本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)材料技術(shù)制備領(lǐng)域，尤其涉及一種az31鎂合金表面zn-mmt涂層的制備與測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

鎂合金材料在工業(yè)用途中出現(xiàn)的化學(xué)性質(zhì)活潑，易腐蝕降解等缺點(diǎn)，恰恰可以用來作為醫(yī)用可降解植入材料，但仍然存在降解過快的問題，怎樣使其在完成植入材料的支撐功能后再逐漸降解是醫(yī)用材料及臨床醫(yī)生關(guān)心的重點(diǎn)；另外，在醫(yī)用材料植入手術(shù)后由于感染導(dǎo)致的植入失敗的案例不在少數(shù)，能否將植入材料中引入抗菌元素，使可降解及抗菌功能結(jié)合，不失為完美之舉。蒙脫石由于其資源豐富，廉價(jià)易得，除了在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，在多個(gè)行業(yè)也應(yīng)用廣泛。

探討在az31鎂合金表面制備zn-mmt涂層的方法。目前尚無該種礦物應(yīng)用到鎂合金表面的報(bào)道，根據(jù)文獻(xiàn)中有關(guān)水滑石等礦物涂層的制備，經(jīng)過多次試驗(yàn)，反復(fù)研究，確定制備工藝為水熱法，溫度160℃，ph10.5，36h。制備出的涂層與基體結(jié)合緊密，較均勻，膜層性能相對(duì)較好，具有廣闊的研究潛力。

zn-mmt涂層在az31合金表面形成的機(jī)理研究。zn-mmt在酸性環(huán)境中的研究較多，在堿性條件的變化研究的較少，僅僅在放射性物質(zhì)深埋后對(duì)mmt的影像中涉及到，堿性環(huán)境下，在az31鎂合金表面制備zn-mmt涂層機(jī)理較復(fù)雜，缺少相應(yīng)的研究。

改進(jìn)模擬體液，增加動(dòng)態(tài)元素，用于研究zn-mmt涂層的耐蝕性。在生物醫(yī)用材料做生物降解研究中，大多研究人員選用生理鹽水、pbs，hanks等作為模擬體液，上述液體能在一定程度上反映體液的無機(jī)鹽成分，但均不含氨基酸等有機(jī)成分，不能完全反應(yīng)機(jī)體的狀況；另外浸泡實(shí)驗(yàn)多采用靜置的方式，也與機(jī)體流動(dòng)的體液，差距較大，數(shù)據(jù)很難反映出機(jī)體真實(shí)情況。

探討zn-mmt涂層提高az31鎂合金血液相容性的機(jī)理。目前，大多數(shù)研究停留在血液相容性研究層面上，對(duì)機(jī)理研究的較少，

目前用于人體的骨固定金屬材料為不銹鋼、鈦及鈦合金鈷基合金等，這些金屬材料在應(yīng)用過程中仍然存在問題：1、金屬離子釋放造成的機(jī)體反應(yīng)；2、強(qiáng)度及彈性模量高；3、需要二次手術(shù)。

在不斷探索過程中，鎂合金走進(jìn)研究人員的視野----生物醫(yī)用降解材料。在鎂合金最初研究中，人們發(fā)現(xiàn)還是降解太快。存在問題：性質(zhì)活躍、易腐蝕，降解快，其在體內(nèi)未完成支撐使命后降解，從而導(dǎo)致植入失敗。此階段，鎂合金醫(yī)用材料的研究大多是圍繞提高其耐蝕性及生物相容性進(jìn)行，例如增加微量元素制成合金、表面改性制備涂層。隨著醫(yī)用鎂合金的研究不斷推進(jìn)，體內(nèi)植入及臨床應(yīng)用試驗(yàn)表明，圍繞植入材料為中心的感染問題，也是導(dǎo)致植入失敗的又一重要原因。(鎂合金抗菌的研究迫在眉睫)。

因此，在提高鎂合金耐蝕性基礎(chǔ)上，研發(fā)具有抗菌性能的醫(yī)用鎂合金植入材料，具有現(xiàn)實(shí)性重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種az31鎂合金表面zn-mmt涂層的制備與測(cè)定方法，旨在解決背景技術(shù)提及的現(xiàn)有技術(shù)的缺陷問題。本發(fā)明主要目標(biāo)就是將自備的具有抗菌功能的zn-mmt，通過水熱法負(fù)載到az31鎂合金表面，提高耐蝕性、血液相容性的同時(shí)增加抗菌功能，拓展蒙脫石的應(yīng)用領(lǐng)域，為鎂合金醫(yī)用植入材料的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。應(yīng)用于人體的鎂合金骨植入材料主要是減緩降解速度，控制腐蝕，在骨骼修復(fù)后，逐漸降解。技術(shù)上采用水熱法制備zn-mmt涂層，表面發(fā)生一定反應(yīng)，結(jié)合力不強(qiáng)，后期會(huì)逐漸脫落，有利于控制鎂合金的降解；在水熱法處理前，首先進(jìn)行超聲處理30min，這一技術(shù)可將蒙脫石的片層狀結(jié)構(gòu)破壞，有利于插入片層狀結(jié)構(gòu)的zn²⁺的溶出，發(fā)揮更好的抗菌效果。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種az31鎂合金表面zn-mmt涂層的制備方法，所述az31鎂合金表面zn-mmt涂層的制備方法包括以下步驟：

以鈉化蒙脫石(na-mmt)為載體，硝酸鋅為鋅源；以zn²⁺含量為檢測(cè)指標(biāo)，采用離子交換法制備zn-mmt抗菌中間體，首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分析硝酸鋅用量、溫度、時(shí)間對(duì)zn-mmt抗菌中間體zn²⁺含量的影響；然后，在單因素基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，建立響應(yīng)面模型；

利用水熱法，在az31鎂合金表面制備zn-mmt涂層。

進(jìn)一步，建立響應(yīng)面模型中選用二次多項(xiàng)式模型建立與檢驗(yàn)回歸方程；回歸方程為：

y＝-1352.84+131.30a-29.12b+10.99c+0.19ab+5.10ac+0.08bc-20.08a²-0.19b²-4.34c²。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用design-expert8.0用中的box-behnken設(shè)計(jì)模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以影響鋅含量的3個(gè)因素：硝酸鋅的量a、溫度b、時(shí)間c為自變量，各因素設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)。

進(jìn)一步zn-mmt涂層制備方法包括：稱取zn-mmt溶于去離子水中制成2％的懸浮液，超聲破碎30min；置于250ml錐形瓶中，在室溫下磁力攪拌0.5h，使zn-mmt分散均勻；調(diào)節(jié)懸浮液ph值至10.5，80℃攪拌4.5h；將預(yù)處理的az31鎂合金放入水熱釜中，需保持鎂合金直立，將攪拌后懸浮液裝入水熱釜中，置于恒溫干燥箱中130℃，36h后取出，去離子水清洗，吹干；得到zn-mmt涂層。

進(jìn)一步，硝酸鋅用量對(duì)zn-mmt中zn²⁺含量的影響中隨著硝酸鋅用量的增加zn-mmt中zn²⁺含量也逐漸增加；當(dāng)硝酸鋅用量達(dá)到4mmol時(shí)，zn-mmt中zn²⁺含量達(dá)到最大；當(dāng)硝酸鋅的用量繼續(xù)增加，zn²⁺含量不再繼續(xù)升高，zn²⁺含量達(dá)到飽和狀態(tài)；

反應(yīng)溫度對(duì)zn-mmt中zn²⁺含量的影響中隨著溫度的升高，進(jìn)入到na-mmt中的zn²⁺含量開始增加，當(dāng)?shù)竭_(dá)80℃時(shí)，zn-mmt中zn²⁺含量達(dá)到最大，此后，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，zn²⁺含量不再增加，反而逐漸減少；

反應(yīng)時(shí)間對(duì)zn-mmt中zn²⁺含量的影響中隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，進(jìn)入到na-mmt中zn²⁺含量逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到4h，zn-mmt中zn²⁺含量達(dá)到最大，此后，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，zn²⁺含量基本保持不變，na-mmt中zn²⁺含量達(dá)到飽和。

本發(fā)明另一目的在于提供一種az31鎂合金表面zn-mmt涂層的測(cè)定方法，所述az31鎂合金表面zn-mmt涂層的測(cè)定方法包括：利用電鏡、eds、xrd、ftir進(jìn)行表征，分析形成機(jī)理；以dmem+10％fbs為模擬體液，利用浸泡后電鏡觀察、析氫實(shí)驗(yàn)，ph測(cè)定、eis曲線及極化曲線分析na-mmt涂層耐蝕性機(jī)理。

通過溶血率、動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間、血細(xì)胞計(jì)數(shù)及血小板黏附實(shí)驗(yàn)分析zn-mmt涂層的體外血液相容性；采用接觸角計(jì)算表面張力，分析zn-mmt涂層降低溶血率，提高鎂合金血液相容性的機(jī)理。

進(jìn)一步，依據(jù)young方程由液體接觸角估算固體的表面張力；固體總表面張力近似等于固體表面張力的非極性值和極性值的和，即γs＝γs^d+γs^p，并且與接觸角的關(guān)系見式

r＝2kη/2γlcos0°＝2kη/γl(1)

γl(1+cosθ)＝2(γ^ds×γ^dl)^1/2+2(γ^ps×γ^pl)^1/2(2)

式(1)中γl是液體的表面張力(mn/m)；γ^dl、γ^pl分別是液體表面張力的非極性部分和極性部分(mn/m)；γ^ds、γ^ps分別是固體表面張力的非極性部分和極性部分(mn/m)；測(cè)定兩個(gè)已知γ^dl和γ^pl的探測(cè)液體在固體表面的接觸角，代入式(1)，聯(lián)立方程求解可得固體γ^ds、γ^ps和固體的表面張力γs..

