專利名稱：顯微鏡照明裝置及其適配器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及暗視場顯微術(shù)領(lǐng)域，更特別地涉及一種用于提高分辨率的能夠與熒光顯微術(shù)任意結(jié)合的裝置和方法。
背景技術(shù)：
所有活的生物，包括人類，都是由細(xì)胞組成的。大多數(shù)的生命形態(tài)以單細(xì)胞存在，單細(xì)胞執(zhí)行個體生命的延續(xù)所必要的全部功能。大部分細(xì)胞都極小，以至于裸眼根本無法看到，需要使用高倍顯微鏡來觀察它們的行為。自發(fā)明高倍顯微鏡以來，在隨后的1500年里，光學(xué)顯微鏡逐漸提高了我們對生物、人體生理學(xué)和解剖學(xué)的了解，生物醫(yī)學(xué)研究，醫(yī)學(xué)診斷，以及材料科學(xué)。顯微鏡學(xué)科學(xué)已經(jīng)發(fā)展到包括多種用以提高分辨率的技術(shù)。
微生物學(xué)的持續(xù)發(fā)展要求對在細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)級別上的生化活動進(jìn)行越來越精密的研究。當(dāng)今，顯微術(shù)中的挑戰(zhàn)不僅僅在于提高越來越細(xì)的分辨率，還在于開發(fā)實時觀察生化活動(若發(fā)生時)的技術(shù)，而不破壞處理中的生物標(biāo)本。
分辨率是顯微鏡鏡區(qū)分兩個相互非常靠近在一起的物體的能力。例如，1000(1000埃；等于100納米或100×10-9米)分辨率的顯微鏡，能夠使靠近在一起達(dá)100納米的物體獨立地可見。小于100納米的物體和特征不能夠被分辨(即，區(qū)別)。目前可用的幾類顯微鏡的典型分辨率或?qū)嶋H分辨能力對于可見光顯微鏡大約是2000，對于紫外線顯微鏡大約是1000，對于掃描電子顯微鏡大約是150至300，對于透射電子顯微鏡大約是2至4。
紫外線顯微鏡比普通光學(xué)顯微鏡提供更精細(xì)的分辨率和更好的放大率，但它對于活體標(biāo)本的研究具有嚴(yán)重的缺點。紫外線光會損壞或殺死許多種活的生物標(biāo)本，從而不能實現(xiàn)許多生物過程的觀察。當(dāng)紫外線光入射到標(biāo)本時，它激發(fā)標(biāo)本分子內(nèi)的熒光，從而標(biāo)本自身發(fā)出熒光。如果標(biāo)本不會天然地產(chǎn)生熒光，那么它必須要用熒光染料著色。許多熒光染料能夠強(qiáng)烈地粘合在活細(xì)胞內(nèi)的元素例如酶上，改變它們的品質(zhì)并顯著改變細(xì)胞生物化學(xué)。其它染料會產(chǎn)生太多的熒光或吸收太多的有用紫外線。
紫外線顯微鏡的操作要求大量的技能。因為紫外線光會損害人眼，所以圖像只能用紫外線攝像機(jī)或?qū)ｉT配備的靜止照相機(jī)進(jìn)行觀察。另外，紫外線顯微鏡所需要的石英光學(xué)系統(tǒng)通常也比可見光顯微鏡中使用的玻璃元件要貴得多。
由于大多數(shù)細(xì)菌和病毒太小而不能用光學(xué)顯微鏡看到，通常使用電子顯微鏡來觀察這種生物。雖然電子顯微鏡可以提供非常精細(xì)的分辨率，但是標(biāo)本通常必須經(jīng)過高真空脫水、冷凍、注入重金屬來制備，并利用電子束接受高溫，使得不可能進(jìn)行活體標(biāo)本的觀察。脫水處理還改變了標(biāo)本，留下了實際上并不會出現(xiàn)的假象和細(xì)胞損壞。另外，為了觀察生物過程中的步驟，許多標(biāo)本也必須在各個階段進(jìn)行觀察，以在該過程中獲得每個期望的步驟。然后，必須使用能夠花費達(dá)每個標(biāo)本兩個小時的過程來制備好每個所選擇的標(biāo)本。
電子顯微鏡的高成本還成為其在生命科學(xué)中使用的障礙。電子顯微鏡很大并且經(jīng)常占據(jù)著整個房間。電子顯微鏡-例如紫外線顯微鏡的操作和調(diào)整要求高度熟練的技術(shù)人員，從而還帶來另外的有關(guān)維修和給電子顯微術(shù)設(shè)施提供人員的成本。因此，當(dāng)今可用的電子和紫外線顯微鏡通常不提供實時觀察活的、未改變的生物標(biāo)本的技術(shù)。
許多生物屬性只能在活細(xì)胞中觀察到。這些屬性包括輸運(yùn)、流動、布朗運(yùn)動、擴(kuò)散、吞噬作用、胞飲作用、有絲分裂、免疫熒光性、以及細(xì)胞交互作用。生物醫(yī)學(xué)技術(shù)包括但不限于基因治療、人工受精、新藥物發(fā)展、細(xì)胞培養(yǎng)和克隆、細(xì)胞再生、培植、生物檢測、以及生物治療，它們都要求活細(xì)胞和細(xì)胞過程的可視化。雖然這些現(xiàn)象的性質(zhì)有時能夠在這些過程發(fā)生之前以及之后通過檢查電子顯微照片推斷出，但更優(yōu)選地是在這些過程發(fā)生時更深入地加以研究。
熒光顯微鏡對于細(xì)菌、動物和植物細(xì)胞的研究是有用的，因為它們在用紫外線光照射時顯現(xiàn)出原始的熒光(自身熒光)。熒光顯微鏡是一種用于利用它們的熒光對小物體觀察的顯微鏡。與具有較長壽命的磷光相比，熒光是一種壽命約為10-8-10-9秒的短時間發(fā)光。熒光最通常是由光激發(fā)產(chǎn)生。發(fā)出的熒光通常具有比激發(fā)光更長的波長?？梢杂萌齻€重要的步驟來劃分熒光產(chǎn)生過程。首先，在最初的幾個飛秒(10-15秒)內(nèi)，分子被入射光子激發(fā)。在接下來的幾個皮秒(10-12秒)期間，分子經(jīng)歷激發(fā)態(tài)電子的振動弛豫，到達(dá)中間態(tài)的最低能量級。最后，在幾個納秒(10-9秒)期間，產(chǎn)生較長波長的光子發(fā)射，并且該分子回到基態(tài)。利用激發(fā)光(EL)激發(fā)分子以發(fā)出較長波長熒光(FL)這樣的整個過程被用于熒光顯微術(shù)中。
在二十世紀(jì)早期，August Kohler和Carl Reichert對熒光顯微術(shù)進(jìn)行了最初研究。Otto Heimstadt和Heinrich Lehmann在1911年論證了第一個實用熒光顯微鏡。短時間后，Stanislav von Provazek和Alfred Coles使用稱作“熒光染料”的有機(jī)染料來得到次生熒光。Max Haintinger徹底調(diào)查了可以用于組織部分以及熒光染料著色的器官的研究的次生熒光。然而，在1941年，當(dāng)Albert Coons研制了一種利用熒光染料標(biāo)記抗體(“熒光標(biāo)記抗體”)的技術(shù)時，熒光顯微術(shù)的真正革命才出現(xiàn)，并由此引入了熒光免疫檢驗法領(lǐng)域，這在現(xiàn)在是一種標(biāo)準(zhǔn)方法。
熒光顯微鏡的主要功能是利用特定波長(激發(fā)光)光照射標(biāo)本，利用熒光激發(fā)該標(biāo)本的分子，接著從該激發(fā)光中分離出微弱發(fā)射的熒光，從而能夠觀察該發(fā)射的熒光。特定光源和存在的兩個濾光器的典型特征在于該熒光顯微鏡的光路一個濾光器設(shè)置在聚光器前，而另一個濾光器設(shè)置在物鏡之后。該第一個濾光器僅僅透過激發(fā)的輻射，而第二濾光器僅僅透過發(fā)射的熒光。因此，入射到標(biāo)本上的激發(fā)光被去除，同時熒光被導(dǎo)向到觀察者眼睛或者被導(dǎo)向到記錄裝置。該光源應(yīng)當(dāng)提供短波長光，例如UV和/或藍(lán)紫光。目前，在一般的使用中有兩種熒光顯微鏡的不同光學(xué)設(shè)計一個使用透射光照明(“完全熒光顯微術(shù)法”)，另一個利用反射光(“上熒光顯微術(shù)”)。
熒光激發(fā)需要的波長光用激發(fā)濾光器選擇，其僅透射激發(fā)光并抑制所有其它波長的光。激發(fā)光的一些部分被樣本吸收，并幾乎立即重發(fā)射較長波長作為熒光。阻擋濾光器透射熒光(發(fā)射光)。穿過標(biāo)本或從樣本反射的激發(fā)光的剩余部分被阻擋濾光器吸收。結(jié)果，觀察到(或記錄)以黑色背景為對照的樣本的彩色圖像。
早期的熒光顯微鏡通常是配備有激發(fā)和阻擋濾光器的明視場透射光顯微鏡。該透射光熒光顯微鏡通過使用暗視場聚光鏡被大大改進(jìn)。暗視場聚光鏡將光以傾斜的角度投射到樣本上，這樣避免了激發(fā)光直接進(jìn)入物鏡。常規(guī)的透射光熒光顯微鏡存在的一些難題使反射光熒光顯微鏡成為許多使用者選擇的儀器。雖然透射光熒光顯微鏡已經(jīng)被證實在許多應(yīng)用中是有價值的，但該技術(shù)具有一些缺點，其包括以下方面(1)物鏡的數(shù)值孔徑需要減小，以防止激發(fā)光進(jìn)入該物鏡，這反過來減小了光的強(qiáng)度和分辨率；(2)常規(guī)的暗視場方法非常浪費光(即，不是非常高效)；(3)一些使用者發(fā)現(xiàn)很難對準(zhǔn)暗視場聚光鏡；(4)發(fā)出的熒光在到達(dá)物鏡前穿過了樣本，從而該光被部分吸收并散射，其導(dǎo)致了散射和強(qiáng)度降低的圖像；以及(5)傳統(tǒng)的暗視場技術(shù)排除了同時利用相位顯微術(shù)或Nomarski微分干涉對比顯微術(shù)進(jìn)行熒光觀測。由于使用暗視場透射熒光顯微術(shù)(完全熒光顯微術(shù))的所有這些問題，所以通常優(yōu)選明視場反射熒光顯微術(shù)(上熒光顯微術(shù))。
自然光光有時被稱作一類電磁輻射，因為光波包括了電場和磁場形式的能量。除了我們能夠看見的光之外，電磁頻譜還包括頻率低于可見光的無線電波、微波、和紅外光。在該頻譜的上端是以高于可見光的頻率傳播的紫外線輻射、X射線、和伽馬射線。
波長是在連續(xù)光波上任何兩個相應(yīng)點之間的距離。波長以距離單位測得，通常是十億分之一米。人眼能夠看到的波長在400和700十億分之一米之間。頻率是在任何時間間隔之間在空間中經(jīng)過一點的波數(shù)，該時間間隔通常是一秒。頻率以每秒波數(shù)為單位測得，或者是赫茲(Hz)?？梢姽獾念l率被稱為顏色。例如，以430萬億Hz傳播的光被視作紅色。
