一種用釀酒酵母工程菌聯(lián)合降解植物的木質(zhì)素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及構(gòu)建和應(yīng)用微生物工程菌的方法。具體是應(yīng)用微 生物工程菌降解植物原料的木質(zhì)素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 猛過氧化物酶（ManganesePeroxidase,MnP)、木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin Peroxidase,LiP)和漆酶（Laccase)具有共同降解木質(zhì)素的作用。
[0003] 植物資源不斷再生，十分豐富。植物的基本成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。其 中在制造沼氣和乙醇業(yè)中有用的成分是纖維素，次之是半纖維素。前者由葡萄糖構(gòu)成，而后 者由戊糖構(gòu)成。這些糖都是轉(zhuǎn)化為乙醇和沼氣的物質(zhì)。但是纖維素分子之間被木質(zhì)素鑲嵌， 被鑲嵌著的纖維素不能被水解。木質(zhì)素是廣泛存在于植物體中的無定形的、分子結(jié)構(gòu)中含 有氧代苯丙醇或其衍生物結(jié)構(gòu)單元的芳香性高聚物，形成纖維支架，結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定。欲利用 纖維素則必須先降解木質(zhì)素。當(dāng)前用于降解木質(zhì)素的方法有物理、化學(xué)和生物的方法。物 理法主要是機(jī)械粉碎法、高溫?zé)峤忸A(yù)處理以及輻射預(yù)處理等，但是物理法耗能大，并且需要 特殊設(shè)備；化學(xué)法主要是酸或堿處理的方法?；瘜W(xué)處理法具有工藝簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但是處理后 的纖維素和半纖維素?fù)p失大，并且產(chǎn)生大量的酸堿廢氣物污染環(huán)境。與化學(xué)法和物理法相 t匕，當(dāng)前應(yīng)用的生物法主要是應(yīng)用天然的表達(dá)分泌降解木質(zhì)素的酶的白腐真菌與植物原料 作用而降解植物原料中的木質(zhì)素。應(yīng)用白腐真菌降解植物的木質(zhì)素的優(yōu)勢(shì)在于，白腐真菌 具有完整的降解木質(zhì)素的酶系（錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶），其不足之處是 白腐真菌所含的錳過氧化物酶基因、木質(zhì)素過氧化物酶基因和漆酶基因只是單拷貝，表達(dá) 的酶的產(chǎn)量少，并且，白腐真菌生長(zhǎng)緩慢，降解木質(zhì)素的周期長(zhǎng)。
[0004] 釀酒酵母（saccharomycescerevisiae)是常用于生產(chǎn)重組蛋白的微生物。釀酒 酵母營養(yǎng)要求低，能將表達(dá)的蛋白分泌到胞外，并且它具有組成型強(qiáng)啟動(dòng)子：三磷酸甘油醛 脫氫酶啟動(dòng)子（PGAP)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明構(gòu)建含錳過氧化物酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌、含木質(zhì)素過氧化物 酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌；用含錳過氧 化物酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌、含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工 程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌與植物原料作用，通過工程菌分泌錳過氧化 物酶、木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶而降解植物原料的木質(zhì)素。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0007] 1.克隆基因：用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)或PCR技術(shù)從含錳過氧化物酶基因的微生物、含 木質(zhì)素過氧化物酶的微生物和含漆酶基因的微生物中分別克隆錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧 化物酶和漆酶基因。
[0008] 2.通過PCR擴(kuò)增或DNA序列合成獲得構(gòu)建表達(dá)載體所需的啟動(dòng)子、信號(hào)肽、轉(zhuǎn)錄終 止子和抗性基因表達(dá)框架的DNA序列。
[0009] 3.分別構(gòu)建含錳過氧化物酶基因表達(dá)框架（釀酒酵母的磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng) 子的DNA序列-信號(hào)肽的DNA序列-錳過氧化物酶基因的DNA序列-轉(zhuǎn)錄終止子的DNA序 列）的釀酒酵母表達(dá)載體、含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架（釀酒酵母的三磷酸甘油醛 脫氫酶啟動(dòng)子的DNA序列-信號(hào)肽的DNA序列-木質(zhì)素過氧化物酶基因的DNA序列-轉(zhuǎn)錄 終止子的DNA序列）的釀酒酵母表達(dá)載體和含漆酶基因表達(dá)框架（釀酒酵母的磷酸甘油醛 脫氫酶啟動(dòng)子的DNA序列-信號(hào)肽的DNA序列-漆酶基因的DNA序列-轉(zhuǎn)錄終止子的DNA 序列）的釀酒酵母表達(dá)載體。以上所構(gòu)建的表達(dá)載體除了含有基因表達(dá)框架之外，還有大 腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)、G418基因表達(dá)框架和氨芐青霉素基因表達(dá)框架。
[0010] 3.通過電轉(zhuǎn)化方法將以上構(gòu)建的3種釀酒酵母表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母。根據(jù) G418抗性，篩選高拷貝重組了錳過氧化物酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母重組子作為含錳過氧 化物酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌；篩選高拷貝重組了含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá) 框架的釀酒酵母重組子作為含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌；篩選高 拷貝重組了漆酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母重組子作為含漆酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工 程菌。
[0011] 4.將以上構(gòu)建的含錳過氧化物酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌、含木質(zhì)素過氧 化物酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌進(jìn)行混 合而作為降解植物的木質(zhì)素的釀酒酵母工程菌的混合菌。
[0012] 5.將以上所述的含錳過氧化物酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌、含木質(zhì)素過氧 化物酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌的混合 菌與植物原料作用，通過工程菌分泌錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶而聯(lián)合降解 植物的木質(zhì)素。
[0013] 本發(fā)明構(gòu)建含錳過氧化物酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌、含木質(zhì)素過氧化物 酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌和含漆酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌，并將這三種 釀酒酵母工程菌進(jìn)行混合應(yīng)用，將這種混合菌與植物原料作用，聯(lián)合降解植物的木質(zhì)素的 優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于：
