本發(fā)明涉及甲殼素納米纖維制備領(lǐng)域，屬于天然高分子領(lǐng)域，也屬于化學(xué)、化工、農(nóng)業(yè)、環(huán)境工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

甲殼素是僅次于纖維素的第二大天然生物高分子，其分子鏈中含有大量乙酰氨基和少量氨基，結(jié)構(gòu)如圖1所示，所以也是一種可再生的天然含氮高分子。自然界中存在著大量的α型和β型的甲殼素，其不同點(diǎn)主要在于α-甲殼素的晶型結(jié)構(gòu)是由反向平行的分子鏈構(gòu)成，所以存在著強(qiáng)的分子間和分子內(nèi)氫鍵作用力。而β-甲殼素的晶型結(jié)構(gòu)是由平行的分子鏈構(gòu)成，相對(duì)于α-甲殼素具有較弱的分子間作用力，所以β-甲殼素更容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。天然α-甲殼素與大量的蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)共存，主要存在于生物體的硬殼中，如蟹殼和蝦殼。而天然β-甲殼素與大量的蛋白質(zhì)和少量的礦物質(zhì)共存，主要存在于生物體的軟骨中，如魷魚(yú)骨和管蟲(chóng)。魷魚(yú)骨是一種漁業(yè)廢棄物，其中含有30wt％以上的β-甲殼素，其N-乙?；潭葹閤＝0.90，是一種可再生的生物資源。甲殼素主要來(lái)源于生物體，所以有較好的生物相容性、生物可降解性、無(wú)毒性、抗菌性、低的抗免疫性等性能。其納米纖維，除了具有甲殼素自身的優(yōu)點(diǎn)外，還具有納米材料高長(zhǎng)徑比、高比表面積等的特點(diǎn)。因而甲殼素納米纖維在生物組織、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域都有很大的應(yīng)用前景。

從魷魚(yú)骨中制備β-甲殼素納米纖維最常用的方法是先用堿溶液和酸溶液對(duì)魷魚(yú)骨進(jìn)行純化，除去蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，得到純化后的β-甲殼素，后用醋酸調(diào)pH在3-4，對(duì)氨基進(jìn)行質(zhì)子化，通過(guò)超聲處理得到高粘度和透明的β-甲殼素納米纖維，直徑在3-4納米，長(zhǎng)度在微米級(jí)，具有較高的長(zhǎng)徑比(Yimin Fan,et al.Biomacromolecules,2008,9,1919-1923.)。該制備方法主要是通過(guò)氨基質(zhì)子化，使纖維間存在靜電相互作用，超聲提供一個(gè)機(jī)械力使纖維間相互分離而得到近乎單根的長(zhǎng)纖維。但是，在制備過(guò)程中需要對(duì)魷魚(yú)骨進(jìn)行純化預(yù)處理，步驟較為繁瑣。

溶解也是一種較為常用的、以自下而上的方式來(lái)制備納米纖維的方法(Chao Zhong,et al.Soft Matter,2010,6,5298-5301.)。β-甲殼素溶解在六氟異丙醇中，濃度為0.001wt％-0.05wt％，然后置于硅晶片或玻璃片上，使溶劑自然蒸發(fā)，再用大量水洗滌，能夠得到直徑為3納米的納米纖維，當(dāng)甲殼素濃度大于0.125wt％時(shí)，纖維會(huì)發(fā)生聚合；將0.5克氯化鋰溶解在10毫升二甲基乙酰胺中，將不同濃度的β-甲殼素溶液加入LiCl/DMAC溶劑中，然后滴在硅晶片或玻璃片上，再分別加入去離子水和乙醇，使纖維素再生，當(dāng)甲殼素的濃度低于0.01wt％能夠得到直徑在3納米,長(zhǎng)度在50-100納米的短纖維，當(dāng)濃度高于0.02wt％時(shí)，能夠得到長(zhǎng)纖維，當(dāng)濃度高于0.2wt％時(shí)，纖維會(huì)發(fā)生合并，得到直徑為10納米的長(zhǎng)纖維。用以上二種溶劑制備得到的納米纖維有很好的細(xì)胞相容性，但是溶解所使用的溶劑具有一定的毒性。

