專利名稱：一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)臨床上使用的檢測方法，確切地說是一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖 核酸碎片及膜完整性的方法。
背景技術(shù)：
精子膜完整性與精子代謝、頂體反應(yīng)、精子獲能及精卵融合密切相關(guān)，測定精子膜 是否完整可以準(zhǔn)確地反映精子功能并預(yù)測精子潛在受精能力。自1984年建立精子尾部低 滲腫脹實(shí)驗(yàn)測定人精子膜功能以來，精子尾部低滲腫脹實(shí)驗(yàn)已成為目前不多的幾個(gè)評價(jià)精 子膜功能的檢測方法之一，越來越廣泛地運(yùn)用于男性生殖避孕的基礎(chǔ)研究和不育的臨床診 治中。細(xì)胞的物質(zhì)交換和新陳代謝活動(dòng)依靠細(xì)胞膜進(jìn)行，精子在男、女性生殖道中極易受到 各種化學(xué)物質(zhì)影響，精子膜對這些物質(zhì)的傳遞能力直接影響精子的活力和新陳代謝，從而 關(guān)系到能否獲能，完成受精的全過程。因此，評價(jià)精子膜功能在精子功能檢測中具有重要意 義。但是，單純的精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)只能確定一個(gè)精子膜是否完整，而不能鑒別其DNA是否 完整，而僅單純檢測精子膜的完整性，而不檢測精子脫氧核糖核酸碎片的完整性還不能準(zhǔn) 確地判斷精子的活性，因此，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方法難以準(zhǔn)確判斷出同一條精子的膜及DNA是否 有損傷，即難以對精子的質(zhì)量作出精確的評價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是提供了一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方 法，它可解決現(xiàn)上述技術(shù)存在的問題，它是將精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)與精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)兩 個(gè)實(shí)驗(yàn)有機(jī)地結(jié)合在一起，其優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)顯示同一條精子其膜是否完整及染色質(zhì)是否 完整，可輔助人們精確判斷精子的質(zhì)量。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖核酸碎片 及膜完整性的方法，其步聚如下
Φ制備低滲液
低滲液為每IOOml蒸餾水中含0. 735g檸檬酸鈉和1. 35g果糖，滲透壓是150m0sm的溶
液；
Θ制備伊紅-吉姆薩染液
向每IOOml的0. 9%的生理鹽水中加入0. 5g伊紅和0. Ig吉姆薩，混勻，使其充分溶解， 配成染液，再用雙層濾紙過濾，所得濾液即伊紅_吉姆薩染液，伊紅_吉姆薩染液置于22°C 室溫內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br> ③單純精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)向每Iml步驟①中所述的低滲液中加入0. Iml精液，混勻，在水溫為37°C的水中水浴
30分鐘后，得低滲處理后精液，觀察200個(gè)精子，計(jì)算尾部腫脹的精子比率；
Φ取Iml步驟 中所述的低滲處理后精液，用離心機(jī)以1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心處理5
分鐘，靜置分層后，棄上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸鹽緩沖液稀釋到10X106/ml ；
S取0. 2ml步驟③中所述的稀釋精液與瓊脂凝膠按體積比1 :1比例混勻后，放置在離
心管內(nèi)，在室溫37 °C條件下孵育5分鐘得配制精液；
吸取50 1步驟G中所述的配制精液置入載玻片上，加蓋蓋玻片，在環(huán)境溫度4°C的
條件下放置4分鐘；所述載玻片是表面設(shè)有干燥的瓊脂層的載玻片；
CD將步驟 中所述的載玻片去除蓋玻片，在室溫22 °C條件下放入摩爾濃度為
0. 081mol/L的HCl溶液內(nèi)浸泡7分鐘；
在22°C室溫下向步驟Θ所述的載玻片上加入50 1的0. 4mol/L的三羥甲基氨基甲 烷，50 1的0. 8mol/L的二硫蘇糖醇和50 1的1% (重量)的磺化琥珀酸N —月桂基單酰 胺二鈉鹽，上述三種溶液混合將載玻片浸泡5分鐘，浸泡5分鐘后的載玻片制成標(biāo)本片；
將步驟 中所述的標(biāo)本片用緩沖液沖洗2分鐘，所述緩沖液中各物質(zhì)含量為三羥
甲基氨基甲烷0. 09mol/L和乙二胺四乙酸0. 002mol/L ；
將所述標(biāo)本片分別放入70%、90%和100%的乙醇中各脫水2分鐘；
經(jīng)步驟③脫水后的標(biāo)本片在空氣中自然干燥后加入染液染色，在顯微鏡下觀察結(jié)^ ο為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，還可以采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)步驟①中所述的蒸
