專利名稱：多波長核酸蛋白層析分離和檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
多波長核酸蛋白層析分離和檢測裝置
一、 技術(shù)領(lǐng)域 本實用新型是生物化學(xué)和生物制藥領(lǐng)域的專用分離檢測方法與設(shè)備，尤其是涉及
多波長核酸蛋白層析分離檢測方法和系統(tǒng)。
二、 背景技術(shù) 在科學(xué)研究和生產(chǎn)過程中，存在著大量的蛋白質(zhì)、核酸和多肽等生物大分子的分 析、分離和純化工作，迫切需要高效快速的分析、分離和制備方法。目前廣泛采用的生化分 離技術(shù)主要有沉淀分離、層析分離、電泳分離、離心分離、膜分離技術(shù)。而層析分離技術(shù)以其 獨特的優(yōu)勢始終占據(jù)著生物大分子純化技術(shù)的主導(dǎo)地位。層析系統(tǒng)包括兩個相固定相和 移動相。當(dāng)移動相流過加有樣品的固定相時，由于各組分在兩相之間的分配比例不同，各組 分就會以不同速度移動而互相分離開來。根據(jù)固定相基質(zhì)的形式，層析可以分為紙層析、薄 層層析和柱層析。生化技術(shù)中常用的凝膠層析、離子交換層析等通常采用柱層析方法。柱 層析系統(tǒng)主要有兩部分組成，層析柱系統(tǒng)和檢測器系統(tǒng)。根據(jù)研究對象設(shè)計層析柱系統(tǒng)， 包括柱體、固定相、流動相(洗脫劑)、流速等，已形成專門研究領(lǐng)域。檢測器是柱層析系統(tǒng) 分析、分離和純化工作的"眼睛"，主要有紫外(UV)吸收、示差折光、介電常數(shù)等。其中紫外 吸收檢測器是柱層析系統(tǒng)應(yīng)用最廣的檢測器，它有①靈敏度高，最低檢測濃度可達10—1Qg/ mL②受操作條件和外界環(huán)境影響小，適于梯度洗脫③對無紫外吸收的物質(zhì)組分無響應(yīng)④非 破壞性檢測，可與其他檢測器串聯(lián)使用等特點及優(yōu)點。既可以用于少量物質(zhì)的分離鑒定， 又可用于大量物質(zhì)的分離純化和制備。占據(jù)著生物大分子分離純化技術(shù)的主導(dǎo)地位，使用 率占70%左右。傳統(tǒng)核酸蛋白層析分離裝置雖然配有280nm、254nm等波長選擇，但實際使 用時只能選定單一波長進行檢測，因此，傳統(tǒng)層析分離裝置只能利用物質(zhì)特征波長分離已 知單一組分(蛋白或核酸等)，不能對未知混合組分進行分離，更不能分析蛋白或核酸的純 度。目前使用的大分子層析分離裝置由核酸蛋白檢測儀、層析柱、恒流泵、部分收集器和記 錄儀等部件構(gòu)成。作為一種簡便的分析分離手段與方法，長期應(yīng)用于教學(xué)實驗、科學(xué)研究和 工業(yè)生產(chǎn)。在零點調(diào)整、靈敏度選擇、讀數(shù)換算、使用記錄儀描譜等環(huán)節(jié)的操作基本一樣，且 僅在單一波長(280nm或254nm)下檢測。只能利用物質(zhì)特征波長分離已知單一組分(蛋白 或核酸)，不能對未知混合組分進行分離，更不能分析蛋白或核酸的純度。傳統(tǒng)核酸蛋白檢 測儀在操作和技術(shù)上普遍存在以下幾方面不足1、誤差。儀器檢測的第一數(shù)據(jù)為光透過率 值。