專利名稱：金烏賊胚胎細(xì)胞染色體標(biāo)本制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及一種利用金烏賊胚胎細(xì)胞制備染色體標(biāo)本的方法。
背景技術(shù)：
染色體標(biāo)本的制備操作簡單、價格低廉、實驗場地要求低的特點，一直是傳統(tǒng)的生物遺傳學(xué)研究技術(shù)，染色體標(biāo)本制備包括前處理、低滲處理、固定、解離、滴片、染色以及洗片等步驟，在生物遺傳學(xué)的許多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但是由于金烏賊成熟個體獲取困難、 成本較高、制作染色體標(biāo)本效果差等原因，利用成熟個體制備染色體顯得不盡人意。胚胎作為制備染色體標(biāo)本的材料之一，獲取相對容易、成本低，被廣泛應(yīng)用于染色體標(biāo)本的制備， 在金烏賊胚胎制備染色體標(biāo)本過程中常采用常規(guī)的冷滴片法，玻片干燥所需時間長、易發(fā)生重復(fù)滴片、細(xì)胞難破裂，影響染色體觀察。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠很好的利用金烏賊胚胎制備染色體標(biāo)本的方法，該方法通過熱滴片法，合理控制滴片的溫度和滴片時的高度，縮短了制片時間， 改善了染色體制片效果，解決了染色體標(biāo)本制備時細(xì)胞破裂程度掌握困難、染色體丟失、染色體形態(tài)差等方面問題。
本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種利用金烏賊胚胎細(xì)胞制備染色體標(biāo)本的方法，它的操作程序是剝膜、前處理、 低滲處理、固定、解離、滴片、染色以及洗片；所述的滴片采用熱滴片法，溫度40°C -60滴片高度1. 8m-2m，每滴完一滴后用吸水紙在液滴中間位置吸除多余的液體。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的技術(shù)方案，上述金烏賊胚胎細(xì)胞制備染色體標(biāo)本的方法包括以下步驟
剝膜使用鑷子固定卵，用解剖針挑破卵膜；然后雙手各持一鑷子從破膜開口處外翻卵膜，逐漸剝離卵膜，露出胚胎；
前處理剝膜后的胚胎采用秋水仙素進(jìn)行前處理，將胚胎細(xì)胞浸入0. 04%的秋水仙素溶液中處理30min ；
低滲處理采用濃度為5%的KCl作為低滲液，處理45min，低滲處理前去凈秋水仙素；
固定采用卡諾氏液(甲醇冰醋酸=3 1，體積比)固定，間隔15min更換固定液一次，共更換3次固定液，第一次加固定液前需移除一半低滲液；
解離采用濃度為50%冰醋酸進(jìn)行解離45min，解離前去凈固定液；
滴片采用熱滴片法，溫度40°C _60°C，滴片高度1. 8m_2m，每滴完一滴后用吸水紙在液滴中間位置吸除多余的液體；
染色采用10% Giemsa染液染色，即Giemsa原液lml,PH 6. 8的磷酸緩沖液9ml，染色時間30min ；
洗片用自來水沖洗玻片，沖洗時有液滴的面朝上，玻片向下傾斜，玻片下端與水平面成30°，玻片磨砂面與水流接觸，水流以滴剛成線狀，慢慢沖洗，至沖洗后的水不再帶有顏色為止。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對比的有益效果是
本發(fā)明采用熱滴片方法，滴片溫度40°C -60°C，在此溫度范圍內(nèi)，細(xì)胞能夠很好破裂，同時保證液滴不會因為溫度過高而干燥過快，有利于液滴延展；液滴經(jīng)過1. 8m-2m的下落高度，與玻片接觸時細(xì)胞破裂，能夠充分釋放染色體；在液滴滴到玻片上后，立即用吸水紙在液滴中間位置吸除多余的液體，使分裂相集中分布在液滴邊緣有利于觀察，且在吸除多余液體后液滴干燥較快，輪廓清晰，有利于把握液滴下落的方向，避免重復(fù)滴片。


圖1、金烏賊染色體中期分裂相
具體實施例方式
下面通過實際例子結(jié)合附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)方法
金烏賊胚胎細(xì)胞制作染色體標(biāo)本步驟包括剝膜、前處理、低滲處理、固定、解離、 滴片以及染色。本發(fā)明在染色體標(biāo)本制備過程中，進(jìn)行了剝膜方法的確定、前處理時間的確定、低滲液的選擇和低滲時間的確定、固定程序的確定、解離時間的確定、滴片方法的改進(jìn)、 染色時間的確定以及洗片步驟的改進(jìn)。
剝膜方法的確定胚胎細(xì)胞制備染色體標(biāo)本一般用于魚類，由于魚類的卵一般都較小，無法進(jìn)行剝膜處理來獲得胚胎，所以都采用直接前處理的方式進(jìn)行。但是金烏賊卵膜厚，秋水仙素難浸透，且卵大有利于剝膜獲得胚胎。剝膜時使用鑷子固定卵，用解剖針挑破卵膜，然后雙手各持一鑷子從破膜開口處外翻卵膜，逐漸剝離卵膜，露出胚胎，大大減短了下步的前處理時間。