界面張力的計(jì)算依據(jù)owen-wendit方程,計(jì)算如下：

γsl＝[(γ^pl)^1/2-(γ^ps)^1/2]²+[(γ^dl)^1/2-(γ^ds)^1/2]²(3)。

本發(fā)明另一目的在于提供一種az31鎂合金表面zn-mmt涂層的測(cè)定方法，所述az31鎂合金表面zn-mmt涂層的測(cè)定方法包括：

利用抑菌圈實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)分析zn-mmt涂層的抗菌性能；采用原子吸收法分析zn-mmt涂層中zn²⁺緩釋性能。

本發(fā)明的zn-mmt涂層提高了az31鎂合金的耐蝕性，生物相容性；有望成為一種理想的醫(yī)用鎂合金植入材料。

本發(fā)明采用dmem+10％fbs為模擬體液，每24h更換，既能使各種離子更接近人體，又增加動(dòng)態(tài)元素，更能真實(shí)地模擬體內(nèi)環(huán)境，得出的數(shù)據(jù)及結(jié)論能客觀地反映體液、涂層兩者之間的相互作用。

本發(fā)明通過測(cè)定zn-mmt涂層對(duì)極性、非極性溶液的接觸角，計(jì)算表面張力，分析提高了涂層對(duì)血液相容性的機(jī)理。

本發(fā)明利用水熱法，以az31為基體，溫度160℃，ph10.5，時(shí)間36h，將zn-mmt成功負(fù)載到az31鎂合金表面。zn-mmt涂層電鏡下呈現(xiàn)典型的蒙脫石片層狀結(jié)構(gòu)，能清晰地看到鋅的納米顆粒?？v切面圖顯示zn-mmt涂層與合金結(jié)合較緊密，厚度約40μm。線掃描及eds圖譜分析可以看出，在涂層表面除了存在mg、al、o、si等元素外，還出現(xiàn)了zn，進(jìn)一步說明在az31表面形成的涂層為zn-mmt。xrd呈現(xiàn)mmt的特征峰。通過析氫及電化學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，zn-mmt涂層耐蝕能力較好，延緩了az31鎂合金在模擬體液中的降解。

本發(fā)明對(duì)az31鎂合金表面的zn-mmt涂層進(jìn)行血液相容性探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)zn-mmt涂層溶血率均低于5％，基體的溶血率為41.62％，大于5％；zn-mmt涂層均對(duì)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板數(shù)量無明顯影響；對(duì)機(jī)體凝血無明顯影響。總之，體外實(shí)驗(yàn)證明，az31鎂合金表面的zn-mmt涂層均提高了az31鎂合金的血液相容性；分析其機(jī)理可能與涂層降低了az31鎂合金表面的接觸角，使其表面張力下降有關(guān)。

本發(fā)明對(duì)az31鎂合金表面的zn-mmt涂層進(jìn)行抗菌性及緩釋性探討，zn-mmt涂層對(duì)s.aureus和e.coli均有明顯抗菌效果；zn-mmt涂層中zn²⁺可以緩慢釋放達(dá)144h，能夠?qū)︶t(yī)用植入材料植入初期起到抗菌作用，減少植入感染的機(jī)會(huì)。

本發(fā)明以na-mmt、硝酸鋅為原料，采用液相離子交換法制備zn-mmt抗菌中間體；應(yīng)用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化條件；以na-mmt為載體，硝酸鋅為鋅源，采用離子交換法，制備zn-mmt抗菌中間體；利用水熱法，在az31鎂合金表面制備zn-mmt涂層；研究了涂層的在dmem+10％fbs溶液中的降解行為和耐腐蝕機(jī)理；采用測(cè)定溶血率、動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間，血小板粘附實(shí)驗(yàn)、接觸角計(jì)算等研究?jī)煞N涂層的血液相容性；通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)及zn²⁺的累積釋放曲線，研究zn-mmt涂層的抗菌性能及緩釋性能，得出以下結(jié)論：

(1)以na-mmt、硝酸鋅為原料，采用液相離子交換法制備zn-mmt抗菌中間體。

(2)采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件為：硝酸鋅為4mmol，溫度為80℃，時(shí)間為4.5h，蒙脫石載鋅量達(dá)到94.65mg/g。

(3)利用水熱法，將我們前期制備的抗菌中間體zn-mmt負(fù)載到az31鎂合金表面，制備了zn-mmt涂層。涂層與基體結(jié)合緊密；高倍電鏡可觀察到除了mmt典型的片層狀結(jié)構(gòu)，還出現(xiàn)納米鋅的顆粒；eds及xrd均顯示出鋅存在；

(4)電化學(xué)實(shí)驗(yàn)、析氫實(shí)驗(yàn)、浸泡過程中ph測(cè)定，均顯示出zn-mmt涂層提高了az31鎂合金的耐蝕能力，起到較好地延緩降解的效果。

(5)對(duì)az31鎂合金表面的zn-mmt涂層溶血率均低于5％，基體的溶血率為41.62％，大于5％；兩種涂層均對(duì)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板數(shù)量無明顯影響；對(duì)機(jī)體凝血無明顯影響。其機(jī)理可能與兩種涂層降低了az31鎂合金表面的接觸角，使其表面張力下降有關(guān)。

(6)對(duì)鎂合金表面的zn-mmt涂層抑菌圈及細(xì)菌生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)證明對(duì)s.aureus和e.coli均有明顯抗菌效果。zn-mmt涂層中zn²⁺的緩慢釋放結(jié)果表明，zn-mmt涂層中zn²⁺可以緩慢釋放達(dá)144h，能夠?qū)︶t(yī)用植入材料植入初期起到抗菌作用，減少植入感染的機(jī)會(huì)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的az31鎂合金表面zn-mmt涂層的制備方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的電鏡下zn-mmt涂層(a)(b),縱切面(c)(d)圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的na-mmt涂層的eds元素組成圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的az31、zn-mmt涂層與zn-mmt的xrd分析圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的az31鎂合金及zn-mmt涂層在dmem+10％fbs培養(yǎng)液中浸泡1d和3d后的電鏡形貌圖；

圖中：zn-mmtcoating(a)(b)為1d，(c)(d)為3d；az31(e)(f)為1d，(g)(h)為3d。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的抑菌圈效果圖。

圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線圖。

圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的鋅離子累積釋放曲線圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)描述。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的az31鎂合金表面zn-mmt涂層的制備方法，包括以下步驟：

s101：以鈉化蒙脫石(na-mmt)為載體，硝酸鋅為鋅源；以zn²⁺含量為檢測(cè)指標(biāo)，采用離子交換法制備zn-mmt抗菌中間體，首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分析硝酸鋅用量、溫度、時(shí)間對(duì)zn-mmt抗菌中間體鋅含量的影響；然后，在單因素基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，建立響應(yīng)面模型；

s102：利用水熱法，在az31鎂合金表面制備zn-mmt涂層。

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

1.1實(shí)驗(yàn)試劑、材料與設(shè)備

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)中所用到主要試劑見表1.1

表1.1化學(xué)試劑

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用基材為擠壓態(tài)az31合金，化學(xué)組成見表1-2。

表1.2實(shí)驗(yàn)用的材料組成(wt％)

1.1.3實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)中析氫和浸泡實(shí)驗(yàn)溫度通過恒溫水浴控制在36.5±1℃，電化學(xué)試驗(yàn)溫度為室溫。析氫和浸泡實(shí)驗(yàn)中，模擬體液為dmem溶液+10％小牛血清(fbs)，其配方見表1.3。

表1.3dmem的組成成分

1.1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)備

主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備見表1.4。

表1.4主要儀器設(shè)備

1.2材料的制備

1.2.1zn-mmt的制備

1.2.1.1制備工藝

稱取na-mmt5g，加入95ml去離子水，攪拌分散得到懸浮液；加入一定量的硝酸鋅；恒溫?cái)嚢?h；1500r/min，10min，得到白色沉淀物；反復(fù)洗滌、過濾，用0.1mol/l的na2s檢驗(yàn)，直至濾液中無zn²⁺檢出，65℃干燥，研磨，過200目篩，即得zn-mmt。

1.2.1.2鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取光譜純鋅0.1000g，溶于20ml硝酸(6mol/ml)，移入1000ml容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，含zn²⁺100μg/ml；取7個(gè)100ml容量瓶，分別加入100μg/mlzn²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液0ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，用去離子水稀釋至刻度，搖勻。系列鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，3μg/ml，4μg/ml，5μg/ml，6μg/ml。采用原子吸收光譜儀在213.9nm測(cè)定吸光值，每個(gè)梯度測(cè)三次，取平均值，繪制zn²⁺標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.3鋅含量的測(cè)定

稱取1gzn-mmt，加入10％硝酸20ml中，浸泡48h；離心分離，洗滌2次，洗滌液回收入容量瓶，定容至100ml；原子吸收法測(cè)定吸光值，利用zn²⁺標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算含鋅量，每組三個(gè)平行樣，取平均值。

1.2.1.4單因素分析

將5gna-mmt通過攪拌分散在95ml去離子水中得到懸浮液，分別分析硝酸鋅的量、反應(yīng)時(shí)間、溫度對(duì)zn-mmt載鋅量的影響。

1.2.1.5響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用design-expert8.0用中的box-behnken設(shè)計(jì)模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以影響鋅含量的3個(gè)因素：硝酸鋅的量(a)、溫度(b)、時(shí)間(c)為自變量，各因素設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1.5，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1.6。

表1.5響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)

表1.6響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.2.2az31鎂合金樣品的預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)用az31采用線切割加工成20×20×4mm和15×15×4mm的方塊。分別用360^#，600^#，800^#，1000^#，1200^#，1500^#水磨砂紙依次對(duì)樣品進(jìn)行打磨，丙酮浸泡去除合金表面油污和氧化皮，然后，用無水乙醇沖洗并用吹風(fēng)機(jī)吹干，備用。

1.2.3zn-mmt涂層的制備

zn-mmt涂層的az31鎂合金樣品制備，稱取zn-mmt溶于去離子水中制成2％的懸浮液，超聲破碎30min，其余步驟同1.2.3。

1.2.4鎂標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取1.6583g優(yōu)級(jí)純mgcl2，溶于去離子水中，定容至1000ml，分別量取上述溶液10ml、20ml、30ml、40ml、50ml于100ml容量瓶中，定容，得到0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l、0.5mol/l的梯度濃度溶液，采用原子吸收法，213.9nm處測(cè)od值，繪制鎂標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3涂層組織結(jié)構(gòu)及成分分析