由于儀器的對數(shù)轉(zhuǎn)換裝置誤差沒能得到很好的校正補償，實際轉(zhuǎn)換結(jié)果存在較大的誤 差。雖然要求使用者在進樣前一定要進行零點調(diào)整，方法為先調(diào)整透過率為100%，然后 再調(diào)吸光度為O，使該點(T = 100%，A = 0)兩者符合了朗伯 一 比爾定律(A = lg(l/T))。 但是，無法保證在測量范圍內(nèi)(一般取0-2A)都符合朗伯一比爾定律。事實上不同點兩者 存在著誤差，有的誤差超過50%。因此，儀器檢測的科學(xué)性得不到保證。 2、讀數(shù)。傳統(tǒng)檢測儀為保證測量時讀數(shù)在儀器有效測量范圍內(nèi)，在儀器面板上都 設(shè)有靈敏度選擇裝置(2. 0A、 1. 0A、0. 5A、0. 2A、0. 1A、0. 05A等)，由此會帶來①當(dāng)對未知樣 品濃度不甚了解，不知如何選擇靈敏度，需要反復(fù)摸索；②儀器顯示值不是樣品吸光度值，真正吸光度值是儀器顯示數(shù)與靈敏度的乘積；③如在測量時改變儀器的靈敏度將會帶來嚴(yán) 重后果(基線變化大)。 3、繁瑣。大多傳統(tǒng)檢測儀在不同靈敏下的測量結(jié)果均為0-10mv直流電壓信號，將 此信號輸出到記錄儀上，選擇適當(dāng)?shù)挠涗泝x走紙速度，在記錄紙上繪出吸光度譜。可想而 知，記錄紙上的吸光度并非樣品吸光度，也受到儀器靈敏度的調(diào)制。要想從記錄紙上得到吸 收峰的面積、歸一化等參數(shù)將是一件費工耗時、十分繁瑣的事。再者，紙質(zhì)譜圖提供的信息 單一且難以保存，更不能直接在文章中插入使用。 4、單一。傳統(tǒng)檢測儀雖然可能配有280nm、254nm等波長選擇，但使用時只能選定 單一波長進行檢測，不能同時進行雙波長(280nm和254nm)同步檢測。因此，傳統(tǒng)層析分離 裝置只能利用物質(zhì)特征波長分離已知組分。需進一步分離未知物質(zhì)，傳統(tǒng)層析分離裝置無 能為力。
三、實用新型內(nèi)容 本實用新型目的是為徹底解決傳統(tǒng)層析分離裝置存在的誤差大、讀數(shù)不直觀、記 錄儀描譜、只能單波長檢測等問題。提出一種涉及多波長核酸蛋白層析分離和檢測系統(tǒng)。 本實用新型技術(shù)解決方案是多波長核酸蛋白層析分離和檢測裝置，由控制器、紫 外光源、干涉濾光片分光、樣品池、光電管，信號放大器，對數(shù)轉(zhuǎn)換器，雙通道A/D轉(zhuǎn)換器構(gòu) 成，紫外光源經(jīng)至少兩種干涉濾光片分光后成不同波長的單色光，單色光通過光路和狹縫 射到樣品池后分別透射到光電管上，光電管經(jīng)光電轉(zhuǎn)換器得到兩路與透射光強度成正比例 的電信號，電信號接信號放大器進行信號放大，并輸入到對數(shù)放大器(轉(zhuǎn)換器)進行信號對 數(shù)轉(zhuǎn)換，對數(shù)轉(zhuǎn)換得到的信號與樣品池光吸收成正比例，再接雙通道A/D轉(zhuǎn)換器，A/D轉(zhuǎn)換 器輸出的數(shù)字信號；由控制器連接A/D轉(zhuǎn)換器的控制端和輸出端、并連接上位電腦工作站 的接口通信端；電腦工作站進行數(shù)據(jù)傳輸接收、屏幕繪譜、參數(shù)分析、譜圖編輯、數(shù)據(jù)保存等 工作。 光源產(chǎn)生的兩束單色光結(jié)構(gòu)是在紫外光源內(nèi)部出口處設(shè)有光路選擇裝置，該裝 置由步進電機和遮光片組成，遮光片上開有兩波長光交替輸出對應(yīng)的(如4對)窗口，分別 對應(yīng)著兩種波長的單色光輸出。在窗口上裝有聚光透鏡，會聚后的光射入濾光片；對數(shù)放大 器輸出的兩路電信號輸入到A/D轉(zhuǎn)換器；步進電機帶動遮光片旋轉(zhuǎn)時分別在光路中輸出兩