餾水是雙蒸水。步驟Q中所述的染液是4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚，加入染色后在日本產(chǎn) 型號Nikon-ElOOO的熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。步驟2中所述的染液是瑞-吉氏染液，加入
染色后在自然光顯微鏡下觀察精子。步驟 中所述的載玻片按以下方法制作先用瓊脂澆 制于載玻片表面，再在80°C的環(huán)境下將其表面的瓊脂干燥。步驟Φ中所述的低滲液的離子 強(qiáng)度為0. 15。步驟 中所述的離心管是1. 5ml的離心管。本發(fā)明的有益效果在于它將精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)與精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)合起來 進(jìn)行，共測定42例正常生育男性得出與單獨(dú)應(yīng)用精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)不同的結(jié)論，即精子在 低滲溶液里進(jìn)行腫脹實(shí)驗(yàn)后，接著進(jìn)行精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，得到的精子形態(tài)變化及DNA改變共有4種類型(A-D)，其中A型精子是精子膜與染色質(zhì)均完整的，精子是具有活動(dòng)能力 或是活的，B型精子是具有大光暈或中光暈而尾部未腫脹的精子，即精子尾部膜損傷，我們 觀察到這種精子是有活動(dòng)能力的精子；如果單純用精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)判斷，結(jié)果這種B型 精子就是死的或沒有活動(dòng)能力的精子；而C型精子是尾部腫脹而具有小光暈或無光暈的精 子，這種精子在單純精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)里就判斷為活動(dòng)的精子，因?yàn)榫游材な悄[脹的，即 完整的。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了單純精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)對于判斷精子活動(dòng)能力和膜的完 整性是不完全的，對于A型精子和D型精子，單純精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)和精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)/ 精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)判斷結(jié)果是一致的，即A型精子是活動(dòng)的和頭膜_尾膜完整 的精子，D型精子是DNA和膜均損傷的精子，是死亡的精子，但對B型精子，單純精子低滲腫 脹實(shí)驗(yàn)只能判斷其為死精子，實(shí)際上這種精子是活精子，而對C型精子的判斷，單純精子低 滲腫脹實(shí)驗(yàn)則判斷為活精子，實(shí)際上這種精子是死精子，應(yīng)用精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)/精子染 色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，就能對這些精子做出正確判斷。精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)/精子染色質(zhì) 擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)即H0S/SCD結(jié)合實(shí)驗(yàn)，精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)即H0S，精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)即 SCD。
* P<0. 01及** P<0. 001，與單純HOS實(shí)驗(yàn)比較。


圖1是單純S⑶顯示大光暈及中光暈的精子的圖橡，標(biāo)注為(S⑶+)；圖2是進(jìn) 行H0S/SCD結(jié)合實(shí)驗(yàn)后的圖像，其中1號精子為小光暈而尾部不腫脹的精子，即D型精 子，2號精子是無光暈的精子，3、4和5號精子是具有大光暈且尾部腫脹的精子，標(biāo)注為 (SCD+)-(HOS+)；圖3是精子具有大光暈且尾部腫脹的精子的圖像；圖4是具有大光暈而 尾部未腫脹的精子的圖像；圖5是具有中光暈且尾部腫脹的精子的圖像；圖6是精子具有 中光暈且尾部未腫脹的精子的圖像；圖7是具有小光暈且尾部腫脹的精子的圖像；圖8是 具有小光暈且尾部未腫脹的精子的圖像；圖9是無光暈而尾部腫脹的精子的圖像；圖10是 無光暈尾部也未腫脹的精子的圖像；圖11是雙頭精子且尾部為腫脹的圖像；圖12是針尖 頭樣精子且尾部未腫脹的圖像；圖13是無光暈而尾部腫脹的退化的精子的圖像；圖14是 無光暈尾部也不腫脹的精子的圖像。上述圖像都是在顯微鏡下放大1000倍所觀察到的。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其特征在于其步聚如下 +Φ制備低滲液