1.3.1掃描電子顯微鏡形貌觀察及能譜分析

樣品、涂層及腐蝕前后微觀形貌及截面形貌采用掃描電子顯微鏡觀察(novananosem450，usa)，實(shí)驗(yàn)參數(shù)為加速電壓15kv。樣品上樣前噴金。利用掃描電鏡中附帶的能譜儀(eds)對(duì)上述樣品進(jìn)行點(diǎn)掃描、線掃描及面掃描，分析各樣品的組成元素和含量變化。

1.3.2x射線衍射分析(xrd)

采用d/max-2500/pcx-衍射儀分析樣品及其腐蝕產(chǎn)物的物相組成，實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：管電流i＝40ma，管電壓u＝40kv，掃描角度范圍2θ為2-80°，掃描速度為8°/min，靶材為cu-kα(λ＝0.154060nm)靶。

1.3.3傅立葉紅外光譜分析

采用nicolet380傅立葉紅外光譜儀，測(cè)定na-mmt、zn-mmt涂層在dmem++10％fbs中腐蝕后產(chǎn)物的官能團(tuán)。實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：波數(shù)范圍：4000-400cm^-1,分辨率：4cm^-1，背景采集：kbr壓片，采集點(diǎn)數(shù)：32個(gè)。

1.4涂層耐蝕性能測(cè)試

1.4.1電化學(xué)實(shí)驗(yàn)

az31合金和zn-mmt涂層的耐腐蝕性能主要采用電化學(xué)測(cè)量的方法電化學(xué)測(cè)試，通過由美國parstat2273電化學(xué)工作站完成。測(cè)試采用三電極體系：參比電極為飽和甘汞電極(sce)，輔助電極為鉑電極，工作電極為被測(cè)樣品。腐蝕介質(zhì)為ph7.4的dmem+10％fbs溶液，實(shí)驗(yàn)溫度為室溫，測(cè)試樣品面積與測(cè)試溶液體積比為1cm²/400ml。動(dòng)態(tài)極化測(cè)試時(shí)，電位掃描范圍為自腐蝕電位(ec)±300mv起，掃描速度為1mv/s。電化學(xué)測(cè)試前，樣品在dmem+10％fbs溶液中浸泡5min以使開路電位盡可能穩(wěn)定。電化學(xué)阻抗譜(eis)采用powersuite-powersine作為測(cè)試軟件，測(cè)試后采用zview軟件進(jìn)行阻抗譜的擬合與分析。

1.4.2浸泡實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)鎂合金及涂層的耐腐蝕性能和降解性能，進(jìn)行體外浸泡試驗(yàn)。浸泡試驗(yàn)按照astm-g31-72標(biāo)準(zhǔn)在dmem+10％fbs溶液中進(jìn)行，測(cè)試過程中溶液溫度保持在36.5±1℃。浸泡一定時(shí)間后進(jìn)行形貌觀察，成分分析等。

1.4.3析氫實(shí)驗(yàn)

腐蝕析氫實(shí)驗(yàn)采用排水集氫氣法，由酸式滴定管、玻璃漏斗和燒杯組成。浸泡樣品表面積約為12cm²，dmem+10％fbs溶液的體積約為300ml，面積/溶液比為1:25cm²/ml。由反應(yīng)方程式可知，每溶解一個(gè)鎂原子就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)氫氣分子，因此通過測(cè)量試樣在腐蝕過程中產(chǎn)生氫氣的體積就可以計(jì)算樣品的析氫腐蝕速率。

1.4.4ph值的變化

將az31合金、zn-mmt涂層的az31合金浸泡在dmem+10％fbs溶液中，每24h更新液體，起初浸泡24h內(nèi)每隔1h測(cè)一次，后期每24h測(cè)定一次，溶液溫度保持在36.5±1℃，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，ph為縱坐標(biāo)，繪制ph變化圖。

1.4.5浸泡溶液離子測(cè)定

將2cm×2cm×0.4cmaz31合金和zn-mmt涂層的az31合金浸泡在dmem+10％fbs溶液中，浸泡溶液體積為100ml，溫度36.5±1℃，在浸泡2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h后，分別取出樣品，利用原子吸收法檢測(cè)浸泡液中的鎂離子的變化。

1.5體外血液相容性及機(jī)理

1.5.1溶血實(shí)驗(yàn)

1.5.1.1溶血率的測(cè)定

(1)材料浸提液的制備

取2cm×2cm×0.4cm的az31合金、zn-mmt涂層的az31各4塊，分別以0.9％nacl作為浸提液，按照iso10993-1標(biāo)準(zhǔn)(試樣表面積/浸提介質(zhì))3cm²/ml的比例，靜置于36.5±1℃恒溫培養(yǎng)箱中浸提90min。用細(xì)菌過濾器過濾除菌后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)2％紅細(xì)胞懸液的制備

取新鮮人血4ml(本實(shí)驗(yàn)室人員志愿捐獻(xiàn)，不存在醫(yī)學(xué)倫理爭(zhēng)議)，1500r/min離心10min，用膠頭滴管吸出上清液，沉淀在底部的紅細(xì)胞用0.9％nacl按上述方法洗滌3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細(xì)胞用0.9％nacl配成2％的混懸液(紅細(xì)胞1ml，加0.9％nacl至50ml)。

(3)溶血率計(jì)算

分別取上述三種樣品的材料浸提液7ml、與0.9％nacl(陰性對(duì)照組)和蒸餾水(陽性對(duì)照組)為對(duì)照，分別做三組平行樣。每組浸提液中加2％紅細(xì)胞懸液1ml，混勻后置36.5±1℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1h，1000r/min離心10min，吸取上清，在545nm處測(cè)od值，取平均值計(jì)算溶血率。

溶血率(％)＝(實(shí)驗(yàn)組od值－陰性對(duì)照組od值)/(陽性對(duì)照組od值－陰性對(duì)照組od值)×100％

1.5.1.2材料浸提液ph的變化

用ph計(jì)測(cè)量上述各浸提液浸提不同時(shí)間時(shí)的ph值。

1.5.1.3材料浸提液中鎂離子的變化

采用原子吸收光譜儀測(cè)定材料浸提液浸提不同時(shí)間的鎂離子、鋅離子的變化，方法同1.4.4。

1.5.2血細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)

將az31合金和zn-mmt涂層的az31合金分別置于10ml人抗凝血中(檸檬酸鈉抗凝)，靜置，30min后進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)，與未接觸材料的血細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較。

1.5.3動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)

體外動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)內(nèi)源性凝血因子被激活的程度,使鎂合金實(shí)驗(yàn)樣品與血液接觸,測(cè)定游離血紅蛋白的光密度值,動(dòng)態(tài)地觀察不同樣品對(duì)凝血時(shí)間的影響。

分別取30μl人抗凝血，滴在az31合金和zn-mmt涂層表面。每組試驗(yàn)設(shè)有6個(gè)間隔時(shí)間(5、20、35、50、90、130min)，每個(gè)時(shí)間3平行樣。到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，樣品立即放入盛有15ml去離子水的燒杯中，靜置10min待未凝固的紅細(xì)胞充分溶于水中，在540nm處測(cè)溶液od值，繪制動(dòng)態(tài)凝血曲線，人為定義od值0.1為出現(xiàn)凝血。

1.5.4血小板黏附實(shí)驗(yàn)

將新鮮抗凝人血(實(shí)驗(yàn)室人員捐獻(xiàn))以1000r/min離心10min，即可得到富血小板血漿。分別移取20μl富血小板血漿滴于az31合金和zn-mmt涂層的表面，36.5℃恒溫箱中保溫30min，然后用pbs(ph＝7.4)清洗除去樣品表面未黏附的血小板。2.5％戊二醛固定液中固定，乙醇系列梯度脫水，取出在空氣中自然干燥，噴金，掃描電鏡觀察黏附的血小板形貌。

1.5.5接觸角測(cè)定

在室溫、空氣條件下，利用躺滴法，采用德國的easy-drop型接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定去離子水在樣品表面的接觸角，將三種樣品置于接觸角測(cè)量?jī)x的樣品室，利用微量進(jìn)樣器將0.6μl極性液體去離子水滴于樣品表面，接觸很短時(shí)間，立即采集液滴的圖像，利用量角法測(cè)得接觸角。每個(gè)樣品取3個(gè)平行樣品，每個(gè)平行樣測(cè)試4個(gè)不同的點(diǎn)，取其平均值。

1.5.6表面張力計(jì)算

依據(jù)young方程可由液體接觸角估算固體的表面張力。根據(jù)owens-wendt-kaelble觀點(diǎn)，固體總表面張力近似等于固體表面張力的非極性值和極性值的和，即γs＝γs^d+γs^p，并且與接觸角的關(guān)系見式

r＝2kη/2γlcos0°＝2kη/γl(1)

γl(1+cosθ)＝2(γ^ds×γ^dl)^1/2+2(γ^ps×γ^pl)^1/2(2)

式(1)中γl是液體的表面張力(mn/m)；γ^dl、γ^pl分別是液體表面張力的非極性部分和極性部分(mn/m)；γ^ds、γ^ps分別是固體表面張力的非極性部分和極性部分(mn/m)。因此，測(cè)定兩個(gè)已知γ^dl和γ^pl的探測(cè)液體在固體表面的接觸角，代入式(1)，聯(lián)立方程求解可得固體γ^ds、γ^ps和固體的表面張力γs..

