專利名稱：用于制造組織的裝置、系統(tǒng)和方法
用于制造組織的裝置、系統(tǒng)和方法
交叉引用本申請要求提交于2010年10月21日的第61/405，582號美國臨時申請的權(quán)益，其通過引用全文并入。
背景技術(shù)：
醫(yī)療保健行業(yè)面臨著許多緊迫的問題。截至2009年12月，有105，305名患者由器官共享聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)(UNOS)登記為需要器官移植。2009年一月到九月，僅進(jìn)行了 21，423例移植。每年添加到UNOS名單上的患者比進(jìn)行移植的更多，導(dǎo)致等待移植的患者數(shù)目凈增加。例如，在2008年初，有75，834人登記為需要腎；在那一年年底，該數(shù)字已增長到80，972人。那一年進(jìn)行了 16，546例腎移植，但名單上增加了 33，005名新患者。2008年，由UNOS登記為需要腎的患者的移植率為20%。等待名單上的患者的死亡率為7%。此外，新藥物化合物的研究和開發(fā)成本大約為18億美元。參見Paul等人(2010).How to improve R&D productivity:the pharmaceutical industry' s grandchallenge.Nature Reviews Drug Discovery 9(3):203_214。藥物研發(fā)是發(fā)現(xiàn)和 / 或設(shè)計藥物的過程。藥物研發(fā)的過程通常至少包括以下步驟:候選藥物的識別、合成、表征、篩選和治療效果的分析。盡管技術(shù)和對生物系統(tǒng)的理解在進(jìn)步，但藥物研發(fā)仍然是一個漫長而昂貴的低效率過程，且新治療發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)的幾率較低。

發(fā)明內(nèi)容
為了緩解對組織和器官的迫切需求，對于促進(jìn)再生醫(yī)學(xué)和組織工程技術(shù)的應(yīng)用的工具和技術(shù)存在需求。對于大幅增加創(chuàng)新的、有成本效益的新醫(yī)學(xué)產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量且不會招致無法承受的研發(fā)成本的工具和技術(shù)，也存在需求。因此，發(fā)明人在本文中描述了用于制造組織和器官的裝置、系 統(tǒng)和方法。本文描述了生物打印機(jī)，其包含:一個或多個打印機(jī)頭，其中打印機(jī)頭包含接收和夾持至少一個墨盒的手段(means)，并且其中所述墨盒包含選自以下一種或多種的內(nèi)容物:生物墨水和支撐材料；用于校準(zhǔn)至少一個墨盒的位置的手段；和用于分配至少一個墨盒的內(nèi)容物的手段。在一個實施方案中，本文描述的打印機(jī)頭包含用于接收和夾持一個墨盒的手段。在另一實施方案中，本文描述的打印機(jī)頭包含用于接收和夾持超過一個墨盒的手段。在另一實施方案中，生物打印機(jī)進(jìn)一步包含打印機(jī)臺。在另一實施方案中，用于接收和夾持至少一個墨盒的手段選自:磁力吸引、筒夾夾頭夾具(collet chuck grip)、套圈、螺母、筒接合器或其組合。在又一實施方案中，用于接收和夾持至少一個墨盒的手段是筒夾夾頭夾具。在又一實施方案中，用于校準(zhǔn)至少一個墨盒的位置的手段選自:激光準(zhǔn)直、光學(xué)準(zhǔn)直、機(jī)械準(zhǔn)直、壓電準(zhǔn)直、磁力準(zhǔn)直、電場或電容準(zhǔn)直、超聲準(zhǔn)直或其組合。在又一實施方案中，用于校準(zhǔn)至少一個墨盒的位置的手段是激光準(zhǔn)直。在另一實施方案中，用于分配至少一個墨盒的內(nèi)容物的手段是應(yīng)用活塞、應(yīng)用壓力、應(yīng)用壓縮氣體、液壓技術(shù)或其組合。在又一實施方案中，用于分配至少一個墨盒的內(nèi)容物的手段是應(yīng)用活塞。在又一實施方案中，活塞的直徑小于墨盒的直徑。在另一實施方案中，生物打印機(jī)進(jìn)一步包含用于調(diào)節(jié)溫度的手段。在又一實施方案中，生物打印機(jī)進(jìn)一步包含用于調(diào)節(jié)環(huán)境溫度、墨盒溫度、墨盒內(nèi)容物溫度、接收表面溫度或其組合的手段。在又一實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段是加熱元件。在又一實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段是加熱器。在又一實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段是輻射加熱器、對流加熱器、傳導(dǎo)加熱器、風(fēng)扇加熱器、熱交換器或其組合。在又一實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段是冷卻元件。在又一實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段是冷卻劑容器、冷凍液、冰、輻射冷卻器、對流冷卻器、傳導(dǎo)冷卻器、風(fēng)扇冷卻器或其組合。在又一實施方案中，將溫度調(diào)節(jié)為約40°C至約90°C。在又一實施方案中，將溫度調(diào)節(jié)為約0°C至約10°C。在另一實施方案中，本文公開的生物打印機(jī)進(jìn)一步包含用于向以下一種或多種應(yīng)用潤濕劑的手段:打印機(jī)臺；接收表面、沉積孔口、生物墨水、支撐材料或打印的構(gòu)建體。本文還公開了校準(zhǔn)包含沉積孔口的墨盒的位置的方法,其中墨盒接附在生物打印機(jī)上，該方法包括:沿至少一個軸校準(zhǔn)墨盒位置；其中所述軸選自X軸、y軸和Z軸；并且其中利用激光進(jìn)行各校準(zhǔn)。在一個實施方案中，該方法包括激發(fā)激光并生成至少一道基本穩(wěn)定和/或基本靜止的激光束，并且其中所述激光束與地面平行。在另一實施方案中，該方法包括激發(fā)激光并生成至少一道基本穩(wěn)定和/或基本靜止的激光束，并且其中所述激光束與地面垂直。在又一實施方案中，利用第一和第二激光進(jìn)行各校準(zhǔn)。在又一實施方案中，第一激光與地面垂直，而第二激光與地面平行。在另一實施方案中，利用水平激光沿y軸校準(zhǔn)墨盒位置包括:定位墨盒，使得墨盒(i)位于第一 y卦限且(ii)分配孔口低于激光束的上閾限；(a)向激光束移動墨盒，并且在激光束被墨盒中斷時立即停止所述移動，其中激光束被墨盒中斷的位置是第一 I位置；(b)重新定位墨盒，使得墨盒位于第二 y卦限，并且分配孔口低于激光束的上閾限；(C)向激光束移動墨盒，并且在激光束被墨盒中斷時立即停止所述移動，其中激光束被中斷的位置是第二 y位置；(d)并計算第一 y位置和第二 y位置之間的中點。在另一實施方案中，利用水平激光沿X軸校準(zhǔn)墨盒位置包括:(a)將墨盒定位(i)在第一 y位置和第二 y位置之間的中點，且(ii)在激光的傳感器閥限(threshold)以外；(b)向傳感器閥限移動墨盒，并且在墨盒接觸傳感器閥限時立即停止所述移動；(c)其中墨盒接觸傳感器的位置加上半個墨盒寬度為X位置。在另一實施方案中，利用水平激光沿z軸校準(zhǔn)墨盒位置包括:(a)定位墨盒，使得分配孔口位于激光束上方；(b)向激光束移動墨盒，并且在激光束被墨盒中斷時立即停止所述移動，其中激光束被中斷的位置是z位置。在另一實施方案中，利用垂直激光沿y軸校準(zhǔn)墨盒的位置包括:(a)定位墨盒，使得墨盒(i)位于第一y卦限且(ii)分配孔口在激光束的傳感器閥限以外；(b)向激光束移動墨盒，并且在激光束被墨盒中斷時立即停止所述移動，其中激光束被墨盒中斷的位置是第一 y位置；(c)重新定位墨盒，使得墨盒位于第二 y卦限且分配孔口在激光束的傳感器閥限以外；(d)向激光束移動墨盒，并且在激光束被墨盒中斷時立即停止所述移動，其中激光束被中斷的位置是第二 I位置；(e)計算第一 y位置和第二 y位置之間的中點；和(f)任選地，重復(fù)(a)-(e)并對計算的中點取平均值。在另一實施方案中，利用垂直激光沿X軸校準(zhǔn)墨盒位置包括:(a)定位墨盒，使得墨盒(i)位于第一 X卦限且(ii)分配孔口在激光束的傳感器閥限以外；(b)向激光束移動墨盒，并且在激光束被墨盒中斷時立即停止所述移動，其中激光束被墨盒中斷的位置是第一 X位置；(c)重新定位墨盒，使得墨盒位于第二 X卦限且分配孔口在激光束的傳感器閥 限以外；(d)向激光束移動墨盒，并且在激光束被墨盒中斷時立即停止所述移動，其中激光束被中斷的位置是第二 X位置；(e)計算第一 X位置和第二 X位置之間的中點；和(f)任選地，重復(fù)(a)-(e)并對計算的中點取平均值。在另一實施方案中，利用垂直激光沿z軸校準(zhǔn)墨盒位置包括:(a)定位打印機(jī)頭，使得分配孔口位于激光束上方并在激光傳感器范圍閥限以外；(b)沿z軸移動打印機(jī)頭，達(dá)到傳感器閥限；其中，z位置是達(dá)到激光傳感器閥限的位置；和任選地，重復(fù)步驟(a)和(b)并計算平均z位置。在另一實施方案中，沿z軸校準(zhǔn)墨盒位置包括:目測確定分配孔口的位置。本文進(jìn)一步描述了用于校準(zhǔn)包含分配孔口的墨盒的位置的系統(tǒng)，其中該墨盒接附在生物打印機(jī)上，所述系統(tǒng)包含:用于沿至少一個軸校準(zhǔn)墨盒位置的手段，并且其中所述軸選自y軸、X軸和z軸。在一個實施方案中，用于校準(zhǔn)墨盒的手段是激光準(zhǔn)直、光學(xué)準(zhǔn)直、機(jī)械準(zhǔn)直、壓電準(zhǔn)直、磁力準(zhǔn)直、電場或電容準(zhǔn)直、超聲準(zhǔn)直或其組合。在另一實施方案中，用于校準(zhǔn)墨盒的手段是激光準(zhǔn)直。在又一實施方案中，激光準(zhǔn)直手段包括選自水平激光和垂直激光的至少一道激光。在又一實施方案中，激光準(zhǔn)直手段包括水平激光和垂直激光。在又一實施方案中，將激光準(zhǔn)直手段精確到垂直軸上±40 μ m和水平軸上±20 μ m。本文進(jìn)一步描述了用于制造組織構(gòu)建體的方法，其包括:計算機(jī)模塊接收期望的組織構(gòu)建體的視覺表示(visual representation)的輸入；計算機(jī)模塊生成一系列命令，其中該命令基于該視覺表示且可被生物打印機(jī)讀?。挥嬎銠C(jī)模塊將該系列命令提供給生物打印機(jī)；和生物打印機(jī)按照該命令沉積生物墨水和支撐材料，以形成具有限定幾何形狀的構(gòu)建體。在一些實施方案中，計算機(jī)模塊包含顯示屏。在進(jìn)一步的實施方案中，計算機(jī)模塊包含圖形用戶界面(GUI)。在更進(jìn)一步的實施方案中，用戶使用由計算機(jī)模塊提供的GUI來限定一個或多個對象的內(nèi)容，以形成期望的組織構(gòu)建體的視覺表示。在一個實施方案中，顯示屏基本上由包含多個形狀基本相同且大小基本相等的對象的網(wǎng)格組成。在又一實施方案中，各個對象的形狀是圓形的。在又一實施方案中，用戶限定一個或多個對象的內(nèi)容，以形成期望的組織構(gòu)建體的視覺表示。在又一實施方案中，用戶限定的對象的內(nèi)容選自生物墨水或支撐材料。在進(jìn)一步的實施方案中，顯示屏由用戶電子或手工輸入的三維渲染(rendering)組成，從而可以在生物打印機(jī)上執(zhí)行生物打印程序之前在任何合適的平面中或矢量上調(diào)整三維渲染的各種組分。本文進(jìn)一步描述·了將墨盒接附到生物打印機(jī)上的方法，包括:(a)將墨盒插入筒夾夾頭中，其中該筒夾夾頭接附在生物打印機(jī)的打印機(jī)頭上；和(b)調(diào)節(jié)該筒夾夾頭的外套環(huán)；其中所述插入和調(diào)節(jié)基本上不改變打印機(jī)頭的位置。本文進(jìn)一步描述了與本文描述的生物打印機(jī)一起使用的墨盒，其包含至少一個孔口，其中孔口的邊緣是光滑或基本光滑的。在一個實施方案中，墨盒是毛細(xì)管或微量移液器。在另一實施方案中，墨盒包含生物墨水。在又一實施方案中，墨盒包含支撐材料。在又一實施方案中，孔口是圓形或正方形的。在又一實施方案中，墨盒具有約I μ m至約1000 μ m的內(nèi)直徑。在又一實施方案中，墨盒具有約500 μ m的內(nèi)直徑。在又一實施方案中，墨盒具有約I μ I至約50 μ I的容積。在又一實施方案中，墨盒具有約5 μ I的容積。在又一實施方案中，標(biāo)記墨盒以指示生物墨水的組成。在又一實施方案中，標(biāo)記墨盒以指示支撐材料的組成。在一些實施方案中，生物墨水和/或支撐材料是準(zhǔn)備好的(primed)。在進(jìn)一步的實施方案中，通過在啟動生物打印機(jī)程序之前將生物墨水?dāng)D出到分配孔口的水平來準(zhǔn)備生物墨水。在進(jìn)一步的實施方案中，通過在啟動生物打印機(jī)程序之前將支撐材料擠出到分配孔口的水平來準(zhǔn)備支撐材料。本文進(jìn)一步描述了用于將墨盒接附到生物打印機(jī)上的系統(tǒng)，其包含:用于接收墨盒并將其固定到生物打印機(jī)的打印機(jī)頭上的手段；其中用于接收和固定墨盒的手段的使用基本上不改變打印機(jī)頭的位置。在一些實施方案中，用于接收墨盒并將其固定到打印機(jī)頭上的手段選自:磁力吸引、筒夾夾頭夾具、套圈、螺母、筒接合器或其組合。在一個實施方案中，用于接收墨盒并將其固定到打印機(jī)頭上的手段中有筒夾。本文進(jìn)一步描述了用于接收一個或多個從生物打印機(jī)分配的結(jié)構(gòu)的接收表面。在一個實施方案中，接收表面是平坦或基本平坦的。在另一實施方案中，接收表面是光滑或基本光滑的。在又一實施方案中，接收表面是(a)平坦或基本平坦的且(b)光滑或基本光滑的或(C)限定或基本限定的。在另一實施方案中，接收表面的形貌被設(shè)計為適應(yīng)或影響一個或多個分配的結(jié)構(gòu)的大小、形狀或紋理(texture)，或者幾何形狀。在又一實施方案中，接收表面包含固體材料、半固體材料或其組合。在又一實施方案中，接收表面包含玻璃、塑料、金屬、金屬合金或其組合。在又一實施方案中，接收表面包含凝膠。在又一實施方案中，接收表面抵抗所述一個或多個結(jié)構(gòu)的粘附。在又一實施方案中，接收表面包含聚合的NovoGel 。


圖1說明了使用水平激光校準(zhǔn)墨盒的一個非限制性實例。圖2說明了使用垂直激光校準(zhǔn)墨盒的一個非限制性實例。圖3說明了毛細(xì)管準(zhǔn)備過程(priming process)的一個非限制性實例。圖4說明了生物打印的組織構(gòu)建體的二維表示形式的一個非限制性實例。圖5說明了通過使用與帶有510μπι針頭的注射器相連的NovoGen ΜΜΧ 生物打印機(jī)來連續(xù)沉積PF-127而生成的三維構(gòu)建體的一個非限制性實例；在該情況下為金字塔形構(gòu)建體。
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圖6說明了通過使用與帶有510μπι針頭的注射器相連的NovoGen ΜΜΧ 生物打印機(jī)來連續(xù)沉積PF-127而生成的三維構(gòu)建體的一個非限制性實例；在該情況下為立方體形狀(左圖)和空心立方體形狀(右圖)的構(gòu)建體。
具體實施例方式本發(fā)明涉及再生醫(yī)學(xué)、組織/器官工程、生物和醫(yī)學(xué)研究以及藥物研發(fā)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于制造組織和器官的裝置，用于校準(zhǔn)和使用此類裝置的系統(tǒng)和方法，以及由本文公開的裝置、系統(tǒng)和方法制造的組織和器官。在某些實施方案中，本文公開了生物打印機(jī)，其包含:一個或多個打印機(jī)頭，其中打印機(jī)頭包含用于接收和夾持至少一個墨盒的手段，并且其中所述墨盒包含選自以下一種或多種的內(nèi)容物:生物墨水和支撐材料；用于校準(zhǔn)至少一個墨盒的位置的手段；和分配至少一個墨盒的內(nèi)容物的手段。在某些實施方案中，本文還公開了校準(zhǔn)包含沉積孔口的墨盒的位置的方法，其中墨盒接附在生物打印機(jī)上，該方法包括:沿至少一個軸校準(zhǔn)墨盒位置；其中該軸選自X軸、y軸和z軸；并且其中利用激光進(jìn)行各校準(zhǔn)。在某些實施方案中，本文還公開了用于校準(zhǔn)包含沉積孔口的墨盒的位置的系統(tǒng)，其中墨盒接附在生物打印機(jī)上，所述系統(tǒng)包含:用于沿至少一個軸校準(zhǔn)墨盒位置的手段，其中該軸選自y軸、X軸和z軸。在某些實施方案中，本文還公開了用于制造組織構(gòu)建體的方法，包括:計算機(jī)模塊接收期望的組織構(gòu)建體的視覺表示的輸入；計算機(jī)模塊生成一系列命令，其中該命令基于該視覺表示且可被生物打印機(jī)讀??；計算機(jī)模塊將該系列命令提供給生物打印機(jī)；以及生物打印機(jī)按照該命令沉積生物墨水和支撐材料，以形成具有限定的幾何形狀的構(gòu)建體。在某些實施方案中，本文還公開了將墨盒接附到生物打印機(jī)上的方法，包括:(a)將墨盒插入筒夾夾頭中，其中該筒夾夾頭接附在生物打印機(jī)的打印機(jī)頭上；和(b)調(diào)節(jié)筒夾夾頭的外套環(huán)；其中所述插入和調(diào)節(jié)基本上不改變打印機(jī)頭的位置。在某些實施方案中，本文還公開了用于將墨盒接附到生物打印機(jī)上的系統(tǒng)，其包含:用于接收墨盒并將其固定到生物打印機(jī)的打印機(jī)頭上的手段；其中使用用于接收和固定墨盒的手段基本上不改變打印機(jī)頭的位置。