低滲液為每IOOml蒸餾水中含0. 735g檸檬酸鈉和1. 35g果糖，滲透壓是150m0sm的溶
液；
S)制備伊紅-吉姆薩染液
向每IOOml的0. 9%的生理鹽水中加入0. 5g伊紅和0. Ig吉姆薩，混勻，使其充分溶解， 配成染液，再用雙層濾紙過濾，所得濾液即伊紅_吉姆薩染液，伊紅_吉姆薩染液置于22°C 室溫內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br> 單純精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)
向每Iml步驟Φ中所述的低滲液中加入0. Iml精液，混勻，在水溫為37°C的水中水浴
30分鐘后，得低滲處理后精液，觀察200個(gè)精子，計(jì)算尾部腫脹的精子比率；
Φ取Iml步驟③中所述的低滲處理后精液，用離心機(jī)以1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心處理5
分鐘，靜置分層后，棄上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸鹽緩沖液稀釋到10X106/ml ；
取0. 2ml步驟Φ中所述的稀釋精液與瓊脂凝膠按體積比1 :1比例混勻后，放置在離
心管內(nèi)，在室溫37 °C條件下孵育5分鐘得配制精液；
吸取50 1步驟 中所述的配制精液置入載玻片上，加蓋蓋玻片，在環(huán)境溫度4°C的
條件下放置4分鐘；所述載玻片是表面設(shè)有干燥的瓊脂層的載玻片；
①將步驟 中所述的載玻片去除蓋玻片，在室溫22 °C條件下放入摩爾濃度為
0. 081mol/L的HCl溶液內(nèi)浸泡7分鐘；
在22°C室溫下向步驟Θ所述的載玻片上加入50 1的0. 4mol/L的三羥甲基氨基甲 烷，50 1的0. 8mol/L的二硫蘇糖醇和50 1的1% (重量)的磺化琥珀酸N —月桂基單酰 胺二鈉鹽，上述三種溶液混合將載玻片浸泡5分鐘，浸泡5分鐘后的載玻片制成標(biāo)本片；
③將步驟 中所述的標(biāo)本片用緩沖液沖洗2分鐘，所述緩沖液中各物質(zhì)含量為三羥
甲基氨基甲烷0. 09mol/L和乙二胺四乙酸0. 002mol/L ；
將所述標(biāo)本片分別放入70%、90%和100%的乙醇中各脫水2分鐘；
Q經(jīng)步驟Θ脫水后的標(biāo)本片在空氣中自然干燥后加入染液染色，在顯微鏡下觀察結(jié)^ O 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)500個(gè)精子，觀察精子光暈大小及尾部腫脹情況。分為大、中、 小和無光暈4個(gè)等級(A-D)。
A型尾腫脹(H0S+)而具有大光暈或中光暈(SCD+)的精子，判斷為尾膜及DNA均 完整的精子，(SCD+) — (H0S+)。B型尾不腫脹(H0S-)而具有大光暈或中光暈(SCD+)的精子，判斷為尾膜損傷而 DNA均完整的精子，(SCD+) — (H0S-)。C型尾腫脹(H0S+)而具有小光暈或無光暈的精子，判斷為尾膜完整而DNA損傷 的精子，(SCD-)-(HOS+)。D型尾不腫脹(H0S-)而具有小光暈或無光暈的精子，判斷為尾膜及DNA均損傷 的精子，判斷為尾膜一頭膜均損傷的精子，(SCD -)-(H0S -)。小光暈以<精子頭直徑四分之一為判斷標(biāo)準(zhǔn)；中光暈>精子頭直長四分之一，而 <精子頭直徑三分之二 ；大光暈>精子頭直徑三分之二。步驟 中所述的蒸餾水是雙蒸水。若步驟《3中所述的染液是4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚，則加入染色后，在日本產(chǎn)型 號Nikon-ElOOO的熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，其觀察效果較好。若步驟Q中所述的染液是瑞-吉氏染液，則加入染色后在自然光顯微鏡下觀察精 子，其觀察效果較好。步驟 中所述的載玻片按以下方法制作先用瓊脂澆制于載玻片表面，再在80°C 的環(huán)境下將其表面的瓊脂干燥。步驟 中所述的低滲液的離子強(qiáng)度為0. 15。
步驟 中所述的離心管是1. 5ml的離心管。 所述的0. 9%的生理鹽水是，稱取0. 9克氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，再用蒸餾水 稀釋到100毫升。 本發(fā)明未詳盡描述的技術(shù)內(nèi)容均為公知技術(shù)。
8
權(quán)利要求
一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其特征在于其步聚如下制備低滲液低滲液為每100ml蒸餾水中含0.735g檸檬酸鈉和1.35g果糖，滲透壓是150mOsm的溶液；制備伊紅 吉姆薩染液向每100ml的0.9%的生理鹽水中加入0.5g伊紅和0.1g吉姆薩，混勻，使其充分溶解，配成染液，再用雙層濾紙過濾，所得濾液即伊紅 吉姆薩染液，伊紅 吉姆薩染液置于22℃室溫內(nèi)保存?zhèn)溆?