TEMPO氧化法能夠制備出帶羧基的β-甲殼素納米纖維(YiminFan,et al.Carbohydrate Polymers,2009,3,832-838.)，該方法是用TEMPO/NaBr/NaClO氧化體系對(duì)甲殼素中的C6位羥甲基進(jìn)行選擇性氧化，然后通過(guò)機(jī)械處理的方式制備出甲殼素納米纖維。但就目前報(bào)道來(lái)說(shuō)，該方法只能是以管蟲(chóng)為原料才能夠制備出帶羧基的β-甲殼素納米纖維。當(dāng)以從管蟲(chóng)中純化后的甲殼素為原料時(shí)，通過(guò)TEMPO氧化，使其羧基含量在0.18-0.25mmol/g后，再加以超聲處理，就能夠成功制備出具有一定粘度和透明度的納米纖維分散液。大部分的纖維直徑在20-50納米范圍內(nèi),長(zhǎng)度為幾個(gè)微米。而用從魷魚(yú)骨中純化后的甲殼素再進(jìn)行TEMPO氧化后不能制備出納米纖維。原因可能是在氧化過(guò)程中會(huì)形成一部分的醛基，而醛基容易與羥基發(fā)生半縮醛反應(yīng)，而無(wú)法制備出納米纖維。另外一個(gè)原因可能是生成的羧基也會(huì)和原本存在的氨基發(fā)生反應(yīng)，而無(wú)法制備出納米纖維。而管蟲(chóng)中的β-甲殼素的乙?；潭群芨?x＝0.99)，本身存在的氨基很少，所以相對(duì)能夠得到納米纖維。所以，以魷魚(yú)骨為原料來(lái)制備帶羧基的甲殼素納米纖維仍是一大挑戰(zhàn)，具有非常重要的實(shí)際意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目在于提供一種制備羧基化甲殼素納米纖維的方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過(guò)調(diào)節(jié)過(guò)硫酸銨濃度來(lái)調(diào)控甲殼素納米纖維晶型的方法。

本發(fā)明提供了一種羧基化甲殼素納米纖維的制備方法。不同于以往需要先對(duì)魷魚(yú)骨進(jìn)行純化得到甲殼素，然后再制備納米纖維的復(fù)雜方法。本發(fā)明所用的方法是直接以魷魚(yú)骨為原料，無(wú)需純化，加入不同濃度的過(guò)硫酸銨進(jìn)行處理并以機(jī)械處理(超聲)輔助，就能夠制備出不同晶型的羧基化甲殼素納米纖維。魷魚(yú)骨甲殼素的乙?；癁?.90，所以本身具有一部分的氨基，使用過(guò)硫酸銨處理時(shí)，給予了一個(gè)酸性的條件，使氨基質(zhì)子化，過(guò)硫酸銨在40-70℃加熱下，更容易對(duì)魷魚(yú)骨進(jìn)行氧化作用，除去蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)同時(shí)使甲殼素C6位上的羥基氧化成羧基，得到羧基化的甲殼素。當(dāng)羧基化后，加入堿，使羧基電離，產(chǎn)生靜電相互作用后，再加以超聲輔助得到半透明的甲殼素納米纖維水分散液。而β-甲殼素在高濃度的過(guò)硫酸銨強(qiáng)氧化作用下，會(huì)使晶型發(fā)生轉(zhuǎn)變，β晶型向穩(wěn)定的α晶型發(fā)生轉(zhuǎn)變，所以能夠通過(guò)控制過(guò)硫酸銨的濃度得到不同晶型的羧基化甲殼素納米纖維。

本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種魷魚(yú)骨納米纖維的制備方法，其特征在于制備所得的納米纖維直徑在3-5納米，長(zhǎng)度在微米級(jí)別，具有較高的長(zhǎng)徑比，所得納米纖維的水分散液為半透明。

一種魷魚(yú)骨納米纖維的制備方法，其特征在于將魷魚(yú)骨直接加到過(guò)硫酸銨中，其中改變過(guò)硫酸銨的濃度，然后于40-70℃加熱攪拌12-72小時(shí)，得到甲殼素絮狀反應(yīng)物，洗滌中性后，配制濃度為0.1wt％-0.2wt％，滴入堿調(diào)節(jié)pH9-10后，300-1000W下超聲5-15分鐘后便能得到半透明的甲殼素納米纖維穩(wěn)定分散液。