光的波長與頻率的關(guān)系由一次方程給出f＝c/L其中c為真空中的光速(每秒299,792,458米)，f為以赫茲(Hz)或每秒周期為單位的頻率，以及L為以米為單位的波長。
顯微鏡分辨率光學(xué)顯微鏡的分辨率或分辨能力可用Abbe的公式計算出D＝L/2NA
其中，D為以米為單位的顯微鏡的分辨能力，L為以米為單位的入射光的波長，以及NA為顯微鏡的數(shù)值孔徑。該數(shù)值孔徑通常表示入射到觀察標(biāo)本上的光的角度。
光散射當(dāng)光波穿過標(biāo)本時，大部分光沿其原始方向繼續(xù)，但少部分光被散射到其它方向上。用于照射該標(biāo)本的光被稱作入射光。穿過各標(biāo)本的入射光的散射被Lord John William Strutt、在隨后的1800年代被三世Baron Rayleigh(LordRayleigh)、之后被Albert Einstein等人研究。
Lord Rayleigh觀察到小部分散射光顯現(xiàn)出與入射光相同的波長。由于這個觀察，以與入射光相同波長被散射的光被稱作瑞利散射(也稱作共振散射或彈性光散射)現(xiàn)象。
在1922年，Arthur H.Compton觀察到一些散射光具有與入射光不同的波長。Compton發(fā)現(xiàn)，當(dāng)光穿過標(biāo)本時，一些光使標(biāo)本分子的電子散射離開，產(chǎn)生X射線范圍頻譜的散射光。
Raman散射在1928年，Chandrasekhara V.Raman教授和K.S.Krislman教授發(fā)現(xiàn)，由Compton觀察到的散射光是由標(biāo)本分子中的振動引起的。由于他的發(fā)現(xiàn)，由標(biāo)本分子中的振動引起的散射的光現(xiàn)象被稱作Raman散射(也稱作非諧振或無彈性光散射)。1930年，Raman由于其發(fā)現(xiàn)獲得了諾貝爾物理獎。
當(dāng)標(biāo)本被入射光穿透時，光和標(biāo)本分子之間的能量被交換。分子振動，產(chǎn)生通常所說的Raman散射現(xiàn)象。分子振動導(dǎo)致標(biāo)本自身發(fā)出散射光，其中一些以比入射光頻率(f)更高的頻率(f+Δf)散射，一些以較低的頻率(f-Δf)散射。Δf代表由Raman散射產(chǎn)生的頻率變化(有時也稱作頻移)。
總之，當(dāng)入射光穿透標(biāo)本時，散射光包括與入射光相同頻率(f)的瑞利散射光、較高頻率(f+Δf)的Raman散射光、和較低頻率(f-Δf)的Raman散射光。
依賴于標(biāo)本的強(qiáng)度由于Raman散射光是由標(biāo)本內(nèi)的分子振動產(chǎn)生的，因此Raman散射光的強(qiáng)度依賴于所觀察到的標(biāo)本類型。例如，血液細(xì)胞標(biāo)本可產(chǎn)生高強(qiáng)度的Raman散射光，而皮膚細(xì)胞標(biāo)本可產(chǎn)生低強(qiáng)度的Raman散射光?？刂芌aman散射光的分辨能力的一種方法是通過使用暗視場聚光鏡來將入射光聚焦在標(biāo)本上。
暗視場顯微術(shù)顯微術(shù)中的暗視場觀察使用聚光鏡將入射光成形為其頂點或焦點被引導(dǎo)朝向標(biāo)本的錐形光。暗視場聚光鏡通常包括在中心設(shè)置的不透明光圈和一個或多個內(nèi)透鏡或反射鏡，以將該光成形為期望的中空錐形。該不透明光圈阻擋大部分的入射光，僅僅允許中空柱形的光進(jìn)入該聚光鏡。
在暗視場顯微術(shù)中，如果在顯微鏡工作臺上沒有標(biāo)本，并且聚光鏡的數(shù)值孔徑高于物鏡的數(shù)值孔徑，那么錐形光線聚焦在工作臺上或其附近，然后發(fā)散到工作臺之外，從而它們不進(jìn)入該物鏡，因此觀察到的視場顯現(xiàn)為黑暗。當(dāng)存在標(biāo)本時，錐形光線穿透標(biāo)本并被標(biāo)本產(chǎn)生光學(xué)不連續(xù)的各種特征散射、衍射、反射、和/或折射。這些光線中的一些進(jìn)入物鏡，顯現(xiàn)出標(biāo)本的特性，這些特性以黑暗背景出現(xiàn)。
許多類型的聚光鏡是可以得到的，并且今天還在使用。在心形暗視場聚光鏡中，入射光從中心不透明的光圈周圍穿過，穿透凸鏡，然后穿透具有球形表面和心形表面的內(nèi)凹鏡。拋物面暗視場聚光鏡與心形暗視場聚光鏡作用大體相似，除了內(nèi)反射鏡的形狀是拋物面外。在Abbe暗視場聚光鏡中，入射光從中心不透明的光圈周圍穿過，然后穿過普通的凸透鏡，最后穿過一第二透鏡。Abbe暗視場聚光鏡可以包括可變內(nèi)孔徑。其它類型的暗視場聚光鏡包括雙心、雙球狀(bispheric)、卡塞格林、雙心光斑環(huán)(spot-ring)、和納爾遜-卡塞格林。
在入射光從中心不透明光圈周圍穿過后，光被成形為類似薄壁的中空柱形。該中空柱形光接著穿透該內(nèi)透鏡或反射鏡，在那里光被折射成期望的中空錐形光。光的折射通常在內(nèi)透鏡元件的周邊附近發(fā)生，在那里的光學(xué)修正常常是最差的。因此，為了獲得精確的中空錐形光，該內(nèi)透鏡被高精度地制成，以避免產(chǎn)生畸形。透鏡和反射鏡的精確研磨大大提高了暗視場聚光鏡的成本。
暗視場聚光鏡中的不透明光圈被仔細(xì)地與中心對準(zhǔn)，以產(chǎn)生均勻的中空柱形光。較差居中的光圈會歪斜中空錐形光，導(dǎo)致不均勻的照射和其它不期望的影響圖像質(zhì)量的光學(xué)效果。由于聚光鏡需要非常精確的對準(zhǔn)，因此它通常由高熟練的操作者對準(zhǔn)暗視場顯微鏡系統(tǒng)。該對準(zhǔn)靈敏度也使暗視場系統(tǒng)會因微小振動而損壞。
由于該不透明的光圈阻擋了大部分的入射光，因此通常需要強(qiáng)光源。除了浪費之外，高能光源的操作和維修還是很昂貴的，并且產(chǎn)生的過多熱量還導(dǎo)致了不期望的對聚光鏡體、顯微鏡工作臺、和標(biāo)本的加熱。
因此，可以看出，存在改進(jìn)裝置、系統(tǒng)和方法以利用較好的分辨率實時觀察活生物標(biāo)本的需求，包括實時地觀察它們的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。本發(fā)明首先是要提供滿足這些和其它需要的這種裝置、系統(tǒng)和方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以不同的形式提供了一種用于顯微鏡的改進(jìn)的照明系統(tǒng)，它提供出色的分辨率和圖像對比度，并且對樣本照明提供非常有效的光利用。在本發(fā)明的一個實施形式中，該照明系統(tǒng)包括具有與暗視場聚光鏡耦合的光源的照明裝置，該暗視場聚光鏡用于將中空的錐形光聚焦到處于觀察的標(biāo)本上。本發(fā)明還包括用于提高到該標(biāo)本的光傳輸?shù)墓?jié)省的適配器。該照明裝置的元件優(yōu)選容納在一個整體的外殼內(nèi)，和/或基本上剛性地與另一個耦合以保持對準(zhǔn)并使得安裝和使用高效。本發(fā)明的該系統(tǒng)和方法特別適于與熒光顯微術(shù)技術(shù)配合。
在一個方面，本發(fā)明是一種用于顯微鏡的照明裝置。該照明裝置優(yōu)選包括至少一個光源用于產(chǎn)生光以照明用于顯微觀察的標(biāo)本，至少一個準(zhǔn)直透鏡用于準(zhǔn)直由該光源產(chǎn)生的光，以及一暗視場聚光鏡，用于接收經(jīng)準(zhǔn)直的光并將中空錐形光導(dǎo)向待觀察的樣本上。
在另一方面，本發(fā)明是一種用于顯微鏡的照明系統(tǒng)中的光傳輸?shù)墓鈱?dǎo)或適配器。該適配器優(yōu)選包括相對于該適配器縱軸中心設(shè)置的并在其一端具有總體平面的襯墊面的襯墊。該適配器還優(yōu)選包括定位在該襯墊周圍的多根光纖，該多根光纖中的每根具有一端面基本上垂直于該適配器的縱軸并定位成靠近該襯墊表。
在又一個方面，本發(fā)明是一種用于顯微觀察標(biāo)本的系統(tǒng)。該系統(tǒng)優(yōu)選包括一透射光顯微鏡，和一照明裝置，用于利用該顯微鏡將光聚焦到待觀察的標(biāo)本上，該照明裝置優(yōu)選包括一光源、準(zhǔn)直透鏡和暗視場聚光鏡。
在另一方面，本發(fā)明是一種顯微觀察標(biāo)本的方法，該方法包括將照明裝置耦合到透射光顯微鏡的步驟，其中該照明裝置包括用于將中空錐形光聚焦到標(biāo)本上的暗視場聚光鏡和用于將光透射到該暗視場聚光鏡以便該照明裝置產(chǎn)生內(nèi)反射光的光源。
在又一個方面，本發(fā)明是一種顯微觀察標(biāo)本以診斷存在的病原體的方法。該方法包括將照明裝置耦合到透射光顯微鏡，其中該照明裝置包括用于將中空錐形光聚焦到標(biāo)本上的暗視場聚光鏡和用于將光透射向該暗視場聚光鏡的光源。
在另一方面，本發(fā)明是一種用于顯微鏡的照明裝置，該顯微鏡具有至少一個光源，用于產(chǎn)生光以照明樣本用于顯微觀察，至少一個準(zhǔn)直透鏡，用于將由光源產(chǎn)生的光準(zhǔn)直，一暗視場聚光鏡，用于接收經(jīng)準(zhǔn)直的光并將中空錐形光導(dǎo)向待觀察的標(biāo)本上，以及一適配器，用于提高光從光源透射到暗視場聚光鏡的效率。
在另一方面，本發(fā)明是一種產(chǎn)生待顯微觀察的樣本的全色熒光圖像的方法。該方法包括利用具有至少一個強(qiáng)度峰值波長的光照射樣本、以及利用該光在待照明的樣本內(nèi)誘發(fā)熒光。
在又一個方面，本發(fā)明是一種顯微觀察樣本的方法，包括該樣本的同時熒光觀察和超分辨率成像。
在另一方面，本發(fā)明是一種樣本實時成像的方法。該方法包括將多個熒光標(biāo)簽加到該樣本上，并同時觀察由該熒光標(biāo)簽所標(biāo)記的多個細(xì)胞特征。
在又一個方面，本發(fā)明是一種產(chǎn)生衰減駐波的方法，其包括將照明引導(dǎo)通過高孔徑聚光鏡，并使光內(nèi)反射以比臨界角更大的角度離開界面。
在另一方面，本發(fā)明是一種減少待照明樣本中的光致褪色的方法，其包括選擇性激發(fā)樣本中的熒光。
在又一個方面，本發(fā)明是一種用于提高顯微分辨率的方法。該方法包括利用導(dǎo)向通過高孔徑聚光鏡以產(chǎn)生全內(nèi)反射的光觀察待照明樣本。