[0014] 由于工程菌的構(gòu)建選擇了強(qiáng)的啟動(dòng)子調(diào)控基因，生產(chǎn)性能好的微生物作為工程菌 構(gòu)建的對(duì)象，并且選擇高拷貝的重組子作為工程菌，所以，本發(fā)明構(gòu)建的含錳過氧化物酶基 因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌、含木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌和含 漆酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母工程菌的混合菌不僅具備釀酒酵母本身的營養(yǎng)要求低、生長(zhǎng) 繁殖迅速等特點(diǎn)，還具備工程菌的良好表達(dá)分泌降解木質(zhì)素的酶系（錳過氧化物酶、木質(zhì) 素過氧化物酶和漆酶）的功能，這三種工程菌的混合應(yīng)用對(duì)植物的木質(zhì)素的降解作用強(qiáng)于 當(dāng)前應(yīng)用于降解植物的木質(zhì)素的天然的表達(dá)分泌木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶 的天然的微生物。
【附圖說明】
[0015] 附圖1?釀酒酵母表達(dá)載體1。
[0016]Pgap.釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S.釀酒酵母交配因子a的信號(hào) 肽（MFa的信號(hào)肽）；mnp.錳過氧化物酶基因；TT.轉(zhuǎn)錄終止子；G418.G418基因表達(dá)框架； ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨芐青霉素基因表達(dá)框架；3'GAP.釀酒酵母的三磷酸甘油 醛脫氫酶基因的3'末端200堿基序列（作為重組序列）。
[0017] 附圖2.釀酒酵母表達(dá)載體2。
[0018]Pgap.釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S.釀酒酵母交配因子a的信號(hào) 肽；lip.木質(zhì)素過氧化物酶基因；TT.轉(zhuǎn)錄終止子；G418.G418基因表達(dá)框架；ColEl.大腸 桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨芐青霉素基因表達(dá)框架；3'GAP.釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶基 因的3 '末端200喊基序列。
[0019] 附圖3.釀酒酵母表達(dá)載體3。
[0020]Pgap.釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S?釀酒酵母交配因子a的信號(hào) 肽；lac漆酶基因；TT.轉(zhuǎn)錄終止子；G418.G418基因表達(dá)框架；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)； AMP.氨芐青霉素基因表達(dá)框架；3'GAP.釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶基因的3'末端200 堿基序列。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面采用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0022] 實(shí)施例一
[0023] 1. 1獲得酶基因及構(gòu)建表達(dá)載體所需的相關(guān)原件
[0024] (l)PCR擴(kuò)增釀酒酵母的磷酸甘油醛脫氫的啟動(dòng)子序列
[0025] 用蝸牛酶裂解釀酒酵母的細(xì)胞壁，提取釀酒酵母基因組DNA，用如下引物： 5'TCGAGITTATCAITATCAAT3' 和 5'TCGAAACTAAGTTCTTGGTG3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng) 序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶基因的 啟動(dòng)子序列。
[0026] (2)PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的漆酶基因
[0027] 用蝸牛酶裂解枯草芽孢桿菌的細(xì)胞壁，提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，應(yīng)用上游引 物(5'AACCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC3')和下游引物（5,AAGCGGCCGCCTATTTATGG GGATCAGTTATA3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證 明是枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列。
[0028] (3)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增白腐真菌的木質(zhì)素過氧化物酶基因和錳過氧化物酶基因
[0029] 應(yīng)用RNA提取試劑盒提取白腐真菌菌（白腐真菌模式菌種-黃孢原毛平革菌）的 總RNA，以總RNA為模板，應(yīng)用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上述合成的cDNA為模 板，應(yīng)用引物 1 (5 'AAGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTC3 '）和引物 2 (5 'AAGCGGCCGCCTA AGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCG3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供 的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的木質(zhì)素過氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA為模 板，應(yīng)用引物 3 (5 'CCGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCA3 '）和引物 4 (5 'TTGCGGCCGCC TATGCGGGACCGITGAACTGGACACC3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提 供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的錳過氧化物酶基因序列
[0030] (4)應(yīng)用PCR擴(kuò)增釀酒酵母的rDNA序列
[0031] 提取釀酒酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用上游引物（5'CCGCTACCaggt tcacctacggaaaccttg3，）和下游引物（5，CCTTCGAAtgtctcaaagattaagccatgc3' )進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是釀酒酵母基因組 中的rDNA序列。
[0032]說明：
[0033] ①釀酒酵母和枯草芽孢桿菌基因組DNA提取方法：將菌細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛 酶溶液（蝸牛酶用lmol/L山梨醇溶解）于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因 組DNA提取方法提取其基因組DNA。
[0034] ②引物5'端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基（2個(gè)堿基）和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位 點(diǎn)（有下劃線的6個(gè)堿基）.
[0035] (5)合成如下G418抗性基因表達(dá)框架序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基 (2個(gè)堿基）和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)（6個(gè)堿基），沒有下劃線的是G418抗性基因序 列]
[0036]CCATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGG ATTATCAATACCATATTTT