專利名稱：實施分析反應的基材的制作方法
實施分析反應的基材本申請是優(yōu)先權日為2006年6月12日且發(fā)明名稱為“實施分析反應的基材”的 中國發(fā)明專利申請200780021826. 4(國際申請?zhí)朠CT/US2007/070901)的分案申請。相關申請的交叉引用本申請依據(jù)35U. S. C. § 119(e)要求 2006 年 6 月 12 日提交的 U. S. S. N. 60/812，863 的權利，在此明確地通過弓I用將其全部內容并入本文。關于聯(lián)邦贊助研究的聲明本發(fā)明的一部分是借助政府支持利用NHGRI撥款No. RO1-HG003710-01做出的，并 且政府對本發(fā)明享有一些權利。
背景技術：
各種不同的科學學科在生物研究領域中的應用在生物體系表征和監(jiān)控方面以及 生物紊亂處理方面產(chǎn)生了巨大進展。特別地，固態(tài)電子學技術與生物研究應用的結合取得 了很多重要進展，包括例如分子陣列技術，即DNA陣列(參見美國專利No. 6，261，776)、微流 體芯片技術(參見美國專利No. 5，976，336)、化學敏感場效應晶體管(ChemFET)，以及其它 有價值的傳感器技術。零模式波導(ZMW)技術使這些半導體制造技術進一步擴展到研究和診斷的不同 領域。特別地，ZMW陣列用于一系列生物化學分析，并特別用于基因分析領域。ZMW典型地 包含位于透明基材上的不透明包覆層中的開口、井洞或納米尺度芯部。由于芯部的狹窄尺 度，因此將始終阻止頻率高于特定截止頻率的電磁輻射傳播穿過該芯部。盡管如前所述，輻 射將穿過有限距離而進入芯部，并在芯部內提供非常小的輻照體積。通過輻照非常小的體 積，有可能訪問(interrogate)極少量的反應物，包括例如單分子反應。通過在單分子水平監(jiān)控反應，能夠精確地識別和/或監(jiān)控給定的反應。這是特別 有前景的單分子DNA排序技術領域的基礎，該技術通過單聚合酶(polymerase enzyme)以 模板依賴方式進行DNA鏈的分子合成來監(jiān)控分子。盡管取得了前述的進涉，然而仍存在很多另外的改進和進展。本發(fā)明提供了很多 這樣的改進和進展。發(fā)明概述本發(fā)明一般針對于用于化學和生物化學分析的基材的配置和/或制造中的改進， 且特別針對于在這樣的基材中制造有光學特征的基材，例如零模式波導(ZMW)。第一方面，本發(fā)明提供了一種零模式波導基材，所述基材包含具有至少第一表面 的透明基材層，位于透明基材層的第一表面之上的金屬包覆層和穿透該包覆層到達透明基 材層的孔，并形成由金屬包覆層包圍的芯部區(qū)域，其中設定該芯部的尺度以阻止頻率高于 截止頻率的電磁輻射傳播穿透整個芯部?；倪€包括位于包覆層上的犧牲陽極。相關聯(lián)地，本發(fā)明提供了監(jiān)控反應的方法，包括在包含金屬包覆層的零模式波導 的芯部中提供反應混合物，其中零模式波導包括犧牲陽極，并監(jiān)控芯部的輻照體積內的反 應混合物。另一方面，本發(fā)明提供了一種零模式波導基材，所述基材包含透明基材層、不透明
3包覆層和芯部，包含穿透包覆層并至少部分延伸到透明基材層內的孔。


圖1提供了位于基材上的零模式波導(ZMW)的示意性圖解。圖2提供了包括犧牲陽極層的ZMW的示意性圖解。圖3提供了包括在透明基材層內的增加體積區(qū)域的ZMW的示意性圖解。圖4提供了圖3所示的ZMW的示例性制造過程。圖5顯示了制造圖3所示的ZMW的替代性示例制造過程。圖6為包括凹陷表面的ZMW的對比優(yōu)勢的示意性圖解。發(fā)明詳述本發(fā)明一般針對于用于化學和生物化學分析的基材的配置和/或制造中的改進， 且特別針對于在這樣的基材中制造有光學特征的基材，例如零模式波導(ZMW)。在本發(fā)明的上下文中，分析基材一般包含剛性或半剛性固體基材，典型地在整個 配置中基本是平面的，使用相關檢測系統(tǒng)例如熒光顯微鏡、光學成像系統(tǒng)或電信號檢測系 統(tǒng)可以在該基材上進行并監(jiān)控感興趣的反應。典型地，這樣的基材可具有制造于基材內或 位于基材的表面上的附加功能部件。這樣的部件包括例如分子部件，如分子連接部分，例如 抗體、核酸非特異性化學偶聯(lián)基團、結合肽等，或者性能改變基團例如疏水或親水基團，以 便在基材上提供相對疏水或親水的區(qū)域。同樣地，該基材可以具有制造于基材上或基材中 的結構部件，包括例如屏障、井洞、柱體、柱狀物、溝道、槽、電接觸部、掩模層、包覆層等。根據(jù)本發(fā)明提供的特定解決方案的需要，本發(fā)明一般可以應用于一系列不同的基 材類型。例如，第一方面，本發(fā)明提供了包含設置于其中的零模式波導(ZMW)陣列的基材。 