本發(fā)明的這些和其它方面、特征和優(yōu)點將參照附圖和這里的詳細(xì)說明被理解，并借助于在所附權(quán)利要求中特別指出的各個元件和組合加以實現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解，前述的發(fā)明內(nèi)容和隨后的


以及具體實施方式
都是對本發(fā)明示范性實施例的說明，而并非對如權(quán)利要求所述的本發(fā)明的限制。

本專利或申請文件包括至少一個彩色附圖。具有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞_的拷貝將通過向?qū)＠终埱蟛⒅Ц侗匾馁M用被提供。
圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一個示例實施例的用于顯微鏡系統(tǒng)的照明裝置的透視圖。
圖2示出了圖1中的該照明裝置的側(cè)視圖并以虛線示出了內(nèi)部光學(xué)元件。
圖3示出了根據(jù)本發(fā)明另一個示例實施例的照明裝置的截面圖。
圖4示出了根據(jù)本發(fā)明又一示例實施例的照明裝置的截面圖。
圖5示出了根據(jù)本發(fā)明又一示例實施例的照明裝置的截面圖。
圖6示出了結(jié)合有根據(jù)本發(fā)明的照明裝置的顯微鏡系統(tǒng)的透視圖。
圖7示出了用于與根據(jù)本發(fā)明一示例實施例的照明裝置結(jié)合使用的適配器的透視圖。
圖8示出了圖7的適配器的頂視圖。
圖9示出了圖7的適配器的內(nèi)部襯墊部分的透視圖。
圖10示出了圖7的適配器的部分圖示頂視圖。
圖11示出了根據(jù)本發(fā)明另一示例實施例的適配器的一部分的局部說明。
圖12示出了圖11的適配器的部分透視圖。
圖13A和13B示出了利用現(xiàn)有技術(shù)的照明系統(tǒng)產(chǎn)生的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的圖像。
圖14A和14B示出了利用本發(fā)明的照明系統(tǒng)產(chǎn)生的圖13A和13B中的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的提高了分辨率的圖像。
圖15A示出了使用現(xiàn)有技術(shù)的照明系統(tǒng)、對用三種光學(xué)查詢標(biāo)簽著色并三次照相產(chǎn)生的牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的所得圖像，每種著色使用一濾光器，該所得圖像是相互重疊的三幅圖像。
圖15B示出了利用本發(fā)明的照明系統(tǒng)成像時圖15A的移動，并示出了提高的分辨率。
圖16示出了BPAE細(xì)胞的圖像，該BPAE用用于標(biāo)記F-肌動蛋白的紅色-熒光Texas紅色閃毒蕈環(huán)肽、與用于標(biāo)記微管的綠色-熒光BODIPY FL山羊抗體-鼠lgG和用于標(biāo)記原子核的蘭色-熒光DAPI結(jié)合的鼠單克隆抗體-微管蛋白著色。
圖17示出了利用H(hemoloxylin)和E(四溴螢光素)著色石蠟嵌入組織的第一牙齒的顯影圖像。
具體實施例方式
通過接下來參看作為本公開一部分的附圖的詳細(xì)說明，本發(fā)明將更容易被理解。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于這里描述和/或示出的這些特定裝置、方法、條件或參數(shù)，這里所用的術(shù)語僅僅是用于示范性說明特殊實施例的目的，而不是要限制權(quán)利要求的發(fā)明。同樣，如同包括在隨后的權(quán)利要求中使用的術(shù)語，單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”包括多個，并且涉及的特定數(shù)值包括至少該特定值，除非上下文明確給出相反規(guī)定。這里的范圍可以表示成從“大約”或“近似”的一個特定值和/或到“大約”或“近似”的另一個特定值的形式。當(dāng)表示該范圍時，另一個實施例包括從該一個特定值和/或到另一個特定值。類似的，當(dāng)數(shù)值以近似值表示時，使用“大約”作為前提，應(yīng)當(dāng)理解該特定數(shù)值形成了另一個實施例。
圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一示例實施例，用在暗視場顯微術(shù)的顯微鏡系統(tǒng)12上的照明裝置10的透視圖。如從圖1的透視圖和圖2的側(cè)視圖中所更加清楚地看到的，該照明裝置10包括加接在光束導(dǎo)向器16的輸出端口的暗視場聚光鏡14。優(yōu)選地，該暗視場聚光鏡是心形暗視場聚光鏡，例如可從尼康公司買到的Nikon#12000暗視場聚光鏡(浸油的)，其內(nèi)部的光學(xué)元件為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選地，該心形暗視場聚光鏡的數(shù)值孔徑為約1.2至約1.4。可替換地，還可以使用其它形式的暗視場聚光鏡。該暗視場聚光鏡優(yōu)選接收來自光源穿過其輸入側(cè)的環(huán)形狹縫的入射光，并將中空錐形光從其輸出側(cè)聚焦并導(dǎo)向到待顯微觀察的樣本上，如接下來更詳細(xì)說明的。光束導(dǎo)向器16可以是可從Edmund Industrial Optics買到的C-固定架板(C-mounted plate)分束器#R54-825，或者其它構(gòu)成為以預(yù)期的方式改變光路方向的合適的光束導(dǎo)向器。
在該光束導(dǎo)向器16的輸入端口處的是一簡單透鏡固定架18，例如簡單透鏡固定架(12.5mm保持器)，可從Edmund Industrial Optics買到的#R55-246，在其中容納一短傳濾光器，例如可從Edmund Industrial Optics買到的的Tech Spec短傳濾光器450nm Y478-286。優(yōu)選地，該短傳濾光器阻擋波長比大約450nm更長的光。可變光圈筒20，例如可從Edmund Industrial Optics買到可用的可變光圈筒#R03-623，連接到該透鏡固定架18。高對比度UV偏振器22，例如來自Edmund Industrial Optics的高對比度UV偏振器(12.5mm)#R47-327，連接到該可變光圈筒20。微視頻成像透鏡24，例如可從Edmund Industrial Optics買到的有限共軛MVO微視頻成像透鏡#R54-854，以及相關(guān)聯(lián)的筒固定架26，例如可從Edmund Industrial Optics買到的30mm筒/C-固定架、15mm延長#R54-630，連接到該高對比度UV偏振器22。熱吸收玻璃28，例可從Edmund IndustrialOptics買到的tech spec熱吸收玻璃(12.5mm直徑)#R45-720，連接到該微視頻成像透鏡24。光導(dǎo)安裝適配器30，例如可從Edmund Industrial Optics買到的C-螺紋光導(dǎo)安裝適配器#R53-047720，連接到該熱吸收玻璃。該光導(dǎo)安裝適配器30將光源32通過光導(dǎo)34連接到該照明系統(tǒng)。該光導(dǎo)34或光傳輸管道可以包括用于容納并將光從光源傳輸?shù)侥康牡氐娜魏尾煌牟考ǖ幌抻诤唵蔚墓?、腔、位于光學(xué)元件之間的開放路徑、或光纜例如光纖光纜。
優(yōu)選地，該照明裝置10構(gòu)成為當(dāng)入射光穿透標(biāo)本時可以激發(fā)拉曼類型光散射。本發(fā)明的照明裝置10可包括單光源或多光源。優(yōu)選地，光源32包括金屬鹵化物光源，例如21瓦特金屬鹵化物光源。如果該照明裝置10包括單個光源，那么優(yōu)選地，該光源發(fā)射以多頻率傳播的光。當(dāng)該多頻率光穿透標(biāo)本時，組合現(xiàn)象會激發(fā)拉曼散射光，產(chǎn)生高分辨率圖像。2004年2月10日出版的U.S.專利No.6,690,509和2004年1月15日的U.S.專利申請公開No.US2004-0008522A1，二者在此都被引入作參考，可被參考用于進(jìn)一步理解由來自單光源的光激發(fā)的散射、由來自雙光源的入射光激發(fā)的散射、和得到的組合現(xiàn)象。
另外，本發(fā)明的照明裝置10可包括兩個光源，它們可以是相同類型或不同類型，例如，但不限于金屬鹵化物光源、激光器、或紫外線(UV)光源。優(yōu)選地，使用低功率光源，例如21瓦特金屬鹵化物光源，以節(jié)省能量并減少雜光量。在該實施例中，照明裝置10可包括光組合器，例如在U.S.專利No.6,690,509中所述的。該光組合器將由兩個光源發(fā)出的光組合并產(chǎn)生單一的能夠向顯微鏡傳輸?shù)慕M合光。當(dāng)該組合光中不同頻率的光穿透標(biāo)本時，該組合現(xiàn)象激發(fā)拉曼散射光，其產(chǎn)生高分辨率圖像，如U.S.專利No.6,690,509中較詳細(xì)描述的。
如同在圖2的側(cè)視圖中更加清楚看到的，裝置10優(yōu)選地具有帶外壁42和內(nèi)壁44的殼40。為了清楚的說明，圖2以虛線繪制了一些內(nèi)部光學(xué)元件。該內(nèi)壁44在其中限定了一腔46，用于容納來自光源32的光。來自光源34的光48A通過光導(dǎo)34進(jìn)入該照明裝置10的腔46，并穿過第一準(zhǔn)直透鏡50和第二準(zhǔn)直透鏡52。該第一和第二準(zhǔn)直透鏡50和52用來準(zhǔn)直光，或換句話說，產(chǎn)生平行光線。在這個方面，該準(zhǔn)直過程去除了或過濾了非平行光線。通過準(zhǔn)直用于照明標(biāo)本的光，能夠提高所得到的圖像的分辨率。另外，準(zhǔn)直光不容易受顯微鏡系統(tǒng)中任何光學(xué)元件的極小的缺陷影響而變形。優(yōu)選地，準(zhǔn)直透鏡50和52中的一個或二者都可在平行于光路的方向上調(diào)整或移動，以將光聚焦在希望的位置上。該透鏡50和52和/或該殼40還可以包括用于調(diào)整該透鏡對準(zhǔn)的機(jī)構(gòu)。
