的乙酸酯標準曲線是并行的。將乙酸酯峰積分，并相對于標準曲線確定試樣中的乙酸酯量。通過計算開始時燒瓶中醋酸乙烯酯單體的實際量，而確定PVAc的水解度。醋酸乙烯酯的Mw為86g/mol。
就注入1.5毫升PVAc溶液的實驗1-6而言，按如下進行計算 0.0015升×60克VAc/升÷86克/摩爾×0.0415升＝2.522×10-2摩爾/升結果列于下表12中。1％的水解度將產生2.522×10-4摩爾/升的乙酸酯濃度，其等于15.1毫克/升＝15.1ppm乙酸酯。對于實驗1-6，相對于對應于15.1ppm乙酸酯的1％的水解，計算水解度。對于實驗7-12，計算的結果給出了對應于29.2ppm乙酸酯的1％的水解。
表12

表中enzyme酶實施例8以不同的pH和溫度測量醋酸乙烯酯均聚物的水解度該實施例嚴格按照實施例7進行，所不同的是條件，即在35、45和55℃并且pH＝6(利用5mM的MES緩沖劑)或pH＝8(利用5mM的Hepes緩沖劑)。結果列于下表13中。
表13

*實驗錯誤，放棄結果表中enzyme酶實施例9防止PVAc聚集物在金屬上的沉積PVAc聚集物具有很高的沉積并粘附至不同表面上的趨勢，這樣的表面如用于例如成形毛毯、壓榨毛毯等的金屬和疏水材料的表面。在此描述的脂解酶當添加至包含PVAc的溶液中時，將阻止這些粘性物的形成(聚集物不粘附至玻璃表面上)。
將200毫升緩沖劑5mM的Hepes(pH＝8)加熱至45℃。將10ppm酶B)添加至一燒杯中。對不添加酶的燒杯作為酶空白進行平行試驗。通過玻璃涂覆的磁鐵進行攪拌。將金屬表面浸入該溶液中。將4毫升2％w/v的PVAc(Mw≈113000)甲醇溶液注入該溶液中。10分鐘之后停止實驗。
如圖1，附上了金屬表面的照片。左側的桿為添加了酶B的實驗，而右側的桿為沒有添加酶的對照實驗。左側桿的表面看來很干凈，同時PVAc溶液保持混濁狀態(tài)。相反，對照實驗(右側的桿)出現(xiàn)了粘附至金屬表面上的PVAc聚集物，并且周圍的溶液變得透明。
實施例10防止PVAc在金屬表面上的沉積在金屬表面上聚集物的沉積量能夠定量為在定義明確的表面上的質量吸附(mass uptake)。為此，可使用裝備有Wilhelmy板的張力儀。對張力儀進行操作，以測量將板整個緩慢地浸入PVAc溶液每一個2分鐘之后的重量增加。測量10分鐘之后的重量。
通過浸入乙醇中并在煤氣灶火焰(gas bumer flame)中無焰(glow)燃燒對Wilhelmy板進行凈化。
將干凈板置于張力儀電子天平上。在張力儀燒杯中，將200毫升緩沖劑--5mM的Hepes(pH＝8)加熱至希望的溫度(35℃或45℃)。添加酶。
注入2毫升2％w/v的PVAc(Mw≈113000)甲醇溶液。開始使Wilhelmy板上/下移動。10分鐘之后測量板的重量。低質量吸附表明防止了PVAc沉積。在35和45℃獲得的結果分別列于表13和14中。
表13

表14

實施例11脂解酶純度的測定利用得自PIERCE(與PIERCE cat.No.23225相同)的BCA蛋白測試盒(protein assay kit)，測定酶試樣的蛋白質濃度。Bicinchoninic Acid(BCA)的鈉鹽是穩(wěn)定的、水溶性化合物，它能夠在堿性環(huán)境中與亞銅離子(Cu1+)形成強紫色配合物。BCA試劑構成了能夠監(jiān)測蛋白質與堿性Cu2+反應(雙縮脲反應)中產生的亞銅離子的、BCA蛋白測試盒的基礎。由該反應產生的顏色是穩(wěn)定的，并且隨著蛋白質濃度成比例地增加(Smith，P.K.，et al.(1985)，分析生物化學，vol.150，pp.76-85)。BCA工作液通過將50份試劑A與1份試劑B混合而制備(試劑A是PIERCE cat.No.23223，包含在堿性碳酸鹽緩沖劑中的BCA和酒石酸；試劑B是PIERCE cat.No.23224，包含4％CuSO4*5H2O)。將300毫升試樣與3.0毫升BCA工作液混合。在37℃30分鐘之后，將試樣冷卻至室溫，并將A490讀作試樣中蛋白質濃度的量度。作為標準物，在所述測試中，將包括牛血清清蛋白的稀釋物(PIERCE cat.No.23209)。
如果脂解酶呈固態(tài)，首先，在5℃，將該產品溶解/懸浮在20體積的100mM H3BO3、10mM 3，3′-二甲基戊二酸、2mMCaCl2、pH6(緩沖劑A)中至少15分鐘；而如果在該階段的酶為懸浮液，那么，將該懸浮液過濾通過0.45微米的過濾器，以得到透明溶液。由此將溶液處理成液體脂解酶。
如果脂解酶是液體，那么，首先在6-8000Da cut-off SpectraPor滲析管(cat.no.132 670，得自Spectrum Medical Industries)中，相對100體積的緩沖劑A+150mM的NaCl(緩沖劑B)，在5℃滲析至少5小時，以除去可能引起高粘度的配方化學劑，后者對尺寸排阻色譜法是有害的。
如果在滲析期間形成沉淀物，那么使?jié)B析的脂解酶過濾通過0.45微米的過濾器。在滲析過的酶產品中蛋白質的濃度利用上述蛋白質濃度測試來確定，并用緩沖劑B稀釋該酶產品，從而給出準備用于尺寸排阻色譜法的試樣，其蛋白質濃度為5毫克/毫升。如果在滲析之后酶產品的蛋白質濃度低于5毫克/毫升，那么，照原樣使用之。
使300毫升HiLoad26/60 Superdex75pg柱(Amersham Pharmacia Biotech)在緩沖劑B中平衡(流量1毫升/分鐘)。將1.0毫升酶試樣應用于該柱，并用緩沖劑B對該柱進行洗脫(流量1毫升/分鐘)。從柱的出口收集2.0毫升餾分，直至試樣從該柱洗脫為止。就，分析所收集餾分的脂解活性。將在此所述的一次或更多次測試中具有活性的蛋白質峰定義為脂解酶峰。以峰中蛋白質量除以所有識別峰中總蛋白質量來計算脂解酶的純度。在特定的實施方案中，純度指的是峰中蛋白質量除以識別的脂解峰中蛋白質總量。