界面張力的計(jì)算依據(jù)owen-wendit方程,計(jì)算如下：

γsl＝[(γ^pl)^1/2-(γ^ps)^1/2]²+[(γ^dl)^1/2-(γ^ds)^1/2]²(3)

如表1.7實(shí)驗(yàn)用液體表面張力及各分項(xiàng)值。

表1.7實(shí)驗(yàn)用液體表面張力及各分項(xiàng)值

1.6抗菌性能及機(jī)理分析

1.6.1實(shí)驗(yàn)菌傳代及菌懸液制備

從試管斜面上挑取e.coli和s.aureus菌體，接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜培養(yǎng)12h。離心收集菌體，用50mmol/l磷酸緩沖液(ph為6.5)洗滌2次，再加入緩沖液，制備細(xì)菌懸液，備用。

1.6.2抑菌圈(如圖6)實(shí)驗(yàn)

(1)抑菌片的制備：az31基體、na-mmt涂層和zn-mmt涂層的az31合金，滅菌后直接作為抑菌片。

(2)試驗(yàn)菌平皿的制備：通過分光光度法稀釋菌液濃度為10⁷cfu/ml。取0.1ml菌懸液在培養(yǎng)皿上均勻涂布。

(3)抑菌劑樣片貼放：每個(gè)平板貼放3片試驗(yàn)樣片，用無菌鑷子分別取各種抑菌片貼放于平皿合適位置，并做好標(biāo)記。貼放好后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面，蓋好平皿，置37℃溫箱，培養(yǎng)18h-24h觀察結(jié)果，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.3細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(如圖7a、b)

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的e.coli和s.aureus菌液,按1％的接種量(菌體濃度為10⁸個(gè)/ml)分別接種至肉湯液體培養(yǎng)基中，將az31基體zn-mmt涂層的az31合金三種樣品置入上述培養(yǎng)基中，37℃，150r/min搖床振蕩培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，用分光光度計(jì)測(cè)定od410(e.coli)、od650(s.aureus)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6.4zn-mmt涂層中鋅的體外累積釋放(如圖8)

將制備了zn-mmt涂層的az31鎂合金樣品置于ph7.4的pbs中，36.5℃，100rp/恒溫振蕩，每隔一定時(shí)間取1ml液體，然后加入等量預(yù)熱的pbs液體，繼續(xù)振蕩，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。將取出的液體用用原子吸收光譜儀測(cè)定其中鋅離子釋放量，每組設(shè)三個(gè)平行樣，取平均值，繪制鋅離子累積釋放曲線。

1.7數(shù)據(jù)處理

采用spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用平均值x±標(biāo)準(zhǔn)差(sd)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析或t檢驗(yàn)，p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異非常顯著。

2.載鋅蒙脫石制備工藝優(yōu)化及表征

蒙脫石(mmt)是一種片層狀硅酸鹽，由于其特殊的片層狀結(jié)構(gòu)，帶電荷的不均勻性及較大的比表面積，在醫(yī)藥上廣泛用作乳化劑、助懸劑、增稠劑、吸附劑、緩釋載體等。另外，mmt在無機(jī)和有機(jī)抗菌材料的載體方面的應(yīng)用，也受到研究人員的廣泛關(guān)注。在眾多抗菌材料中，無機(jī)抗菌劑的應(yīng)用較為廣泛，也是研究的熱點(diǎn)，尤其是金屬離子抗菌劑ag⁺、cu²⁺、zn²⁺均具有較好的抗菌效果。遺憾的是，以ag⁺作為抗菌離子時(shí)易變色而失性；cu²⁺抗菌作用較好，但對(duì)人體有一定毒害；zn²⁺的抗菌性能稍弱，但zn²⁺是機(jī)體必須的陽離子，相比之下，用作抗菌離子時(shí)，具有成本低、性能持久、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于各種抗菌材料中。在抗菌材料領(lǐng)域，另外一個(gè)熱點(diǎn)是載體材料。近幾年，天然非金屬礦物用作抗菌劑的載體備受關(guān)注。mmt是其中之一，天然蒙脫石層間陽離子通常是ca²⁺、na⁺、k⁺、mg²⁺，可以通過離子交換法制備h⁺、li⁺、nh⁴⁺、k⁺、cu²⁺、zn²⁺、al³⁺、fe³⁺等改性蒙脫石。我國天然蒙脫石以鈣基蒙脫石為主，存在陽離子交換容低的缺點(diǎn)，為改善這一缺點(diǎn)，常常先進(jìn)行鈉化，即鈉化蒙脫石(na-mmt)，然后再進(jìn)行陽離子交換。本實(shí)驗(yàn)以na-mmt為載體，將硝酸鋅中的zn²⁺引入na-mmt的層間，制備載鋅蒙脫石(zn-mmt)抗菌中間體，并對(duì)其進(jìn)行表征，以zn²⁺含量為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件。本發(fā)明為蒙脫石作為載體制備抗菌材料的研究提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。

2.1響應(yīng)面模型優(yōu)化zn-mmt制備工藝

2.1.1單因素分析

2.1.1.1硝酸鋅用量對(duì)zn-mmt中zn²⁺含量的影響

硝酸鋅用量對(duì)zn-mmt中zn²⁺含量的影響，隨著硝酸鋅用量的增加，zn-mmt中zn²⁺含量也逐漸增加。當(dāng)硝酸鋅用量達(dá)到4mmol時(shí)，zn-mmt中zn²⁺含量達(dá)到最大。當(dāng)硝酸鋅的用量繼續(xù)增加，zn²⁺含量不再繼續(xù)升高，由此說明4mmol硝酸鋅與5gna-mmt進(jìn)行離子交換反應(yīng)，zn²⁺含量達(dá)到飽和狀態(tài)。

2.1.1.2反應(yīng)溫度對(duì)zn-mmt中zn²⁺含量的影響

反應(yīng)溫度對(duì)zn²⁺含量影響，隨著溫度的升高，進(jìn)入到na-mmt中的zn²⁺含量開始增加，當(dāng)?shù)竭_(dá)80℃時(shí)，zn-mmt中zn²⁺含量達(dá)到最大，此后，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，zn²⁺含量不再增加，反而逐漸減少。由此可見，80℃為此離子交換反應(yīng)的較佳反應(yīng)溫度，此時(shí)，na-mmt中的zn²⁺含量最高。

2.1.1.3反應(yīng)時(shí)間對(duì)zn-mmt中zn²⁺含量的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)zn-mmt中zn²⁺含量的影響，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，進(jìn)入到na-mmt中zn²⁺含量逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到4h，zn-mmt中zn²⁺含量達(dá)到最大，此后，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，zn²⁺含量基本保持不變，由此可見，反應(yīng)達(dá)到4h，na-mmt中zn²⁺含量達(dá)到飽和，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間反而可能導(dǎo)致zn²⁺從mmt層間少量溶出。

2.1.2響應(yīng)面模型設(shè)計(jì)與結(jié)果

線性及三次模型擬合不顯著(p>0.05)，二次模型擬合極顯著(p<0.01)，因此選用二次多項(xiàng)式模型。系統(tǒng)趨向于選擇擁有最大預(yù)測(cè)決定系數(shù)和最小預(yù)測(cè)殘差平方和的模型，即二次多項(xiàng)式模型。

2.1.3建立與檢驗(yàn)回歸方程

應(yīng)用design-expert軟件對(duì)表2.1的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸模型為：

y＝-1352.84+131.30a-29.12b+10.99c+0.19ab+5.10ac+0.08bc-20.08a²-0.19b²-4.34c²

對(duì)上述模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2.1。

表2.1回歸模型方差分析表

2.1.4回歸方程的參數(shù)評(píng)估與因子效應(yīng)分析

二次回歸模型的參數(shù)評(píng)估見表2.2，由表2.2可知，a、b、c、ac、c²達(dá)到顯著水平，a²、b²為極顯著水平，由此可見，硝酸鋅的量、溫度、時(shí)間對(duì)zn-mmt中zn²⁺含量有顯著影響。綜合考慮各因素的影響，3個(gè)因素對(duì)zn-mmt的zn²⁺含量的影響次序?yàn)椋合跛徜\用量＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間。

表2.2回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表

2.1.5響應(yīng)面交互作用分析

2.1.5.1硝酸鋅的量與反應(yīng)溫度的交互作用

反應(yīng)時(shí)間4.5h時(shí)，硝酸鋅用量、反應(yīng)溫度對(duì)zn-mmt中的zn²⁺含量的影響顯著，硝酸鋅用量與溫度交互作用不顯著。固定反應(yīng)時(shí)間，隨著硝酸鋅用量的增加，zn-mmt中的zn²⁺含量也增大，硝酸鋅用量達(dá)4mmol左右時(shí)，zn²⁺含量最高；硝酸鋅用量為4mmol時(shí)，隨反應(yīng)溫度升高，zn-mmt中的zn²⁺含量逐漸增加，80℃左右zn²⁺含量最高，溫度再繼續(xù)升高，zn²⁺含量不再升高，反而有所下降。分析原因可能為在一定的溫度范圍內(nèi)，升高溫度加快離子交換的反應(yīng)速度，通過離子交換進(jìn)入到na-mmt中zn²⁺增加；但是，溫度繼續(xù)升高，zn²⁺從蒙脫石中的溶出也會(huì)相應(yīng)增加；另外，zn-mmt中zn²⁺除了離子交換的部分，還有以化學(xué)吸附的形式進(jìn)入si-o四面體和al-o八面體的微孔中少量的zn²⁺，反應(yīng)溫度升高，這部分zn²⁺可能出現(xiàn)解吸附，在洗滌過程中去除，導(dǎo)致zn²⁺含量下降。

2.1.5.2硝酸鋅用量與反應(yīng)時(shí)間的交互作用

反應(yīng)溫度80℃時(shí)，硝酸鋅用量、時(shí)間顯著影響zn-mmt中的zn²⁺含量，二者存在顯著的交互作用。固定反應(yīng)溫度，隨反應(yīng)時(shí)間增加，zn-mmt中的zn²⁺含量逐漸增加，4.5h時(shí)zn²⁺含量最高；反應(yīng)時(shí)間為4.5h時(shí)，隨著硝酸鋅用量的增加，zn-mmt中的zn²⁺含量逐漸增加，4mmol左右達(dá)到最大。分析原因可能隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，蒙脫石中陽離子交換不斷增加，4.5h后na⁺、zn²⁺交換達(dá)到平衡，再增加時(shí)間，也不會(huì)使更多的zn²⁺進(jìn)入na-mmt層間。