某些定義除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所一般理解的具有相同的含義。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)均通過引用全文并入。除非上下文另有明確指示，在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括其復(fù)數(shù)形式。因此，例如，提及“一種核酸”包括一種或多種核酸，和/或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言在閱讀本公開內(nèi)容后將會變得顯而易見的本文所述類型的組合物，諸如此類。除非另有說明，本文中對“或”的任何提及旨在包括“和/或”。本文使用的“同種異體移植物”是指源自與受體物種相同而在遺傳上不同的該物種成員的器官或組織。本文使用的“生物墨水”是指含有多個細(xì)胞的液體、半固體或固體組合物。在一些實施方案中，生物墨水包含細(xì)胞溶液、細(xì)胞聚集體、含細(xì)胞的凝膠、多細(xì)胞體或組織。在一些實施方案中，生物墨水另外包含支撐材料。在一些實施方案中，生物墨水另外包含提供使生物打印可行的特定生物力學(xué)性能的非細(xì)胞材料。本文使用的“生物打印”是指通過與自動化的、計算機(jī)輔助的、三維成型(prototyping)裝置(例如生物打印機(jī))相兼容的方法，利用細(xì)胞(例如細(xì)胞溶液、含細(xì)胞的凝膠、細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞濃縮物、多細(xì)胞聚集體、多細(xì)胞體等)的三維精確沉積。本文使用的“墨盒”是指能夠接收(和容納)生物墨水或支撐材料的任何物體。本文使用的“計算機(jī)模塊”是指與更大的計算機(jī)系統(tǒng)交互的軟件組件(包括一段代碼)。在一些實施方案中，軟件模塊(或程序模塊)以文件形式出現(xiàn)，并且一般在更大的軟件系統(tǒng)內(nèi)處理特定任務(wù)。在一些實施方案中，模塊可包括在一個或多個軟件系統(tǒng)內(nèi)。在其它實施方案中，模塊可與一個或多個其它模塊無縫集成到一個或多個軟件系統(tǒng)內(nèi)。計算機(jī)模塊任選地是獨立的一段代碼，或任選地是不能單獨識別的代碼。計算機(jī)模塊的一個關(guān)鍵特征是其允許最終用戶使用計算機(jī)來執(zhí)行所識別的功能。本文使用的“可植入的”是指可生物相容并且能夠臨時或基本永久地嵌入或植入活生物體內(nèi)或者附加到活生物體上。本文使用的“器官”是指連接成為結(jié)構(gòu)單元以行使常見功能的組織集合。器官的實例包括但不限于皮膚、汗腺、皮脂腺、乳腺、骨、腦、下丘腦、垂體、松果體、心臟、血管、喉、氣管、支氣管、肺、淋巴管、唾液腺、粘液腺、食道、胃、膽囊、肝臟、胰腺、小腸、大腸、結(jié)腸、尿道、腎、腎上腺、管道(conduit)、輸尿管、膀胱、輸卵管、子宮、卵巢、睪丸、前列腺、甲狀腺、甲狀旁腺、瞼板腺、腮腺、扁桃體、增殖腺(adenoid)、胸腺和脾臟。本文使用的“患者”是指任何個體。該術(shù)語與“受試者”、“受體”和“供體”可以互換。這些術(shù)語均不應(yīng)解釋為需要醫(yī)學(xué)專業(yè)人士(例如醫(yī)師、護(hù)士、執(zhí)業(yè)護(hù)士、醫(yī)師助手、護(hù)理員、臨終關(guān)懷工作者、社工、臨床研究員等)或科研人員的(持續(xù)的或其它方式的)監(jiān)督。本文使用的“干細(xì)胞”是指展示出潛能和自我更新的細(xì)胞。干細(xì)胞包括但不限于全能細(xì)胞、多潛能細(xì)胞(pluripotent cells)、多能細(xì)胞(multipotent cells)、寡能細(xì)胞、單能細(xì)胞和祖細(xì)胞。干細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞、圍產(chǎn)期干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、羊膜干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。本文使用的“組織”是指細(xì)胞的聚集體。組織的實例包括但不限于結(jié)締組織(例如網(wǎng)形結(jié)締組織、致密結(jié)締組織、彈性組織、網(wǎng)狀結(jié)締組織和脂肪組織)、肌肉組織(例如骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神經(jīng)組織和上皮組織(例如單層上皮和復(fù)層上皮)、內(nèi)胚層源組織、中胚層源組織和外胚層源組織。本文使用的“異種移植物”是指源自與受體不同的物種的器官或組織。
現(xiàn)有的器官移植方法目前，尚沒有可靠的器官從頭合成方法。器官僅來自于活供體(例如對于腎和肝捐獻(xiàn))、已故供體(例如對于肺和心臟捐獻(xiàn))，且在少數(shù)情況下來自于動物(例如豬心臟瓣膜)。因此，需要器官移植的患者必須等待供體器官可以獲得。這導(dǎo)致可用的器官的短缺。此外，對從活生物體獲得器官的依賴增加了移植排斥的可能性。
移植排斥 在某些情況下，接受器官移植的患者經(jīng)歷超急性排斥反應(yīng)。本文使用的“超急性排斥反應(yīng)”是指因為受體具有預(yù)先存在的針對供體器官的抗體而導(dǎo)致的補體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。超急性排斥反應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生，并且其特征為血液凝集。如果不立即移除移植的器官，患者可能患膿毒癥。異種移植物會引起超急性排斥反應(yīng)，除非首先對受體施用免疫抑制齊U。在一些實施方案中，從頭制造的組織或器官將不包含任何抗原，因此不能被受體的任何抗體識別。在某些情況下，接受器官移植的患者經(jīng)歷急性排斥反應(yīng)。本文使用的“急性排斥反應(yīng)”是指在移植后約一周到移植后約一年開始的免疫應(yīng)答。急性排斥反應(yīng)是由供體器官上存在外源HLA分子而導(dǎo)致的。在某些情況下，APC識別外源HLA并激活輔助T細(xì)胞。在某些情況下，輔助T細(xì)胞激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在某些情況下，細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的存在導(dǎo)致具有外源HLA的細(xì)胞死亡，并因此導(dǎo)致移植的器官的損害(或死亡)。急性排斥反應(yīng)在約60-75%的腎移植和50-60%的肝移植中發(fā)生。在一些實施方案中，從頭制造的組織或器官將不包含任何HLA，因此將不會導(dǎo)致輔助T細(xì)胞的激活。在某些情況下，接受器官移植的患者經(jīng)歷慢性排斥反應(yīng)。本文使用的“慢性排斥反應(yīng)”是指由針對移植的組織的慢性炎癥性和免疫應(yīng)答所導(dǎo)致的移植排斥。在一些實施方案中，從頭制造的組織或器官將不包含任何抗原或外源HLA，因此將不會引發(fā)炎癥性或免疫應(yīng)答。
在某些情況下，接受器官移植的患者經(jīng)歷慢性同種異體移植血管病變(CAV)。本文使用的“慢性同種異體移植血管病變”是指由移植器官的內(nèi)部血管纖維化所導(dǎo)致的移植器官的功能喪失。在某些情況下，CAV是對移植器官的長期免疫應(yīng)答的結(jié)果。在一些實施方案中，從頭制造的組織或器官將不包含任何抗原或外源HLA，因此將不會導(dǎo)致免疫應(yīng)答。為了避免移植排斥，對器官受體施用免疫抑制藥物。免疫抑制劑包括但不限于皮質(zhì)類固醇(例如潑尼松和氫化可的松)、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(例如環(huán)孢菌素和他克莫司)、抗增殖劑(例如硫唑嘌呤和霉酚酸)、針對免疫系統(tǒng)的特異性組分的抗體(例如巴利昔單抗、達(dá)利珠單抗(dacluzimab)、抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)和抗淋巴細(xì)胞球蛋白(ALG)和mTOR抑制劑(例如西羅莫司和依維莫司))。然而，免疫抑制劑具有數(shù)種負(fù)面副作用，包括但不限于易感染性(例如，肺炎卡氏肺囊蟲(pneumocystis carinii pneumonia) (PCP)Jfji炎巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus pneumonia) (CMV)、單純皰疫(herpes simplex)病毒和帶狀皰疹(herpes zoster)病毒感染)和惡性細(xì)胞的擴(kuò)散、高血壓、血脂異常、高血糖、消化性潰瘍、肝和腎的損傷以及與其它藥物的相互作用。在一些實施方案中，從頭制造的組織或器官將不會導(dǎo)致免疫應(yīng)答，因此將不需要施用免疫抑制劑。
感染在某些情況下，供體器官可能感染了傳染原。在移植已感染的器官后，該傳染原能夠擴(kuò)散到供體全身(部分是因為免疫抑制藥物的使用)。作為非限制性實例，受體已從移植的器官感染了 HIV、西尼羅河病毒、狂犬病、丙型肝炎、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、結(jié)核、查加斯病和克-雅氏病。雖然這樣的感染是罕見的，但它們?nèi)詴l(fā)生-已故供體的社會史經(jīng)常是不準(zhǔn)確的，因為其必然來源于近親，如果未發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，血清學(xué)試驗可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果，或者血清學(xué)試驗也可能由于輸血后的血液稀釋而產(chǎn)生假陰性。而且，因為獲得的器官存活時間有限，未對許多不常見的傳染原進(jìn)行篩查。在一些實施方案中，從頭制造的組織或器官將不包含任何傳染原。
供體并發(fā)癥活供體也可能由于捐獻(xiàn)器官而經(jīng)歷并發(fā)癥。這些并發(fā)癥包括醫(yī)院交叉感染、對麻醉的過敏反應(yīng)和手術(shù)差錯。而且，器官供體可能某一天發(fā)現(xiàn)他們自身需要他們所捐獻(xiàn)的器官。例如，腎供體剩下的腎臟或肝供體剩下的肝葉可能受損。在一些實施方案中，從頭制造的組織或器官消除了對供體器官的需求，因此將避免對供體的負(fù)面副作用。鑒于可用器官的缺乏和供體器官移植之后可能引發(fā)的所有并發(fā)癥，對于從頭制造組織和器官的方法存在需求。
鉬織工稈組織工程是一個跨學(xué)科領(lǐng)域，它應(yīng)用和結(jié)合了工程和生命科學(xué)的原理，旨在發(fā)展通過增加、修復(fù)或替換器官或組織來恢復(fù)、維持或改善組織功能的生物替代品。經(jīng)典組織工程的基本方法是將活細(xì)胞接種到生物相容的且最后可生物降解的環(huán)境(例如支架)中，然后在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)該構(gòu)建體，使得初始細(xì)胞群可以在植入后進(jìn)一步擴(kuò)充并成熟以生成靶組織。使用模擬生物細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的適當(dāng)支架，發(fā)育中的組織可以在體外和體內(nèi)成熟后同時繼承所需器官的形式和功能。但是，用類似于天然組織的結(jié)構(gòu)達(dá)到足夠高的細(xì)胞密度具有挑戰(zhàn)性， 因為控制細(xì)胞在支架各處的分布和空間排列的能力受到限制。這些限制可能導(dǎo)致組織或器官的機(jī)械性能差和/或功能不足。關(guān)于支架的生物降解、殘留聚合物的捕獲和制造過程的工業(yè)規(guī)模放大，存在另外的挑戰(zhàn)。已嘗試了無支架的方法。目前無支架的方法具有數(shù)個限制:
復(fù)雜的幾何形狀，例如其中每層包含一種不同的細(xì)胞類型的多層結(jié)構(gòu)，可能需要將細(xì)胞類型確定地、高分辨率地放置在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)，從而可再現(xiàn)地達(dá)到類似于天然組織的成
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規(guī)模和幾何形狀受擴(kuò)散和/或?qū)τ糜陴B(yǎng)分供應(yīng)的功能性血管網(wǎng)絡(luò)的需求所限。
組織的存活能力可能被限制擴(kuò)散和限制細(xì)胞獲取養(yǎng)分的限制材料削弱。在某些實施方案中，本文公開了生成三維組織構(gòu)建體的裝置、系統(tǒng)和方法。本文公開的裝置、系統(tǒng)和方法使用了分三個階段的過程:(i)預(yù)處理或生物墨水制備，(ii)處理，即生物打印機(jī)將生物墨水顆粒實際自動化遞送/打印到生物紙張上，和(iii)后處理，即打印的構(gòu)建體在生物反應(yīng)器中成熟/培養(yǎng)。最終的結(jié)構(gòu)形成在后處理期間通過生物墨水顆粒的融合而發(fā)生。本文公開的裝置、系統(tǒng)和方法具有以下優(yōu)點:
■其能夠產(chǎn)生含細(xì)胞的組織和/或器官。
■其通過利用發(fā)育生物學(xué)的原理來模擬天然組織形成過程的環(huán)境條件。
■其可以獲得眾多的復(fù)雜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(例如多層結(jié)構(gòu)、重復(fù)的幾何圖案、段、片、管、囊
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■其與自動化制造手段·兼容并且規(guī)模是可調(diào)整的。生物打印使得生成可用于組織修復(fù)、組織增強(qiáng)、組織替換和器官替換的可植入含細(xì)胞組織的改良方法成為可能。此外，生物打印使得生成微尺度的組織類似物(包括對體外試驗有用的組織類似物)的改良方法成為可能。