序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>脂解酶在粘性物控制中的應用<130>10142<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>194<212>PRT<213>Humicola insolens<400>1Gln Leu Gly Ala Ile Glu Asn Gly Leu Glu Ser Gly Ser Ala Asn Ala1 5 10 15Cys Pro Asp Ala Ile Leu Ile Phe Ala Arg Gly Ser Thr Glu Pro Gly20 25 30Asn Met Gly Ile Thr Val Gly Pro Ala Leu Ala Asn Gly Leu Glu Ser35 40 45His Ile Arg Asn Ile Trp Ile Gln Gly Val Gly Gly Pro Tyr Asp Ala50 55 60Ala Leu Ala Thr Asn Phe Leu Pro Arg Gly Thr Ser Gln Ala Asn Ile65 70 75 80Asp Glu Gly Lys Arg Leu Phe Ala Leu Ala Asn Gln Lys Cys Pro Asn85 90 95Thr Pro Val Val Ala Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Ala Leu Ile Ala100 105 110
Ala Ala Val Ser Glu Leu Ser Gly Ala Val Lys Glu Gln Val Lys Gly115 120 125Val Ala Leu Phe Gly Tyr Thr Gln Asn Leu Gln Asn Arg Gly Gly Ile130 135 140Pro Asn Tyr Pro Arg Glu Arg Thr Lys Val Phe Cys Asn Val Gly Asp145 150 155 160Ala Val Cys Thr Gly Thr Leu Ile Ile Thr Pro Ala His Leu Ser Tyr165 170 175Thr Ile Glu Ala Arg Gly Glu Ala Ala Arg Phe Leu Arg Asp Arg Ile180 185 190Arg Ala<210>2<211>199<212>PRT<213>Fusarium solani pisi<400>2Gly Arg Thr Thr Arg Asp Asp Leu Ile Asn Gly Asn Ser Ala Ser Cys1 5 10 15Ala Asp Val Ile Phe Ile Tyr Ala Arg Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn20 25 30Leu Gly Thr Leu Gly Pro Ser Ile Ala Ser Asn Leu Glu Ser Ala Phe35 40 45Gly Lys Asp Gly Val Trp Ile Gln Gly Val Gly Gly Ala Tyr Arg Ala50 55 60Thr Leu Gly Asp Asn Ala Leu Pro Arg Gly Thr Ser Ser Ala Ala Ile65 70 75 80
Arg Glu Met Leu Gly Leu Phe Gln Gln Ala Asn Thr Lys Cys Pro Asp85 90 95Ala Thr Leu Ile Ala Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Ala Leu Ala Ala100 105 110Ala Ser Ile Glu Asp Leu Asp Ser Ala Ile Arg Asp Lys Ile Ala Gly115 120 125Thr Val Leu Phe Gly Tyr Thr Lys Asn Leu Gln Asn Arg Gly Arg Ile130 135 140Pro Asn Tyr Pro Ala Asp Arg Thr Lys Val Phe Cys Asn Thr Gly Asp145 150 155 160Leu Val Cys Thr Gly Ser Leu Ile Val Ala Ala Pro His Leu Ala Tyr165 170 175Gly Pro Asp Ala Arg Gly Pro Ala Pro Glu Phe Leu Ile Glu Lys Val180 185 190Arg Ala Val Arg Gly Ser Ala195<210>3<211>317<212>PRT<213>Candida Antarctica<400>3Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu1 5 10 15Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys20 25 30Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe35 40 45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys50 55 60Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr65 