2.1.5.3.反應(yīng)時(shí)間與溫度的交互作用時(shí)間

硝酸鋅用量為4mmol時(shí)，反應(yīng)時(shí)間、溫度對(duì)zn-mmt中的zn²⁺含量有顯著影響，但二者無顯著交互作用。固定硝酸鋅濃度，隨反應(yīng)溫度的增加，zn-mmt中的zn²⁺含量逐漸增加，80℃時(shí)zn²⁺含量最高，當(dāng)反應(yīng)溫度80℃時(shí)，zn-mmt中的zn²⁺含量隨時(shí)間的增加而逐漸增加，4.5h時(shí)zn²⁺含量最高，進(jìn)一步增加反應(yīng)時(shí)間，zn²⁺含量不再增加，反而逐漸下降。這是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，離子交換反應(yīng)增加，使交換進(jìn)入na-mmt中zn²⁺增加，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間zn²⁺的溶出也會(huì)相應(yīng)增加；另外，si-o四面體和al-o八面體的微孔中吸附少量zn²⁺可能出現(xiàn)解吸附，導(dǎo)致zn-mmt中的zn²⁺含量下降。

2.2zn-mmt的表征

2.2.1形貌觀察及成分分析

zn-mmt電鏡下形貌，離子交換前的na-mmt，鏡下可見顆粒較大，聚集成花絮狀、團(tuán)塊狀聚集體，邊緣呈圓盾狀、旋渦狀、尖角狀等形貌。zn-mmt鏡下形貌，顆粒較細(xì)小，很少聚集成團(tuán)塊，顆粒呈不規(guī)則形，有的邊緣也存在片層狀，旋渦狀形貌。由于eds點(diǎn)掃中na與zn的峰重合，但zn含量明顯比沒交換前na增多，說明zn的峰是交換進(jìn)去的zn與未交換的na兩者的重合。zn²⁺成功插入到na-mmt片層中。

2.2.2xrd分析

蒙脫石離子交換前后xrd分析，na-mmt和zn-mmt在衍射角0°–30°之間兩個(gè)峰無明顯差別，說明在zn-mmt制備過程中只發(fā)生了zn²⁺和na⁺離子的交換，蒙脫石的結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變；另外，未出現(xiàn)鋅的衍射峰的，說明層間的鋅粒子比較細(xì)小，無明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。

當(dāng)離子交換后，蒙脫石(d001)面衍射角2θ向低角度方向偏移。利用布拉格(bragg)方程：

2dsinθ＝nλ

其中：d為蒙脫石片層的晶面間距；

θ為入射角；

λ為入射x射線的波長(zhǎng)，此處λ＝0.15406nm；

n為衍射級(jí)數(shù)，此處取n＝1。

可分別計(jì)算到各自的晶面間距d001，所得結(jié)果見表2.3。

表2.3蒙脫石及樣品層間距

由表2.3可知，離子交換后蒙脫石片層的晶面間距增大，由1.48nm增加到1.57nm，說明zn²⁺交換后，蒙脫石的(001)面網(wǎng)間距增加，分析zn²⁺交換層間的陽離子引起蒙脫石d(001)值增大的原因，可能是由于zn²⁺主要是以水合鋅離子的形式進(jìn)入了蒙脫石晶格的層間。

本發(fā)明以na-mmt、硝酸鋅為原料，采用液相離子交換法制備zn-mmt抗菌中間體；應(yīng)用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化條件；采用掃描電鏡觀察zn-mmt形貌；eds、xrd等分析組成及插層機(jī)理，得出以下結(jié)果

(1)以硝酸鋅為原料，采用離子交換法成功制備zn-mmt抗菌中間體。

(2)單因素試驗(yàn)分析表明，采用na-mmt5g，分別在硝酸鋅用量為4mmol、溫度80℃、反應(yīng)時(shí)間4h時(shí)，各自得到最高的zn²⁺含量。

(3)采用響應(yīng)面法，對(duì)zn-mmt制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的回歸方程為：y＝-1352.84+131.30a-29.12b+10.99c+0.19ab+5.10ac+0.08bc-20.08a²-0.19b²-4.34c²；最佳優(yōu)化條件：硝酸鋅為4mmol，溫度為80℃，時(shí)間為4.5h，此時(shí)得到的zn-mmt抗菌中間體中的zn²⁺含量達(dá)到94.65mg/g。

(4)zn-mmt鏡下呈現(xiàn)顆粒細(xì)小，很少聚集成團(tuán)塊，顆粒呈不規(guī)則形，有的邊緣也存在片層狀，旋渦狀形貌。zn²⁺主要是以水合鋅離子的形式進(jìn)入了蒙脫石晶格的層間，層間距由離子交換前的1.48nm增加到1.57nm。

3、zn-mmt涂層的耐蝕性能及降解機(jī)理

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年由于疾病、交通事故和運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷等造成的骨缺損和缺失患者人數(shù)近1000萬人，在骨修復(fù)手術(shù)過程中，骨植入材料起到至關(guān)重要的作用。目前，在臨床上常用的傳統(tǒng)骨科內(nèi)固定材料主要有不銹鋼、鈦合金、鈷鉻鉬合金等，雖然，這些材料較廣泛地應(yīng)用于臨床，但仍存在彈性模量高于人骨，多數(shù)需要二次手術(shù)等缺點(diǎn)。因此，發(fā)展可降解金屬生物材料已成為當(dāng)前骨植入材料發(fā)展的方向，鎂合金以其具有可降解性能、良好的生物學(xué)特性及力學(xué)性能漸漸引起研究人員的關(guān)注，大量的基礎(chǔ)研究、體外實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)，均取得可喜的成績(jī)。但是，也要看到鎂合金作為醫(yī)用植入材料仍然存在許多問題：鎂合金植入材料在人體內(nèi)含有cl^-離子體液環(huán)境中會(huì)迅速降解，使之不能維持到骨骼愈合；另外腐蝕產(chǎn)生的物質(zhì)刺激局部組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)等等。鎂合金醫(yī)用材料的這些缺點(diǎn)嚴(yán)重影響其應(yīng)用，制約了它的發(fā)展。如何減慢鎂合金的降解速度，特別是控制其植入初期的降解，使之在體內(nèi)完成使命后再逐漸降解？目前這一問題成為研究的熱點(diǎn)。對(duì)鎂合金表面進(jìn)行改性是提高鎂合金耐腐蝕性行之有效的方法，不改變鎂合金固有的特性，通過調(diào)整改性表面的成分和結(jié)構(gòu)控制其腐蝕速率。

天然蒙脫石是由兩層硅氧四面體夾一層鋁氧八面體構(gòu)成的層狀硅酸鹽粘土礦物，是非金屬納米礦物，其鈉化后的蒙脫石具有分散能力好、吸附性能及離子交換能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，加之礦產(chǎn)資源豐富、價(jià)格低等，廣泛應(yīng)用于石油化工、冶金、污水處理、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)。

本發(fā)明通過水熱法在鎂合金表面制備zn-mmt涂層；電鏡觀察形貌；eds、xrd分析其組成，探討涂層形成機(jī)理；通過電化學(xué)實(shí)驗(yàn)、浸泡實(shí)驗(yàn)、電鏡觀察浸泡后形貌及xrd分析涂層的抗腐蝕性能及機(jī)理。本發(fā)明首次將蒙脫石應(yīng)用于鎂合金表面，為鎂合金改性提供新的方法，為后續(xù)研究zn-mmt涂層的抗菌性能打下基礎(chǔ)。

3.1zn-mmt涂層的形貌與成分分析

3.1.1zn-mmt涂層的電鏡形貌及eds分析

圖2為az31基體和zn-mmt涂層表面電鏡形貌，從圖2(a)(b)中可以看出zn-mmt涂層附著在az31表面形成了一層較厚均勻的涂層，呈典型的蒙脫石片層狀結(jié)構(gòu)，電鏡下能清晰地看到鋅的納米顆粒。圖2.(c)為縱切面圖，顯示zn-mmt涂層與合金結(jié)合較緊密，厚度約40μm。圖2(d)線掃描圖譜。

圖3為zn-mmt涂層的eds元素組成圖，為zn-mmt涂層的eds分析，在涂層表面除了存在mg、al、o、si等元素外，還出現(xiàn)了zn，進(jìn)一步說明在az31表面形成的涂層為zn-mmt。

3.1.2zn-mmt涂層的xrd分析

zn-mmt涂層的xrd分析見圖4，az31、zn-mmt和zn-mmt涂層在2θ角為20°時(shí)，zn-mmt存在特征峰；同樣，在zn-mmt涂層存在zn-mmt的特征峰，說明涂層是由zn-mmt形成的。

3.2zn-mmt涂層的耐蝕性能

選用模擬體液為dmem+10％fbs培養(yǎng)液，相對(duì)于當(dāng)前研究所用較多的hank's液和sbf等，主要成分是無機(jī)鹽離子和葡萄糖，而dmem在上述基礎(chǔ)上增加了多種氨基酸，另外血清中含血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素等成分，更貼近人體內(nèi)環(huán)境，以此作為腐蝕介質(zhì)分析az31基體和zn-mmt涂層的抗腐蝕性能，對(duì)今后鎂合金的體內(nèi)植入等應(yīng)用性研究更有參考價(jià)值。

3.2.1zn-mmt涂層的電化學(xué)分析

利用電化學(xué)分析技術(shù)對(duì)az31鎂合金及zn-mmt涂層在體外模擬腐蝕體系中腐蝕速率進(jìn)行分析，評(píng)估其作為體內(nèi)可吸收降解醫(yī)用植入材料的可行性。