牛物打印 在某些實施方案中，本文公開了用于制造組織和器官的裝置、系統(tǒng)和方法。在一些實施方案中，該裝置是生物打印機(jī)。在一些實施方案中，該方法包括使用生物打印技術(shù)。在進(jìn)一步的實施方案中，利用本文描述的裝置、系統(tǒng)和方法而制造的組織和器官是生物打印的。在一些實施方案中，使用利用快速成型技術(shù)的方法來生成生物打印的細(xì)胞構(gòu)建體、組織和器官，該快速成型技術(shù)基于通過三維遞送裝置(例如生物打印機(jī))向生物相容的表面(例如由水凝膠和/或多孔膜組成)上三維、自動化、計算機(jī)輔助地沉積細(xì)胞和支撐材料，該細(xì)胞包括細(xì)胞溶液、細(xì)胞懸浮液、含細(xì)胞的凝膠或糊狀物、細(xì)胞濃縮物、多細(xì)胞體(例如圓柱體、球狀體、帶狀物等)。在一些實施方案中，本文使用的術(shù)語“工程化”在用來指組織和/或器官時，是指按照計算機(jī)代碼由計算機(jī)輔助的裝置(例如生物打印機(jī))定位細(xì)胞、細(xì)胞溶液、細(xì)胞懸浮液、含細(xì)胞的凝膠或糊狀物、細(xì)胞濃縮物、多細(xì)胞聚集體和它們的層，以形成三維結(jié)構(gòu)。在進(jìn)一步的實施方案中，計算機(jī)腳本是例如一個或多個計算機(jī)程序、計算機(jī)應(yīng)用或計算機(jī)模塊。在更進(jìn)一步的實施方案中，三維組織結(jié)構(gòu)通過細(xì)胞或多細(xì)胞體的打印后融合而形成，類似于早期形態(tài)發(fā)生中的自組裝現(xiàn)象。盡管可使用包括人工布置在內(nèi)的許多方法在生物相容的表面上排列細(xì)胞、多細(xì)胞聚集體和/或它們的層以產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)，但是由自動化的、計算機(jī)輔助的機(jī)器例如生物打印機(jī)來定位是有利的。用這一技術(shù)遞送細(xì)胞或多細(xì)胞體的優(yōu)點包括快速、準(zhǔn)確且可再現(xiàn)地布置細(xì)胞或多細(xì)胞體，以用多種組合物產(chǎn)生展示出細(xì)胞、多細(xì)胞聚集體和/或它們的層的計劃的或預(yù)定的取向或圖案的構(gòu)建體。優(yōu)點還包括保證了高的細(xì)胞密度，同時使細(xì)胞損傷最小化。在一些實施方案中，生物打印的方法是連續(xù)和/或基本連續(xù)的。連續(xù)生物打印方法的一個非限制性實例是通過與生物墨水儲器連接的分配尖端(例如注射器、毛細(xì)管等)從生物打印機(jī)分配生物墨水。在進(jìn)一步的非限制性實施方案中，連續(xù)生物打印方法是以功能單元的重復(fù)圖案分配生物墨水。在各種實施方案中，重復(fù)的功能單元具有任何合適的幾何形狀，包括例如圓形、正方形、長方形、三角形、多邊形和不規(guī)則幾何形狀。在進(jìn)一步的實施方案中，生物打印的功能單元的重復(fù)圖案包含層，并且相鄰地生物打印(例如堆疊)多個層以形成工程化的組織或器官。在各種實施方案中，相鄰地生物打印(例如堆疊)2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個層，以形成工程化的組織或器官。在一些實施方案中，生物打印的功能單元以鑲嵌圖案重復(fù)?！拌偳秷D案”是無重疊且無空隙地填充平面的圖形平面。連續(xù)和/或鑲嵌生物打印的優(yōu)點可包括增加生物打印的組織的產(chǎn)量。產(chǎn)量增加可包括實現(xiàn)規(guī)模增加、復(fù)雜性增加或者生產(chǎn)時間或成本減少。另一個非限制性的潛在優(yōu)點可以是減少完成三維構(gòu)建體的生物打印所需的校準(zhǔn)事件數(shù)目。連續(xù)生物打印還可有利于任選地使用注射器機(jī)構(gòu)由生物墨水的大儲器打印較大的組織。連續(xù)生物打印中的方法可能涉及獨立地或彼此相關(guān)地優(yōu)化和/或平衡參數(shù)，例如打印高度、泵速、機(jī)撲(robot)速度或其組合。在一個實例中，生物打印機(jī)頭的沉積速度是3mm/s,第一層的分配高度是0.5mm,而對于隨后各層分配高度增加0.4mm 在一些實施方案中，分配高度大致與生物打印機(jī)分配尖端的直徑相等。非限制性地，合適的和/或最佳的分配距離不會導(dǎo)致材料壓扁或附著于分配針頭。在各種實施方案中，生物打印機(jī)分配尖端具有約 20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000 μ m或更大的內(nèi)徑,包括其間的值(increments therein)。在各種實施方案中，生物打印機(jī)的生物 墨水儲器具有約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100立方厘米或更大的容積，包括其間的值。當(dāng)系統(tǒng)中的剩余壓力積累較低時，泵速可能是合適的和/或最佳的。有利的泵速可取決于儲器和分配針頭的橫截面積之間的比例，比例越大，所需的泵速越低。在一些實施方案中，合適的和/或最佳的打印速度使均勻線的沉積成為可能，而不會影響材料的機(jī)械完整性。本文公開的發(fā)明包括商業(yè)方法。在一些實施方案中，利用本文公開的裝置和方法的速度和規(guī)模可調(diào)性來設(shè)計、建立和運行用于生產(chǎn)工程化組織和/或器官的工業(yè)和/或商業(yè)設(shè)施。在進(jìn)一步的實施方案中，將工程化組織和/或器官作為例如用于醫(yī)學(xué)處理/治療組織損傷、組織疾病和/或器官衰竭的材料、工具和試劑盒，或者作為用于進(jìn)行生物試驗和/或藥物篩選服務(wù)的材料、工具和試劑盒進(jìn)行生產(chǎn)、儲存、分送、上市、廣告宣傳和出售。
生物打印機(jī)在某些實施方案中，本文公開了用于制造組織和器官的生物打印機(jī)。在一些實施方案中，生物打印機(jī)是使生物打印過程自動化的任何儀器。在某些實施方案中，本文公開的生物打印機(jī)包含:一個或多個打印機(jī)頭，其中打印機(jī)頭包含用于接收和夾持至少一個墨盒的手段，并且其中所述墨盒包含選自以下一種或多種的內(nèi)容物:生物墨水和支撐材料；用于校準(zhǔn)至少一個墨盒的位置的手段；和用于分配至少一個墨盒的內(nèi)容物的手段。在各種實施方案中，生物打印機(jī)以二維或三維的預(yù)定的幾何學(xué)性質(zhì)(例如位置、圖案等)分配生物墨水和/或支撐材料。在一些實施方案中，生物打印機(jī)通過相對于打印機(jī)臺或適合接收生物打印的材料的接收表面移動打印機(jī)頭來實現(xiàn)特定的幾何學(xué)性質(zhì)。在其它實施方案中，生物打印機(jī)通過相對于打印機(jī)頭移動打印機(jī)臺或接收表面來實現(xiàn)特定的幾何學(xué)性質(zhì)。在某些實施方案中，生物打印機(jī)保持在無菌環(huán)境中。在一些實施方案中，本文公開的生物打印機(jī)包含一個或多個打印機(jī)頭。在進(jìn)一步的實施方案中，打印機(jī)頭包含用于接收和夾持至少一個墨盒的手段。在一些實施方案中，打印機(jī)頭包含用于接收和夾持超過一個墨盒的手段。在一些實施方案中，用于接收和夾持至少一個墨盒的手段選自:磁力吸引、筒夾夾頭夾具、套圈、螺母、筒接合器或其組合。在一些實施方案中，用于接收和夾持至少一個墨盒的手段是筒夾夾頭夾具。在一些實施方案中，本文公開的生物打印機(jī)包含用于校準(zhǔn)至少一個墨盒的位置的手段。在一些實施方案中，用于校準(zhǔn)至少一個墨盒的位置的手段選自:激光準(zhǔn)直、光學(xué)準(zhǔn)直、機(jī)械準(zhǔn)直、壓電準(zhǔn)直、磁力準(zhǔn)直、電場或電容準(zhǔn)直、超聲準(zhǔn)直或其組合。在一些實施方案中，用于校準(zhǔn)至少一個墨盒的位置的手段是激光準(zhǔn)直。在一些實施方案中，本文公開的生物打印機(jī)包含用于分配至少一個墨盒的內(nèi)容物的手段。在一些實施方案中，用于分配至少一個墨盒的內(nèi)容物的手段是應(yīng)用活塞、應(yīng)用壓力、應(yīng)用壓縮氣體、應(yīng)用液壓技術(shù)或應(yīng)用其組合。在一些實施方案中，用于分配至少一個墨盒的內(nèi)容物的手段是應(yīng)用活塞。在一些實施方案中，活塞的直徑小于墨盒的直徑。在一些實施方案中，本文公開的生物打印機(jī)進(jìn)一步包含接收表面。在進(jìn)一步的實施方案中，接收表面是生物打印機(jī)向其上分配生物墨水和/或支撐材料的無細(xì)胞毒性表面。在一些實施方案中，本文公開的生物打印機(jī)進(jìn)一步包含打印機(jī)臺。在進(jìn)一步的實施方案中，接收表面是打印機(jī)臺的表面。在其它實施方案中，接收表面是與打印機(jī)臺分離的組件，但是它附著在臺上或由臺支撐。在一些實施方案中，接收表面是平坦或基本平坦的。在一些實施方案中，表面是光滑或基本光滑的。在其它實施方案中，表面是基本平坦且基本光滑的。在更進(jìn)一步的實施方案中，接收表面經(jīng)特別設(shè)計以適應(yīng)生物打印的結(jié)構(gòu)的形狀、大小、紋理或幾何形狀。在更進(jìn)一步的實施方案中，接收表面控制或影響生物打印的構(gòu)建體的大小、形狀、紋理或幾何形狀。
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在一些實施方案中，本文公開的生物打印機(jī)進(jìn)一步包含用于調(diào)節(jié)溫度的手段。在一些實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段調(diào)節(jié)和/或保持環(huán)境溫度。在其它各種實施方案中，作為非限制性實例，用于調(diào)節(jié)溫度的手段調(diào)節(jié)和/或保持打印頭、墨盒、墨盒內(nèi)容物(例如生物墨水、支撐材料等)、打印機(jī)臺和接收表面的溫度。在一些實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段是加熱元件。在一些實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段是加熱器。在一些實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段是輻射加熱器、對流加熱器、傳導(dǎo)加熱器、風(fēng)扇加熱器、熱交換器或其組合。在一些實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段是冷卻元件。在一些實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段是冷卻劑容器、冷凍液、冰或其組合。在一些實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段是輻射冷卻器、對流冷卻器、傳導(dǎo)冷卻器、風(fēng)扇冷卻器或其組合。在各種實施方案中，用于調(diào)節(jié)溫度的手段調(diào)節(jié)溫度到約0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90°C，包括其間的值。在一些實施方案中，將溫度調(diào)節(jié)到約40°C至約90°C。在其它實施方案中，將溫度調(diào)節(jié)到約0°C至約10°C。
在一些實施方案中，本文公開的生物打印機(jī)進(jìn)一步包含用于向以下一種或多種應(yīng)用潤濕劑的手段:打印機(jī)臺；接收表面、沉積孔口、生物墨水、支撐材料或打印的構(gòu)建體。在一些實施方案中，用于應(yīng)用潤濕劑的手段是應(yīng)用流體的任何合適方法(例如噴霧器、移液管、噴墨等)。在一些實施方案中，潤濕劑是水、組織培養(yǎng)基、緩沖鹽溶液、血清或其組合。在進(jìn)一步的實施方案中，在生物打印機(jī)分配生物墨水或支撐材料之后應(yīng)用潤濕劑。在一些實施方案中，與生物打印機(jī)分配生物墨水或支撐材料同時或基本同時地應(yīng)用潤濕劑。在一些實施方案中，在生物打印機(jī)分配生物墨水或支撐材料之前應(yīng)用潤濕劑。
打印機(jī)頭在某些實施方案中，本文公開了用于制造組織和器官的生物打印機(jī)。在一些實施方案中，本文公開的生物打印機(jī)包含一個或多個打印機(jī)頭。在進(jìn)一步的實施方案中，打印機(jī)頭包含用于接收和夾持至少一個墨盒的手段。在更進(jìn)一步的實施方案中，打印機(jī)頭將至少一個墨盒接附到生物打印機(jī)上。用于接收和夾持至少一個墨盒的許多手段都是合適的。用于接收和夾持至少一個墨盒的合適的手段包括那些可靠地、精確地和牢固地將至少一個墨盒接附到生物打印機(jī)上的手段。在各種實施方案中，作為非限制性實例，用于接收和夾持至少一個墨盒的手段是磁力吸引、筒夾夾頭夾具、套圈 、螺母、筒接合器或其組合。在一些實施方案中，本文公開的打印機(jī)頭接收和夾持一個墨盒。在各種其它實施方案中，本文公開的打印機(jī)頭同時接收和夾持2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個墨盒。在進(jìn)一步的實施方案中，本文公開的打印機(jī)頭進(jìn)一步包含用于從所接收和夾持的多個墨盒中選擇在生物打印中欲使用的墨盒的手段。在一些實施方案中，本文公開的打印機(jī)頭進(jìn)一步包含儲器(或與之流體連通)，以便含有超過一個或多個墨盒的容納量的生物墨水和/或支撐材料。在進(jìn)一步的實施方案中，儲器向一個或多個墨盒供應(yīng)生物墨水和/或支撐材料，以便通過分配孔口進(jìn)行分配。包括儲器的打印機(jī)頭配置在連續(xù)或基本連續(xù)的生物打印應(yīng)用中特別有用。許多容積適合本文公開的儲器。在各種實施方案中，儲器具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500ml 或更大的內(nèi)部容積，包括其間的值。在一些實施方案中，生物打印涉及使用計算機(jī)來獨立或彼此相關(guān)地配置參數(shù)，例如打印高度、泵速、機(jī)撲速度或其組合。在進(jìn)一步的實施方案中，計算機(jī)代碼指定打印機(jī)頭的定位，以將打印機(jī)頭的高度配置在接收表面以上。在進(jìn)一步的實施方案中，計算機(jī)代碼指定打印機(jī)頭的移動方向和速度，以配置生物墨水和/或支撐材料的分配特征。
墨盒在某些實施方案中，本文公開了用于制造組織和器官的生物打印機(jī)。在一些實施方案中，接附在生物打印機(jī)上的墨盒包含生物墨水或支撐材料。在一些實施方案中，生物打印機(jī)以特定圖案在特定位置分配生物墨水或支撐材料，以形成特定的細(xì)胞構(gòu)建體、組織或器官。為了制造復(fù)雜的組織構(gòu)建體，生物打印機(jī)以精確的速度和均勻的量沉積生物墨水或支撐材料。因此，對于具有(a)光滑或基本光滑的分配孔口和(b)光滑或基本光滑的內(nèi)表面的墨盒存在需求。本文使用的“墨盒”是指能夠接收(和容納)生物墨水和/或支撐材料的任何物體。
在一些實施方案中，本文公開的墨盒包含生物墨水。在一些實施方案中，本文公開的墨盒包含支撐材料。在一些實施方案中，本文公開的墨盒包含生物墨水和支撐材料的組
口 ο在某些實施方案中，本文公開了與本文公開的生物打印機(jī)一起使用的墨盒，其包含至少一個分配孔口。在一些實施方案中，墨盒包含一個分配孔口。在各種其它實施方案中，墨盒包含 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100 個或更多個分配孔口。在進(jìn)一步的實施方案中，分配孔口的邊緣是光滑或基本光滑的。許多形狀適合本文公開的分配孔口。在各種實施方案中，作為非限制性實例，適合分配孔口的形狀包括圓形、卵形、三角形、正方形、長方形、多邊形和不規(guī)則形狀。在一些實施方案中，孔口是圓形的。在其它實施方案中，孔口是正方形的。在另外的其它實施方案中，孔口是卵形、橢圓形或長方形的，并且以帶樣形式分配固體或半固體生物墨水和/或支撐材料。在一些實施方案中，墨盒的內(nèi)表面是光滑或基本光滑的。在一些實施方案中，墨盒由剛性結(jié)構(gòu)組成以利于校準(zhǔn)。在一些實施方案中，墨盒壁由抵抗細(xì)胞附著的材料組成。在一些實施方案中，墨盒由生物相容的材料組成。許多類型的墨盒適合與本文公開的生物打印機(jī)及其使用方法一起使用。在一些實施方案中，墨盒與涉及通過一個或多個分配孔口擠出半固體或固體生物墨水或支撐材料的生物打印兼容。在一些實施方案中，墨盒與涉及通過一個或多個分配孔口分配液體或半固體的細(xì)胞溶液、細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞濃縮物的生物打印兼容。在一些實施方案中，墨盒與不連續(xù)生物打印兼容。在一些實施方案中，墨盒與連續(xù)和/或基本連續(xù)的生物打印兼容。在一些實施方案中，墨盒是毛細(xì)管或微量移液器。在一些實施方案中，墨盒是注射器或針頭。許多內(nèi)直徑適合基本圓形或圓柱形的墨盒。在各種實施方案中，作為非限制性實例，合適的內(nèi)直徑包括 1、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μπι 或更大，包括其間的值。在其它各種實施方案中，作為非限制性實例，合適的內(nèi)直徑包括1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mm 或更大，包括其間的值。在一些實施方案中，墨盒具有約Iym至約IOOOym的內(nèi)直徑。在一個特定的實施方案中，墨盒具有約500 μ m的內(nèi)直徑。在另一特定的實施方案中，墨盒具有約250 μ m的內(nèi)直徑。許多內(nèi)部容積適合本文公開的墨盒。在各種實施方案中，作為非限制性實例，合適的內(nèi)部容積包括1、10、
20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μ I 或更大，包括其間的值。在其它各種實施方案中，作為非限制性實例，合適的內(nèi)部容積包括1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500ml或更大，包括其間的值。在一些實施方案中，墨盒具有約I μ I至約50 μ I的容積。在一個特定的實施方案中，墨盒具有約5 μ I的容積。在一些實施方案中，墨盒與生物墨水和/或支撐材料向接收表面上的噴墨打印(例如在美國專利7，051，654中所描述的)兼容。在進(jìn)一步的實施方案中，墨盒包括在本文描述的計算機(jī)代碼控制下的、電壓門控噴嘴或針頭形式的分配孔口。在一些實施方案中，墨盒是準(zhǔn)備好的。在一些實施方案中，準(zhǔn)備墨盒增加了分配、沉積或擠出過程的精度。本文使用的“準(zhǔn)備好”是指通過致密化(compacting)和前推墨盒的內(nèi)容物直到待分配 的材料(生物墨水或支撐材料)位于與分配孔口接觸的位置，而將墨盒的內(nèi)容物準(zhǔn)備好以供分配、沉積或擠出。在一些實施方案中，當(dāng)內(nèi)容物是致密的或基本致密的且內(nèi)容物與墨盒的孔口物理接觸時，墨盒是準(zhǔn)備好的。在一些實施方案中，標(biāo)記墨盒以指示其內(nèi)容物的組成。在進(jìn)一步的實施方案中，標(biāo)記墨盒以指不其中所含的生物墨水和/或支撐材料的組成。在一些實施方案中，對墨盒的表面著色。在一些實施方案中，對墨盒的外表面染色、上漆、用鋼筆標(biāo)記、用粘貼物(sticker)標(biāo)記或其組合。在一些實施方案中，標(biāo)記墨盒的外表面以增加墨盒表面的不透明度(例如，用以增加被墨盒表面反射掉的激光束的量)。在一些實施方案中，對墨盒的表面著色。在一些實施方案中，對墨盒的外表面刻痕。本文使用的“刻痕”是指在墨盒表面上刻劃，以降低表面的光滑度。使用任何合適的方法給墨盒表面刻痕(例如應(yīng)用酸性物質(zhì)、應(yīng)用腐蝕性物質(zhì)、應(yīng)用磨蝕性物質(zhì)等)。在一些實施方案中，對墨盒的外表面上漆、拋光(例如火焰拋光)、蝕刻(例如激光蝕刻)、用鋼筆標(biāo)記、用粘貼物標(biāo)記或其組合。