該準(zhǔn)直光被引導(dǎo)到該光束導(dǎo)向器16的平面鏡56上，并反射到暗視場聚光鏡14中。在該描述的實施例中，該平面鏡56以大約45°角定位，以將光48C沿著90°光路反射到暗視場聚光鏡14中。該暗視場聚光鏡14自身具有內(nèi)部光學(xué)元件，用于控制光路以輸出中空錐形光。例如，在該描述的實施例中，該暗視場聚光鏡14具有一凸鏡58，其將光反射到凹周邊反射鏡，該凹周邊反射鏡依次又向外引導(dǎo)光錐，使其頂點導(dǎo)向?qū)驑?biāo)本。接著，該光照射通過激發(fā)拉曼散射而觀察的該樣本或標(biāo)本。該照明系統(tǒng)10的精細(xì)聚焦允許該焦點定位在標(biāo)本內(nèi)的任何深度處。而且，光被導(dǎo)向標(biāo)本的角度可被調(diào)整以產(chǎn)生提高的分辨率。
由于光與標(biāo)本的交互作用引起的特殊光學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生了額外的對比機(jī)制。該照明裝置10在一些方面與差動干涉對比顯微鏡(“DIC”)類似，但該照明裝置不要求必要的定位條件，具有較好的對比度，能夠用于顯現(xiàn)非常小的微粒，并能夠以雙折射標(biāo)本使用。
圖3繪制了根據(jù)本發(fā)明另一示例實施例的照明裝置10’。該照明裝置10’基本上與照明裝置10類似，但除了這里所記錄的外。該照明裝置10’具有三透鏡的準(zhǔn)直器，包括透鏡50’、52’和54’，用于準(zhǔn)直來自光源32的光。來自光源的光透射穿過適配器100，適配器100的功能和結(jié)構(gòu)接下來將更詳細(xì)地說明，并進(jìn)入該殼40’的內(nèi)腔46’。由透鏡50’、52’和54’準(zhǔn)直的光接著被光束導(dǎo)向器16’反射進(jìn)該暗視場聚光鏡14’，該光束導(dǎo)向器16’具有以大約45°角定向的平面鏡56’。
圖4繪制了根據(jù)本發(fā)明又一示例實施例的照明裝置10”。該照明裝置10”基本與照明裝置10類似，除了這里所記錄的外。來自光導(dǎo)34”的光進(jìn)入該殼40”的內(nèi)腔46”，并接著穿過定位在靠近光束導(dǎo)向器16”的兩個準(zhǔn)直透鏡50”和52”，該光束導(dǎo)向器16”具有以大約45°角定向的平面鏡56”，以將該光反射向該暗視場聚光鏡14”。進(jìn)入該暗視場聚光鏡14”的光接著被該暗視場聚光鏡的內(nèi)部光學(xué)元件處理，并且從該暗視場聚光鏡出來的光形成具有其頂點被導(dǎo)向該標(biāo)本的中空錐形。雖然未示出，但是該照明裝置10”殼可以包括一個或多個定位元件，用于改變該準(zhǔn)直透鏡50”和52”的位置。
圖5繪制了根據(jù)本發(fā)明的另一示例實施例的照明裝置10。該照明裝置10基本上與照明裝置10”類似，除了這里所描述的外。來自光源34的光透過適配器100，并進(jìn)入殼40的內(nèi)腔46。該適配器100提高了光的節(jié)省，從而允許使用低瓦特的光源，接下來以更詳細(xì)的方式描述根據(jù)本發(fā)明的適配器的實施例形式。來自該適配器100的光接著被光束導(dǎo)向器16反射向該暗視場聚光鏡14，該光束導(dǎo)向器16具有以大約45°角定向的平面鏡56，以將該光反射朝向該暗視場聚光鏡。一旦反射，該光穿過定位靠近光束導(dǎo)向器16的輸出端口處的兩個準(zhǔn)直透鏡50和52。接著，進(jìn)入該暗視場聚光鏡14的光被該暗視場聚光鏡的內(nèi)部光學(xué)元件所處理，并且從該暗視場聚光鏡出來的光具有其頂點被導(dǎo)向標(biāo)本的中空錐形。如圖5中所繪制的，該照明裝置10可包括一個或多個定位元件70，用于改變準(zhǔn)直透鏡50”和52”的一個或兩個的位置以在該入口處將光聚焦到該暗視場聚光鏡。其它定位元件也可用于調(diào)整這里所描述的任何元件，例如光束導(dǎo)向器16中的內(nèi)反鏡56，適配器100相對于該暗視場聚光鏡14 或其它元件的對準(zhǔn)，以及光在其路徑中傳播傳輸?shù)娜魏卧囊话銓?zhǔn)。在上述示例實施例中，照明裝置的準(zhǔn)直透鏡或透鏡的焦距，不管使用的是一個還是多個透鏡，大約為10mm。
圖6繪制了一種能夠結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的包括上述說明的照明裝置10、10’、10”和10中的任一個的照明裝置使用的顯微鏡系統(tǒng)12。該系統(tǒng)12優(yōu)選包括定位在設(shè)計成抑制振動的抗振動臺或平臺72上的顯微鏡70。例如，該顯微鏡70可以是可從Olympus Corporation買到的Olympus BX51顯微鏡，不過本發(fā)明設(shè)計考慮到了使用任何不同的透射光顯微鏡。該抗振動工作臺72可以是例如可從Technical Manufacturing Corporation買到的抗振動工作臺TMC型號#66-501。另外，該系統(tǒng)12包括計算機(jī)系統(tǒng)74，其包括處理器76、監(jiān)視器78、和輸入裝置，例如鍵盤80和鼠標(biāo)82。在一示例實施例中，該計算機(jī)系統(tǒng)74是PC IBM商業(yè)系統(tǒng)，P4-3.2Ghz/1GB/120GB/DVD-CD-RW/IEE 1394 PCI/XPP。例如，該系統(tǒng)12還優(yōu)選包括攝像機(jī)84，具有關(guān)聯(lián)的控制面板在靠近目鏡處連接到該顯微鏡70，用于記錄標(biāo)本的細(xì)胞過程。該攝像機(jī)84經(jīng)由接口86連接到該計算機(jī)處理器76，以便能夠在該顯示屏上顯示圖像。在一示例實施例中，該攝像機(jī)84是可從AVA Astro Corporation買到的Astrovid StellaCam-EX。該接口模塊86，例如可從Canopus Corporation買到的高級數(shù)字視頻轉(zhuǎn)換器(AdvanceDigital Video Converter)ADVC100，能夠提供位于該攝像機(jī)84和計算機(jī)系統(tǒng)74之間的接口，不過本發(fā)明設(shè)計考慮到了其它兼容接口。
如這里說明的，本發(fā)明的照明裝置的結(jié)構(gòu)提供了比以前周知的系統(tǒng)獨特的優(yōu)點。第一，該照明裝置提供照明，例如科勒照明，適于非常高分辨率的成像。并且該照明裝置通過分辨與大約100-250nm一樣小或更小的細(xì)胞特征并探測小于60nm的特征，可以提供“超分辨率成像”。同時，還提供了超高空間分辨率(＜150nm)和對比度，并且探測極限小于60nm。因此，與相位對比度顯微鏡相比，本發(fā)明的照明裝置具有較好的分辨率而沒有任何顯著的圖像變形。該照明裝置允許在實時出現(xiàn)的同時觀察活細(xì)胞和細(xì)胞過程(與電子顯微鏡相比，例如，其要求非活細(xì)胞，并且在該細(xì)胞被“殺死”時改變細(xì)胞結(jié)構(gòu))。此外，使用本發(fā)明的照明裝置還可避免標(biāo)本/樣本準(zhǔn)備技術(shù)，例如冷凍、脫水、著色、標(biāo)記、和金屬沉積。利用本發(fā)明的照明系統(tǒng)產(chǎn)生的示例性圖像示于圖14A和14B，與利用現(xiàn)有技術(shù)的系統(tǒng)產(chǎn)生的圖13A和13B的圖像相比，其示出了分辨率相當(dāng)好的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
另外，從不需要被高熟練的操作者對準(zhǔn)，不管是相對于樣本上下對準(zhǔn)還是沿著標(biāo)本之下的水平軸側(cè)并行地對準(zhǔn)來看，暗視場聚光鏡14是本發(fā)明的照明裝置的一個固定的、整體元件。然而，本發(fā)明的整個照明裝置能夠向上或向下移動朝向或離開該樣本，以將大量光按希望聚焦到樣本上。本發(fā)明的照明系統(tǒng)的元件優(yōu)選地在一個基本剛性的組件中與彼此地連接，例如通過在基本剛性的殼中固定這些元件和/或?qū)⑦@些元件直接或間接相互連接。此外，本發(fā)明的該照明裝置自包含的、便攜的，并能夠容易安裝到各種可買到的透射光顯微鏡上。本發(fā)明的照明裝置能夠構(gòu)成為與現(xiàn)有的顯微鏡一起良好運(yùn)行而不需要對該顯微鏡基礎(chǔ)作任何修改。換句話說，該照明裝置還能構(gòu)成為孤立的，不需要任何附件固定到正在使用的顯微鏡上。該照明裝置可隨意包括一個或多個專門定尺寸和成形以使該裝置適合于任何類型的顯微鏡的底部的支架或環(huán)，從而有利于方便改裝現(xiàn)有的顯微鏡。
圖7示出了適合于例如結(jié)合本發(fā)明的照明裝置(包括任何上述說明的照明裝置10、10’、10”、和/或10的示例實施例)使用的光導(dǎo)或適配器100，以提供較好的光節(jié)省。此外，該適配器100能夠與暗視場聚光鏡(本發(fā)明的照明裝置具有或沒有的額外元件)組合使用，以便該適配器被定尺寸和成形以適合該暗視場聚光鏡的腔，由此在該光源和聚光鏡之間提供符合尺寸。在這種實施例中，該適配器100優(yōu)選地具有普通的圓柱殼，該圓柱殼包括尺寸與該暗視場聚光鏡中的腔的內(nèi)壁上的螺紋匹配的外螺紋，不過其它特征可用于提供可釋放的附件。在可選擇的實施例中，該適配器100可永久附連到該暗視場聚光鏡，以形成單獨的整體單元。
當(dāng)結(jié)合本發(fā)明的照明裝置使用時，適配器100優(yōu)選定位在光源和光束導(dǎo)向器之間，并被相應(yīng)地定尺寸和成形，例如如圖5所示。該適配器100可以是單獨的元件或與該照明裝置的一個或多個其它元件為一整體或相耦合。在該適配器和照明裝置之間基本剛性的耦合(直接或間接地)，例如通過提供在整體殼內(nèi)的兩個、其間的螺紋連接、壓配合連接等，能夠有利于保持穿過本發(fā)明的系統(tǒng)的光路的對準(zhǔn)，從而有利于有效的安裝和操作。如同圖7-12中更加清楚看到地，在不同的形式中，該適配器100優(yōu)選包括殼102和內(nèi)部襯墊104，該內(nèi)部襯墊104定位用以將入射光引導(dǎo)向該殼102的周邊。一根或多根光纖106位于殼102的周邊，以致于使該入射光能夠傳播穿過該一根或多根光纖106。優(yōu)選地，該光纖106或細(xì)絲捆在一起成為光纖光纜108。該光纜108將來自光源32的光透射向該殼102，其中單個光纖106被分離并分散在該襯墊104周圍以形成環(huán)形的光纖端部束。