3.2.1.1極化曲線

極化曲線反應(yīng)了電極電位與極化電流或電流密度之間的關(guān)系。腐蝕電位(ecoor)的大小反映了材料全面腐蝕反應(yīng)發(fā)生的難易程度：電位越高，耐蝕性越好。腐蝕電流(icorr)大小反映了腐蝕進(jìn)行的快慢以及腐蝕發(fā)生的程度。腐蝕電流越小，則腐蝕速率越小，耐蝕性越好。az31鎂合金基體和na-mmt涂層在dmem+10％fbs培養(yǎng)液中36.5℃時(shí)的極化曲線圖表明，az31在dmem+10％fbs溶液中的腐蝕電位ec＝-1.54v，zn-mmt涂層的腐蝕電位ec＝-1.33v。結(jié)果表明，在dmem+10％fbs溶液中zn-mmt涂層比az31鎂合金的耐腐蝕性強(qiáng)，也就是說水熱法制備的zn-mmt涂層在模擬體液中對(duì)鎂合金有一定保護(hù)作用。表3.1為az31鎂合金及zn-mmt涂層的自腐蝕電位，腐蝕電流密度，由表可知，zn-mmt涂層的az31鎂合金基體腐蝕電流密度比az31基體提高了約2個(gè)數(shù)量級(jí)，腐蝕速度下降明顯。由此說明，zn-mmt涂層明顯提高了az31鎂合金的耐蝕性。

表3.1az31基體及zn-mmt涂層的自腐蝕電位，腐蝕電流密度

3.2.1.2交流阻抗譜測(cè)試

通過交流阻抗法(eis)對(duì)zn-mmt涂層的性耐蝕進(jìn)行了進(jìn)一步分析，結(jié)果表明，zn-mmt涂層在高頻區(qū)的容抗弧直徑遠(yuǎn)高于az31鎂合金基體，因此其阻抗值z(mì)n-mmt涂層＞az31，由此表明zn-mmt涂層極大地提高了az31鎂合金基體的耐蝕性，能更有效地防止各種離子向鎂合金基體的擴(kuò)散、滲透，從而降低az31鎂合金基體的腐蝕速率。

3.2.2zn-mmt涂層浸泡中的析氫變化

az31鎂合金基體及zn-mmt涂層在dmem+10％fbs液體中的析氫速率中可以發(fā)現(xiàn)，zn-mmt涂層的腐蝕速度明顯低于az31鎂合金基體本身，在浸泡初期12h，隨著時(shí)間的增加，az31基體表面有大量氣泡生成，24-60h內(nèi)均維持較高的氫氣釋放速率，約為0.07ml·cm^-2·h^-1；60h后az31基體的析氫速率緩慢下降為0.06ml·cm^-2·h^-1，可能是腐蝕產(chǎn)物堆積及溶液ph升高，使腐蝕速度降低所致。圖中顯示zn-mmt涂層的析氫速率明顯低于az31，腐蝕速度低于基體本身，平均析氫率為0.015ml·cm^-2·h^-1左右，說明zn-mmt涂層有效地改善了az31鎂合金的抗腐蝕能力。

3.2.3zn-mmt涂層浸泡時(shí)ph變化

az31鎂合金基體及zn-mmt涂層在dmem+10％fbs液體浸泡時(shí)ph變化可知，z31合金在dmem+10％fbs溶液浸泡前5h，ph值迅速上升，然后緩慢升高，浸泡24h后ph升高至8.9左右；而zn-mmt涂層在dmem+10％fbs溶液浸泡后ph緩慢增加，24h后ph升高至7.91。由此可以看出，zn-mmt涂層起到了一定的保護(hù)作用，減緩了az31鎂合金的腐蝕。

3.3.zn-mmt涂層腐蝕后電鏡形貌及eds分析

圖5(a)(b)為zn-mmt涂層在dmem+10％fbs培養(yǎng)液中浸泡1d后的微觀形貌，觀察到涂層表面結(jié)構(gòu)稍有松散，無明顯的腐蝕現(xiàn)象。圖5(e)(f)az31基體浸泡1d形貌，可以看到明顯的裂紋腐蝕，不規(guī)則，表面可見腐蝕產(chǎn)物。圖5(c)(d)zn-mmt涂層在dmem+10％fbs培養(yǎng)液中浸泡3d后的微觀形貌，涂層表面出現(xiàn)明顯裂紋，但裂紋深度未到達(dá)基體表面。圖5(e)(f)az31基體浸泡3d可以看到裂紋腐蝕較深，腐蝕產(chǎn)物增多。比較az31及zn-mmt涂層在dmem+10％fbs溶液中腐蝕1d和3d天后的形貌，可以看出zn-mmt涂層的制備對(duì)基體起到了較好的保護(hù)作用。

zn-mmt涂層的腐蝕從涂層表面開始向內(nèi)部發(fā)展，出現(xiàn)裂紋，從裂紋多少及分布來看，短時(shí)間內(nèi)涂層不會(huì)脫落。由此可見，zn-mmt涂層增加了az31鎂合金的耐蝕性。

本發(fā)明通過水熱法成功地在az31鎂合金表面制備了zn-mmt涂層，

(1)zn-mmt涂層電鏡下可觀察到納米鋅的顆粒，結(jié)構(gòu)致密；與基體結(jié)合緊密；涂層約40μm厚。

(2)az31鎂合金表面的zn-mmt涂層腐蝕電流密度比az31基體提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)，eis圖中半圓直徑遠(yuǎn)大于基體，腐蝕速度明顯下降。

(3)az31鎂合金表面zn-mmt涂層，通過電化學(xué)實(shí)驗(yàn)、析氫實(shí)驗(yàn)、浸泡實(shí)驗(yàn)及電鏡觀察，結(jié)果表明，zn-mmt涂層可以有效的減緩樣品在模擬體液中的腐蝕，提高了鎂合金的抗腐蝕能力

4、zn-mmt涂層的體外血液相容性

當(dāng)今時(shí)代，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和材料學(xué)的發(fā)展十分迅猛，生物醫(yī)用材料己逐漸在骨外科、口腔科、心血管科等臨床治療中發(fā)揮著重要的作用。在各國生物醫(yī)用材料分析中，生物學(xué)評(píng)價(jià)是最基本的環(huán)節(jié)，也是對(duì)人體安全性的重要保證。生物相容性是指生物醫(yī)用材料應(yīng)用于生物體內(nèi)，所產(chǎn)生的宿主反應(yīng)是可接受的，并能起到有效治療作用，它反映了材料與活體組織或系統(tǒng)相互作用的生物學(xué)行為^[194]，包括血液相容性、組織相容性。生物醫(yī)用材料與血液接觸時(shí)，兩者相互作用，血液中的各種成分及功能不可避免會(huì)受到影響。但是，具有良好血液相容性的生物醫(yī)用材料對(duì)血液成分及功能影響較小，不會(huì)造成凝血、溶血等損害。本發(fā)明在az31鎂合金表面制備zn-mmt涂層，提高了耐蝕性，比較適合骨科固定材料。下面對(duì)兩種涂層進(jìn)行體外溶血實(shí)驗(yàn)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)、凝血酶原時(shí)間、血小板黏附實(shí)驗(yàn)，以考察zn-mmt涂層的az31鎂合金的血液相容性；同時(shí)，通過測(cè)定浸提液中鎂離子濃度、ph、鎂合金及涂層的接觸角等，探討涂層提高az31鎂合金血液相容性的機(jī)理，為其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

4.1體外血液相容性

4.1.1溶血實(shí)驗(yàn)

溶血，即紅細(xì)胞破裂，血紅蛋白外逸，亦稱為紅細(xì)胞溶解。在臨床上，引起溶血的因素很多，可分為內(nèi)源性因素與外源性因素。其中，內(nèi)源性因素包括溶血性細(xì)菌侵入抗原-抗體反應(yīng)、各種機(jī)械損傷、紅細(xì)胞內(nèi)在(膜、酶)缺陷、藥物作用等；外源性因素主要有低滲溶液、機(jī)械強(qiáng)力振蕩、突然低溫冷凍、過酸或過堿等。溶血率實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)常用的檢驗(yàn)植入材料血液相容性的方法，由于其能敏感的反應(yīng)材料對(duì)紅細(xì)胞的影響，所以被公認(rèn)為是評(píng)價(jià)長(zhǎng)期植入骨、軟組織及血液環(huán)境中的生物材料的安全性的指標(biāo)之一。iso標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，如果材料與血液接觸后的溶血率小于5％，則符合溶血率要求；如果材料與血液接觸后溶血率大于5％，則預(yù)示著材料有溶血作用。本發(fā)明試驗(yàn)采用體外非直接接觸法-利用和材料充分接觸的浸提液來與新鮮血液接觸，考察由材料釋放出的離子對(duì)紅細(xì)胞有無溶血作用。

az31鎂合金、zn-mmt涂層的血紅蛋白吸光值及溶血率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明；az31的溶血率為41.62％，大于5％，發(fā)生了明顯溶血現(xiàn)象；zn-mmt涂層的溶血率為3.99％，均小于5％，無明顯溶血現(xiàn)象，溶血率達(dá)到了生物材料要求的標(biāo)準(zhǔn)。其中，zn-mmt涂層的溶血率明顯低于az31鎂合金基體，兩兩比較有極顯著性意義(p<0.01)；顯然，在az31鎂合金表面制備了zn-mmt涂層后明顯提高了az31鎂合金的血液相容性。

4.1.2血細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)

血液是由血漿和血細(xì)胞組成的流體組織，在心血管系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)流動(dòng),起著運(yùn)輸物質(zhì)的作用，血細(xì)胞可分為紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板三類，各自執(zhí)行著相應(yīng)的功能。生物材料的血液相容性包括對(duì)血液成分及功能無明顯影響，即：不會(huì)造成紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板的明顯減少。本發(fā)明對(duì)az31鎂合金和zn-mmt涂層進(jìn)行體外血細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果為三種樣品在血液中浸泡30min后，血小板減少分別為(1.26±0.56×10¹⁰/l、1.45±0.52×10¹⁰/l)，紅細(xì)胞減少分別為(1.15±0.80×10¹¹/l、1.42±0.61×10¹¹/l)及白細(xì)胞減少分別為(0.17±0.02×10⁹/l、0.14±0.06×10⁹/l)，三種血細(xì)胞的數(shù)量稍有所下降，但均在正常范圍內(nèi)。經(jīng)spss16.0軟件進(jìn)行方差分析，posthoctests結(jié)果為；az31鎂合金、zn-mmt涂層在血液中浸泡30min后，三種血細(xì)胞減少均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。