魁在某些實施方案中，本文公開了用于制造組織和器官的生物打印機(jī)。在一些實施方案中，接附在生物打印機(jī)上的墨盒包含生物墨水和/或支撐材料。在一些實施方案中，生物打印機(jī)以特定圖案在特定位置分配生物墨水和/或支撐材料，以形成特定的細(xì)胞構(gòu)建體、組織或器官。在一些實施方案中，包含生物墨水的墨盒是一次性的。在一些實施方案中，在擠出內(nèi)各物后，將墨盒從生物打印機(jī)上退出。在一些實施方案中，新的墨盒隨后接附到生物打印機(jī)上。為了制造復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，本文公開的生物打印機(jī)以合適的可重復(fù)精度從墨盒分配生物墨水和/或支撐材料。在各種實施方案中，合適的可重復(fù)精度包括任意軸上約±5、10、20、30、40或50 μ m的可重復(fù)精度。在一些實施方案中，本文公開的生物打印機(jī)以約±20 μ m的可重復(fù)精度從墨盒分配生物墨水和/或支撐材料。但是，墨盒的不受控的移除和插入可導(dǎo)致打印機(jī)頭的位置(因此導(dǎo)致墨盒的位置)相對于組織構(gòu)建體發(fā)生變化，以至于由新墨盒沉積的第一個生物墨水 顆粒的布置精度可相對于由前一墨盒沉積的最后一個生物墨水顆粒發(fā)生變化。因此，需要這樣一種將墨盒接附并固定到打印機(jī)頭上的方法，其中所述接附和固定產(chǎn)生最小的打印機(jī)頭位置變化。在某些實施方案中，本文公開了將墨盒接附到生物打印機(jī)上的方法，包括:(a)將墨盒插入筒夾夾頭中，其中該筒夾夾頭接附在生物打印機(jī)的打印機(jī)頭上；和(b)調(diào)節(jié)筒夾夾頭的外套環(huán)；其中所述插入和調(diào)節(jié)基本上不改變打印機(jī)頭的位置。在某些實施方案中，本文公開了用于將墨盒接附到生物打印機(jī)上的系統(tǒng)，其包含:用于接收墨盒并將其固定到生物打印機(jī)的打印機(jī)頭上的手段；其中使用用于接收和固定墨盒的手段基本上不改變打印機(jī)頭的位置。在一些實施方案中，用于接收墨盒并將其固定到打印機(jī)頭上的手段是夾頭或套圈。本文使用的“夾頭”是指由可調(diào)節(jié)的爪組成的夾持裝置。在一些實施方案中，用于接收墨盒并將其固定到打印機(jī)頭上的手段是筒夾。本文使用的“筒夾”是指夾頭的一個子類型-其在欲夾持的對象周圍形成套環(huán)，并施加強(qiáng)勁的夾緊。本文使用的“套圈”是指用來將一個對象固定到另一個上的帶(例如金屬帶)。在一些實施方案中，用于接收墨盒并將其固定到打印機(jī)頭上的手段是筒接合器。本文使用的“筒接合器”是指用來將一個對象固定到另一個上的螺紋管。
接收表面
在某些實施方案中，本文公開了用于制造組織和器官的生物打印機(jī)。在一些實施方案中，生物打印機(jī)將生物墨水和/或支撐材料的多個元素、部分和/或區(qū)域分配到接收表面上。在進(jìn)一步的實施方案中，分配以特定圖案在特定位置發(fā)生。在更進(jìn)一步的實施方案中，生物打印機(jī)將生物墨水和/或支撐材料沉積到接收表面上的位置由用戶輸入限定，并被翻譯成計算機(jī)代碼。在一些實施方案中，生物墨水和/或支撐材料的元素、部分和/或區(qū)域各自具有小于300mmx300mmxl60mm的尺寸。僅舉例來說，生物墨水或支撐材料的部分的尺寸可以是75mmx5.0mmx5.0mm ；0.3mmx2.5mmx2.5mm ； lmmxlmmx50mm ;或 1 50mmx 1 5Ommx8Omnin 由于各部
分的尺寸通常較小以及在一些情況下需要高精度，接收表面中的微小瑕疵可導(dǎo)致細(xì)胞構(gòu)建體、組織或器官的瑕疵(并可能導(dǎo)致失敗)。因此，對于能夠接收生物墨水和/或支撐材料的部分的基本光滑且基本平坦的接收表面或者限定或基本限定的接收表面存在需求。在某些實施方案中，本文公開了用于接收一個或多個由本文公開的生物打印機(jī)生成的結(jié)構(gòu)的接收表面。在一些實施方案中，接收表面是平坦或基本平坦的。在一些實施方案中，接收表面是光滑或基本光滑的。在一些實施方案中，接收表面是平坦或基本平坦的。在一些實施方案中，接收表面是限定或基本限定的。在其它實施方案中，接收表面經(jīng)特別設(shè)計以適應(yīng)特定的生物打印的結(jié)構(gòu)的形狀、大小、紋理或幾何形狀。在進(jìn)一步的實施方案中，接收表面控制或影響生物打印的構(gòu)建體的大小、形狀、紋理或幾何形狀。在一些實施方案中，接收表面包含固體材料、半固體材料或其組合。在一些實施方案中，接收表面包含玻璃、涂層玻璃、塑料、涂層塑料、金屬、金屬合金或其組合。在一些實施方案中，接收表面包含凝膠。在一些實施方案中，接收表面和其上的任何涂層是生物相容的。在各種實施方案中，接收表面包含本文公開的任何支撐材料和/或限制材料。在特定的實施方案中，接收表面包含聚合的NovoGel 或聚合的瓊脂糖、聚合的明膠、細(xì)胞外基質(zhì)(或其組分)、膠原蛋白或其組合。
軟件
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在某些實施方案中，本文公開了用于制造組織和器官的生物打印機(jī)。在一些實施方案中，接附在生物打印機(jī)上的一個或多個墨盒包含生物墨水和/或支撐材料。在一些實施方案中，生物打印機(jī)以特定圖案在特定位置分配生物墨水或支撐材料，以形成特定的細(xì)胞構(gòu)建體、組織或器官。為了制造復(fù)雜的組織構(gòu)建體，生物打印機(jī)在接收表面上的精確位置(二維或三維)沉積生物墨水或支撐材料。在一些實施方案中，生物打印機(jī)沉積生物墨水和/或支撐材料的位置由用戶輸入限定，并被翻譯成計算機(jī)代碼。在進(jìn)一步的實施方案中，計算機(jī)代碼包括為執(zhí)行特定任務(wù)而寫成的、在數(shù)字處理裝置的中央處理器(CPU)中可執(zhí)行的一系列指令。在一些實施方案中，另外的生物打印參數(shù)，作為非限制性實例，包括打印高度、泵速、機(jī)撲速度和/或可變分配孔口的控制，由用戶輸入限定，并被翻譯成計算機(jī)代碼。在其它實施方案中，此類生物打印參數(shù)不是由用戶輸入直接限定的，而是源自依據(jù)本文描述的計算機(jī)代碼的其它參數(shù)和條件。在某些實施方案中，本文公開了用于制造組織構(gòu)建體、組織和器官的方法，包括:計算機(jī)模塊接收期望的組織構(gòu)建體的視覺表示的輸入；計算機(jī)模塊生成一系列命令，其中該命令基于該視覺表示且可被生物打印機(jī)讀?。挥嬎銠C(jī)模塊將該系列命令提供給生物打印機(jī)；以及生物打印機(jī)按照該命令沉積生物墨水和/或支撐材料，以形成具有限定的幾何形狀的構(gòu)建體。
計算機(jī)可讀介質(zhì)在一些實施方案中，生物打印機(jī)沉積生物墨水和/或支撐材料的位置由用戶輸入限定，并被翻譯成計算機(jī)代碼。在一些實施方案中，本文公開的裝置、系統(tǒng)和方法進(jìn)一步包含計算機(jī)可讀介質(zhì)或用計算機(jī)可讀程序代碼編碼的介質(zhì)。在進(jìn)一步的實施方案中，計算機(jī)可讀介質(zhì)是數(shù)字處理裝置例如生物打印機(jī)(或其組件)或者與生物打印機(jī)(或其組件)相連的計算機(jī)的有形組件。在更進(jìn)一步的實施方案中，計算機(jī)可讀介質(zhì)任選地可從數(shù)字處理裝置移除。在一些實施方案中，作為非限制性實例，計算機(jī)可讀介質(zhì)包括CD-R0M、DVD、閃存裝置、固態(tài)存儲器、磁盤驅(qū)動器、磁帶驅(qū)動器、光盤驅(qū)動器、云計算系統(tǒng)和服務(wù)等。
計算機(jī)模塊在一些實施方案中，本文描述的裝置、系統(tǒng)和方法包含軟件、服務(wù)器和數(shù)據(jù)庫模塊。在一些實施方案中，“計算機(jī)模塊”是與更大的計算機(jī)系統(tǒng)交互的軟件組件(包括一段代碼)。在進(jìn)一步的實施方案中，軟件模塊(或程序模塊)以一個或多個文件的形式出現(xiàn)，并且通常在更大的軟件系統(tǒng)內(nèi)處理特定任務(wù)。在一些實施方案中,模塊包含在一個或多個軟件系統(tǒng)中。在其它實施方案中，模塊與一個或多個其它模塊集成到一個或多個軟件系統(tǒng)中。計算機(jī)模塊任選地是獨立的一段代碼，或任選地是不能單獨識別的代碼。在一些實施方案中，模塊處于單一應(yīng)用程序中。在其它實施方案中，模塊處于多個應(yīng)用程序中。在一些實施方案中，將模塊托管(host)在一臺機(jī)器上。在其它實施方案中，將模塊托管在多臺機(jī)器上。在一些實施方案中，將模塊托管在同一地點的多臺機(jī)器上。在其它實施方案中，將模塊托管在超過一個地點的多臺機(jī)器上。本文進(jìn)一步描述了地點和定位 數(shù)據(jù)的格式化。在一些實施方案中，本文描述的數(shù)據(jù)文件以任何合適的數(shù)據(jù)序列化格式進(jìn)行格式化，作為非限制性實例，所述數(shù)據(jù)序列化格式包括制表符分隔的值、逗號分隔的值、字符分隔的值、定界符分隔的值、XML、JSON、BSON和YAML。計算機(jī)模塊的一個關(guān)鍵特征是其允許最終用戶使用計算機(jī)來執(zhí)行所識別的功能。
圖形用戶界面在一些實施方案中，計算機(jī)模塊包含圖形用戶界面(⑶I)。本文使用的“圖形用戶界面”是指這樣一種用戶環(huán)境，其使用應(yīng)用程序的輸入和輸出的圖像和文本表示形式以及儲存信息的分層或其它數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，計算機(jī)模塊包含顯示屏。在進(jìn)一步的實施方案中，計算機(jī)模塊通過顯示屏呈現(xiàn)二維GUI。在其它實施方案中，計算機(jī)模塊通過顯示屏呈現(xiàn)三維GUI，例如虛擬現(xiàn)實環(huán)境。在一些實施方案中，顯示屏是觸摸屏或多點觸摸屏，并且呈現(xiàn)交互式⑶I。在一些實施方案中，顯示屏呈現(xiàn)基本上由網(wǎng)格組成的⑶I，該網(wǎng)格包含形狀基本相同且大小基本相等的有規(guī)律間隔排列的對象。呈現(xiàn)的對象具有任何合適的形狀。在一些實施方案中，作為非限制性實例，對象的合適形狀包括圓形、卵形、正方形、長方形、三角形、菱形、多邊形或其組合。在一些實施方案中，用戶定義一個或多個對象的內(nèi)容，以形成期望的組織構(gòu)建體的二維或三維視覺表示。參見例如圖4。在一些實施方案中，作為非限制性實例，用戶定義的對象的內(nèi)容是具有各種組成的生物墨水或具有各種組成的支撐材料。在一些實施方案中，用戶通過修改單元(cell)的顏色或?qū)ο蟮男螤顏矶x對象的內(nèi)容。
牛物墨水在某些實施方案中，本文公開了用于制造組織和器官的裝置、系統(tǒng)和方法。在一些實施方案中，該裝置包含一個或多個用于接收和夾持至少一個任選地包含生物墨水的墨盒的打印機(jī)頭。在一些實施方案中，該方法包括使用生物墨水。在進(jìn)一步的實施方案中，利用本文描述的裝置、系統(tǒng)和方法制造的組織和器官在制造時或制造后包含生物墨水。在一些實施方案中，“生物墨水”包括含有多個細(xì)胞的液體、半固體或固體組合物。在一些實施方案中，生物墨水包含液體或半固體的細(xì)胞溶液、細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞濃縮物。在進(jìn)一步的實施方案中，細(xì)胞溶液、懸浮液或濃縮物包含液體或半固體(例如粘性)載體和多個細(xì)胞。在更進(jìn)一步的實施方案中，載體是合適的細(xì)胞營養(yǎng)培養(yǎng)基，例如本文描述的那些細(xì)胞營養(yǎng)培養(yǎng)基。在一些實施方案中，生物墨水包含半固體或固體多細(xì)胞聚集體或多細(xì)胞體。在進(jìn)一步的實施方案中，生物墨水如下生產(chǎn):1)以預(yù)定比例混合多個細(xì)胞或細(xì)胞聚集體和生物相容的液體或凝膠，以得到生物墨水，和2)致密化生物墨水以生產(chǎn)具有期望的細(xì)胞密度和粘度的生物墨水。在一些實施方案中，生物墨水的致密化通過離心、切向流過濾(“TFF”)或其組合來實現(xiàn)。在一些實施方案中，生物墨水的致密化生成可擠出的組合物，從而允許多細(xì)胞聚集體或多細(xì)胞體的形成。在一些實施方案中，“可擠出的”是指能夠強(qiáng)制(例如在壓力下)通過噴嘴或孔口(例如一個或多個孔或管)而成形。在一些實施方案中，生物墨水的致密化由細(xì)胞生長到合適的密度而造成。生物墨水所必需的細(xì)胞密度將隨使用的細(xì)胞和生產(chǎn)的組織或器官而變化。在一些實施方案中，生物墨水的細(xì)胞凝聚和/或粘附。在一些實施方案中，“凝聚”是指粘合細(xì)胞、多細(xì)胞聚集體、多細(xì)胞體和/或它們的層的細(xì)胞間粘附性能。在進(jìn)一步的實施方案中，該術(shù)語與“融合”可交換使用。在一些實施方案中，生物墨水另外還包含支撐材料、細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞外基質(zhì)(或其組分)、細(xì)胞粘附劑、細(xì)胞死亡抑制劑、抗凋亡劑、抗氧化劑、擠出化合物及其組合。
細(xì)胞在各種實施方案·中，本文公開了包括含有多個細(xì)胞的液體、半固體或固體組合物的生物墨水。在一些實施方案中，生物墨水包含液體或半固體的細(xì)胞溶液、細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞濃縮物。在一些實施方案中，任何哺乳動物細(xì)胞都適合在生物墨水中使用和在使用本文描述的裝置、系統(tǒng)和方法的組織和器官制造中使用。在各種實施方案中，細(xì)胞是任何合適的細(xì)胞。在進(jìn)一步的各種實施方案中，細(xì)胞是脊椎動物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、人細(xì)胞或其組合。在一些實施方案中，在本文公開的方法中使用的細(xì)胞類型取決于所生產(chǎn)的細(xì)胞構(gòu)建體、組織或器官的類型。在一些實施方案中，生物墨水包含一個細(xì)胞類型(也稱為“同源墨水”)。在一些實施方案中，生物墨水包含超過一個細(xì)胞類型(也稱為“異源墨水”)。在進(jìn)一步的實施方案中，作為非限制性實例，細(xì)胞是收縮性細(xì)胞或肌肉細(xì)胞(例如骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成肌細(xì)胞)、結(jié)締組織細(xì)胞(例如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，以及分化成骨形成細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或淋巴組織的細(xì)胞)、骨髓細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、上皮細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、血管細(xì)胞、血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、許旺細(xì)胞、胃腸道細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肺細(xì)胞、氣管細(xì)胞、角膜細(xì)胞、泌尿生殖細(xì)胞、腎細(xì)胞、生殖細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、實質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、間皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、未分化細(xì)胞(例如胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞和祖細(xì)胞)、內(nèi)胚層源細(xì)胞、中胚層源細(xì)胞、外胚層源細(xì)胞及其組合。
