本發(fā)明涉及一種利用角質(zhì)酶處理造紙白水的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在世界范圍內(nèi)，造紙工業(yè)的廢水都是備受關(guān)注的污染源。在我國，造紙廢水污染已成為制約行業(yè)生存發(fā)展的關(guān)鍵因素。制漿造紙廢水主要包括黑液、中段水、造紙白水三大類。在制漿系統(tǒng)以清潔工藝如“堿性過氧化氫蒸漂一體化”等替代燒堿法傳統(tǒng)工藝后，制漿廢水排放量已經(jīng)較低(＜60m3/噸漿)，其污染負荷相當(dāng)于傳統(tǒng)工藝的50％左右，先進的制漿造紙系統(tǒng)僅排放蒸漂廢水和造紙白水。與蒸漂廢水相比，造紙白水主要含有細小纖維、雜細胞物、化學(xué)添加物(如膠料、填料、化學(xué)助劑等)，成分相對簡單，是造紙廢水中最具資源化可能性的一部分。
造紙白水的回用不僅可以節(jié)約清水的用量，減少纖維和化學(xué)品的流失，節(jié)省資源和降低成本，減少對環(huán)境污染也具有重要的意義。但隨著白水封閉循環(huán)程度的提高，白水中的有害物質(zhì)也會逐漸積累。在這些有害物質(zhì)中，對造紙濕部化學(xué)影響最大、最難處理的是白水中的溶解物質(zhì)和膠體物質(zhì)(DCS)。DCS一方面來源于可溶性木材抽出物(如小分子木素、淀粉、7帽類)、樹脂等天然物質(zhì)以及水和生產(chǎn)過程中添加的各種有機和無機添加劑及應(yīng)用的化學(xué)藥品。白水DCS中樹脂類物質(zhì)是一些溶于中性有機溶劑的憎水性物質(zhì)，這部分物質(zhì)在造紙過程中會以多種形式沉積在設(shè)備表面，造成停機和紙質(zhì)下降等問題。
針對此類問題的常用處理方法主要是利用陽離子聚合電解質(zhì)進行中和，這個過程不但需要消耗大量化學(xué)品，而且處理成本高，同時會增加造紙后續(xù)水處理難度，因此，開發(fā)一種反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好的造紙白水處理方法十分必要。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種環(huán)境友好、生產(chǎn)成本低、反應(yīng)過程簡單可控的角質(zhì)酶處理造紙白水的方法。處理后的白水可以滿足不同的回用要求，達到造紙白水零排放的目的。
本發(fā)明的第一個目的是提供一種降解造紙白水中樹脂類物質(zhì)的方法，所述方法是將角質(zhì)酶以0.5～8000U/g底物的添加量加入至含樹脂類物質(zhì)的溶液中，控制處理時間30-240min，pH為7-9進行酶解處理；所述樹脂類物質(zhì)包括三油酸甘油酯、木素脂肪酸酯、樹脂酸、聚醋酸乙烯酯。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述樹脂類物質(zhì)是三油酸甘油酯、木素脂肪酸酯、樹脂酸、聚醋酸乙烯酯中的一種或兩種以上的組合。
本發(fā)明的一種實施方式中，所述樹脂類物質(zhì)的濃度為4～400g/L。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述樹脂類物質(zhì)為濃度200～400g/L的三油酸甘油酯，處理時間30～60min，控制溫度40～60℃。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述樹脂類物質(zhì)為濃度5～2g/L的聚醋酸乙烯酯，處理時間120～180min，控制溫度30～50℃。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述樹脂類物質(zhì)為總濃度為5～20g/L的三油酸甘油酯、木素脂肪酸酯、樹脂酸、聚丙烯酸酯混合物，處理時間120～240min。
在本發(fā)明的一種實施方式中，聚醋酸乙烯酯的濃度為5～20g/L。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述造紙白水還含，細小纖維、填料、涂料和溶解了的木材成分,以及添加的膠料、濕強劑、防腐劑等外觀呈白色乳濁狀態(tài)，無味，不易沉降；