種波長的單色光；根據(jù)需要本實用新型亦可以采用三束相異波長的光。對應(yīng)的采用三只光 電管(R2868)，遮光片上開有(三的倍數(shù)，如6對)窗口，在窗口上裝有聚光透鏡，會聚后的 光射入相應(yīng)的濾光片。 光源產(chǎn)生的兩束單色光光路進行檢測的步驟是 1)、在紫外光源內(nèi)部出口處設(shè)有光路選擇裝置，該裝置由步進電機和遮光片組成， 遮光片上開有(二的倍數(shù)，如4對)窗口，在窗口上裝有聚光透鏡，會聚后的光射入射相應(yīng) 濾光片；2)、對數(shù)放大器輸出的兩路電信號輸入到A/D轉(zhuǎn)換器；3)、通過控制步進電機的旋 轉(zhuǎn)和A/D轉(zhuǎn)換器信號獲得實現(xiàn)同步，保證不同波長信號和A/D輸出相一致；4)、然后對兩路 數(shù)字信號進行整形變換，送給接口電路。 本實用新型有益效果是本實用新型以朗伯_比爾定律為依據(jù)，在檢測方法、光源 設(shè)計、光路轉(zhuǎn)換進行了設(shè)計。在檢測電路包括模擬放大、對數(shù)放大、A/D轉(zhuǎn)換、數(shù)字控制、嵌入式技術(shù)以及電腦工作站等方面亦然。經(jīng)過試驗和用戶試用，完成了 "雙波長核酸蛋白檢測 儀"和電腦軟件工作站的研制，配上層析柱、恒流泵、部分收集器等部件，構(gòu)成了完整的"雙 波長核酸蛋白層析分離檢測系統(tǒng)"。該系統(tǒng)實現(xiàn)了良好檢測效果本實用新型在層析過程中 用兩種波長(如280nm和254nm)對樣品池液體的吸光度進行實時同步檢測并設(shè)計層析電 腦軟件工作站。繪制出信息更加豐富的雙波長層析譜，在雙波長圖譜中進行比值運算(如 用280nm吸光度除以254nm吸光度)，得到蛋白和核酸的純度圖譜。 1)、吸光度A和透過率T嚴(yán)格符合朗伯-比爾定律(A二Lg(l/T))，任意兩者(A和 T)對應(yīng)誤差小于1% ;2)、系統(tǒng)自動調(diào)整吸光度到0. OOO，透光率到100% ;3)、雙波長(如 280nm和254nm)同步檢測；4)、數(shù)據(jù)采集、電腦接口 (COM 口和USB接口 )和軟件工作站，檢 測、采集、軟件工作站一體化系統(tǒng)集成；5)、層析分析軟件具有數(shù)據(jù)采集、實時描譜、分析參 數(shù)、保存、打印、編輯等功能。6)、分析參數(shù)有峰高、峰寬、峰面積、歸一化、保留時間、面積含 量、純度、層析柱分辯率等。
四
圖1是本實用新型硬件構(gòu)成示意圖 圖2是本實用新型檢測系統(tǒng)框圖 圖3、4是兩種檢測圖譜