在一些實施方案中，細(xì)胞是成體分化細(xì)胞。在進(jìn)一步的實施方案中，“分化細(xì)胞”是在分離時具有與例如平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞一致的組織特異性表型的細(xì)胞，其中該組織特異性表型(或展現(xiàn)該表型的潛能)從分離時保持到使用時。在其它實施方案中，細(xì)胞是成體未分化細(xì)胞。在進(jìn)一步的實施方案中，“未分化細(xì)胞”是不具有或已失去例如平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的明確的組織特異性性狀的細(xì)胞。在一些實施方案中，未分化細(xì)胞包括干細(xì)胞。在進(jìn)一步的實施方案中，“干細(xì)胞”是展示出潛能和自我更新的細(xì)胞。干細(xì)胞包括但不限于全能細(xì)胞、多潛能細(xì)胞、多能細(xì)胞、寡能細(xì)胞、單能細(xì)胞和祖細(xì)胞。干細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、羊膜干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。在另外的其它實施方案中，細(xì)胞是成體分化細(xì)胞和成體未分化細(xì)胞的混合物。
細(xì)胞培養(yǎng)基在一些實施方案中，生物墨水包含細(xì)胞培養(yǎng)基。該細(xì)胞培養(yǎng)基是任何合適的培養(yǎng)基。在各種實施方案中，作為非限制性實例，合適的細(xì)胞培養(yǎng)基包括Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水、Earle平衡鹽、Hanks平衡鹽、Tyrode鹽、Alsever溶液、Gey平衡鹽溶液、改良的Kreb-Henseleit緩沖液、Kreb-Ringer碳酸氫鹽緩沖液、Puck鹽水、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基/養(yǎng)分F_12Ham、養(yǎng)分混合物F_10Ham(Ham’ sF-10)、培養(yǎng)基199、最 低基本培養(yǎng)基Eagle、RPM1-1640培養(yǎng)基、Ames培養(yǎng)基、BGJb培養(yǎng)基(Fitton-Jackson 改良)、Click 培養(yǎng)基、CMRL-1066 培養(yǎng)基、Fischer 培養(yǎng)基、Glascow 最低基本培養(yǎng)基(GMEM)、Iscove 改良的 Dulbecco 培養(yǎng)基(IMDM)、L-15 培養(yǎng)基(Leibovitz)、McCoy 5A改良培養(yǎng)基、NCTC培養(yǎng)基、Swim S-77培養(yǎng)基、Waymouth培養(yǎng)基、WiIIiam培養(yǎng)基E或其組合。在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基是改良的或補充的。在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含白蛋白、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胎球蛋白、糖、氨基酸、維生素、生長因子、細(xì)胞因子、激素、抗生素、脂質(zhì)、脂質(zhì)載體、環(huán)糊精或其組合。
細(xì)胞外基質(zhì)在一些實施方案中，生物墨水進(jìn)一步包含細(xì)胞外基質(zhì)的一種或多種組分或其衍生物。在一些實施方案中，“細(xì)胞外基質(zhì)”包括由細(xì)胞產(chǎn)生并轉(zhuǎn)運出細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞外隙的蛋白質(zhì)，它們在細(xì)胞外隙中可作為支撐用來將組織保持在一起、提供抗張強(qiáng)度和/或促進(jìn)細(xì)胞信號傳導(dǎo)。細(xì)胞外基質(zhì)組分的實例包括但不限于膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸鹽、彈性蛋白和蛋白聚糖。例如，多細(xì)胞聚集體可包含多種ECM蛋白(例如明膠、纖維蛋白原、纖維蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白和/或蛋白聚糖)。ECM組分或ECM組分的衍生物可添加到用來形成多細(xì)胞聚集體的細(xì)胞糊中。添加到細(xì)胞糊中的ECM組分或ECM組分的衍生物可從人或動物來源純化而來，或者通過本領(lǐng)域已知的重組方法生產(chǎn)。或者，ECM組分或ECM組分的衍生物可以由伸長細(xì)胞體中的細(xì)胞自然分泌，或者可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法對用于產(chǎn)生伸長細(xì)胞體的細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作，以改變一種或多種ECM組分或ECM組分的衍生物和/或一種或多種細(xì)胞粘附分子或細(xì)胞-基底粘附分子(例如選擇蛋白、整聯(lián)蛋白、免疫球蛋白和黏附素(adherins))的表達(dá)水平。ECM組分或ECM組分的衍生物可促進(jìn)多細(xì)胞聚集體中的細(xì)胞凝聚。例如，可適當(dāng)?shù)叵蛴脕硇纬啥嗉?xì)胞聚集體的細(xì)胞糊中添加明膠和/或纖維蛋白原。然后可以通過添加凝血酶使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白。在一些實施方案中，生物墨水進(jìn)一步包含促進(jìn)細(xì)胞粘附的試劑。
在一些實施方案中，生物墨水進(jìn)一步包含抑制細(xì)胞死亡(例如壞死、凋亡或自吞噬作用)的試劑。在一些實施方案中，生物墨水進(jìn)一步包含抗凋亡劑。抑制細(xì)胞死亡的試劑包括但不限于小分子、抗體、肽、肽體(peptibodies)或其組合。在一些實施方案中，抑制細(xì)胞死亡的試劑選自:抗-TNF劑、抑制白細(xì)胞介素活性的試劑、抑制干擾素活性的試劑、抑制GCSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)活性的試劑、抑制巨噬細(xì)胞炎性蛋白活性的試劑、抑制TGF-B(轉(zhuǎn)化生長因子B)活性的試劑、抑制MMP(基質(zhì)金屬蛋白酶)活性的試劑、抑制胱天蛋白酶活性的試劑、抑制MAPK/JNK信號傳導(dǎo)級聯(lián)活性的試劑、抑制Src激酶活性的試劑、抑制JAK(Janus激酶)活性的試劑或其組合。在一些實施方案中，生物墨水包含抗氧化劑。
擠出化合物在一些實施方案中，生物墨水進(jìn)一步包含擠出化合物(即，改變生物墨水的擠出性能的化合物)。擠出化合物的實例包括但不限于凝膠、水凝膠、表面活性劑多元醇(例如Pluronic F-127或PF-127)、溫度敏感性聚合物、透明質(zhì)酸鹽、藻酸鹽、細(xì)胞外基質(zhì)組分(及其衍生物)、膠原蛋白、其它生物相容的天然或合成聚合物、納米纖維和自組裝納米纖維。已用多種方式定義了凝膠(有時也稱為凍膠)。例如，美國藥典將凝膠定義為由以無機(jī)小顆粒構(gòu)成的懸浮液或經(jīng)液體滲透的有機(jī)大分子組成的半固體體系。凝膠包括單相或兩相體系。單相凝膠由以在分散的大分子和液體之間不存在明顯界限的方式均勻分布在整個液體中的有機(jī)大分子組成。一些單相凝膠由合成大分子(例如卡波姆)或由天然樹膠(例如黃蓍膠)制備而成。在一些實施方案中，單相凝膠通常是水性的，但也會使用醇和油來制備。兩相凝膠由離散小顆粒的網(wǎng)絡(luò)組成。凝膠還可分類為疏水性或親水性的。在某些實施方案中，疏水性凝膠的基質(zhì)由用膠體二氧化硅或者鋁皂或鋅皂膠凝的液體石蠟與聚乙烯或脂肪油組成。相反，疏水性凝膠的基質(zhì)一般由用合適的膠凝劑(例如黃蓍膠、淀粉、纖維素衍生物、羧乙烯聚合物和硅酸鎂鋁)膠凝的水、甘油或丙二醇組成。在某些實施方案中，本文公開的組合物或裝置的流變學(xué)是假塑性、塑性、觸變性或脹流性的。合適的水凝膠包括源自膠原蛋白、透明質(zhì)酸鹽、纖維蛋白、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖及其組合的水凝膠。在其它實施方案中，合適的水凝膠是合成的聚合物。在進(jìn)一步的實施方案中，合適的水凝膠包括源自聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(環(huán)氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其組合的水凝膠。在各種具體的實施方案中，支撐材料選自:水凝膠、NovoGel 、瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、Matrigel 、透明質(zhì)酸、泊洛沙姆、肽水凝膠、聚(異丙基η-聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羥乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、絲或其組合。在一些實施方案中，基于水凝膠的擠出化合物是熱可逆的凝膠(也稱作溫度敏感性凝膠或熱凝膠(thermogels))。在一些實施方案中,合適的熱可逆的水凝膠在室溫下不是液體。在特定實施方案中，合適的水凝膠的膠凝溫度(Tgel)為約10°C、約15°C、約20°C、約25°C、約30°C、約35°C和約40°C，包括其間的值。在某些實施方案中，合適的水凝膠的Tgel為約10°C到約25°C。在一些實施方案中，本文描述的生物墨水(例如，包含水凝膠、一個或多個細(xì)胞類型和其它添加劑等)在室溫下不是液體。在特定實施方案中，本文描述的生物墨水的膠凝溫度(Tge l)為約10°C、約15°C、約20°C、約25°C、約30°C、約35°C和約40°C，包括其間的值。在某些實施方案中，本文描述的生物墨水的Tgel為約10°C到約25°C。
由聚氧丙烯和聚氧乙烯組成的聚合物在并入水溶液中時形成熱可逆的凝膠。這些聚合物具有在可在生物打印機(jī)設(shè)備中保持的溫度下由液態(tài)變?yōu)槟z態(tài)的能力。液態(tài)至凝膠態(tài)的相變?nèi)Q于溶液中的聚合物濃度和成分。泊洛沙姆407 (Pluronic F-127或PF-127)是由聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物組成的非離子型表面活性劑。其它的泊洛沙姆包括188(F-68級)、237(F-87級)、338(F_108級)。泊洛沙姆的水溶液在酸、堿和金屬離子的存在下是穩(wěn)定的。PF-127是市售的通式為E106P70E106且平均摩爾質(zhì)量為13，000的聚氧乙烯-聚氧丙烯三嵌段共聚物。該聚合物可通過會增強(qiáng)聚合物的膠凝性能的合適的方法進(jìn)一步純化。它包含大約70%的環(huán)氧乙烷，這解釋了它的親水性。它是泊洛沙姆ABA嵌段共聚物系列之一。PF-127具有良好的增溶能力、低毒性，因此被認(rèn)為是一種合適的擠出化合物。在一些實施方案中，通過描述的任何手段來測量本文提出的水凝膠和生物墨水的粘度。例如，在一些實施方案中，使用LVDV-1I+CP錐板粘度計(Cone Plate Viscometer)和錐轉(zhuǎn)子(Cone Spindle) CPE-40來計算水凝膠和生物墨水的粘度。在其它實施方案中，使用Brookfield(轉(zhuǎn)子和杯)粘度計來計算水凝膠和生物墨水的粘度。在一些實施方案中，在室溫下測量本文提及的粘度范圍。在其它實施方案中，在體溫下(例如在健康人的平均體溫下)測量本文提及的粘度范圍。在進(jìn)一步的實施方案中，水凝膠和/或生物墨水的特征在于具有約500至
I,000，000 厘泊、約 750 至 I, 000，000 厘泊、約 1000 至 I, 000，000 厘泊、約 1000 至 400，000厘泊、約2000至100，000厘泊、約3000至50，000厘泊、約4000至25，000厘泊、約5000至20，000厘泊或約6000至15，000厘泊的粘度。在一些實施方案中，生物墨水包含適用于連續(xù)生物打印的細(xì)胞和擠出化合物。在特定的實施方案中，生物墨水具有約1500mPa.s的粘度。Pluronic F-127和細(xì)胞材料的混合物可能適用于連續(xù)生物打印。這樣的生物墨水可如此制備:在48小時內(nèi)，通過在冷的(4°C)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中連續(xù)混合，溶解Pluronic F-127粉末到30% (w/v)。Pluronic F-127也 可在水中溶解?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)無菌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)和擴(kuò)增細(xì)胞。細(xì)胞可以例如以200g沉淀成塊，在30% Pluronic F-127中重懸，并吸入附于生物打印機(jī)的儲器中，其在儲器中可在約10到約25°C的膠凝溫度下凝固。生物墨水在生物打印前的膠凝是任選的。生物墨水，包括含Pluronic F-127的生物墨水，可以作為液體進(jìn)行分配。在各種實施方案中，Pluronic F-127的濃度可以是具有合適的粘度和/或細(xì)胞毒性性質(zhì)的任何值。生物打印后，合適濃度的Pluronic F-127還可能能夠在保持其形狀的同時支撐重量。在一些實施方案中，Pluronic F-127的濃度為約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%或約50%。在一些實施方案中，Pluronic F-127的濃度為約30%至約40%，或約30%至約35%。圖5描繪了通過使用與帶有510 μ m針頭的注射器相連的NovoGen MMX 生物打印機(jī)連續(xù)沉積PF-127而生成的三維金字塔形構(gòu)建體。圖6描述了通過使用與帶有510 μ m針頭的注射器相連的NovoGen MMX 生物打印機(jī)連續(xù)沉積PF-127而生成的三維立方體形(左圖)和空心立方體形(右圖)構(gòu)建體。在一些實施方案中，在使用前除去生物墨水的非細(xì)胞組分(例如，擠出化合物等)。在進(jìn)一步的實施方案中，非細(xì)胞組分是例如水凝膠、表面活性劑多元醇、溫度敏感性聚合物、透明質(zhì)酸鹽、藻酸鹽、膠原蛋白或其它生物相容的天然或合成聚合物。在更進(jìn)一步的實施方案中，通過物理、化學(xué)或酶手段除去非細(xì)胞組分。在一些實施方案中，在使用時一定比例的非細(xì)胞組分保持與細(xì)胞組分關(guān)聯(lián)。在一些實施方案中，預(yù)處理細(xì)胞以增加細(xì)胞的相互作用。例如，細(xì)胞可以在離心后在離心管內(nèi)培養(yǎng)，以在生物墨水成形前增強(qiáng)細(xì)胞間的相互作用。
支撐材料在某些實施方案中，本文公開了用于制造組織和器官的裝置、系統(tǒng)和方法。在一些實施方案中，該裝置包含一個或多個用于接收和夾持至少一個任選地包含支撐材料的墨盒的打印機(jī)頭。在一些實施方案中，該方法包括使用支撐材料。在進(jìn)一步的實施方案中，利用本文描述的裝置、系統(tǒng)和方法制造的組織和器官在制造時或制造后包含支撐材料。在一些實施方案中，支撐材料能夠拒絕細(xì)胞生長或遷移到其中或附著于其上。在一些實施方案中，支撐材料對營養(yǎng)培養(yǎng)基而言是可滲透的。在一些實施方案中，支撐材料的粘度是可改變的。在一些實施方案中，通過改變支撐材料的溫度來改變支撐材料的粘度。在一些實施方案中，通過改變支撐材料的壓力來改變支撐材料的粘度。在一些實施方案中，通過改變支撐材料的濃度來改變支撐材料的粘度。在一些實施方案中，通過交聯(lián)(例如通過使用化學(xué)交聯(lián)劑)或光致交聯(lián)(例如使用紫外線暴露)來改變支撐材料的粘度。在一些實施方案中，支撐材料的滲透性是可改變的。在一些實施方案中，通過改變支撐材料的溫度或支撐材料周圍的溫度來改變支撐材料的滲透性。在一些實施方案中，通過讓支撐材料與改變滲透性的試劑接觸來改變支撐材料的滲透性。在一些實施方案中，改變支撐材料的順應(yīng)性(compliance)(即，彈性或硬度)。在一些實施方案中，通過改變支撐材料的溫度或支撐材料周圍的溫度來改變支撐材料的順應(yīng)性。在一些實施方案 中，通過使支撐材料與改變順應(yīng)性的試劑接觸來改變支撐材料的順應(yīng)性。許多支撐材料適用于本文描述的方法。在一些實施方案中，水凝膠是具有一種或多種有利性質(zhì)的示例性支撐材料，所述性質(zhì)包括:不可粘附、生物相容、可擠出、可生物打印、非細(xì)胞和具有合適的強(qiáng)度。在一些實施方案中，合適的水凝膠是天然聚合物。在一個實施方案中，限制材料由NovoGel 組成。在進(jìn)一步的實施方案中，合適的水凝膠包括源自表面活性劑多元醇(例如Pluronic F-127)、膠原蛋白、透明質(zhì)酸鹽、纖維蛋白、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖、其衍生物或組合的水凝膠。在其它實施方案中，合適的水凝膠是合成聚合物。在進(jìn)一步的實施方案中，合適的水凝膠包括源自聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(環(huán)氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其組合的水凝膠。在各種具體的實施方案中，限制材料選自:水凝膠、NovoGel 、瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、Matrigel 、透明質(zhì)酸、泊洛沙姆、肽水凝膠、聚(異丙基η-聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羥乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、絲或其組合。在一些實施方案中，支撐材料在存在于生物打印機(jī)中之前包含細(xì)胞。在一些實施方案中，支撐材料是包含細(xì)胞懸浮液的水凝膠。在一些實施方案中，支撐材料是包含超過一種細(xì)胞類型的混合物的水凝膠。