；單純精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)向每1ml步驟中所述的低滲液中加入0.1ml精液，混勻，在水溫為37℃的水中水浴30分鐘后，得低滲處理后精液，觀察200個(gè)精子，計(jì)算尾部腫脹的精子比率；取1ml步驟中所述的低滲處理后精液，用離心機(jī)以1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心處理5 分鐘，靜置分層后，棄上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸鹽緩沖液稀釋到10×106/ml；取0.2ml步驟中所述的稀釋精液與瓊脂凝膠按體積比11比例混勻后，放置在離心管內(nèi)，在室溫37℃條件下孵育5分鐘得配制精液；吸取50 l步驟中所述的配制精液置入載玻片上，加蓋蓋玻片，在環(huán)境溫度4℃的條件下放置4分鐘；所述載玻片是表面設(shè)有干燥的瓊脂層的載玻片；將步驟中所述的載玻片去除蓋玻片，在室溫22℃條件下放入摩爾濃度為0.081mol/L的HCl溶液內(nèi)浸泡7分鐘；在22℃室溫下向步驟所述的載玻片上加入50 l 的0.4mol/L的三羥甲基氨基甲烷，50 l的 0.8mol/L的二硫蘇糖醇和50 l的1%(重量)的磺化琥珀酸N－月桂基單酰胺二鈉鹽，上述三種溶液混合將載玻片浸泡5分鐘，浸泡5分鐘后的載玻片制成標(biāo)本片；將步驟中所述的標(biāo)本片用緩沖液沖洗2分鐘，所述緩沖液中各物質(zhì)含量為三羥甲基氨基甲烷0.09mol/L和乙二胺四乙酸0.002mol/L；將所述標(biāo)本片分別放入70%、90%和100%的乙醇中各脫水2分鐘； 經(jīng)步驟脫水后的標(biāo)本片在空氣中自然干燥后加入染液染色，在顯微鏡下觀察結(jié)果。2010102497415100001dest_path_image002.jpg,2010102497415100001dest_path_image004.jpg,dest_path_image006.jpg,496291dest_path_image002.jpg,dest_path_image008.jpg,773558dest_path_image006.jpg,dest_path_image010.jpg,892824dest_path_image008.jpg,2010102497415100001dest_path_image012.jpg,459328dest_path_image010.jpg,2010102497415100001dest_path_image014.jpg,546101dest_path_image012.jpg,2010102497415100001dest_path_image016.jpg,2010102497415100001dest_path_image018.jpg,2010102497415100001dest_path_image020.jpg,2010102497415100001dest_path_image022.jpg,2010102497415100001dest_path_image024.jpg,2010102497415100001dest_path_image026.jpg,417937dest_path_image024.jpg
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其 特征在于步驟S中所述的蒸餾水是雙蒸水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其 特征在于步驟S中所述的染液是4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚，加入染色 后在日本產(chǎn)型號 Nikon-ElOOO的熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其 特征在于步驟Θ中所述的染液是瑞-吉氏染液，加入染色后在自然光顯微鏡下觀察精子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其特征在于步驟 中所述的載玻片按以下方法制作先用瓊脂澆制于載玻片表面，再在 80°C的環(huán)境下將其表面的瓊脂干燥。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其 特征在于步驟Φ中所述的低滲液的離子強(qiáng)度為0. 15。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其 特征在于步驟③中所述的離心管是1. 5ml的離心管。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時(shí)檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其步聚如下①制備低滲液；②制備伊紅-吉姆薩染液；③單純精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)；④離心處理步驟③中所述的低滲處理后精液，棄上清液，并稀釋；⑤將步驟④中所述的稀釋精液與瓊脂凝膠按比例混勻后，進(jìn)行孵育5分鐘得配制精液；⑥將步驟⑤中所述的配制精液置入載玻片上；⑦將所述的載玻片在HCl溶液內(nèi)浸泡；⑧向所述的載玻片上加入三羥甲基氨基甲烷、二硫蘇糖醇和磺化琥珀酸N－月桂基單酰胺二鈉鹽浸泡成標(biāo)本片；⑨將步驟⑧中所述的標(biāo)本片用緩沖液沖洗；⑩將所述標(biāo)本片脫水； 經(jīng)步驟⑩脫水后的標(biāo)本片干燥后加入染液染色。
文檔編號G02B21/34GK101907620SQ20101024974
公開日2010年12月8日 申請日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者張麗紅, 王磊光, 邱毅 申請人:山東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所