如圖7所示，中心軸110在與使用中的暗視場聚光鏡和顯微鏡的定向基本平行的方向上延伸穿過該適配器100。優(yōu)選地，光纖106被分離并定向成環(huán)繞該襯墊104，以產(chǎn)生環(huán)形光線，在與該中心軸110基本平行的方向上傳播。環(huán)形的直徑和厚度優(yōu)選構(gòu)成為近似匹配該照明裝置的暗視場聚光鏡的環(huán)形入口狹縫的尺寸。該環(huán)形光線從而形成中空圓柱光，其優(yōu)選與照明裝置的暗視場聚光鏡的環(huán)形狹縫精確對準(zhǔn)，由此基本上來自光源的全部光被有效的傳送到標(biāo)本，進(jìn)一步提高了光利用效率并使得低瓦特的光源能夠提供改進(jìn)的照明。該適配器與照明系統(tǒng)的其它元件的對準(zhǔn)優(yōu)選由在基本上剛性殼中容納的元件、和/或在其間直接或間接耦合來保持，例如利用一個或多個螺紋耦合。
該殼102包括第一端部分112、中間部分114、和第二端部分116。入口118位于第一端部分112的遠(yuǎn)端120，出口122位于第二端部分116的近端124。優(yōu)選地，該殼102在遠(yuǎn)端120的方向上具有錐形剖面。同樣優(yōu)選地，第一部分112通常是圓柱形并成形為接收光纖束106。該中間部分114優(yōu)選地為平滑彎曲的或呈階梯狀的，從其與該第一端部分112的交叉處的最小直徑逐漸膨脹至其與第二端部分116的交叉處的最大直徑。該第二端部分116優(yōu)選通常是圓柱形，具有足夠容納該光纖106和內(nèi)部襯墊104的直徑，以及具有足夠允許該光纖106在朝向該殼102的出口122上更平行于該中心軸110地定位的長度。
如同圖7和8中更清楚示出的，光纖106在襯墊104周圍展開，形成環(huán)帶140。優(yōu)選地，光纖106的分離通常是輻射狀的，不過由于光纖的內(nèi)反射特性不需要精確的輻射定向。光纖106可利用適配器100內(nèi)部的摩擦力和彈力被適當(dāng)?shù)谋３郑没虿挥谜衬z或其它固定裝置都可以。光纖106優(yōu)選在或靠近殼102的出口122處終止在該適配器100的端面126中。每個端面126優(yōu)選幾乎垂直于光纖106的縱軸被切割，以減少來自光纖體部分的光的任何不平行干涉。另外，該端面126可被平滑拋光以進(jìn)一步提純將要發(fā)射的光。該殼102和內(nèi)部襯墊104優(yōu)選構(gòu)成為幫助引導(dǎo)該光纖106朝向相對于該中心軸110基本平行的定向。另外，該襯墊104在靠近該襯墊104的頂部優(yōu)選包括基本上圓柱形的側(cè)面，以更好地定向該光纖。
圖9是內(nèi)部襯墊104的透視圖說明。優(yōu)選地，該襯墊104具有基本上半球形部分130，和具有平面端面134的基本上圓柱形部分132。該基本上圓柱形部分132具有外壁136，用以幫助保持光纖106在靠近端面134處在基本上平行的方向上對準(zhǔn)。該基本上圓柱形部分132具有長度L1，足夠允許該光纖106變成更平行于該中心軸110的定向。該襯墊104可由半剛性塑料或任何其它合適的具有足夠的硬度以保持分離的光纖106并足夠彈性以適當(dāng)保持該光纖的材料制成。優(yōu)選地，該襯墊104按照光纖106的尺寸和數(shù)量來定尺寸和成形，從而該襯墊104和光纖106一起有效地充滿殼102內(nèi)的有用空間。在一示例實施例中，該襯墊104的直徑近似于暗視場聚光鏡的不透明光圈的直徑。在一變形實施例中，該襯墊104的直徑可稍微大于該不透明光圈的直徑，從而產(chǎn)生的中空圓柱形光等于或小于聚光鏡的入口孔徑。采用該方式，被導(dǎo)向到該適配器100外圍的大部分光進(jìn)入該暗視場聚光鏡，用于在照射標(biāo)本中使用，因此提高了效率。
本發(fā)明還包括一種利用數(shù)學(xué)模型確定希望的襯墊尺寸和光纜束尺寸用以充填可用空間的方法。利用圖10中示出的參數(shù)，該方法從計算在該適配器100的出口122處該環(huán)形開口的表面面積(S)開始S=π4×(D2-d2)=2πρδ---(1)]]>其中D為殼102的第二部分116的內(nèi)部直徑；d為襯墊104的基本上圓柱形部分132的外部直徑；ρ為該環(huán)形開口140的平均半徑；δ為環(huán)形開口140的寬度；以及df為光纖106的直徑。進(jìn)入到該暗視場聚光鏡中的光束的面積(SL)可被記成SL＝πD2/4 (2)該光纖可以六邊形陣列或晶格排列以最優(yōu)化該空間。在該情況下，充填密度(f)等于f＝π/6≈0.907f(3)從公式(1)和(3)，由密集捆扎的光纖占據(jù)的表面面積(Sf)可近似為Sf＝2πfρδ (4)具有直徑df的需要去充填該適配器的光纖數(shù)目(Nf)等于Sf與由單根光纖占據(jù)的面積(pidf2/4)的比。因此，Nf=δfρδ/df2---(5)]]>如果光纖束的直徑為db，那么該束的截面面積(Sb)可表示成Sb＝πdb2/4 (6)從公式(1)和(6)，該束的直徑可被計算出db=22ρδ---(7)]]>因此，本發(fā)明還包括一種利用計算出的直徑db來確定束或光纜希望的尺寸的方法。
適配器100的效率(K)可被描述成穿過具有適配器的暗視場聚光鏡14的光能量與沒有適配器的能量的比。忽略光纖和透鏡中的少量損耗，該效率K可近似利用公式(1)和(2)得出K＝D2/(D2-d2)(8)例如，在暗視場適配器100中，其中該殼102的第二部分116具有等于16毫米的內(nèi)部直徑D，并且襯墊104的基本上圓柱形部分132具有等于14mm的外部直徑，下列參數(shù)可被近似·殼內(nèi)部半徑，R＝D/2＝8mm。
·襯墊外部半徑r＝d/2＝7mm。
·環(huán)形開口平均半徑，ρ＝(R+r)/2＝7.5mm。
·環(huán)形開口寬度，δ＝R-r＝1mm。
假定光纖具有0.1mm的直徑(df)，并使用公式(5)，束中的光纖數(shù)量(Nfz)可被估算為Nf＝8×0.907×7.5×1/(0.1)2＝5442根光纖。
該束的直徑，根據(jù)公式(7)，可被表示成db=2×(2×7.5×1)=7.75mm≈8mm]]>以及該適配器的效率K可被計算為K＝152/(162-142)＝4.27在此例子中，與沒有使用適配器的能量傳輸相比，具有上述所示參數(shù)的適配器100透射大約四倍或更多倍的光能量到該暗視場聚光鏡14中。
適配器100’的一替代實施例描述于圖11和12中。在該實施例中，適配器100’包括準(zhǔn)直腔150。代替光纖106在與襯墊130的面134共面的端面126中終止，如上述說明的實施例，光纖106’在中間端面152處終止，如圖12中更清楚示出的。在該實施例中，該準(zhǔn)直腔150通常由中間端面152的平面、襯墊的外壁136’、殼102的第二部分132的內(nèi)壁154、和出口122’的平面限定。
如圖11的截面圖所示，從中間端面152發(fā)出的光線156包括平行光線156A和非平行光線156B。優(yōu)選地，內(nèi)壁154和外壁136’具有深色或不透明顏色，或以其它方式處理成吸收非平行光線156B。在該方面，該準(zhǔn)直腔150有助于進(jìn)入顯微鏡70或照明裝置10(依賴于該系統(tǒng)是如何構(gòu)成的)的光準(zhǔn)直。優(yōu)選地，任何非平行光線156B被吸收或被以其它方式阻止進(jìn)入該暗視場聚光鏡，而平行光線156A穿過該出口122’并進(jìn)入聚光鏡。該準(zhǔn)直腔150具有足夠允許吸收非平行光線156B的長度L2。所示該長度L2通常比襯墊104’的基本上圓柱形部分132’的長度L1短；然而，其它結(jié)構(gòu)也考慮到了，并也可足以實現(xiàn)本發(fā)明的適配器100’的準(zhǔn)直效果。在具有準(zhǔn)直腔的該實施例中，光纖106’的端面152的精度和拋光在由適配器100’產(chǎn)生的準(zhǔn)直度方面不是關(guān)鍵的，因為來自非完美拋光表面的、沒有垂直導(dǎo)向的任何光線將不會進(jìn)入該聚光鏡。然而，光纖優(yōu)選是經(jīng)過拋光的。如果殼154的內(nèi)表面和襯墊104的外表面被拋光并被鏡面化，那么光的透射將達(dá)到最大化，這是因為來自光纖的傾斜光利用鏡面之間的反射將還被導(dǎo)向該聚光鏡。在該情況中，光效率非常高，能夠在不是全黑(即，略微混濁的背景)的背景上觀察到圖像。對于一些應(yīng)用，上述布置是可接受的。然而，如果殼154的內(nèi)表面和襯墊的外表面變黑，那么即使該光傳輸降低，該圖像的背景還會非常黑。這種布置對于獲得高對比度和高分辨率是有用的。
對配備或沒有配備本發(fā)明的適配器的本發(fā)明的照明裝置的一個有利的已知應(yīng)用，是其與熒光顯微術(shù)結(jié)合使用可更好的觀察標(biāo)本。例如，熒光標(biāo)記或光學(xué)查詢標(biāo)簽，例如但不限于Texas紅染料、熒光素、DAPI(或4’，6-二脒基(Diamidino)-2-苯吲哚(phenylindole))、有機(jī)熒光染料、剛果紅、金屬納米粒子像例如金納米粒子、或量子點，被施加到將被誘發(fā)熒光并觀察的樣本。一般地，使用這類標(biāo)記的通常熒光顯微術(shù)標(biāo)記技術(shù)是本領(lǐng)域熟練人員所周知的。在暗視場顯微術(shù)中，金屬納米粒子和量子點是優(yōu)選地?？少I到的金屬納米粒子通常具有大約幾個納米的尺寸，并且它們產(chǎn)生非常強(qiáng)的散射，這在暗視場顯微術(shù)中是有效的。量子點是半導(dǎo)體納米粒子，通常具有幾個納米的尺寸。它們是強(qiáng)熒光的，并能夠用暗視場成像觀察到。根據(jù)本發(fā)明，具有暗視場聚光鏡的照明裝置可改進(jìn)成現(xiàn)有的顯微鏡12，然后可以在這種顯微鏡下觀察/研究/記錄該樣本。