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述的角質(zhì)酶來自嗜熱單孢菌Thermobifidafusca或氨基酸序列與得自Thermobifidafusca的角質(zhì)酶至少有60％，特別是65％，更準確地說70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或92％，或95％，或97％，或至少99％的同源性且具有角質(zhì)酶活性的酶。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述的角質(zhì)酶也來自腐皮鐮刀菌Fusarium solani或氨基酸序列與得自Fusarium solani的角質(zhì)酶至少有60％，特別是65％，更準確地說70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或92％，或95％，或97％，或至少99％的同源性且具有角質(zhì)酶活性的酶。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述的角質(zhì)酶也來自特異腐質(zhì)霉Humicola Insolens或氨基酸序列與得自Humicola Insolens的角質(zhì)酶至少有60％，特別是65％，更準確地說70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或92％，或95％，或97％，或至少99％的同源性且具有角質(zhì)酶活性的酶。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述角質(zhì)酶是Genbank登錄號為AAZ54920、AAZ54921或AAA33334的角質(zhì)酶。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述角質(zhì)酶是PDB登錄號為4OYY的角質(zhì)酶。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述角質(zhì)酶的是由生產(chǎn)角質(zhì)酶的重組大腸桿菌發(fā)酵24-48h，經(jīng)過12000rpm，離心10min，去除菌體，收集上清得到的角質(zhì)酶粗酶液；所述重組大腸桿菌公開于Identification and Characterization ofBacterial Cutinase,The Journal of Biological Chemistry,2008,283(28)25854-25862。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述角質(zhì)酶的生產(chǎn)方法也為在一定培養(yǎng)條件下,以生產(chǎn)角質(zhì)酶的重組畢赤酵母發(fā)酵一定時間，經(jīng)過12000rpm，離心10min，去除菌體，上清即為粗酶液。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組畢赤酵母是pPIC9K為載體，表達Genbank登錄號為AAA33334或Protein data bank登錄號為4OYY的角質(zhì)酶的重組畢赤酵母。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組畢赤酵母是pPIC9K為載體，表達PDB登錄號為4OYY的角質(zhì)酶的重組畢赤酵母。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵是將所述重組畢赤酵母接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28～37℃發(fā)酵。
本發(fā)明的第二個目的是提供所述方法在工業(yè)廢水處理領(lǐng)域，尤其是造紙廢水處理方面的應(yīng)用。