如上所述魷魚(yú)骨納米纖維的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

(1)配制濃度為10wt％-50wt％的過(guò)硫酸銨溶液。

(2)將魷魚(yú)骨加入到過(guò)硫酸銨溶液中，魷魚(yú)骨和過(guò)硫酸銨的質(zhì)量比是1：5～1：50。

(3)將步驟(2)中的混合液置于40-70℃加熱攪拌反應(yīng)一段時(shí)間，直到反應(yīng)物呈現(xiàn)絮狀物時(shí)，即為反應(yīng)結(jié)束，一般需要12-72小時(shí)。

(4)將步驟(3)中的反應(yīng)物用去離子水洗滌至中性，滴入堿調(diào)節(jié)pH9-10。

(5)將步驟(4)的反應(yīng)物于細(xì)胞破碎儀中冰水浴中300-1000w超聲5-15分鐘，得到半透明的甲殼素納米纖維水分散液。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，其特征在于直接使用魷魚(yú)骨為原料，無(wú)需除蛋白質(zhì)和除礦物質(zhì)的步驟，在過(guò)硫酸銨反應(yīng)過(guò)程中就能夠達(dá)到純化目的，反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)單，易于操作，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，其特征在于調(diào)節(jié)處理時(shí)過(guò)硫酸銨的濃度，能夠制備出不同晶型的甲殼素納米纖維。設(shè)過(guò)硫酸銨的質(zhì)量百分濃度為x：當(dāng)10wt％≤x＜20wt％的過(guò)硫酸銨處理時(shí)，能夠制備出β晶型的羧基化甲殼素納米纖維；當(dāng)20wt％≤x≤30wt％的過(guò)硫酸銨處理時(shí)，能夠制備出α和β晶型都存在的羧基化甲殼素納米纖維；當(dāng)30wt％＜x≤50wt％的過(guò)硫酸銨處理時(shí)，魷魚(yú)骨能夠制備出α晶型的羧基化甲殼素納米纖維。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，其特征在于制備出的羧基甲殼素納米纖維的直徑在3-5納米，長(zhǎng)度在微米級(jí)，其在水中的分散液為半透明。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，其特征在于能夠在300-1000W的功率下超聲，只需調(diào)控超聲的時(shí)間，就能夠制備出穩(wěn)定的甲殼素納米纖維。

[有益效果]

本發(fā)明由于采取上述技術(shù)方案，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明使用的原料是漁業(yè)廢料魷魚(yú)骨，能起到變廢為寶的作用，魷魚(yú)骨作為一種天然的可再生的生物資源，符合可持續(xù)發(fā)展的要求，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.本發(fā)明直接使用過(guò)硫酸銨對(duì)魷魚(yú)骨進(jìn)行處理，一步法便能得到甲殼素，再外加機(jī)械處理就能夠得到甲殼素納米纖維，過(guò)程簡(jiǎn)單，綠色環(huán)保。

3.本發(fā)明制備出來(lái)的帶羧基的甲殼素納米纖維的直徑在3-5納米，長(zhǎng)度在微米級(jí)，具有高的長(zhǎng)徑比，能達(dá)到350。

4.本發(fā)明能夠通過(guò)控制過(guò)硫酸銨濃度來(lái)調(diào)控甲殼素的晶型，設(shè)過(guò)硫酸銨的質(zhì)量百分比濃度為x：當(dāng)10wt％≤x＜20wt％的過(guò)硫酸銨處理時(shí)，能夠制備出β晶型的羧基化甲殼素納米纖維；當(dāng)20wt％≤x≤30wt％的過(guò)硫酸銨處理時(shí)，能夠制備出α和β晶型都存在的羧基化甲殼素納米纖維；當(dāng)30wt％＜x≤50wt％的過(guò)硫酸銨處理時(shí)，魷魚(yú)骨能夠制備出α晶型的羧基化甲殼素納米纖維。