五具體實施方式如附圖所示，根據(jù)硬件框圖與，本實用新型多波長核酸蛋白層析分離和檢測裝置， 由控制器、紫外光源、干涉濾光片分光、樣品池、光電管，信號放大器，對數(shù)轉(zhuǎn)換器，雙通道A/ D轉(zhuǎn)換器構(gòu)成，紫外光源經(jīng)至少兩種干涉濾光片分光分光后成不同波長的單色光，單色光通 過光路和狹縫射到樣品池后分別透射到光電管上，光電管經(jīng)光電轉(zhuǎn)換器得到兩路與透射光 強度成正比例的電信號，電信號接信號放大器進行信號放大，并接對數(shù)放大器(轉(zhuǎn)換器)進 行信號對數(shù)轉(zhuǎn)換，對數(shù)轉(zhuǎn)換得到的信號與樣品池光吸收成正比例，再接雙通道A/D轉(zhuǎn)換器， A/D轉(zhuǎn)換器輸出的數(shù)字信號；由控制器連接A/D轉(zhuǎn)換器的控制端和輸出端、并連接上位電腦 工作站的接口通信端；電腦工作站進行數(shù)據(jù)傳輸接收、屏幕繪譜、參數(shù)分析、譜圖編輯、數(shù)據(jù) 保存等工作。 由紫外光源產(chǎn)生的兩束單色光結(jié)構(gòu)是在紫外光源內(nèi)部出口處設(shè)有光路選擇裝 置，該裝置由步進電機和遮光片組成，遮光片上開有(4對)窗口，在窗口上裝有聚光透鏡， 會聚后的光射入濾光片；對數(shù)放大器輸出的兩路電信號輸入到A/D轉(zhuǎn)換器； 本實用新型以朗伯_比爾定律為依據(jù)，在光源設(shè)計、光路設(shè)計、模擬放大、對數(shù)放 大、A/D轉(zhuǎn)換、數(shù)字控制、嵌入式技術(shù)以及電腦工作站等方面使用全新設(shè)計理念。經(jīng)過長時 間研究、試驗和用戶使用，完成了"雙波長核酸蛋白檢測儀"和電腦軟件工作站的研制，配上 層析柱、恒流泵、部分收集器等部件，構(gòu)成了完整的"雙波長核酸蛋白層析分離系統(tǒng)"。該系 統(tǒng)實現(xiàn)了 IJ及光度A和透過率T嚴(yán)格符合朗伯-比爾定律(A = Lg(l/T))，任意兩者(A和 T)對應(yīng)誤差小于1% ; 2、系統(tǒng)自動調(diào)整吸光度到 . OOO，透光率到100% ;[0021] 3、雙波長(如280nm和254nm)同步檢測； 4、數(shù)據(jù)采集、電腦接口 (COM 口和USB接口 )和軟件工作站，檢測、采集、軟件工作 站一體化系統(tǒng)集成； 5、層析分析軟件具有數(shù)據(jù)采集、實時描譜、分析參數(shù)、保存、打印、編輯功能； 6、分析參數(shù)有峰高、峰寬、峰面積、歸一化、保留時間、面積含量、純度、層析柱分辯 率等； ( 二 )由朗伯 一 比爾定律可知，組分在不同波長下的吸光度值A(chǔ)( A )，只與該組分 下得消光系數(shù)K(A)有關(guān)，即<formula>formula see original document page 6</formula>[0026] 此比值為一常數(shù)。用兩種(如280nm、254nm)或兩種以上波長對樣品池液體的吸 光度進行同步檢測并進行繪制，得到信息更加豐富的雙波長或多波長層析譜。本實用新型 用雙波長(如280nm和254nm)進行同步實時檢測，在得到的雙波長圖譜中進行運算(用 280nm吸光度除以254nm吸光度)，就得到蛋白、核酸純度圖譜?？梢灾滥睦锸羌兊鞍?比 值大于1. 7)，哪里是純核酸(比值小于0. 5)。 圖3為血紅蛋白和核黃素混合樣品溶液2mg，層析柱長20cm，內(nèi)徑1. Ocm，固定相為 葡聚糖凝膠G25，用0. 05mol磷酸緩沖液洗脫得到的層析圖譜。由于血紅蛋白和核黃素分子 量不同(血紅蛋白分子量大于核黃素分子量)，在層析柱的停留時間將不同。第一個峰為血 紅蛋白組分，第二峰為核黃素組分，可以看到兩組分已完全分離。 圖4是在圖3基礎(chǔ)上進行比值運算(用280nm(淺色)吸光度除以254nm(深色) 吸光度(黑色)曲線，即A280/A254)后得到的純度譜。文獻指出純度譜中比值大于1.7 部分純蛋白，比值小于0. 5部分為純核酸。因此，樣品里血紅蛋白組分純度較高，核黃素組 分蛋白純度較低。