前處理時間樣品采用秋水仙素進(jìn)行前處理，前處理時間過短或過長均會使染色體形態(tài)不利于觀察，本實施例將胚胎細(xì)胞浸入0. 04%的秋水仙素溶液中處理30min。
低滲液的選擇和低滲時間的確定常規(guī)方法采用過濾海水做為低滲液，由于海水濃度較難確定導(dǎo)致低滲時間不確定，我們采用KCl作為低滲液，濃度為5%，處理45min。低滲處理前去凈秋水仙素。
固定程序的確定在實驗過程中發(fā)現(xiàn)固定液固定3次后，可在_4°C長期保存樣品。 我們采用卡諾氏液(甲醇冰醋酸=3 1，體積比)固定，間隔15min更換固定液一次，共更換3次固定液。由于固定液中有冰醋酸會對樣品有一定的解離作用，會影響固定效果，因此在第一次加固定液前只移除一半低滲液作為緩沖，第二、三次則需將舊液完全移除后再加新的固定液。
解離時間采用冰醋酸進(jìn)行解離，濃度為50%，解離時間過短或過長都會影響滴片效果，我們將解離時間設(shè)定為45min，滴片效果良好，無大組織塊干擾。解離前去凈固定液，否則影響解離液濃度。
滴片方法常規(guī)的冷滴片法容易發(fā)生重復(fù)滴片，影響染色體觀察，且需要干燥過夜，所需時間較長。我們采用熱滴片法滴片，溫度40°C -60°C，滴片高度1.8m-aii，每滴完一滴后用吸水紙在液滴中間位置吸除多余的液體。
染色時間采用10% Giemsa染液染色，即Giemsa原液(GIBC0公司生產(chǎn))1ml，PH 6.8的磷酸緩沖液(PBS)9ml，染色時間最終影響了染色體標(biāo)本的質(zhì)量，染色時間過短染色體形態(tài)不清晰，染色時間過長背景色加深，我們采用的染色時間為30min，然后用自來水清洗玻片。
洗片步驟用自來水沖洗玻片，沖洗時有液滴的面朝上，玻片向下傾斜，玻片下端與水平面成30°，玻片磨砂面與水流接觸，水流以滴剛成線狀，慢慢沖洗，至沖洗后的水不再帶有顏色為止。
采用上述方法，我們在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所進(jìn)行了實際應(yīng)用，對金烏賊胚胎染色體進(jìn)行制片，結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法可以獲得良好的染色體標(biāo)本，染色體中期分裂相多、形態(tài)清晰、分散良好，具體效果見圖1。
權(quán)利要求
1.一種利用金烏賊胚胎細(xì)胞制備染色體標(biāo)本的方法，它的操作程序是剝膜、前處理、 低滲處理、固定、解離、滴片、染色以及洗片，其特征在于所述的滴片采用熱滴片法，溫度 400C -60°C，滴片高度1. 8m-2m，每滴完一滴后用吸水紙在液滴中間位置吸除多余的液體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的剝膜使用鑷子固定卵，用解剖針挑破卵膜；然后雙手各持一鑷子從破膜開口處外翻卵膜，逐漸剝離卵膜，露出胚胎；所述的前處理剝膜后的胚胎采用秋水仙素進(jìn)行前處理，將胚胎細(xì)胞浸入0. 04%的秋水仙素溶液中處理30min ；所述的低滲處理采用KCl作為低滲液，濃度為5%，處理45min，低滲處理前去凈秋水仙素；所述的固定采用卡諾氏液，即甲醇冰醋酸=3 1(體積比)固定，間隔15min更換固定液一次，共更換3次固定液，第一次加固定液前需移除一半低滲液；所述的解離采用濃度為50%冰醋酸進(jìn)行解離45min，解離前去凈固定液； 所述的滴片采用熱滴片法，溫度40°C _60°C，滴片高度1. 8m-aii，每滴完一滴后用吸水紙在液滴中間位置吸除多余的液體；所述的染色采用10% Giemsa染液染色，即Giemsa原液1ml，PH 6. 8的磷酸緩沖液 9ml，染色時間30min ；所述的洗片用自來水沖洗玻片，沖洗時有液滴的面朝上，玻片向下傾斜，玻片下端與水平面成30°，玻片磨砂面與水流接觸，水流以滴剛成線狀，慢慢沖洗，至沖洗后的水不再帶有顏色為止。
全文摘要
一種利用金烏賊胚胎細(xì)胞制備染色體標(biāo)本的方法，它的操作程序是剝膜、前處理、低滲處理、固定、解離、滴片、染色以及洗片，其特征在于所述的滴片采用熱滴片法，溫度40℃-60℃，滴片高度1.8m-2m，每滴完一滴后用吸水紙在液滴中間位置吸除多余的液體。該方法通過熱滴片法，合理控制滴片的溫度和滴片時的高度，縮短了制片時間，改善了染色體制片效果，解決了染色體標(biāo)本制備時細(xì)胞破裂程度掌握困難、染色體丟失、染色體形態(tài)差等方面問題。利用該發(fā)明對金烏賊胚胎細(xì)胞染色體進(jìn)行制片，獲得良好的染色體標(biāo)本，染色體中期分裂相多、形態(tài)清晰、分散良好，具體效果見。
文檔編號G09B23/36GK102509504SQ20111028411
公開日2012年6月20日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者劉克奉, 劉長琳, 吳彪, 孫建明, 莊志猛, 燕敬平, 王曉華, 王琛, 陳四清 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所