5.本發(fā)明得到的羧基化甲殼素納米纖維水分散液為半透明。

6.本發(fā)明得到的羧基化甲殼素納米纖維水分散液，有利于表面功能化改性，具有高的長(zhǎng)徑比，能達(dá)到350，因而制備出的水凝膠和氣凝膠在吸附金屬離子水處理方面具有更好的效果。

7.本發(fā)明得到的羧基化甲殼素納米纖維經(jīng)過(guò)表面功能化后與樹(shù)脂等聚合物材料復(fù)合時(shí)，在聚合物材料中顯示具有優(yōu)良的分散性。在復(fù)合材料中，高長(zhǎng)徑比的甲殼素納米纖維起到增強(qiáng)效果，能顯著改善復(fù)合材料的力學(xué)性能。

8.本發(fā)明得到的羧基化甲殼素納米纖維水分散液，在生物醫(yī)藥業(yè)和組織工程上具有大的應(yīng)用前景。

【附圖說(shuō)明】

圖1為甲殼素結(jié)構(gòu)示意圖(x>0.50)；

圖2為不同濃度的過(guò)硫酸銨處理后的甲殼素納米纖維的紅外圖。(A)、(B)、(C)過(guò)硫酸銨濃度依次為10wt％、25wt％、50wt％；

圖3為不同濃度的過(guò)硫酸銨處理后的甲殼素納米纖維的XRD圖。(A)、(B)、(C)過(guò)硫酸銨濃度依次為10wt％、25wt％、50wt％；

圖4為不同濃度的過(guò)硫酸銨處理后的甲殼素納米纖維的透射圖。(A)、(B)、(C)過(guò)硫酸銨濃度依次為10wt％、25wt％、50wt％。

【具體實(shí)施方式】

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述，應(yīng)理解的是，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

1克魷魚(yú)骨加入到100毫升濃度為10wt％的過(guò)硫酸銨溶液中，40℃攪拌加熱反應(yīng)72小時(shí)后，得到甲殼素絮狀反應(yīng)物，洗滌至中性，配制濃度為0.1wt％水分散液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4wt％的氫氧化鈉調(diào)pH為9，300W超聲15分鐘，得到半透明的帶羧基的β晶型甲殼素納米纖維水分散液。

實(shí)施例2

1克魷魚(yú)骨加入到100毫升濃度為25wt％的過(guò)硫酸銨溶液中，60℃攪拌加熱反應(yīng)48小時(shí)后，得到甲殼素絮狀反應(yīng)物，洗滌至中性，配制濃度為0.1wt％水分散液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4wt％的氫氧化鈉調(diào)pH為9，800W超聲5分鐘，得到半透明的帶羧基的α和β晶型同時(shí)存在的甲殼素納米纖維水分散液。

實(shí)施例3

2克魷魚(yú)骨加入到200毫升濃度為50wt％的過(guò)硫酸銨溶液中，70℃攪拌加熱反應(yīng)12小時(shí)后，得到甲殼素絮狀反應(yīng)物，洗滌至中性，配制濃度為0.2wt％水分散液，用濃度為4wt％的氫氧化鈉調(diào)pH為9，1000W超聲5分鐘，得到半透明的帶羧基的α晶型甲殼素納米纖維水分散液。

實(shí)施例4

1克魷魚(yú)骨加入到100毫升濃度為20wt％的過(guò)硫酸銨溶液中，50℃攪拌加熱反應(yīng)72小時(shí)后，得到甲殼素絮狀反應(yīng)物，洗滌至中性，配制濃度為0.2wt％水分散液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4wt％的氫氧化鈉調(diào)pH為10，500W超聲15分鐘，得到半透明的α和β晶型同時(shí)存在的羧基化甲殼素納米纖維水分散液，得到的甲殼素纖維的直徑在3-5納米，長(zhǎng)度在微米級(jí)，長(zhǎng)徑比在300-350范圍內(nèi)。

實(shí)施例5

3克魷魚(yú)骨加入到300毫升濃度為30wt％的過(guò)硫酸銨溶液中，70℃攪拌加熱反應(yīng)24小時(shí)后，得到甲殼素絮狀反應(yīng)物，洗滌至中性，配制濃度為0.15wt％水分散液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4wt％的氫氧化鈉調(diào)pH為9，1000W超聲5分鐘，得到半透明的α和β晶型同時(shí)存在的羧基化甲殼素納米纖維水分散，得到的甲殼素纖維的直徑在3-5納米，長(zhǎng)度在微米級(jí)，長(zhǎng)徑比在300-350范圍內(nèi)。