有益效果：本發(fā)明的方法采用高效穩(wěn)定的酶催化分解三油酸甘油酯，聚醋酸乙烯酯等脂類，無需高溫加熱或劇烈攪拌，反應(yīng)條件溫和，降解率可達83.5％，環(huán)境友好。反應(yīng)所需的角質(zhì)酶生產(chǎn)簡單，提高了生產(chǎn)效率。同時，酶法處理相較其他物理處理，步驟簡單，在實際白水處理過程中，當(dāng)加酶量為0.5～1U/g底物時也具有較好的處理效果，濁度差達95％以上。在角質(zhì)酶處理過后的白水可以直接回用，部分或全部替代清洗用水，從而實現(xiàn)造紙系統(tǒng)用水的閉路循環(huán)，達到真正意義上的零排放。這些優(yōu)勢在環(huán)境保護日益受到重視的當(dāng)今社會，顯得尤為重要。
具體實施方式
角質(zhì)酶的酶活測定方法：
在37℃下，采用連續(xù)分光光度法測定酶活力。反應(yīng)總體積為1.5mL，包括30μL酶液和1470μL含50mmol/L硫磺脫氧膽酸鈉和50mmol/L對硝基苯丁酸酯(pNPB)的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，在波長405nm處，記錄對硝基酚的生成速率。酶活的定義為：在37℃，每分鐘將對硝基苯丁酸酯催化水解生成1μmol對硝基酚的酶量即為一個酶活力單位。
實施例1：Thermobifidafusca來源的角質(zhì)酶水解造紙白水樹脂沉積物(三油酸甘油酯)模型
秤取15mL三油酸甘油酯(0.915g/mL加入到pH8.0的Tris-HCl緩沖液85mL中，混合均勻后取10mL加入100U Thermobifidafusca來源角質(zhì)酶(Genbank登錄號：AAZ54920)，在60℃水浴中精確反應(yīng)30min后，取5mL反應(yīng)液加入5mL95％的乙醇終止反應(yīng)，然后利用0.05mol/L氫氧化鈉標準液在電位滴定儀上滴定至pH 10.3為終點。根據(jù)滴定消耗的氫氧化鈉標準液的體積來判斷角質(zhì)酶對三油酸甘油酯的分解情況。角質(zhì)酶可分解三油酸甘油酯，生成油酸，通過滴定，消耗氫氧化鈉用量越多，說明酶反應(yīng)越徹底。結(jié)果如表1所示，當(dāng)角質(zhì)酶添加量為72.86U/g底物反應(yīng)液時，在60℃反應(yīng)30min后，三油酸甘油酯降解率達83.5％。
表1 Thermobifidafusca來源的角質(zhì)酶水解三油酸甘油酯
實施例2：Fusarium solani來源的角質(zhì)酶水解造紙白水樹脂沉積物(三油酸甘油酯)模型
秤取15mL三油酸甘油酯加入到pH8.5的Tris-HCl緩沖液85mL中，混合均勻后取10mL加入1000U Fusarium solani來源角質(zhì)酶(Genbank登錄號：AAA33334)，在60℃水浴中精確反應(yīng)60min后，取5mL樣品加入5mL 95％的乙醇終止反應(yīng)，然后利用0.05mol/L氫氧化鈉標準液在電位滴定儀上滴定至pH10.3為終點。根據(jù)滴定消耗的氫氧化鈉標準液的體積來判斷角質(zhì)酶對三油酸甘油酯的分解情況。結(jié)果如表2所示，當(dāng)角質(zhì)酶添加量為728.6U/g底物的反應(yīng)液時，在40℃反應(yīng)60min后，三油酸甘油酯降解率達74.8％。
表2 Fusarium solani來源的角質(zhì)酶水解三油酸甘油酯
實施例3：Humicola Insolens來源的角質(zhì)酶水解造紙白水樹脂沉積物(三油酸甘油酯)模型
秤取15mL三油酸甘油酯加入到pH8.5的Tris-HCl緩沖液85mL中，混合均勻后取10mL加入200U Humicola Insolens來源角質(zhì)酶(RCSB Protein data bank登錄號：4OYY)，在40℃水浴中精確反應(yīng)60min后，取5mL樣品加入5mL 95％的乙醇終止反應(yīng)，然后利用0.05mol/L氫氧化鈉標準液在電位滴定儀上滴定至pH10.3為終點。根據(jù)滴定消耗的氫氧化鈉標準液的體積來判斷角質(zhì)酶對三油酸甘油酯的分解情況。結(jié)果如表2所示，當(dāng)角質(zhì)酶添加量為145.72U/g底物的反應(yīng)液時，在60℃反應(yīng)60min后，三油酸甘油酯降解率達83.5％。