而且，本發(fā)明的該系統(tǒng)和方法通過同時使用多個熒光標(biāo)簽(多個顏色)能夠產(chǎn)生實時的圖像記錄(即，不需要多重曝光，并且不需要不同的帶通濾光器)，這允許觀察并記錄多個細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)交互作用。在圖15B中可以更加清楚地看見一個例子。圖15B的圖像示出了與圖15A(現(xiàn)有技術(shù))相比更好的分辨率。特別的，向樣本施加三種不同的標(biāo)簽。示出牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的備有#1載片的FluoCells被與Mito Trakcer Red CMXRos一起孵化以標(biāo)記該線粒體。在固定和滲透后，該細(xì)胞被BODIPY FL phallacidin著色以標(biāo)記該F-肌動蛋白纖絲并最后再被DAPI著色以標(biāo)記該核子。在圖15A中，通過使用單獨的適合Texas紅染料、熒光素和DAPI的帶通濾光器獲得多重曝光圖像。在圖15B中，示出較好分辨率的單個圖像由本發(fā)明的照明裝置產(chǎn)生而不使用任何濾光器。如這里更加詳細(xì)論述的，與通常僅僅適用于對死的或非活細(xì)胞的現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的照明裝置允許活細(xì)胞被誘發(fā)熒光并觀察。
另外，分子探針(能夠結(jié)合到特定蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜、核等的抗體或肽)可與光學(xué)查詢標(biāo)簽(納米粒子、量子點、染料)配對，并且這種復(fù)合體能夠被引入到細(xì)胞。當(dāng)該復(fù)合體結(jié)合目標(biāo)分子時，該光學(xué)查詢標(biāo)簽提供額外的對比度?？蛇x的，穿透增強(qiáng)劑，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或二甲亞砜(DMSO)可與該光學(xué)查詢標(biāo)簽結(jié)合使用。由本發(fā)明的照明系統(tǒng)產(chǎn)生的附加圖像示于圖16和17中。接下來將說明本方法的附加優(yōu)點。
與本發(fā)明的照明裝置結(jié)合的這種熒光技術(shù)在各種臨床應(yīng)用中是狠有用的，例如性傳播的疾病的快速準(zhǔn)確的檢查，例如衣原體。例如，在根據(jù)本發(fā)明方法的實施例中，衛(wèi)生保健專業(yè)技術(shù)人員收集來自病人的尿樣。熒光素著色的抗體被加到該尿樣，與該衣原體細(xì)菌結(jié)合，并在具有本發(fā)明的照明裝置的顯微鏡光下發(fā)出熒光，提供衣原體存在或不存在的指示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明能夠應(yīng)用到許多其它應(yīng)用中，包括涉及在生物樣本中快速準(zhǔn)確的檢測傳染物或病原體的存在的應(yīng)用，也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的照明裝置與熒光顯微術(shù)結(jié)合使用的一個顯著的優(yōu)點是，被觀察的圖像的空間分辨率和對比度通過最小化在樣本上的斑點尺寸和減少雜光被提高。該斑點可通過向上和向下移動整個照明裝置(不僅僅是暗視場聚光鏡)朝向或離開將被觀察的標(biāo)本，來進(jìn)行定位，例如使用人工或電動定位調(diào)整機(jī)構(gòu)。最小化斑點的尺寸增加了樣本的輻照度(每單位面積的能量)并由于增加了的與樣本最小粒子的交互作用而增加了對比度，否則這就不會產(chǎn)生足夠的可見光。由于照明強(qiáng)度的增加，小的光散射粒子與其背景之間的光學(xué)差異增加了。在更高的照明下，更小的粒子散射足夠的光以可視。即使粒子的尺寸小于50nm，該粒子也能被看見。小的蛋白質(zhì)聚合體(類蛋白體)和嗅覺纖毛的移動能夠利用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法被看到并照相，該小的蛋白質(zhì)聚合體(類蛋白體)和嗅覺纖毛的直徑都小于100納米，并由于太小而不能在明視場或DIC(微分干涉對比度)照明中被看到。該照明裝置的高輸出數(shù)值孔徑允許利用該物鏡的高數(shù)值孔徑的全部優(yōu)點，從而產(chǎn)生高亮度超分辨率圖像。
與熒光顯微術(shù)結(jié)合使用的本發(fā)明和方法的另一個顯著的優(yōu)點是，在本發(fā)明的照明裝置的實施例形式中使用的優(yōu)選金屬鹵化物燈產(chǎn)生一些強(qiáng)的光譜線，其能夠與樣本交互作用以產(chǎn)生特殊的光學(xué)效應(yīng)，與通常具有連續(xù)的光譜的白熾燈或鹵素?zé)粝喾?。本發(fā)明的照明裝置允許更有效的使用光。金屬鹵化物燈的強(qiáng)度主峰出現(xiàn)在313、334、365、406、435、546、和578納米處。從該照明裝置出射的光穿過該樣本，與該分子交互作用，并誘發(fā)熒光。由于本發(fā)明的照明裝置提供高效的照明，所以幾乎來自光源的全部光被用于照射該樣本，從而高效地保守住了光能。該照明裝置的實施例形式的聚光鏡的幾何結(jié)構(gòu)和高孔徑為產(chǎn)生衰減波提供了條件，大大提高了顯微鏡的分辨率，和全內(nèi)反熒光(TIRF)。當(dāng)光以大于臨界角(該臨界角是折射角度為90度的入射角度)的角度被內(nèi)反射離開界面時形成衰減波，從而產(chǎn)生全內(nèi)反射。當(dāng)次級微米尺寸的結(jié)構(gòu)定位于非常靠近產(chǎn)生衰減波的該界面時，其與該結(jié)構(gòu)交互作用，并產(chǎn)生散射和熒光。熒光的選擇性地激發(fā)消除了焦點外的光并減少了光致褪色，這在常規(guī)的顯微鏡中典型地出現(xiàn)。
與共焦顯微鏡不同，本發(fā)明通過將其焦斑減少至近場大小，實現(xiàn)了其三維分段，以便能夠?qū)崿F(xiàn)寬視場實時探測而不需要掃描。通常公認(rèn)的是，TIRF現(xiàn)象僅僅發(fā)生在非?？拷Ａ?樣本的界面處，在那里光從具有高折射率的介質(zhì)進(jìn)入到具有低折射率的介質(zhì)中。實際上，衰減波現(xiàn)象被延伸超過玻璃/水界面，，只要兩個相鄰表面的折射率存在梯度。與細(xì)胞內(nèi)液之一相比，許多內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有高折射率。細(xì)胞膜的折射率約為1.46，而細(xì)胞質(zhì)相對于鹽水的平均折射率為1.02，并且細(xì)胞質(zhì)的折射率在橫過細(xì)胞直徑上變化，中心處的折射率是邊緣處折射率的1.6倍。由此，以全內(nèi)反射角度進(jìn)入該細(xì)胞內(nèi)界面的光也沿著這些表面產(chǎn)生衰減波，并在靠近這些界面的結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生熒光。衰減波熒光與本發(fā)明的高輸出數(shù)值孔徑一起，允許利用物鏡的高數(shù)值孔徑的全部優(yōu)點，并利用例如21瓦特光源的低瓦特光產(chǎn)生高亮度超分辨率和熒光圖像。當(dāng)存在玻璃-金屬界面時，該系統(tǒng)能夠產(chǎn)生表面等離子。本發(fā)明的該系統(tǒng)還在每個每個角度經(jīng)由光柱為駐波全內(nèi)反射熒光創(chuàng)造條件。
與熒光技術(shù)結(jié)合使用的本發(fā)明的照明裝置和方法還增加了結(jié)果圖像的清晰度和強(qiáng)度。樣本中任何深度處的焦點精細(xì)調(diào)焦和定位允許該照明裝置將照明焦點剛好定位在非?？拷镧R的樣本的上表面以下。這防止了發(fā)出的熒光不得不在到達(dá)物鏡前穿過該樣本的整個厚度。從而，與傳統(tǒng)的顯微鏡典型的不夠清晰的圖像相比，獲得了清晰和強(qiáng)烈的熒光圖像。
本發(fā)明的該系統(tǒng)和方法還有利于消除了對激發(fā)濾光器和阻擋濾光器的需要，該激發(fā)濾光器和阻擋濾光器通常在傳統(tǒng)的熒光顯微鏡中使用。由于本發(fā)明的照明裝置從入射光和樣本的交互作用(散射和熒光)產(chǎn)生的光中產(chǎn)生非常有效分離的入射光，因此消除了對激發(fā)濾光器和阻擋濾光器的需要。當(dāng)不使用濾光器并且在樣本中存在熒光時，由裝配有本發(fā)明的照明裝置的透射光顯微鏡產(chǎn)生的圖像包括重疊的超分辨率圖像，其將沒有熒光物存在于熒光圖像。與相位對比度顯微術(shù)相反，本系統(tǒng)提供較好的分辨率并沒有圖像變形。利用本發(fā)明的照明裝置產(chǎn)生的圖像與Nomarski微分干涉對比度(DIC)顯微術(shù)相似，但它們不需要預(yù)先必須的定向，而且它們具有較好的對比度和分辨率，使用者能夠目視非常小的粒子，并且它們花費較少即可獲得。因此，與利用該照明裝置的超分辨率成像一起同時熒光觀察的使用方法比將熒光觀察與相位和DIC顯微術(shù)結(jié)合更為有利。
因此，可以發(fā)現(xiàn)，與熒光顯微術(shù)方法結(jié)合使用的本發(fā)明的照明裝置，驚人的克服了傳統(tǒng)的透射熒光顯微術(shù)(完全熒光顯微術(shù))的許多問題。
另外，配備有本發(fā)明的照明裝置的顯微鏡系統(tǒng)提供的透射光熒光顯微術(shù)方法具有比明視場反射熒光顯微術(shù)(上熒光顯微術(shù))顯著的優(yōu)點。本發(fā)明的照明裝置典型的提供至少四(4)倍的更好的光節(jié)省，以便能夠使用低瓦特功率電源，例如21瓦特電源；與典型的上熒光(epi-fluorescence)顯微鏡要求的大約75-100瓦特的較高瓦特相比。本發(fā)明的該照明裝置不需要二向色鏡，并還可任意排除激發(fā)和阻擋濾光器，從而提供更好的效率。由于傳統(tǒng)的系統(tǒng)的二向色鏡的透射效率大約為85％，以及該濾光器的透射效率大約為80％，因此，傳統(tǒng)系統(tǒng)的這三個元件的整體效率被計算為大約54％(0.85×0.8×0.8＝0.544)。由于本發(fā)明的照明裝置的表面鏡56的效率幾乎為100％，因此本發(fā)明的透射效率典型地至少比傳統(tǒng)的上熒光顯微鏡好46％。