70 75 80Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn85 90 95Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln100 105 110Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu115 120 125Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu130 135 140Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly145 150 155 160Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile165 170 175Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro180 185 190Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys195 200 205Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His210 215 220Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala225 230 235 240Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr245 250 255Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly275 280 285Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe290 295 300Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro305 310 權利要求
1.一種造紙方法，包括a)由包含回用紙的材料制備紙漿；b)用脂解酶對紙漿進行處理，所述酶能夠水解包含醋酸乙烯酯單體的聚合物；和c)由處理過的紙漿造紙。
2.權利要求1的方法，其中酶具有a)在45℃于分散的PVAc底物上18小時之后，通過毛細管電泳確定的水解度至少為0.1，其中分散的PVAc底物通過將1.5毫升于甲醇中6％的PVAc注入40毫升緩沖劑，pH6或8，中而制得，并且其中PVAc的分子量約為12800；和/或b)在由50mM的NaCl、0.5mM的KH2PO4、9％(v/v)甘油和0.1％(w/v)阿拉伯膠組成的乳液中，將5％(w/v)包含醋酸乙烯酯聚合物制劑作為底物，在35℃持續(xù)4分鐘的水解活性，其中所述聚合物是(i)PVAc均聚物制劑并且反應pH為8；(ii)醋酸乙烯酯乙烯共聚物制劑并且反應pH是7；和/或(iii)醋酸乙烯酯叔癸酸乙烯基酯共聚物制劑并且反應pH為7。
3.權利要求2的方法，其中在(i)條件下的水解活性大于0.2單位。
4.權利要求2的方法，其中酶的PVAc水解活性至少為0.7單位/毫升。
5.權利要求2的方法，其中在(ii)條件下的水解活性至少為0.2單位/毫升。
6.權利要求2的方法，其中在(iii)條件下的水解活性至少為0.2單位/毫升。
7.上述權利要求2-6任一項的方法，其中為了根據(jù)a)測定水解度以及為了根據(jù)步驟i)-iii)中的任一步測定水解活性，所述酶是定義明確的。
8.上述權利要求2-7任一項的方法，其中為了根據(jù)a)測定水解度以及為了根據(jù)步驟i)-iii)中的任一步測定水解活性，所述酶是脫鹽的。
9.上述權利要求2-8任一項的方法，其中為了根據(jù)步驟i)-iii)中的任一項確定水解活性，將A280＝0.15或50微克酶蛋白的200微升酶溶液添加至15毫升底物乳液中。
10.權利要求1-9任一項的方法，用于粘性物控制和/或用于脫墨。
11.權利要求1-10任一項的方法，其中用于造紙的酶劑量以每克包含醋酸乙烯酯單體的聚合物計為0.1至5000單位的PVAc水解活性。
12.權利要求1-11任一項的方法，其中每噸紙漿的酶劑量為(i)根據(jù)權利要求1的(i)，從約100至100000單位；或(ii)為約0.1至約100000毫克酶蛋白。
13.權利要求1-12任一項的方法，其中在LAS和/或過氧化氫存在下，酶是活性的和穩(wěn)定的。
14.權利要求1-13任一項的方法，另外還包括使用選自下列的至少一種另外的酶蛋白酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、脂肪酶、半纖維素酶、葡聚糖內切酶、角質蛋白酶和果膠酶。
15.權利要求1-14任一項的方法，另外還包括使用至少一種陰離子、非離子、陽離子性和/或兩性離子表面活性劑和/或分散劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及某些脂解酶如角質蛋白酶和脂肪酶在由再生紙張制造紙張和紙制品中的應用。上述酶的實例源自于腐質霉屬、念珠菌屬、鐮刀菌屬和假單胞菌屬的菌株。通過利用這些酶，減少了與來源于廢紙的所謂粘性物有關的問題。
文檔編號D21H21/00GK1639416SQ02810427
公開日2005年7月13日 申請日期2002年5月17日 優(yōu)先權日2001年5月21日
發(fā)明者金·博爾奇, 亨里克·倫德, 社領正樹, 坂口博脩, 漢尼·H·佩德森, 詹姆斯·W·菲茨亨里 申請人:諾維信公司