支撐材料的示例性用途
在一些實施方案中，支撐材料用作構(gòu)造生物構(gòu)建體(例如細(xì)胞構(gòu)建體、組織、器官等)的構(gòu)建單元。在進(jìn)一步的實施方案中，支撐材料單元用來限定和保持期望的構(gòu)建體的缺乏細(xì)胞材料的域(即，中間細(xì)胞單元)。在一些實施方案中，支撐材料能夠采用任何形狀或大小。例如，根據(jù)一個實施方案，可加熱NovoGel 溶液(最初為與緩沖液和水混合的粉末相)以降低其粘度，并將其吸入到具有所需尺寸的微量移液器中(或通過活塞的負(fù)位移進(jìn)入所需形狀的室中)。可冷卻移液器(或室)中的NovoGel 溶液至室溫，例如通過對移液器(或室)外部進(jìn)行強(qiáng)制風(fēng)冷或?qū)⑽⒘恳埔浩鞑迦牒欣湟后w的容器中，以便其可以凝固成具有所需形狀的凝膠，即支撐材料。得到的支撐材料可在特定細(xì)胞構(gòu)建體、組織或器官的構(gòu)建期間從移液器或室分配。參見例如圖4。在一些實施方案中，使用支撐材料來提高工程化組織或器官在生物打印后的存活能力。在進(jìn)一步的實施方案中，支撐材料提供了組織或器官與營養(yǎng)培養(yǎng)基之間穿過臨時或半永久的限制材料(例如支撐材料)柵格的直接接觸。在一些實施方案中，組織被限制在多孔或有間隙的材料中。該組織或器官的至少一些細(xì)胞直接獲取養(yǎng)分提高了該組織或器官的存活能力。在進(jìn)一步的實施方案中，本文公開的方法包括另外的和任選的用于提高工程化組織或器官存活能力的步驟，包括:1)任選地在放置凝聚的多細(xì)胞聚集體之前分配限制材料(例如支撐材料)的基底層；2)任選地分配限制材料的周界；3)在限定的幾何形狀內(nèi)生物打印組織的細(xì)胞；和4)以在限制材料中引入間隙的圖案(例如柵格、篩網(wǎng)或網(wǎng)格)，分配限制材料的伸長體(例如圓柱體、帶狀物等)，覆蓋初生的組織。在一些實施方案中，覆蓋圖案的間隙均勻或基本均勻地分布在組織或器官的表面周圍。在其它實施方案中，間隙不均勻地分布，因而組織或器官的細(xì)胞不均勻地暴露于養(yǎng)分。在不均勻的實施方案中，可利用存在差異的養(yǎng)分獲取性來影響組織或器官的一種或多種性能。例如，可能期望使生物打印的細(xì)胞構(gòu)建體、組織或器官的一個表面上的細(xì)胞比另一表面上的細(xì)胞增殖得更快。在一些實施方案中，組織或器官的各個部分對養(yǎng)分的暴露可在不同的時間變化，以影響組織或器官朝期望的終`點的發(fā)育。在一些實施方案中，在任何合適的時間移除限制材料，包括但不限于在生物打印后立即(例如在10分鐘內(nèi))、在生物打印后(例如在10分鐘后)、在細(xì)胞彼此基本凝聚前、在細(xì)胞彼此基本凝聚后、在細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)前、在細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)后、恰在使用前，等等。在各種實施方案中，通過任何合適的方法移除限制材料。例如，在一些實施方案中，限制材料被切除、脫離細(xì)胞、消化或溶解。
用于校準(zhǔn)生物打印機(jī)墨盒位置的方法和系統(tǒng)在某些實施方案中，本文公開了用于制造組織和器官的生物打印機(jī)。在一些實施方案中，接附到生物打印機(jī)上的墨盒包含生物墨水和/或支撐材料。在一些實施方案中，生物打印機(jī)以特定圖案在特定位置沉積生物墨水或支撐材料，以形成特定的細(xì)胞構(gòu)建體。在一些實施方案中，包含生物墨水的墨盒是一次性的。在一些實施方案中，墨盒在擠出、分配或沉積內(nèi)容物之后從生物打印機(jī)上退出。在一些實施方案中，新的墨盒接附到生物打印機(jī)上。為了制造復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，本文公開的生物打印機(jī)以合適的可重復(fù)精度從墨盒分配生物墨水和/或支撐材料。在各種實施方案中，合適的可重復(fù)精度包括任意軸上約±5、10、
20、30、40或50μπι的精度。在一些實施方案中，本文公開的生物打印機(jī)以約±20 μ m的可重復(fù)精度從墨盒分配生物墨水和/或支撐材料。但是，在一些實施方案中，由于墨盒的移除和插入，打印機(jī)頭(因此墨盒)相對于組織構(gòu)建體的位置發(fā)生變化。因此，對于精確地校準(zhǔn)打印機(jī)頭、墨盒和分配孔口相對于打印機(jī)臺、接收表面、組織或器官的位置的方法，存在需求。在一些實施方案中，校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的方法包括使用至少一道激光。在進(jìn)一步的實施方案中，校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的方法包括使用第一和第二激光。在一些實施方案中，校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的方法包括手動(例如目視)校準(zhǔn)。在一些實施方案中，校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的方法包括手動校準(zhǔn)和激光校準(zhǔn)。在一些實施方案中，沿一個軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選自X軸、y軸和z軸。在一些實施方案中，沿兩個軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選自X軸、y軸和Z軸。在一些實施方案中，沿三個軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選自X軸、y軸和z軸。在一些實施方案中，利用至少一道激光進(jìn)行校準(zhǔn)。在進(jìn)一步的實施方案中，利用第一和第二激光進(jìn)行校準(zhǔn)。
使用水平激光進(jìn)行校準(zhǔn)的方法在某些實施方案中，本文公開了校準(zhǔn)包含分配孔口的打印機(jī)頭的位置的方法。在一些實施方案中，本文公開的方法進(jìn) 一步包括激發(fā)激光并生成至少一道基本穩(wěn)定和/或基本靜止的激光束，并且其中所述激光束與地面平行。參見圖1。在一些實施方案中，該方法包括沿至少一個軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置，其中該軸選自X軸、y軸和z軸。在一些實施方案中，該方法包括沿至少兩個軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置，其中該軸選自X軸、y軸和z軸。在一些實施方案中，該方法包括沿至少三個軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置，其中該軸選自X軸、y軸和Z軸。在一些實施方案中，該方法包括(a)沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置；(b)沿X軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置；和/或(C)沿Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置；其中各軸對應(yīng)于笛卡爾坐標(biāo)系中同名的軸。在一些實施方案中，利用至少一道激光進(jìn)行校準(zhǔn)。在一些實施方案中，利用第一和第二激光進(jìn)行校準(zhǔn)。在一些實施方案中，沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括:(a)定位打印機(jī)頭，使得打印機(jī)頭(i)位于第一 y卦限且(ii)分配孔口低于激光束的上閾限；(b)向激光束移動打印機(jī)頭，并且在激光束被打印機(jī)頭中斷時立即停止所述移動，其中激光束被打印機(jī)頭中斷的位置是第一 y位置；(c)重新定位打印機(jī)頭，使得打印機(jī)頭位于第二 y卦限且分配孔口低于激光束的上閾限；(d)向激光束移動打印機(jī)頭，并且在激光束被打印機(jī)頭中斷時立即停止所述移動，其中激光束被中斷的位置是第二 I位置；(e)并計算第一 y位置和第二 y位置之間的中點。在一些實施方案中，沿X軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括:(a)將打印機(jī)頭定位(i)在第一y位置和第二y位置之間的中點且(ii)在激光的傳感器閥限以外；和(b)向傳感器閥限移動打印機(jī)頭，并且在打印機(jī)頭接觸傳感器閥限時立即停止所述移動；其中打印機(jī)頭接觸傳感器的位置加上半個打印機(jī)頭寬度為X位置。在一些實施方案中，沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括:(a)定位打印機(jī)頭，使得激光束可測量打印機(jī)頭的一側(cè)的精確位置；(b)定位打印機(jī)頭，使得激光束可測量打印機(jī)頭的對側(cè)的精確位置；(C)并相對于每次測量過程中的激光位置和測量的距離，計算打印機(jī)頭的中點位置。在一些實施方案中，沿X軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括:(a)定位打印機(jī)頭，使得激光束可測量打印機(jī)頭的一側(cè)的精確位置；(b)定位打印機(jī)頭，使得激光束可測量打印機(jī)頭的對側(cè)的精確位置；(C)并相對于每次測量過程中的激光位置和測量的距離，計算打印機(jī)頭的中點位置。在一些實施方案中，沿z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括:(a)定位打印機(jī)頭，使得分配孔口位于激光束上方；和(b)向激光束移動打印機(jī)頭，并且在激光束被打印機(jī)頭中斷時立即停止所述移動，其中激光束被中斷的位置是z位置。
使用垂直激光進(jìn)行校準(zhǔn)的方法在某些實施方案中，本文公開了校準(zhǔn)包含分配孔口的打印機(jī)頭的位置的方法。在一些實施方案中，本文公開的方法進(jìn)一步包括激發(fā)激光并生成至少一道基本穩(wěn)定和/或基本靜止的激光束，并且其中所述激光束與地面垂直。參見圖2。在一些實施方案中，該方法包括沿至少一個軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選自X軸、y軸和z軸。在一些實施方案中，該方法包括沿至少兩個軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選自X軸、y軸和z軸。在一些實施方案中，該方法包括沿至少三個軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選自X軸、y軸和z軸。在一些實施方案中，該方法包括(a)沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置；(b)沿x軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置；和(C)沿z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置；其中各軸對應(yīng)于笛卡爾坐標(biāo)系中的同名軸。在一些實施方案中，沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括:(a)定位打印機(jī)頭，使得打印機(jī)頭⑴位于第一 y卦限且(·ii)分配孔口在激光的傳感器閥限以外；(b)向激光束移動打印機(jī)頭，并且在激光束被打印機(jī)頭中斷時立即停止所述移動，其中激光束被打印機(jī)頭中斷的位置是第一 y位置；(c)重新定位打印機(jī)頭，使得打印機(jī)頭位于第二 y卦限且分配孔口在激光的傳感器閥限以外；(d)向激光束移動打印機(jī)頭，并且在激光束被打印機(jī)頭中斷時立即停止所述移動，其中激光束被中斷的位置是第二 y位置；(e)并計算第一 y位置和第二 y位置之間的中點。在一些實施方案中，沿X軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括:(a)將打印機(jī)頭定位(i)在第一 y位置和第二 y位置之間的中點，且(ii)在激光的傳感器閥限以外；和(b)向傳感器閥限移動打印機(jī)頭，并且在打印機(jī)頭接觸傳感器閥限時立即停止所述移動；其中打印機(jī)頭接觸傳感器的位置加上半個打印機(jī)頭寬度為X位置。在一些實施方案中，沿z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括:(a)定位打印機(jī)頭，使得分配孔口位于激光束上方，使得其恰在激光傳感器范圍閥限以外；和(b)降低打印機(jī)頭，直至達(dá)到傳感器閥限，其中達(dá)到激光傳感器閥限的位置是z位置。在一些實施方案中，在打印機(jī)頭的多個點重復(fù)步驟(a)和(b)，并對測量的高度取平均值，以確定z位置。在一些實施方案中，沿z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置包括:(a)定位打印機(jī)頭，使得激光束可以測量打印機(jī)頭底部上的一個或多個點的精確位置；(b)基于該激光位置和已知的測量的距離，計算打印機(jī)頭的絕對或平均位置。
使用垂直和水平激光進(jìn)行校準(zhǔn)的方法
在某些實施方案中，本文公開了校準(zhǔn)包含分配孔口的打印機(jī)頭的位置的方法，其中打印機(jī)頭接附在生物打印機(jī)上，該方法包括沿至少一個軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選自X軸、y軸和z軸。在一些實施方案中，該方法包括沿至少兩個軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選自X軸、y軸和Z軸。在一些實施方案中，該方法包括沿至少三個軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置，其中該軸選自X軸、y軸和z軸。在一些實施方案中，該方法包括(a)沿y軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置；(b)沿x軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置；和(C)沿z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的位置；其中各軸對應(yīng)于笛卡爾坐標(biāo)系中的同名軸。在一些實施方案中，校準(zhǔn)包括使用第一激光和第二激光。在一些實施方案中，第一激光是垂直的激光，而第二激光是水平的激光。