本發(fā)明的照明裝置的另一個優(yōu)點特征是其固有的“冷”光。與典型的上熒光顯微術(shù)中的固體錐形照明體積相比，本發(fā)明的照明裝置的照明體積可由空的光錐限定。例如，對于具有大約1.2至1.4數(shù)值孔徑范圍和折射率1.51的空光錐，估計其照明體積要比固體錐形數(shù)值孔徑1.33的小約2.5倍。因此，與標(biāo)準(zhǔn)的上熒光顯微鏡產(chǎn)生的圖像相比，基于空的和固體的錐形幾何體積比例，大約2.5倍小的樣本體積可以被經(jīng)受照明并光致褪色。
此外，本發(fā)明的該系統(tǒng)和方法能夠以超分辨率圖像同時熒光觀察。因此，本發(fā)明能夠更好的觀察超小粒子例如量子點，其通常不能利用明視場上熒光顯微鏡觀察到。本發(fā)明不需要改變用于多色熒光的濾光器，并且該圖像可以按單次“拍攝”(記錄)的方式被記錄。這表現(xiàn)出比現(xiàn)有的系統(tǒng)大大的進(jìn)步，在現(xiàn)有的系統(tǒng)中，單獨的圖像通過利用適用于某些斑點(顏色)的不同帶通濾光器獲得，并重疊以產(chǎn)生單獨的圖像。利用本系統(tǒng)和方法，由于不需要濾光器，能夠?qū)崟r獲得單個圖像。這樣，本發(fā)明的該系統(tǒng)和方法能夠利用多個熒光標(biāo)簽(多種顏色)產(chǎn)生實時圖像記錄，這允許觀察和記錄多個細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)交互作用。
雖然已經(jīng)參照優(yōu)選實施例說明了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，許多改進(jìn)、添加和刪除仍落在本發(fā)明由隨后的權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于顯微鏡的照明裝置，所述照明裝置包括至少一個光源，用于產(chǎn)生光以照明用于顯微觀察的樣本；至少一個準(zhǔn)直透鏡，用于準(zhǔn)直由該光源產(chǎn)生的光；以及一暗視場聚光鏡，用于接收經(jīng)準(zhǔn)直的光并將中空錐形光導(dǎo)向待觀察的樣本上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的照明裝置，進(jìn)一步包括一光束導(dǎo)向器，用于將來自光源的光導(dǎo)向該暗視場聚光鏡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的照明裝置，進(jìn)一步包括基本上剛性的耦合裝置，用于保持該光源和該暗視場聚光鏡之間的對準(zhǔn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的照明裝置，其中該光源是金屬-鹵化物光源。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的照明裝置，其中該光源發(fā)出具有至少兩種不同波長的光。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的照明裝置，其中該至少一個準(zhǔn)直透鏡包括多個準(zhǔn)直透鏡，用于準(zhǔn)直來自該光源的該光。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的照明裝置，進(jìn)一步包括一配件，用于附于透射光顯微鏡。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的照明裝置，其中為了產(chǎn)生該中空錐形光，該暗視場聚光鏡的不透明光圈部分不需要與該聚光鏡的中心對準(zhǔn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的照明裝置，其中該暗視場聚光鏡是一整體元件。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的照明裝置，進(jìn)一步包括一適配器，用于提高從光源到該暗視場聚光鏡的光傳輸效率，該適配器包括一中心設(shè)置的襯墊和多個環(huán)繞該襯墊的光纖。
11.一種用于顯微鏡的照明系統(tǒng)中的光傳輸?shù)倪m配器，所述適配器包括一襯墊，該襯墊相對于該適配器的縱軸而中心設(shè)置，并在其一端具有基本上平面的襯墊面，所述適配器包括環(huán)繞該襯墊定位的多個光纖，該多個光纖的每個都具有一端面，該端面基本上定向成垂直于該適配器的該縱軸并定位成靠近該襯墊面。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的適配器，進(jìn)一步包括一殼，用于封裝該多個光纖和該襯墊。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的適配器，其中該殼包括位于其靠近該襯墊面端部的第一耦合，用于與該照明系統(tǒng)的暗視場聚光鏡部分連接，和位于其相對一端的第二耦合，用于與該照明系統(tǒng)的光源部分連接。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的適配器，其中在鄰接該光纖的該端部面的該殼中限定一準(zhǔn)直腔。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的適配器，其中該準(zhǔn)直腔包括表面，該表面構(gòu)成為吸收在除了平行于該縱軸之外的方向上傳播的部分光。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的適配器，其中該襯墊沿著其靠近該襯墊面的長度的至少一部分具有基本上圓柱部分，并沿著該適配器的該縱軸延伸一距離，該距離足夠保持該多個光纖在基本上平行于該適配器的該縱軸方向上對準(zhǔn)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的適配器，其中該襯墊具有一與該襯墊面相對的圓形端部。
18.一種用于顯微觀察標(biāo)本的系統(tǒng)，包括一透射光顯微鏡；以及一照明裝置，用于利用該顯微鏡將光聚焦到待觀察的該標(biāo)本上，所述照明裝置包括一光源、一準(zhǔn)直透鏡和一暗視場聚光鏡。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括一適配器，用于提高從該光源到該標(biāo)本的光傳輸?shù)墓?jié)省，所述適配器包括一中心設(shè)置的襯墊和環(huán)繞該襯墊的多個光纖。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括一照相機(jī)，用于記錄該標(biāo)本的圖像。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的系統(tǒng)，其中該照明裝置將中空錐形光聚焦到該標(biāo)本上。
22.一種顯微觀察標(biāo)本的方法，所述方法包括將一照明裝置耦合到一透射光顯微鏡，該照明裝置包括一暗視場聚光鏡，用于將中空錐形光聚焦到該標(biāo)本上，和一光源，用于將光傳輸?shù)皆摪狄晥鼍酃忡R，其中該照明裝置產(chǎn)生該光的內(nèi)反射。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，進(jìn)一步包括將光傳輸穿過一適配器，該適配器包括多個光纖，用于接收來自光源的光并將中空柱形光傳遞到該暗視場聚光鏡。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，進(jìn)一步包括向該標(biāo)本施加一熒光標(biāo)記，并在該顯微鏡下觀察該樣本。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該觀察步驟進(jìn)一步包括觀察一活的標(biāo)本以實時觀察細(xì)胞的過程。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中將中空錐形光聚焦到該標(biāo)本上的該步驟進(jìn)一步包括調(diào)整該錐形光的角度以提高分辨率。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中聚焦在該標(biāo)本上的該中空錐形光的焦斑尺寸被減小至近場大小。
28.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，進(jìn)一步包括將照明的焦點正好定位在位于靠近該物鏡的樣本的上表面以下，以防止該發(fā)出的熒光在到達(dá)該物鏡前穿過該整個樣本。
29.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中傳輸?shù)皆撜彰餮b置的基本上所有的光在該照明裝置中被內(nèi)反射。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中來自該光源的基本上所有的傳輸光照明該樣本。
31.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中該照明裝置產(chǎn)生衰減波。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中該衰減波在全內(nèi)反射角的情況下在該標(biāo)本的細(xì)胞內(nèi)界面處形成，并在靠近該界面的結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生熒光。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中傳輸?shù)皆撜彰餮b置中的該光以一角度內(nèi)反射離開界面，該角度比該臨界角大以便產(chǎn)生全內(nèi)反射。
34.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中該暗視場聚光鏡具有大約1.2至1.4的孔徑。