權(quán)利要求多波長核酸蛋白層析分離和檢測裝置，由控制器、紫外光源、干涉濾光片分光、樣品池、光電管，信號放大器，對數(shù)轉(zhuǎn)換器，A/D轉(zhuǎn)換器構(gòu)成，其特征是采用雙通道A/D轉(zhuǎn)換器，所述紫外光源是經(jīng)兩干涉濾光片分光后成不同波長的兩束單色光的紫外光源，兩束單色光通過光路和狹縫射到樣品池后分別透射到光電管上，光電管經(jīng)光電轉(zhuǎn)換器得到兩路與透射光強度成正比例的電信號，所述電信號接信號放大器進行信號放大，并接對數(shù)轉(zhuǎn)換器進行信號對數(shù)轉(zhuǎn)換，對數(shù)轉(zhuǎn)換得到的信號與樣品池光吸收成正比例，再連接雙通道A/D轉(zhuǎn)換器，雙通道A/D轉(zhuǎn)換器輸出數(shù)字信號；由控制器連接A/D轉(zhuǎn)換器的控制端和輸出端、并連接上位電腦工作站的信號處理的接口通信端。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多波長核酸蛋白層析分離和檢測裝置，其特征是光源產(chǎn)生的 兩束單色光結(jié)構(gòu)是在紫外光源內(nèi)部出口處設(shè)有光路選擇裝置，該裝置由步進電機和遮光 片組成，遮光片上開有4對窗口 ，分別對應(yīng)著兩種波長的單色光輸出，在窗口上裝有聚光透 鏡，會聚后的光射入濾光片；對數(shù)放大器輸出的兩路電信號輸入到A/D轉(zhuǎn)換器；設(shè)有步進電 機帶動遮光片旋轉(zhuǎn)，分別在光路中輸出兩種波長的單色光。
專利摘要多波長核酸蛋白層析分離和檢測裝置，由控制器、紫外光源、干涉濾光片分光、樣品池、光電管、信號放大器、對數(shù)轉(zhuǎn)換器、A/D轉(zhuǎn)換器構(gòu)成，采用雙通道A/D轉(zhuǎn)換器，所述紫外光源是經(jīng)兩干涉濾光片分光后成不同波長的兩束單色光的紫外光源，兩束單色光通過光路和狹縫射到樣品池后分別透射到光電管上，光電管經(jīng)光電轉(zhuǎn)換器得到兩路與透射光強度成正比例的電信號，所述電信號接信號放大器進行信號放大，并接對數(shù)轉(zhuǎn)換器進行信號對數(shù)轉(zhuǎn)換，對數(shù)轉(zhuǎn)換得到的信號與樣品池光吸收成正比例，再連接雙通道A/D轉(zhuǎn)換器，雙通道A/D轉(zhuǎn)換器輸出數(shù)字信號；由控制器連接A/D轉(zhuǎn)換器的控制端和輸出端、并連接上位電腦工作站的信號處理的接口電路。
文檔編號G02B7/00GK201449370SQ20092004452
公開日2010年5月5日 申請日期2009年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月4日
發(fā)明者徐順利 申請人:南京大學(xué)