使用激光進(jìn)行校準(zhǔn)的系統(tǒng)在某些實施方案中，本文公開了用于校準(zhǔn)包含沉積孔口的墨盒的位置的系統(tǒng)，其中墨盒接附在生物打印機(jī)上，所述系統(tǒng)包含:用于沿至少一個軸校準(zhǔn)墨盒位置的手段，其中該軸選自y軸、X軸和z軸。在某些實施方案中，本文還公開了用于校準(zhǔn)包含分配孔口的打印機(jī)頭的位置的系統(tǒng)，其中打印機(jī)頭接附在生物打印機(jī)上，所述系統(tǒng)包含:用于沿X軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的手段；用于沿I軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的手段；和用于沿Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的手段。在一些實施方案中，用于校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的系統(tǒng)包含用于沿X軸、y軸和z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的手段。在一些實施方案中，用于沿X軸、y軸和Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的手段是激光準(zhǔn)直、光學(xué)準(zhǔn)直、機(jī)械準(zhǔn)直、壓電準(zhǔn)直、磁力準(zhǔn)直、電場或電容準(zhǔn)直、超聲準(zhǔn)直或其組合。在一些實施方案中，用于校準(zhǔn)打印機(jī)頭位置的系統(tǒng)包含用于沿X軸、y軸和z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的手段。在一 些實施方案中，用于沿X軸、y軸和Z軸校準(zhǔn)打印機(jī)頭的手段是激光準(zhǔn)直。在一些實施方案中，激光準(zhǔn)直手段包含至少一道激光。在一些實施方案中，激光準(zhǔn)直手段包含多道激光。在一些實施方案中，激光準(zhǔn)直意味著其具有任何合適的精度。在各種實施方案中，合適的精度包括任意軸上約±5、10、20、30、40或50μπι的精度。在一些實施方案中，激光準(zhǔn)直手段精確到垂直軸上±40 μ m和水平軸上±20 μ m。在一些實施方案中,在激光源和測量點之間的激光路徑未中斷。在一些實施方案中，通過使用反射表面或光學(xué)透鏡，激光路徑改變了最多179°。在一些實施方案中，激光路徑改變了 90°。在一些實施方案中，使用水平激光束，通過利用反射表面偏轉(zhuǎn)，在垂直路徑上進(jìn)行測量。在一些實施方案中，使用垂直激光束，通過利用反射表面偏轉(zhuǎn)，在水平路徑上進(jìn)行測量。
實施例以下具體實施例僅應(yīng)解釋為說明性的，并且不以任何方式限制本公開內(nèi)容的其余部分。無需進(jìn)一步詳述，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于本文的描述最大程度地利用本發(fā)明。本文引用的所有出版物特此通過引用全文并入。其引用證明了此類信息的可用性和公開傳播。
實施例1:HASMC-HAEC混合細(xì)朐圓梓體 細(xì)胞培養(yǎng)
平滑肌細(xì)胞:使原代人主動脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)在補充有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml 青霉素、0.lmg/ml 鏈霉素、0.25 μ g/ml 兩性霉素 B,0.0lM HEPES (全部來自Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)、50mg/L 腦氛酸、50mg/L 甘氛酸、20mg/L 丙氛酸、50mg/L抗壞血酸和3 μ g/L CuSO4 (全部來自Sigma, St.Louis,MO)的低葡萄糖Dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(DMEM ；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中于 37°C和 5% CO2 下保持和擴(kuò)充。在所有研究中使用第4代至第8代的HASMC的鋪滿培養(yǎng)物。內(nèi)皮細(xì)胞:使原代人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)在補充有2% FBS, I μ g/ml氫化可的松、10ng/ml人表皮生長因子、3ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10 μ g/ml肝素、100U/ml青霉素,0.lmg/ml 鏈霉素和 0.25 μ g/ml 兩性霉素 B (全部來自 Invitrogen Corp.，Carlsbad,CA)的培養(yǎng)基200中保持和擴(kuò)充。細(xì)胞在37°C和5% CO2下在經(jīng)明膠(來自豬血清；Sigma，St.Louis,MO)包被的組織培養(yǎng)基處理的培養(yǎng)瓶中生長。在所有研究中使用第4傳至第8代的HAEC的鋪滿培養(yǎng)物。
NovoGel 模具2% w/v NovoGel 溶液的制備:將Ig低熔點NovoGel 在50mlDulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)中溶解。簡言之，在加熱板上將DPBS和NovoGel 加熱到85°C，持續(xù)攪拌直到NovoGel 完全溶解。通過在125°C下蒸汽滅菌25分鐘對NovoGel 溶液進(jìn)行滅菌。只要溫度保持在66.50C以上，NovoGel 溶液就停留在液相。低于這一溫度則發(fā)生相變，NovoGel 溶液的粘度增加，且NovoGel 形成固體凝膠。NovoGel 模具的制備:使用適合IOcm培養(yǎng)皿的丁eflon_'R模具，制造用于溫育細(xì)胞圓柱體的NovoGel 模具。簡言之，使用70%乙醇溶液對Tefl01^模具進(jìn)行預(yù)先滅菌，并使模具經(jīng)受紫外線照射45分鐘。將滅菌的模具放置在IOcm培養(yǎng)皿(VWR International LLC,ffestChester, PA)頂上并牢固接附。使這一組裝件(Teflon 模具+培養(yǎng)皿)保持垂直，并將45ml預(yù)溫?zé)岬臒o菌2% NovoGel 溶液倒入Teflon 模具和培養(yǎng)皿之間的空間中。然后將組裝件在室溫下水平放置I小時，以使NovoGel 完全膠凝。膠凝后，移除TeflonR印模，并用DPBS洗滌No voGel 模具兩次。然后向NovoGel 模具添加17.5mlHASMC培養(yǎng)基。
HASMC-HAEC 圓柱體HASMC-HAEC混合細(xì)胞圓柱體的制造:為了制備混合細(xì)胞圓柱體，單獨收集HASMC和HAEC，然后以預(yù)定比例混合。簡言之，從鋪滿培養(yǎng)瓶中除去培養(yǎng)基，并用DPBS(lml/5cm2生長區(qū)域)洗滌細(xì)胞。通過在胰蛋白酶(lml/15cm2生長區(qū)域)的存在下溫育10分鐘，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶表面脫離。使用0.15%胰蛋白酶使HASMC脫離，而使用0.1 %胰蛋白酶使HAEC脫離。溫育后向瓶中添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(相對于胰蛋白酶體積的2X體積)。將細(xì)胞懸浮液在200g下離心6分鐘，接著完全移除上清液。將細(xì)胞沉淀在各自的培養(yǎng)基中重懸，并使用血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行計數(shù)。合并適當(dāng)體積的HASMC和HAEC，產(chǎn)生含有5、7.5、10、12.5和15%HAEC(作為總細(xì)胞群的％)的混合細(xì)胞懸浮液。將該混合細(xì)胞懸浮液在200g下離心5分鐘，接著完全移除上清液。將混合細(xì)胞沉淀在6ml HASMC培養(yǎng)基中重懸，并將其轉(zhuǎn)移到20ml玻璃小瓶中，接著在37°C和5% CO2下在定軌搖床上于150rpm培養(yǎng)60分鐘。這使得細(xì)胞彼此聚集并開始細(xì)胞間粘附。培養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中并在200g下離心5分鐘。移除上清液培養(yǎng)基后，將細(xì)胞沉淀在400 μ I HASMC培養(yǎng)基中重懸，并用移液器上下抽吸數(shù)次，以確保所有的細(xì)胞簇被打碎。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到放置在15ml離心管內(nèi)的
0.5ml微量離心管(microfuge tube)中，接著在2000g下離心4分鐘，以形成高度密集且致密的細(xì)胞沉淀。吸去上清液培養(yǎng)基，并通過抽吸將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管(OD 1.0mm, ID 0.5mm,
T,75mm ；Drummond Scientific C0.,BroomalI,PA)中，以便產(chǎn)生長度為 50mm 的細(xì)胞圓柱體。將毛細(xì)管內(nèi)部的細(xì)胞糊在37°C和5% CO2下于HASMC培養(yǎng)基中培養(yǎng)20分鐘。然后使用與毛細(xì)管一起提供的柱塞，將細(xì)胞圓柱體從毛細(xì)管沉積到NovoGel 模具(用HASMC培養(yǎng)基覆蓋)的凹槽中。將細(xì)胞圓柱體在37°C和5% CO2下培養(yǎng)24和48小時。
實施例2:多層血管 細(xì)胞培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞:將原代人主動脈平滑肌細(xì)胞(HASMC ；GIBC0)在補充有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml 青霉素、0.lmg/ml 鏈霉素、0.25 μ g/ml 兩性霉素 B,0.0lM HEPES (全部來自Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)、50mg/L 腦氛酸、50mg/L 甘氛酸、20mg/L 丙氛酸、50mg/L抗壞血酸和3 μ g/L CuSO4(全部來自Sigma, St.Louis, MO)的低葡萄糖dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(DMEM)中于37°C和5% CO2保持和擴(kuò)充。在所有研究中使用第4代至第8代的HASMC的鋪滿培養(yǎng)物。內(nèi)皮細(xì)胞:將原代人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)在補充有2% FBS、1 μ g/ml氫化可的松、10ng/ml人表皮生長因子、3ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10 μ g/ml肝素、100U/ml青霉素、0.lmg/ml 鏈霉素和 0.25 μ g/ml 兩性霉素 B (全部來自 Invitrogen Corp.，Carlsbad,CA)的培養(yǎng)基200中保持和擴(kuò)充。使細(xì)胞在37°C和5% CO2下在經(jīng)明膠(來自豬血清)包被的組織培養(yǎng)基處理的培養(yǎng)瓶中生長。在所有研究中使用第4代至第8代的HAEC的鋪滿培養(yǎng)物。成纖維細(xì)胞:將原代人皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)在補充有2 % FBS、I μ g/ml氫化可的松、10ng/ml人表皮生長因子、3ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子、10 μ g/ml肝素、100U/ml青霉素和0.lmg/ml鏈霉素(全部來自Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)的培養(yǎng)基106中于37°C和5% CO2保持和擴(kuò)充。在所有研究中使用第4代至第8代HDF的鋪滿培養(yǎng)物。
NovoGel 溶液和模具2%和4% (w/v)NovoGel 溶液的制備:將Ig或2g(分別對于2%或4% )低熔點NovoGel (超純LMP)在50ml Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)中溶解。簡言之，在持續(xù)攪拌下，將DPBS和NovoGel 在加熱板上加熱到85°C，直到NovoGel 完全溶解。通過在125°C下蒸汽滅菌25分鐘對NovoGel 溶液進(jìn)行滅菌。只要溫度保持在66.5°C以上，NovoGel 溶液就停留在液相。低于這一溫度則發(fā)生相變，NovoGel 溶液的粘度增加，且NovoGel 形成固體凝膠。NovoGel 模具的制備:使用適合IOcm培養(yǎng)皿的Teflon^.模具，制造用于培養(yǎng)細(xì)胞圓柱體的NovoGel 模具。簡言之，使用70%乙醇溶液對Teflcn^模具進(jìn)行預(yù)先滅菌，并使模具經(jīng)受紫外線照射45分鐘。將滅菌的模具放置在IOcm培養(yǎng)皿頂上并牢固接附。使這一組裝件(Teflon &模具+培養(yǎng)皿)保持垂直，并將45ml預(yù)溫?zé)岬臒o菌2% NovoGel 溶液倒入Teflonp'和培 養(yǎng)皿之間的空間中。然后將組裝件在室溫下水平放置I小時，以使NovoGel 完全膠凝。膠凝后，移除Teflon 印模，并用DPBS洗滌NovoGel 模具兩次。然后，向NovoGel 模具添加17.5ml HASMC培養(yǎng)基以便培養(yǎng)HASMC-HAEC混合細(xì)胞圓柱體，或者向NovoGel 模具添加17.5ml HDF培養(yǎng)基以便培養(yǎng)HDF細(xì)胞圓柱體。
細(xì)胞圓柱體HASMC-HAEC混合細(xì)胞圓柱體的制造:為了制備混合細(xì)胞圓柱體，單獨收集HASMC和HAEC，然后以預(yù)定比例混合。簡言之，從鋪滿培養(yǎng)瓶中移除培養(yǎng)基，用DPBS(lml/5cm2生長區(qū)域)洗滌細(xì)胞。通過在胰蛋白酶(lml/15cm2生長區(qū)域)的存在下溫育10分鐘，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶表面脫離。使用0.15%胰蛋白酶使HASMC脫離，而使用0.1 %胰蛋白酶使HAEC脫離。溫育后，向瓶中添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(相對于胰蛋白酶體積的2X體積)。使細(xì)胞懸浮液在200g下離心6分鐘，接著完全移除上清液。使細(xì)胞沉淀在各自的培養(yǎng)基中重懸，并使用血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行計數(shù)。合并適當(dāng)體積的HASMC和HAEC，以產(chǎn)生含有15% HAEC和剩余85%的HASMC(作為總細(xì)胞群的百分比)的混合細(xì)胞懸浮液。將該混合細(xì)胞懸浮液在200g下離心5分鐘，接著完全移除上清液。使混合細(xì)胞沉淀在6ml HASMC培養(yǎng)基中重懸，并將其轉(zhuǎn)移到20ml玻璃小瓶中，接著在37°C和5% CO2下在定軌搖床上于150rpm培養(yǎng)60分鐘。這使細(xì)胞彼此聚集并開始細(xì)胞間粘附。培養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，在200g下離心5分鐘。移除上清液培養(yǎng)基后，使細(xì)胞沉淀在400 μ I HASMC培養(yǎng)基中重懸，用移液器上下抽吸數(shù)次，以確保所有的細(xì)胞簇被打碎。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到放置在15ml離心管內(nèi)的
0.5ml微量離心管中，接著在2000g下離心4分鐘，以形成高度密集且致密的細(xì)胞沉淀。吸去上清液培養(yǎng)基，并通過抽吸將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管(0D 1.0mm, ID 0.5mm, L 75mm)中，以便產(chǎn)生長度為50mm的細(xì)胞圓柱體。將毛細(xì)管內(nèi)部的細(xì)胞糊在37 °C和5 % CO2下于HASMC培養(yǎng)基中培養(yǎng)20分鐘。然后使用與毛細(xì)管一起提供的柱塞，將細(xì)胞圓柱體從毛細(xì)管沉積到NovoGel 模具(用HASMC培養(yǎng)基覆蓋)的凹槽中。將細(xì)胞圓柱體在37°C和5% CO2下培養(yǎng)24小時。HDF細(xì)胞圓柱體的制造:使用與制備HASMC-HAEC混合細(xì)胞圓柱體類似的方法制備HDF圓柱體。簡言之，從鋪滿的HDF培養(yǎng)瓶中移除培養(yǎng)基，并用DPBS(lml/5cm2生長區(qū)域)洗滌細(xì)胞。通過在胰蛋白酶(0.l%;lml/15cm2生長區(qū)域)的存在下溫育10分鐘，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶表面脫離。溫育后，向瓶中添加HDF培養(yǎng)基(相對于胰蛋白酶體積的2X體積)。將細(xì)胞懸浮液在200g下離心6分鐘，接著完全移除上清液。使細(xì)胞沉淀在6ml HDF培養(yǎng)基中重懸，并將其轉(zhuǎn)移到20ml玻璃小瓶中，接著在37°C和5% CO2下在定軌搖床上于150rpm培養(yǎng)75分鐘。培養(yǎng)后,將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，并在200g下離心5分鐘。移除上清液培養(yǎng)基后，使細(xì)胞沉淀在400 μ I HDF培養(yǎng)基中重懸，并用移液器上下抽吸數(shù)次，以確保所有的細(xì)胞簇被打碎。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到放置在15ml離心管內(nèi)的0.5ml微量離心管中，接著在2000g下離心4分鐘，以形成高度密集且致密的細(xì)胞沉淀。吸去上清液培養(yǎng)基，并通過抽吸將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管(0D 1.0mm, ID 0.5mm，L 75mm)中，以便產(chǎn)生長度為50mm的細(xì)胞圓柱體。將毛細(xì)管內(nèi)部的細(xì)胞糊在37°C和5% CO2下在HDF培養(yǎng)基中培養(yǎng)20分鐘。然后將細(xì)胞圓柱體從毛細(xì)管沉積到NovoGel 模具(用HDF培養(yǎng)基覆蓋)的凹槽中。將細(xì)胞圓柱體在37°C和5% CO2下培養(yǎng)24小時。