35.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中該光源進(jìn)一步包括一金屬-鹵化物光源。
36.一種識別病原體的方法，所述方法包括將一照明裝置耦合到一透射光顯微鏡，該照明裝置包括一暗視場聚光鏡，用于將中空錐形光聚焦到標(biāo)本上，和一光源，用于將光傳輸?shù)皆摪狄晥鼍酃忡R。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中該照明裝置產(chǎn)生該光的內(nèi)反射。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中觀察標(biāo)本的該步驟進(jìn)一步包括實時觀察一活的標(biāo)本。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中向該標(biāo)本施加一熒光標(biāo)記用于觀察發(fā)出的熒光。
40.一種用于顯微鏡的照明裝置，所述照明裝置包括至少一個光源，用于產(chǎn)生光以照射用于顯微觀察的標(biāo)本；至少一個準(zhǔn)直透鏡，用于準(zhǔn)直由該光源產(chǎn)生的光；一暗視場聚光鏡，用于接收經(jīng)準(zhǔn)直的光并將中空錐形光導(dǎo)向待觀察的該標(biāo)本上；以及一適配器，用于提高從該光源向該暗視場聚光鏡傳輸?shù)墓獾男省?br> 41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的照明裝置，其中該適配器進(jìn)一步包括一中心設(shè)置的襯墊和環(huán)繞該襯墊的多個光纖。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的照明裝置，其中該適配器進(jìn)一步包括一殼，該殼包括位于其靠近該襯墊表面的一端部處的第一耦合，用于連接到該照明系統(tǒng)的暗視場聚光鏡部分，和位于其相對端部處的第二耦合，用于連接到該照明系統(tǒng)的光源部分。
43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的照明裝置，其中該適配器與該系統(tǒng)成一整體。
44.根據(jù)權(quán)利要求40所述的照明裝置，其中該適配器能夠可拆卸地安裝到該照明裝置。
45.一種產(chǎn)生待顯微觀察的樣本的全色熒光圖像的方法，所述方法包括利用具有至少一個強(qiáng)度峰值波長的光照射該樣本，并利用所述光在待照射的該樣本中誘發(fā)熒光。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中待顯微觀察的該樣本用熒光標(biāo)記來標(biāo)記。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中該顯微觀察在不用激發(fā)濾光器或阻擋濾光器的情況下而完成。
48.一種顯微觀察樣本的方法，包括對樣本的同時熒光觀察和超分辨率成像。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中該樣本的該超分辨率成像包括成像小于100納米的物體。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中該樣本的該超分辨率成像包括探測小于50納米的物體。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，包括將中空錐形光聚焦到待顯微觀察的該樣本中的斑點上。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，進(jìn)一步包括最小化所述斑點的尺寸。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，進(jìn)一步包括減小入射在該樣本上的雜光。
54.一種對樣本實時成像的方法，所述方法包括將多個熒光標(biāo)簽加到該樣本上，并同時觀察由所述熒光標(biāo)簽所標(biāo)記的多個細(xì)胞特征。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，包括活的細(xì)胞的多重細(xì)胞特征的觀察。
56.一種產(chǎn)生衰減駐波的方法，包括將照明引導(dǎo)穿過一高孔徑聚光鏡，并以大于該臨界角的角度內(nèi)反射光離開界面。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，進(jìn)一步包括產(chǎn)生全內(nèi)反射。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中該衰減駐波靠近細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，以產(chǎn)生全內(nèi)反射熒光。
59.一種減少待照明樣本中的光致褪色的方法，所述方法包括在該樣本中選擇性地激發(fā)熒光。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中該選擇性地激發(fā)熒光包括聚焦中空錐形光，該中空錐形光的頂點位于樣本內(nèi)的一點。
61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中該選擇性地激發(fā)熒光包括最小化入射在該樣本上的光斑尺寸，并減少入射在該樣本上超出所述光斑的雜光。
62.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中該選擇性地激發(fā)熒光包括利用低瓦特光源照明該樣本。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中該選擇性地激發(fā)熒光包括利用小于100瓦特的光源照射該樣本。
64.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中由該光源產(chǎn)生的所有光基本上都被聚焦到該樣本上。
65.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中該選擇性地激發(fā)熒光包括在該樣本內(nèi)靠近不同折射率材料之間的界面，產(chǎn)生衰減駐波。
66.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中該選擇性地激發(fā)熒光包括照射樣本中的一斑點，所述斑點位于鄰近該樣本靠近顯微鏡的物鏡的表面。
67.一種用于提高顯微分辨率的方法，包括利用光觀察待照明的樣本，該光被導(dǎo)向穿過高孔徑聚光鏡以產(chǎn)生全內(nèi)反射。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中該觀察樣本的步驟包括觀察納米粒子。
69.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中該觀察樣本的步驟包括觀察量子點。
70.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中朝該樣本引導(dǎo)入射光的角度可以被調(diào)整以提高分辨率。
71.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，包括觀察該樣標(biāo)本中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且其中入射在該細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的該光在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間界面處產(chǎn)生衰減波。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中該衰減波在靠近該界面處產(chǎn)生熒光。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，進(jìn)一步包括同時觀察用多重?zé)晒鈽?biāo)簽所標(biāo)記的多個細(xì)胞特征。
74.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中該細(xì)胞結(jié)構(gòu)是活細(xì)胞的一部分。
75.一種產(chǎn)生衰減駐波的方法，包括引導(dǎo)照明穿過一高孔徑聚光鏡，并使光內(nèi)反射以大于臨界角的角度離開界面，其中該衰減駐波產(chǎn)生在靠近細(xì)胞結(jié)構(gòu)處以產(chǎn)生全內(nèi)反射熒光。
76.一種在玻璃-金屬界面處產(chǎn)生表面等離子的方法，包括產(chǎn)生衰減駐波靠近所述界面。
77.一種以每個角度經(jīng)由圓柱形光產(chǎn)生駐波全內(nèi)反射熒光的方法。
全文摘要
一種用于顯微鏡的照明系統(tǒng)(10)，包括光源(32)，用于產(chǎn)生光以照射用于顯微觀察的樣本，至少一個準(zhǔn)直透鏡(50，52)，用于準(zhǔn)直由該光源產(chǎn)生的光，以及一暗視場聚光鏡(14)，用于接收經(jīng)準(zhǔn)直的光并將中空錐形光導(dǎo)向待觀察的樣本上。該系統(tǒng)可任意包括一適配器(100)，用于提高從光源到標(biāo)本的光傳輸?shù)墓?jié)省，該適配器具有一中心設(shè)置的襯墊和環(huán)繞該襯墊的多根光纖，以產(chǎn)生中空光柱，用于向該暗視場聚光鏡傳輸。該系統(tǒng)提供提高了的分辨率和對比度，并還適于匹配熒光顯微技術(shù)。
文檔編號G02B21/12GK101069115SQ200580019890
公開日2007年11月7日 申請日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月16日
發(fā)明者V·J·沃迪亞諾伊, O·M·普斯托維 申請人:奧本大學(xué)