表2 Humicola Insolens來源的角質(zhì)酶水解三油酸甘油酯
實施例4：Thermobifidafusca來源的角質(zhì)酶水解造紙白水樹脂沉積物(聚醋酸乙烯酯)模型
秤取1mL聚醋酸乙烯酯(約1g/mL)乳液加入到pH 8.0的Tris-HCl緩沖液99mL中，混合均勻后取10mL加入200U Thermobifidafusca來源的角質(zhì)酶(Genbank登錄號：AAZ54920)，在50℃水浴中精確反應(yīng)120min后，取5mL樣品加入5mL95％的乙醇終止反應(yīng)，然后利用0.05mol/L氫氧化鈉標準液在電位滴定儀上滴定至pH 10.3為終點。根據(jù)滴定消耗的氫氧化鈉標準液的體積來判斷角質(zhì)酶對聚醋酸乙烯酯的分解情況。結(jié)果如表3所示，當(dāng)角質(zhì)酶添加量為200U/g底物反應(yīng)液，在50℃反應(yīng)120min后，消耗5.0mL氫氧化鈉。
表3 Thermobifidafusca角質(zhì)酶水解聚醋酸乙烯酯
實施例5：Fusarium solani來源的角質(zhì)酶水解造紙白水樹脂沉積物(聚醋酸乙烯酯)模型
秤取1mL聚醋酸乙烯酯乳液加入到pH8.5的Tris-Hcl緩沖液99mL中，混合均勻后取10mL加入800U Fusarium solani來源角質(zhì)酶(Genbank登錄號：AAA33334)，在30℃水浴中精確反應(yīng)180min后，取5mL樣品加入5mL95％的乙醇終止反應(yīng)，然后利用0.05mol/L氫氧化鈉標準液在電位滴定儀上滴定至pH10.3為終點。根據(jù)滴定消耗的氫氧化鈉標準液的體積來判斷角質(zhì)酶對聚醋酸乙烯酯的分解情況。結(jié)果如表4所示。當(dāng)角質(zhì)酶添加量為8000U/g底物反應(yīng)液，在30℃反應(yīng)180min后，消耗4.1mL氫氧化鈉.
表4 Fusarium solani角質(zhì)酶水解聚醋酸乙烯酯
實施例6：Humicola Insolens來源的角質(zhì)酶水解造紙白水樹脂沉積物(聚醋酸乙烯酯)模型
秤取1mL聚醋酸乙烯酯(約1g/mL)乳液加入到pH 8.5的Tris-HCl緩沖液99mL中，混合均勻后取10mL加入400U Humicola Insolens來源的角質(zhì)酶(PDB登錄號：4OYY)，在60℃水浴中精確反應(yīng)120min后，取5mL樣品加入5mL95％的乙醇終止反應(yīng)，然后利用0.05mol/L氫氧化鈉標準液在電位滴定儀上滴定至pH 10.3為終點。根據(jù)滴定消耗的氫氧化鈉標準液的體積來判斷角質(zhì)酶對聚醋酸乙烯酯的分解情況。結(jié)果如表3所示，當(dāng)角質(zhì)酶添加量為4000U/g底物反應(yīng)液，在60℃反應(yīng)120min后，消耗4.6mL氫氧化鈉。
表3 Humicola Insolens角質(zhì)酶水解聚醋酸乙烯酯
實施例7：Thermobifidafusca來源的角質(zhì)酶水解造紙白水樹脂沉積物混合模型
秤取15mL三油酸甘油酯和1mL聚醋酸乙烯酯乳液加入到pH8.0的Tris-HCl緩沖液84mL中，混合均勻后取10mL加入200U Thermobifidafusca來源角質(zhì)酶(Genbank登錄號：AAZ54920)，在60℃水浴中精確反應(yīng)45min后，取5mL反應(yīng)液加入5mL95％的乙醇終止反應(yīng)，然后利用0.05mol/L氫氧化鈉標準液在電位滴定儀上滴定至pH 10.3為終點。根據(jù)滴定消耗的氫氧化鈉標準液的體積來判斷角質(zhì)酶對混合模型的分解情況。結(jié)果如表5所示，當(dāng)角質(zhì)酶添加量為84U/g底物時，在60℃反應(yīng)45min后，混合模型降解率達76.8％。
表5 Thermobifidafusca來源的角質(zhì)酶水解混合模型
實施例8：Fusarium solani來源的角質(zhì)酶水解造紙白水樹脂沉積物混合模型