實(shí)施例6

將上述實(shí)例1、2和3中得到的產(chǎn)物，使用常壓干燥成膜，再用紅外光譜分析，如圖2所示。研究發(fā)現(xiàn)，三者的紅外放大圖在波長(zhǎng)為1735cm^-1處都有明顯的特征峰，該峰對(duì)應(yīng)的是羧酸基團(tuán)；圖2A對(duì)應(yīng)的實(shí)施例1中，波長(zhǎng)在1653cm^-1處只有一個(gè)峰，只存在分子內(nèi)氫鍵，證明是β晶型；圖2B對(duì)應(yīng)的實(shí)施例2中，波長(zhǎng)在1656cm^-1和1632cm^-1處有兩個(gè)明顯的峰，存在分子間和分子內(nèi)氫鍵，但兩個(gè)峰的峰強(qiáng)有很大的差異，證明是同時(shí)具有α晶型和β晶型；圖2C對(duì)應(yīng)的實(shí)施例3中，波長(zhǎng)在1653cm^-1和1631cm^-1處有兩個(gè)明顯的峰，存在分子間和分子內(nèi)氫鍵，證明是α晶型。

實(shí)施例7

將上述實(shí)例1、2和3中得到的產(chǎn)物，使用真空抽濾成膜，再用XRD分析，如圖3所示。研究發(fā)現(xiàn)，圖3A對(duì)應(yīng)的實(shí)施例1中在2θ為8.56°和20.00°上有明顯的出峰，進(jìn)一步說(shuō)明是β晶型；圖3B對(duì)應(yīng)的實(shí)施例2中在2θ為8.02°、19.03°和23.14°上有出峰，但在23.14°上的出峰不明顯，進(jìn)一步說(shuō)明是具有α晶型和β晶型；圖3C對(duì)應(yīng)的實(shí)施例3中在2θ為8.86°、19.50°和23.64°上有明顯的出峰，進(jìn)一步說(shuō)明是α晶型。

實(shí)施例8

將上述實(shí)例1、2和3中得到的產(chǎn)物，分別稀釋至濃度為0.1wt％，使用磷鎢酸鈉染色制樣，用透射電鏡分析，如圖4所示。都能得到直徑在3-5納米，長(zhǎng)度在微米級(jí)的長(zhǎng)纖維。

對(duì)比例1

1克魷魚(yú)骨加入到100毫升濃度為10wt％的過(guò)硫酸銨溶液中，40℃攪拌加熱反應(yīng)48小時(shí)后，得到甲殼素絮狀反應(yīng)物，洗滌至中性，配制濃度為0.1wt％水分散液，用0.1wt％醋酸調(diào)pH至3，800W超聲3分鐘，分散液發(fā)生絮凝，無(wú)法得到甲殼素納米纖維。

對(duì)比例2

1克魷魚(yú)骨加入到100毫升濃度為20wt％的過(guò)硫酸銨溶液中，80℃攪拌加熱反應(yīng)24小時(shí)后，溶液發(fā)黃，反應(yīng)過(guò)程中可能發(fā)生了降解，所以該溫度下無(wú)法進(jìn)行反應(yīng)。

對(duì)比例3

1克魷魚(yú)骨加入到100毫升濃度為10wt％的過(guò)硫酸銨溶液中，60℃攪拌加熱反應(yīng)48小時(shí)后，得到甲殼素絮狀反應(yīng)物，洗滌至中性，配制濃度為0.2wt％的水分散液，用濃度為4wt％的氫氧化鈉調(diào)pH9，100W超聲30分鐘，無(wú)法得到甲殼素納米纖維。

對(duì)比例4

1克魷魚(yú)骨加入到100毫升濃度為9wt％的過(guò)硫酸銨溶液中，60℃攪拌加熱反應(yīng)72小時(shí)后，洗滌至中性，配制濃度為0.2wt％的水分散液，用濃度為4wt％的氫氧化鈉調(diào)pH10，500W超聲10分鐘，無(wú)法得到甲殼素納米纖維。