多層血管的制造NovoGel 基板的制備:通過將IOml預(yù)溫?zé)岬?> 40°C )NovoGel (2% w/v)分配到IOcm培養(yǎng)皿中來制造NovoGel 基板。分配后NovoGel 立即均勻擴(kuò)散,從而覆蓋整個皿底并形成均勻?qū)?。將培養(yǎng)皿在室溫下溫育20分鐘，以使NovoGel 完全膠凝。多層血管:使用HDF圓柱體和HASMC-HAEC混合細(xì)胞圓柱體制造由HDF外層和HASMC-HAEC內(nèi)層組成的血管。采用如圖4中所示的幾何排列。簡言之，在24小時培養(yǎng)期結(jié)束時，將成熟的HDF和HASMC-HAEC圓柱體吸回毛細(xì)管中并置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中直至進(jìn)一步使用。由NovoGel 棒組成的支撐結(jié)構(gòu)如下制備:將預(yù)溫?zé)岬?% NovoGel 吸入到毛細(xì)管(L=50mm)中，并在冷PBS溶液(4°C )中快速冷卻。5cm長的膠凝的NovoGel 圓柱體從毛細(xì)管放下(使用柱塞)，并且直接放倒在NovoGel 基板上。第二個NovoGel 圓柱體與第一個毗連，重復(fù)該過程直至放置10個NovoGel 圓柱體，從而形成第一層。此時將20 μ I PBS分配到NovoGel 圓柱體上方以保持其濕潤。進(jìn)一步將六個NovoGel 圓柱體在如圖4中所示的位置處放到第I層之上(第2層)。然后在位置4、5和6放置三個HDF圓柱體，以完成第2層。分配各個HDF圓柱體后，在放置的圓柱體的上方分配40 μ IHDF培養(yǎng)基，以幫助隨后的圓柱體的放置并防止細(xì)胞圓柱體脫水。接下來放置第3層的NovoGel 圓柱體，緊接著在位置3和6放置HDF圓柱體。用HDF培養(yǎng)基再潤濕該結(jié)構(gòu)后，在位置4和5放倒HASMC-HAEC混合圓柱體。隨后，在細(xì)胞圓柱體的上方分配40 μ IHASMC培養(yǎng)基和40 μ I HDF培養(yǎng)基。通過在位置I和7放置NovoGel 圓柱體，在位置2和6放置HDF圓柱體，在位置3和5放置HASMC-HAEC混合圓柱體，最后在位置4放置4% NovoGel 圓柱體，完成第4層。類似地，通過在圖4中所示的位置放倒NovoGel 圓柱體接著是HDF圓柱體最后是HASMC-HAEC圓柱體，完成第5、6和7層。一旦整個構(gòu)建體完成，將0.5ml溫?zé)岬腘ovoGel 分配到該構(gòu)建體的各端上，并使其在室溫下膠凝5分鐘。在該NovoGel 膠凝后，向培養(yǎng)皿添加30ml HASMC培養(yǎng)基(以確保整個構(gòu)建體完全浸沒)。將構(gòu)建體在37°C和5% CO2下培養(yǎng)24小時，以允許細(xì)胞圓柱體之間的融合。在24小時結(jié)束時，從融合的多層血管移除周圍的NovoGel 支撐結(jié)構(gòu)。
實施例3:生物打印機(jī)組裝生物打印機(jī)。生物打印機(jī)包含打印機(jī)頭，打印機(jī)頭具有用于夾持墨盒的筒夾夾頭夾具和用于分配墨盒的內(nèi)容物的活塞。使用的墨盒是長度為75-85_的玻璃微毛細(xì)管。每次需要生物墨水或支撐材料時，裝載新的毛細(xì)管。為了打印結(jié)構(gòu)，在打印過程的持續(xù)期間，也就是在新的毛細(xì)管裝載到打印機(jī)頭中時，需要±20 μ m的分配位置可重復(fù)性。為了保持所有裝載的毛細(xì)管在x、y和z方向上相對于同一點的可重復(fù)性，生物打印機(jī)包含用于校準(zhǔn)微毛細(xì)管位置的激光校準(zhǔn)系統(tǒng)。激光校準(zhǔn)系統(tǒng)將所有毛細(xì)管尖端的位置校準(zhǔn)到共同參照位置。所有打印移動都是相對于這一參照位置作出的。通過使用單激光測距傳感器，校準(zhǔn)所有三個軸(x、y和z軸)。該系統(tǒng)由激光傳感器和激光束組成。傳感器閥限是激光傳感器的最大感應(yīng)距離。傳感器設(shè)置為忽略比預(yù)定義的閥限更遠(yuǎn)的所有信號。傳感器使用三角測量來確定與對象(毛細(xì)管尖端)的距離。激光傳感器定向為使光束垂直向上對準(zhǔn)(+z軸)。
垂直激光校準(zhǔn)對于X軸上的校準(zhǔn):將毛細(xì)管尖端移動到激光傳感器的范圍中，尖端在激光束的左側(cè)(-X)。將毛細(xì)管向+X方向移動，直到傳感器檢測到毛細(xì)管邊緣，并記錄這一位置。從對側(cè)重復(fù)以上步驟(即，尖端放置在激光束右側(cè)(+X)并向-X方向移動，直到傳感器檢測到毛細(xì)管邊緣)。對來自兩個步驟的位置取平均值，以計算毛細(xì)管的中點。任選地，對不同y位置重復(fù)以上過程，并對計算的中點取平均值。對于y軸上的校準(zhǔn):對y軸重復(fù)以上(對于X軸的)程序。對于z軸上的校準(zhǔn):毛細(xì)管尖端移動到傳感器束上方，使得該束擊中毛細(xì)管的底部表面，且尖端恰在傳感器范圍閥限以外。降低毛細(xì)管，直至達(dá)到傳感器閥限，該位置記錄為z位置。任選地，在毛細(xì)管尖端表面上的多個點重復(fù)以上步驟，并對測量的高度取平均值。
水平激光校準(zhǔn)對于y軸上的校準(zhǔn):移動毛細(xì)管，使得尖端恰低于激光束的高度，并且毛細(xì)管向一側(cè)離開(以y方向)。毛細(xì)管以y方向朝向激光移動。當(dāng)激光傳感器檢測到毛細(xì)管反射的束時，停止毛細(xì)管并記錄這一位置。重復(fù)以上步驟，讓毛細(xì)管向激光的另一側(cè)離開，以_y方向移動。將來自以上步驟的中點記錄為y位置。對于X軸上的校準(zhǔn):使用y軸上的校準(zhǔn)結(jié)果，移動y軸，使得激光集中于毛細(xì)管上。移動毛細(xì)管越過傳感器閥限，并向傳感器移動。在毛細(xì)管越過傳感器閥限且傳感器輸出發(fā)生變化時，立即停止毛細(xì)管。將這一位置加上1/2毛細(xì)管寬度(來自y校準(zhǔn))記錄為X位置。對于z軸上的校準(zhǔn):將毛細(xì)管從X位置上移，直至其擺脫激光束。毛細(xì)管尖端朝向激光束下移，并且在激光束中斷時立即停止(使用與對于y軸相同的過程)。將這一位置記錄為Z位置。
毛細(xì)管準(zhǔn)備在從毛細(xì)管打印·之前，準(zhǔn)備好毛細(xì)管內(nèi)部的生物墨水或支撐材料，使得生物墨水或支撐材料將恰好在毛細(xì)管的尖端處開始打印。使用校準(zhǔn)激光來準(zhǔn)備毛細(xì)管。毛細(xì)管尖端移動到恰在激光束上方，其中該束集中在y軸上。尖端在激光束上方20-100 μ m處。向下驅(qū)動打印機(jī)頭中的分配活塞，直至生物墨水或支撐材料開始從毛細(xì)管尖端向外分配并中斷激光束。通過反向驅(qū)動活塞(20-100μπι)將分配的生物墨水或支撐材料吸回毛細(xì)管中。于是毛細(xì)管被準(zhǔn)備好以備分配。
NovoGel 毛細(xì)管清潔NovoGel 用作支撐材料。為了除去粘在毛細(xì)管外表面上的過量NovoGel 并避免過量的NovoGel 影響打印質(zhì)量,除去過量的NovoGel 。將擦拭部件(wiping feature)集成到散裝(bulk)NovoGel 容器中。散裝NovoGel 容器配備有標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療小瓶，該小瓶具有用于接附隔膜的開蓋。隔膜配置為在1-2_厚的硅膠的中心具有十字切口。通過將毛細(xì)管穿過隔膜浸入散裝NovoGel 容器中并抽吸NovoGel ，在其離開容器時，將過量的NovoGel 從毛細(xì)管上擦去，并留在散裝容器中。
血管結(jié)構(gòu)的打印如上所述組裝生物打印機(jī)和墨盒。生物打印機(jī)具有臺，該臺含有用于接收由生物打印機(jī)生成的結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿用NovoGel 包被。血管結(jié)構(gòu)的二維表示形式(參見例如圖4)由用戶輸入到軟件程序中，進(jìn)入與生物打印機(jī)連接的計算機(jī)中。血管結(jié)構(gòu)的二維表示形式由HASMC-HAEC混合細(xì)胞圓柱體、HDF圓柱體的棒和限定了血管結(jié)構(gòu)的空隙并圍繞血管結(jié)構(gòu)的NovoGel 棒組成。HASMC-HAEC混合細(xì)胞圓柱體和HDF細(xì)胞圓柱體如實施例1所述制備，并吸入毛細(xì)管中以供插入到打印機(jī)頭的筒夾夾頭中?；蛘?，將毛細(xì)管裝載到打印機(jī)頭中并浸入散裝NovoGel 容器中，并將NovoGel 吸到毛細(xì)管中。使用垂直激光校準(zhǔn)系統(tǒng)來校準(zhǔn)毛細(xì)管。當(dāng)將來自軟件程序的命令提供給生物打印機(jī)時，生物打印機(jī)將在預(yù)定位置打印三維結(jié)構(gòu)(在HASMC-HAEC棒、HDF棒和NovoGel 棒之間交替)到培養(yǎng)皿上。參見實施例2。將各個棒放置到培養(yǎng)皿上之后，用少量培養(yǎng)基將棒潤濕。一旦整個構(gòu)建體完成，將溫?zé)岬腘ovoGel 分配到構(gòu)建體的各端上，使其在室溫下膠凝，并向培養(yǎng)皿添加細(xì)胞培養(yǎng)基以浸沒整個構(gòu)建體。然后將該構(gòu)建體在37°C和5% CO2下溫育，以促使細(xì)胞圓柱體之間的融合。在溫育時間結(jié)束時，從融合的多層血管移除周圍的NovoGel 支撐結(jié)構(gòu)。雖然本發(fā)明已結(jié)合其具體實施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解，能夠?qū)Ρ景l(fā)明的方法作進(jìn)一步修改。本專利申請旨在涵蓋本發(fā)明的任何變化、用途或改動，其一般遵循本發(fā)明的原理并且包括與本公開內(nèi)容相比的偏差，這些偏差在本發(fā)明所屬領(lǐng)域的已知或慣用實踐范圍內(nèi)，在闡述前可應(yīng)用于本文中的基本特`征，并且落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種生物打印機(jī)，其包含: a.一個或多個打印機(jī)頭，其中該打印機(jī)頭包含用于接收和夾持至少一個墨盒的手段，并且其中所述墨盒包含選自以下一種或多種的內(nèi)容物: 1.生物墨水，和 .支撐材料； b.用于校準(zhǔn)至少一個墨盒的位置的手段；和 c.用于分配至少一個墨盒的內(nèi)容物的手段。
2.如權(quán)利要求1所述的生物打印機(jī)，其中所述用于分配至少一個墨盒的內(nèi)容物的手段是應(yīng)用活塞、應(yīng)用壓力、應(yīng)用壓縮氣體、液壓技術(shù)或其組合。
3.如權(quán)利要求1所述的生物打印機(jī)，進(jìn)一步包含用于調(diào)節(jié)溫度的手段。
4.如權(quán)利要求3所述的生物打印機(jī)，進(jìn)一步包含用于調(diào)節(jié)環(huán)境溫度、墨盒溫度、墨盒內(nèi)容物溫度、接收表面溫度或其組合的手段。
5.如權(quán)利要求4所述的生物打印機(jī)，其中所述用于調(diào)節(jié)溫度的手段是加熱元件。
6.如權(quán)利要求5 所述的生物打印機(jī)，其中所述用于調(diào)節(jié)溫度的手段是輻射加熱器、對流加熱器、傳導(dǎo)加熱器、風(fēng)扇加熱器、熱交換器或其組合。
7.如權(quán)利要求4所述的生物打印機(jī)，其中所述用于調(diào)節(jié)溫度的手段是冷卻元件。
8.如權(quán)利要求7所述的生物打印機(jī)，其中所述用于調(diào)節(jié)溫度的手段是冷卻劑容器、冷凍液、冰、輻射冷卻器、對流冷卻器、傳導(dǎo)冷卻器、風(fēng)扇冷卻器或其組合。
9.如權(quán)利要求1所述的生物打印機(jī)，進(jìn)一步包含用于向以下一種或多種應(yīng)用潤濕劑的手段: a.打印機(jī)臺； b.接收表面； c.沉積孔口； d.生物墨水； e.支撐材料；和 f.打印的構(gòu)建體； 其中在一個或多個時間點應(yīng)用潤濕劑，該時間點選自:通過生物打印機(jī)分配生物墨水或支撐材料之前、與分配基本同時和通過生物打印機(jī)分配生物墨水或支撐材料之后。
10.一種校準(zhǔn)包含沉積孔口的墨盒的位置的方法，其中所述墨盒接附在生物打印機(jī)上，該方法包括:沿至少一個軸校準(zhǔn)墨盒位置；其中所述軸選自X軸、y軸和z軸；并且其中利用激光進(jìn)行各校準(zhǔn)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中利用激光沿至少一個軸校準(zhǔn)墨盒位置包括: a.沿軸定位激光束； b.沿與激光束軸垂直的軸移動所述墨盒，并且在激光束被墨盒中斷時立即停止所述移動，其中記錄激光束被中斷的位置； c.在激光束的路徑內(nèi)沿激光束的相同軸移動墨盒，并且在達(dá)到傳感器閥限時立即停止所述移動，其中記錄達(dá)到傳感器閥限的位置； d.定位墨盒，使得激光束能夠測量墨盒上一個或多個點的精確位置；和 e.在一個或多個軸上重復(fù)步驟(a)、(b)、(c)和(d)中的一個或多個，并對記錄的位置進(jìn)行計算，以確定墨盒在空間中的位置。
12.一種用于校準(zhǔn)包含沉積孔口的墨盒的位置的系統(tǒng)，其中所述墨盒接附在生物打印機(jī)上，所述系統(tǒng)包含:用于沿至少一個軸校準(zhǔn)墨盒位置的手段，其中所述軸選自y軸、X軸和Z軸。
13.如權(quán)利要求12所述的系統(tǒng)，其中所述用于校準(zhǔn)墨盒位置的手段是激光準(zhǔn)直、光學(xué)準(zhǔn)直、機(jī)械準(zhǔn)直、壓電準(zhǔn)直、磁力準(zhǔn)直、電場或電容準(zhǔn)直、超聲準(zhǔn)直或其組合。
14.一種用于制造組織構(gòu)建體的方法，包括: a.計算機(jī)模塊接收期望的組織構(gòu)建體的視覺表示的輸入； b.計算機(jī)模塊生成一系列命令，其中該命令基于該視覺表示且可被生物打印機(jī)讀取； c.計算機(jī)模塊將該系列命令提供給生物打印機(jī)；和 d.生物打印機(jī)按照該命令沉積生物墨水和支撐材料，以形成具有限定的幾何形狀的構(gòu)建體。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述視覺表示包含將期望的組織構(gòu)建體的一個或多個元素識別為以下一種或多種: a.生物墨水； b.生物墨水的具體組成； c.支撐材料；和 d.支撐材料的具體組成。
16.一種接收表面，其用于接收由如權(quán)利要求1所述的生物打印機(jī)沉積的一個或多個結(jié)構(gòu)，其中該接收表面是基本平坦或基本光滑的。
17.一種接收表面，其用于接收由如權(quán)利要求1所述的生物打印機(jī)沉積的一個或多個結(jié)構(gòu)，其中該接收表面的形貌被設(shè)計為適應(yīng)或影響一個或多個沉積的結(jié)構(gòu)的大小、形狀或紋理，或者幾何形狀。
全文摘要
本文描述了生物打印機(jī)，其包含一個或多個打印機(jī)頭，其中打印機(jī)頭包含用于接收和夾持至少一個墨盒的手段，并且其中所述墨盒包含選自以下一種或多種的內(nèi)容物生物墨水和支撐材料；用于校準(zhǔn)至少一個墨盒的位置的手段；和用于分配至少一個墨盒的內(nèi)容物的手段。本文進(jìn)一步描述了用于制造組織構(gòu)建體的方法，包括計算機(jī)模塊接收期望的組織構(gòu)建體的視覺表示的輸入；計算機(jī)模塊生成一系列命令，其中該命令基于該視覺表示且可被生物打印機(jī)讀取；計算機(jī)模塊將該系列命令提供給生物打印機(jī)；和生物打印機(jī)按照該命令沉積生物墨水和支撐材料，以形成具有限定的幾何形狀的構(gòu)建體。
文檔編號B41J2/01GK103249567SQ201180050831
公開日2013年8月14日 申請日期2011年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者基思·墨菲, 斯科特·多爾夫曼, 內(nèi)森·史密斯, 拉里·鮑文斯, 伊恩·索恩, 堤姆·麥克唐納, 克里斯·利-蘭開斯特, 理查德·金·洛 申請人:奧加諾沃公司