秤取15mL三油酸甘油酯和1mL聚醋酸乙烯酯乳液加入到pH8.5的Tris-HCl緩沖液84mL中，混合均勻后取10mL加入500U Fusarium solani來源角質(zhì)酶(Genbank登錄號：AAZ54920)，在35℃水浴中精確反應(yīng)60min后，取5mL反應(yīng)液加入5mL95％的乙醇終止反應(yīng)，然后利用0.05mol/L氫氧化鈉標準液在電位滴定儀上滴定至pH 10.3為終點。根據(jù)滴定消耗的氫氧化鈉標準液的體積來判斷角質(zhì)酶對混合模型的分解情況。結(jié)果如表5所示，當(dāng)角質(zhì)酶添加量為
210.75U/g時，在35℃反應(yīng)60min后，混合模型降解率達66.8％。
表5Thermobifidafusca來源的角質(zhì)酶水解混合模型
實施例9：Humicola Insolens來源的角質(zhì)酶水解造紙白水樹脂沉積物混合模型
秤取15mL三油酸甘油酯和1mL聚醋酸乙烯酯乳液加入到pH8.5的Tris-HCl緩沖液84mL中，混合均勻后取10mL加入300U Humicola Insolens來源角質(zhì)酶(PDB登錄號：4OYY)，在60℃水浴中精確反應(yīng)60min后，取5mL反應(yīng)液加入5mL95％的乙醇終止反應(yīng)，然后利用0.05mol/L氫氧化鈉標準液在電位滴定儀上滴定至pH 10.3為終點。根據(jù)滴定消耗的氫氧化鈉標準液的體積來判斷角質(zhì)酶對混合模型的分解情況。結(jié)果如表5所示，當(dāng)角質(zhì)酶添加量為126.05U/g時，在35℃反應(yīng)60min后，混合模型降解率達73.5％。
表5 Thermobifidafusca來源的角質(zhì)酶水解混合模型
實施例10：Thermobifidafusca來源的角質(zhì)酶處理某紙廠二級循環(huán)剩余白水
1、處理水量與水質(zhì)：
處理水量：1000m3
進水水質(zhì)：COD 50～200mg/L、pH 7.0、濁度200～1000NTU，其中三油酸甘油酯、木素脂肪酸酯、樹脂酸、聚丙烯酸酯的總濃度范圍約10～20g/L。
2、處理過程：
調(diào)節(jié)白水pH至8.5±0.2，加入Thermobifidafusca來源的角質(zhì)酶(Genbank登錄號：AAZ54921)10000U(加酶量約0.5～1U/g)，在室溫(16～25℃)下處理3小時。
測定處理后水質(zhì)，結(jié)果如表5所示，白水濁度由245減低至12NTU，濁度差達95.1％。
表5 Thermobifida fusca角質(zhì)酶水解剩余白水
實施例11：Fusarium solani來源的角質(zhì)酶處理某紙廠二級循環(huán)剩余白水
1、處理水量與水質(zhì)：
處理水量：1500m3
進水水質(zhì)：COD 50～400mg/L、pH 7.0、濁度200～1000NTU。
2、處理過程：
調(diào)節(jié)白水pH至8.0±0.2，加入Fusarium solani來源的角質(zhì)酶(Genbank登錄號：AAA33334)80000U(加酶量約2.67～5.33U/g)，在室溫(16～25℃)下處理4小時。
測定處理后水質(zhì)，結(jié)果如表6所示，白水濁度由592減低至42NTU，濁度差達92.9％。
表6 Fusarium solani來源的角質(zhì)酶水解剩余白水
實施例12：Humicola Insolens來源的角質(zhì)酶處理某紙廠二級循環(huán)剩余白水
1、處理水量與水質(zhì)：
處理水量：1500m3
進水水質(zhì)：COD 50～400mg/L、pH 7.0、濁度200～1000NTU。
2、處理過程：
調(diào)節(jié)白水pH至8.0±0.2，加入HumicolaInsolens來源的角質(zhì)酶(PDB登錄號：4OYY)50000U(加酶量約2.5～5U/g)，在室溫(16～25℃)下處理4小時。
測定處理后水質(zhì)，結(jié)果如表6所示，白水濁度由332減低至29NTU，濁度差達91.6％。
表6 Humicola Insolens來源的角質(zhì)酶水解剩余白水
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。