綜合來看，az31鎂合金比zn-mmt涂層造成的血細(xì)胞的減少明顯，但數(shù)據(jù)經(jīng)過方差分析兩兩比較均無顯著性意義(p>0.05)。說明三種樣品對(duì)血液中紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板影響不大，即zn-mmt涂層后的az31合金對(duì)血細(xì)胞無明顯影響。分析三種血細(xì)胞稍有下降的原因，白細(xì)胞下降了可能是材料表面吸附所致，在材料接觸血液時(shí)，白細(xì)胞表面cr3受體的表達(dá)增強(qiáng)，能夠識(shí)別附在材料表面的c3的分解產(chǎn)物，促使白細(xì)胞在材料表面吸附，導(dǎo)致白細(xì)胞數(shù)量減少；紅細(xì)胞的減少與材料接觸血液后，發(fā)生少量溶血有關(guān)；血小板減少也是由于材料吸附所致。

4.1.3動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)

體外動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)常用來檢測(cè)內(nèi)源性凝血因子被激活的程度，以觀察材料對(duì)人體血液凝血時(shí)間的影響。體外動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間曲線反映血液在材料表面的凝固趨勢(shì)和凝血時(shí)間的長(zhǎng)短，可以比較各種材料對(duì)凝血因子的激活程度,凝血程度越小，材料的血液相容性越好。為了方便比較對(duì)不同材料的抗凝血性能，人為地把縱坐標(biāo)吸光度值為0.100時(shí)的時(shí)間定義為材料的凝血時(shí)間。

從az31鎂合金、zn-mmt涂層的動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間曲線發(fā)現(xiàn)，2條曲線隨著與血液接觸時(shí)間的增長(zhǎng)，材料的od值逐漸減小，最終趨于平緩。在達(dá)到0.10吸光值時(shí)，az31所用時(shí)間最短，其次是na-mmt涂層，時(shí)間最長(zhǎng)的是zn-mmt涂層。zn-mmt涂層的曲線經(jīng)歷時(shí)間長(zhǎng)，呈緩慢向下傾斜形狀，抗凝血性能均優(yōu)于az31。綜合而言，涂層提高了az31鎂合金的抗凝血性能。

4.1.4血小板黏附實(shí)驗(yàn)

血小板是由紅骨髓中巨核細(xì)胞破碎后形成的一種無色、體積小、形態(tài)不規(guī)則的小體，生物材料與血液接觸后，表面吸附一定量的纖維蛋白原，同時(shí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，血小板會(huì)黏附在纖維蛋白原周圍，聚集、釋放大量的凝血活性因子，使凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，凝血酶?huì)激活新的凝血因子，如此循環(huán)發(fā)生凝血反應(yīng)，形成血栓。因此，生物材料表面血小板黏附的數(shù)量和激活狀態(tài)是血液相容性中抗凝血性能最基本的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。血小板黏附愈少，變形越少，則血液相容性愈好。

從eds點(diǎn)掃箭頭所指部位，顯示出有s、c、o等元素成分，結(jié)合形貌確定為血小板；從sem圖中可以看到三種樣品表面均黏附有很少的血小板，血小板形狀不規(guī)則，但都沒有偽足，表明血小板沒有被激活，表現(xiàn)出了良好的抗血小板黏附性能。

4.2血液相容性機(jī)理

4.2.1浸提液mg²⁺濃度及ph的影響

本實(shí)驗(yàn)對(duì)溶血實(shí)驗(yàn)中材料浸提液中的mg²⁺濃度及ph進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4.1。由表4.1可以明顯看出，az31鎂合金在生理鹽水中浸提30min后，mg²⁺濃度為38.23±2.96，是正常人血清mg²⁺濃度的35倍多，而zn-mmt涂層浸提液中mg²⁺濃度略高于人血清正常值；az31鎂合金出現(xiàn)溶血，溶血率41.6％，而zn-mmt涂層未發(fā)生溶血，溶血率分別為3.99％，均小于5％。另外，由表4.1可知，az31鎂合金浸提液ph為8.25±0.77，明顯堿化，高于機(jī)體可以代償?shù)乃?，而zn-mmt涂層浸提液中ph無明顯改變，仍在正常人體體液的ph范圍內(nèi)。

表4.1各組浸提液mg²⁺濃度及ph值

4.2.2接觸角測(cè)定

4.2.2.1材料與去離子的接觸角測(cè)定

材料的親水性與人體對(duì)這種材料的相容性呈正相關(guān)，親水性越高，材料的生物相容性越高。由于血液及組織液中主要組成是水，因此材料的接觸角測(cè)定采用材料與水的接觸界面進(jìn)行測(cè)定。材料的接觸角測(cè)定一定程度上反映了材料親水性，比較az31鎂合金、zn-mmt涂層后材料的接觸角，去離子水滴滴到az31鎂合金基體表面，球形水滴較快變成半球形，平均接觸角為60.43±3.38；滴到zn-mmt涂層時(shí)，球形水滴迅速浸潤(rùn)，zn-mmt涂層后接觸角比az31鎂合金基體減小；三組接觸角數(shù)據(jù)見表4.2，zn-mmt涂層后接觸角與az31鎂合金進(jìn)行比較p<0.05，有顯著性意義；但兩種涂層進(jìn)行比較p＝0.53，p>0.05，無顯著性意義。由此說明，在az31鎂合金表面制備zn-mmt涂層后，提高了材料的親水性能，兩種涂層之間親水性相似，無明顯差別。由此可知，在az31鎂合金表面制備zn-mmt涂層后，材料的接觸角減小，親水性提高，故血液相容性提高。

表4.2材料的接觸角測(cè)定

4.2.3表面張力及界面張力的計(jì)算

根據(jù)公式：

r＝2kη/2γlcos0°＝2kη/γl(1)

γl(1+cosθ)＝2(γ^ds×γ^dl)^1/2+2(γ^ps×γ^pl)^1/2(2)

γsl＝[(γ^pl)^1/2-(γ^ps)^1/2]²+[(γ^dl)^1/2-(γ^ds)^1/2]²(3)

γs＝γs^d+γs^p

可計(jì)算得az31、zn-mmt涂層的表面張力與界面張力,計(jì)算結(jié)果見表4.3：

表4.3不同樣品表面張力、各分項(xiàng)值和界面張力

由表4.3可知，az31鎂合金及zn-mmt涂層的色散力分量γ^ds相差不明顯，而兩種涂層的極性分量γ^ps均明顯大于az31鎂合金，即zn-mmt表面張力高于az31鎂合金。γ^ps是影響材料血液相容性的重要因素，γ^ps的增加提高了材料的潤(rùn)濕性，另一方面使材料優(yōu)先吸附白蛋白，改善材料的血液相容性。zn-mmt涂層的界面張力值小于az31基體。即材料的界面能較小，因而zn-mmt涂層樣品比az31鎂合金基體具有更優(yōu)的血液相容性。

如前面所述表面張力是分子色散力和極性力的共同作用的結(jié)果。提高樣品表面色散力，能夠提高表面吸附蛋白質(zhì)層的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高材料表面的血液相容性。

極性力分量γ^ps/γs是一項(xiàng)生物材料血液相容性的決定性因素，提高極性分量(γ^ps/γs)能夠促進(jìn)血漿白蛋白在表面的吸附，而色散力分量(γ^ds/γs)越高則會(huì)優(yōu)先吸附纖維蛋白^[43]。白蛋白減少與血小板形成復(fù)合體，能夠減少凝血現(xiàn)象的發(fā)生，而纖維蛋白原在材料表面蛋白吸附和血栓形成方面起著非常重要的作用，它與血小板形成復(fù)合體，加速凝血作用，纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白包裹住血液中的某些成分，導(dǎo)致血栓形成。因此極性力分量越高，材料表面的血液相容性越優(yōu)。材料與血液之間的界面能較小的時(shí)候，材料表面不易于吸附纖維蛋白，且吸附的蛋白層只會(huì)產(chǎn)生很少的構(gòu)象變性，這樣的材料有效抑制血小板的激活、團(tuán)聚及變形，具有良好的血液相容性。

本發(fā)明分析了az31鎂合金及在其表面制備的zn-mmt涂層對(duì)血液中紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等的影響，通過溶血率、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、體外動(dòng)態(tài)凝血試驗(yàn)、血小板黏附試驗(yàn)評(píng)估了兩種涂層的血液相容性，并通過測(cè)定材料浸提液中mg²⁺濃度、ph值及材料的接觸角分析溶血及血小板黏附試驗(yàn)的機(jī)理，得出以下結(jié)論：

(1)az31鎂合金表面制備了zn-mmt涂層后溶血率明顯下降，均低于5％，達(dá)到醫(yī)用生物材料對(duì)血液溶血率的要求。

(2)az31鎂合金、zn-mmt涂層體外接觸血液后，對(duì)血液成分無明顯影響，雖然血液中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板數(shù)量均有一定程度減少，但均在正常范圍。

(3)動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間試驗(yàn)表明，在達(dá)到0.10吸光值時(shí)，az31所用時(shí)間較短，時(shí)間較長(zhǎng)的是zn-mmt涂層。zn-mmt抗凝血性能均優(yōu)于az31鎂合金基體。

(4)血小板粘附試驗(yàn)顯示，az31鎂合金和zn-mmt涂層的樣品表面均黏附有很少的血小板，血小板形狀不規(guī)則，但都沒有偽足，表明血小板沒有被激活，表現(xiàn)出了良好的抗血小板黏附性能。

(5)通過材料浸提液中mg²⁺濃度、ph值測(cè)定分析az31鎂合金溶血率高的機(jī)理是：一是az31鎂合金迅腐蝕后mg²⁺溶出，高濃度的鎂離子使紅細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生較大的滲透壓差，紅細(xì)胞膜破壞發(fā)生溶血；二是mg²⁺溶出，生成mg(oh)2，使浸提液ph升高，ph值較高時(shí)，血紅蛋白和膜的結(jié)合效應(yīng)較強(qiáng)，影響紅細(xì)胞的溶血速率；另外，ph值較高時(shí)，血紅細(xì)胞會(huì)與溶液中的ca²⁺發(fā)生融合反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，造成溶血。而zn-mmt涂層的az31鎂合金樣品由于受到涂層的保護(hù)，避免了腐蝕反應(yīng)的發(fā)生，使浸泡樣品的溶液的mg²⁺無明顯溶出、ph值保持恒定值(7.40左右)，因而溶血率下降。

(6)通過接觸角測(cè)定表明在az31鎂合金表面制備zn-mmt涂層后材料的接觸角明顯減小，親水性增加，是材料血液相容性好的機(jī)理。

5、zn-mmt涂層的抗菌實(shí)驗(yàn)

5.1抑菌圈實(shí)驗(yàn)

az31鎂合金na-mmt涂層、zn-mmt涂層對(duì)e.coli和s.aureus的抑菌圈結(jié)果見圖6。圖6(a)(b)(c)az31、na-mmt涂層、zn-mmt涂層對(duì)e.coli抑菌圈，圖6(d)(e)(f)是s.aureus平板上的抑菌圈，az31鎂合金(圖6(a)(d))，na-mmt涂層(圖6(b)(e))對(duì)e.coli及s.aureus均未產(chǎn)生抑菌圈，說明az31鎂合金，na-mmt涂層對(duì)兩種菌無抑菌作用；az31鎂合金zn-mmt涂層對(duì)e.coli及s.aureus均出現(xiàn)明顯抑菌圈，直徑分別為：25mm，23mm，說明在az31鎂合金表面通過水熱法制備的zn-mmt涂層對(duì)e.coli和s.aureus均有較好的抗菌效果。

5.2細(xì)菌生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)

5.2.1zn-mmt涂層對(duì)e.coli生長(zhǎng)曲線的影響

az31鎂合金zn-mmt涂層對(duì)e.coli生長(zhǎng)曲線的影響見圖7(a)。e.coli生長(zhǎng)曲線呈s型，典型的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線；添加na-mmt涂層az31鎂合金的e.coli生長(zhǎng)曲線經(jīng)歷短暫的延遲期，迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期；az31鎂合金組延遲期大約10h，然后進(jìn)入正常生長(zhǎng)。分析原因可能是：az31鎂合金在菌液中發(fā)生降解，產(chǎn)生mg(oh)2，培養(yǎng)基輕度堿化，使細(xì)菌生長(zhǎng)延遲，但是，由于e.coli是腸道菌群，對(duì)堿性環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，故很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；zn-mmt涂層細(xì)菌菌液吸光值無明顯變化，說明e.coli生長(zhǎng)明顯受到抑制。

5.2.2zn-mmt涂層對(duì)s.aureus生長(zhǎng)曲線的影響

az31鎂合金zn-mmt涂層對(duì)s.aureus生長(zhǎng)曲線的影響見圖7(b)，對(duì)照組及na-mmt涂層組s.aureus生長(zhǎng)曲線呈s型，典型的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，說明na-mmt涂層對(duì)s.aureus無抑制作用；az31鎂合金組和zn-mmt涂層組細(xì)菌菌液吸光值無明顯變化，表明s.aureus生長(zhǎng)明顯受到抑制。由此說明，表面有zn-mmt涂層的az31鎂合金抑制了s.aureus生長(zhǎng)；而az31鎂合金組s.aureus受到抑制的原因可能是s.aureus對(duì)鎂合金降解導(dǎo)致堿性環(huán)境不能耐受，生長(zhǎng)受到抑制。

5.3zn-mmt涂層中zn²⁺體外累積釋放

圖8為涂層在磷酸緩沖液中的累積釋放曲線，可以看出曲線分成兩部分，第一部分前96h，zn²⁺以基本以恒速釋放，96h后釋放速度減慢，釋放量明顯減少；zn-mtt中的zn²⁺釋放并沒有出現(xiàn)以往研究人員做mmt緩釋藥物中先快，然后穩(wěn)定，再減慢釋放的結(jié)果，分析原因，可能前期制備zn-mmt中，對(duì)mmt表面物理吸附的zn²⁺進(jìn)行徹底清洗，所以不會(huì)出現(xiàn)釋放初期的快速釋放階段，而是化學(xué)吸附和插層中的zn²⁺緩慢釋放的過程，持續(xù)約96h，以后zn²⁺釋放出現(xiàn)明顯減少，但仍有少量zn²⁺溶出，由此說明，az31鎂合金表面的zn-mmt涂層中zn²⁺緩慢釋放，持續(xù)達(dá)144h，對(duì)外科植入手術(shù)初期可以起到一定的抗菌效果。

6、結(jié)論

本發(fā)明以na-mmt為載體，硝酸鋅為鋅源，采用離子交換法，制備zn-mmt抗菌中間體；然后，利用水熱法，在az31鎂合金表面制備zn-mmt涂層；分析了涂層的結(jié)構(gòu)、組成、形成機(jī)理及在dmem+10％fbs溶液中的降解行為和耐腐蝕機(jī)理；采用測(cè)定溶血率、動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間，血小板粘附實(shí)驗(yàn)、接觸角計(jì)算等研究?jī)煞N涂層的血液相容性；通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)及細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，分析zn-mmt涂層的抗菌性能及機(jī)理，得出以下結(jié)論：

(1)以zn²⁺含量為指標(biāo)，對(duì)zn-mmt抗菌中間體制備過程中的各個(gè)影響因素進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在硝酸鋅為4mmol、反應(yīng)溫度80℃、反應(yīng)時(shí)間4h時(shí)分別得到最高載鋅量。然后，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件。最終的優(yōu)化工藝為：硝酸鋅為4mmol，溫度為80℃，時(shí)間為4.5h，蒙脫石載鋅量達(dá)到94.65mg/g。由此工藝獲得的zn-mmt抗菌中間體電鏡下呈不規(guī)則狀，很少聚集，eds及xrd中均顯示zn²⁺成功插入到蒙脫石片層中，蒙脫石片層的晶面間距由1.48nm增加到1.57nm。

(2)利用水熱法，以az31為基體，溫度160℃，ph10.5，時(shí)間36h，將將前期制備的抗菌中間體zn-mmt負(fù)載到az31鎂合金表面，制備了zn-mmt涂層。涂層與基體結(jié)合緊密；高倍電鏡可觀察到除了mmt典型的片層狀結(jié)構(gòu)，還出現(xiàn)納米鋅的顆粒；eds及xrd均顯示出鋅的存在；電化學(xué)實(shí)驗(yàn)、析氫實(shí)驗(yàn)、浸泡過程中ph及鎂離子測(cè)定，均顯示出zn-mmt涂層提高了az31鎂合金的抗腐蝕能力，起到較好地延緩降解的效果。

(3)對(duì)az31鎂合金表面的zn-mmt涂層進(jìn)行血液相容性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)涂層溶血率均低于5％，基體的溶血率為41.62％，大于5％；zn-mmt涂層均對(duì)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板數(shù)量無明顯影響；對(duì)機(jī)體凝血無明顯影響?？傊?，體外實(shí)驗(yàn)證明，az31鎂合金表面的zn-mmt涂層提高了az31鎂合金的血液相容性；分析其機(jī)理可能與兩種涂層降低了az31鎂合金表面的接觸角，使其表面張力下降有關(guān)。

(4)對(duì)負(fù)載到az31鎂合金后zn-mmt涂層的抗菌性能先后進(jìn)行了分析。抑菌圈及細(xì)菌生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)證明對(duì)s.aureus和e.coli均有明顯抗菌效果。對(duì)其抗菌機(jī)理機(jī)理可能為：na-mmt層間陽離子與具有殺菌作用的zn²⁺交換、吸附至層間，從而導(dǎo)致na-mmt電價(jià)失衡，使其本身帶正電荷，通過靜電作用吸引帶負(fù)電荷的細(xì)菌，使細(xì)菌大量吸附在zn-mmt表面，然后zn²⁺發(fā)揮直接的殺菌作用，它的殺菌作用是靜電吸附和zn²⁺殺菌能力共同作用的綜合結(jié)果，發(fā)揮抗菌的作用的位點(diǎn)在細(xì)菌的細(xì)胞壁，即：zn²⁺作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性，通透性增高，胞內(nèi)物質(zhì)外漏，菌體最終死亡。

(5)分析了az31鎂合金表面zn-mmt涂層中zn²⁺的緩慢釋放，結(jié)果表明，zn-mmt涂層中zn²⁺可以緩慢釋放達(dá)144h，能夠?qū)︶t(yī)用植入材料植入初期起到抗菌作用，減少植入感染的機(jī)會(huì)。

綜上所述，利用na-mmt制備抗菌中間體zn-mmt，將zn-mmt成功負(fù)載到az31鎂合金表面，涂層延緩了鎂合金基體的降解，提高了鎂合金的血液相容性，zn-mmt涂層同時(shí)具備抗菌性能，zn²⁺緩慢釋放達(dá)144h，能夠?qū)︶t(yī)用植入材料植入初期起到抗菌作用，減少植入感染的機(jī)會(huì)。由此推斷，具有zn-mmt涂層的az31鎂合金有望成為較好的功能性醫(yī)用植入材料。

本發(fā)明利用水熱法，在az31鎂合金表面制備了zn-mmt涂層，系統(tǒng)地分析了涂層的形成機(jī)理、結(jié)構(gòu)形貌、在模擬提液中的降解及耐蝕性機(jī)理，認(rèn)為zn-mmt涂層有效地控制了鎂合金的降解，此方面研究尚未見報(bào)道。

本發(fā)明利用水熱法，在az31鎂合金表面制備了zn-mmt涂層，在耐蝕性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，首次對(duì)az31鎂合金表面zn-mmt涂層進(jìn)行系統(tǒng)的抗菌性能及緩釋性能分析，認(rèn)為制備的zn-mmt涂層具有較好的抗菌性能及緩釋效果。

本發(fā)明首次系統(tǒng)地分析zn-mmt涂層的體外血液相容性及zn-mmt涂層降低az31鎂合金溶血率的機(jī)理，為mmt應(yīng)用到鎂合金表面后制備醫(yī)用植入材料，評(píng)價(jià)其生物安全性提供依據(jù)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。