典型地，ZMW的特征在于包圍芯部部件的包覆部件，其中設定芯部的尺度，以使進入芯部中 的電磁能量的頻率低于特定閾值或截止頻率，并被阻止完全傳播穿透該芯部。結果，在芯部 的這種電磁能量的方向僅在芯部的一部分內產(chǎn)生極小的輻照區(qū)域。在將芯部提供作為由包 覆層界定的開放體積時，結果是在芯部內能夠輻照極小的體積。能夠輻射極小的體積，例如 化學或生物化學反應物的體積，在很多應用中特別有價值。在美國專利No. 6，917，726中描 述了這些ZMW陣列，及其制造和用途，出于所有目的將其整體并入本文。零模式波導典型地包括從約IOnm到約250nm的橫截面尺度，并優(yōu)選具有從約20nm 到約IOOnm的橫截面尺度。ZMW的橫截面典型為圓形，然而其也可以具有狹長結構，例如 橢圓、橢球、狹縫、凹槽或其它非圓形形狀。本文討論的零模式波導的芯部的深度典型地至 少部分由包覆層的厚度限定，其厚度的典型范圍從約25nm到約500nm，且優(yōu)選約50nm到約 200nm的厚度。依據(jù)所需的應用，可以從可用深度的整個范圍中選擇所需的深度。通常將本發(fā)明的零模式波導制造在基材中，該基材包括沉積于透明基材上的透明 基材層和不透明的包覆層。波導的芯部部分包含穿透包覆層到達透明層的孔，以限定具有 開放的上端和被透明基材封閉的下端的井洞。圖1顯示了這樣的波導的示意性圖解。如圖 所示，整個基材100包括波導芯部102，其位于不透明的包覆層104之內并且連續(xù)穿透至透 明基材層106?？梢酝ㄟ^多種方法進行ZMW的制造。然而，在優(yōu)選的方面，使用如下的分層制造策 略在透明平面基材例如玻璃、熔結氧化硅、石英、氧化鋁、透明聚合物等上提供薄金屬膜。
4通常如下進行芯部的界定在透明基材上提供適當?shù)目刮g劑(resist)層并對抗蝕劑層進 行顯影以得到作為所需波導芯部的負像的柱狀物或柱體。然后，將不透明膜例如薄金屬膜 或半導體膜層沉積在基材上以提供包覆層，并除去抗蝕劑柱狀物以在其位置產(chǎn)生由包覆層 包圍的孔或芯部。典型金屬包覆層包括可以使用常規(guī)金屬沉積技術例如濺射和/或蒸發(fā)來 制備的許多金屬膜中的任何。這樣的金屬包括鋁、金、鉬、鉻等及其組合，例如多層沉積物。 半導體包覆層還可用于各種應用中，并包括例如可以使用例如氣相沉積而沉積于基材上的 各種III-V族、IV族和/或II-VI族半導體中的任何?？梢酝ㄟ^半導體制造領域已知的各種方法進行抗蝕劑柱狀物的界定，包括例如光 刻法、電子束平版印刷(e-beam lithography)技術，納米壓印平版印刷等。在至少第一方面，零模式波導的整體結構可以并入附加功能體(functionality)， 在優(yōu)選情形中，該附加功能體作為附加層施加于整個基材。如上所述，優(yōu)選的零模式波導包含位于透明基材材料上的金屬包覆層。在將這樣 的金屬化基材用于化學和/或生物化學操作時，基材將不可避免地暴露于可能略微損害金 屬的環(huán)境中，包括例如相對高鹽濃度和/或非中性PH的環(huán)境，例如酸性或堿性條件。所有這 些因素增加了這樣的材料易于腐蝕的趨勢。特別地，將這些金屬部件暴露于高鹽環(huán)境中可 能產(chǎn)生電化腐蝕的機會。相應地，在至少一方面，本發(fā)明提供一種零模式波導基材，該基材 包括作為基材部件的犧牲或電蝕(galvanic)陽極。這樣的電蝕陽極可以是基材的一部分， 例如作為一部分或作為分離層沉積在基材上，或可以將其作為獨立部件添加到反應混合物 中，例如作為顆粒、條帶或絲線?？梢允褂酶鞣N不同金屬中的任何作為電蝕陽極，包括例如 鋅、鎂、鋁、鐵、鎳、或可以充當下方包覆層金屬的犧牲陽極的任何其它金屬。應理解，最佳金 屬陽極層的選擇可以在某種程度上取決于下方包覆層的構成(make-up)。另外，由于裝置所 暴露的環(huán)境會根據(jù)應用所需而變化，因此金屬的還原電勢將不同于它們的標準值。因此，多 種材料可以用作犧牲陽極。對于具有半電池電勢X(在所用的條件下)的包覆層材料，以及 具有半電池電勢Y的陽極材料，若Y小于X，則金屬可以用作犧牲陽極。在某些情形中，包覆 層材料或陽極材料或它們兩者都將自發(fā)地改變至具有新的半電池電勢X’和Y’的另一表面 態(tài)，并且若Y’小于X’，則這些材料可以用作犧牲陽極。在犧牲陽極材料的性能中優(yōu)選的材 料包括鎂、鋅、鈹、鎘、鈾、鋁、銦、錫、鉛、鐵、鎳、銅、鉻、鉭和鎢。在特別優(yōu)選的方面，鋅層與 金屬包覆層一起沉積或沉積于金屬包覆層之上?？梢允褂酶鞣N金屬膜沉積技術在包覆層上 提供陽極層，包括濺射、蒸發(fā)、等離子體氣相沉積等。在相關實施方案中，可以通過位于陽極層和包覆層之間的非導電層使附加層與包 覆層電絕緣。在該實施方案中，可以直接對陽極層施加電勢，由此去除陽極材科具有特定還 原電勢的限制。在該實施方案中，本發(fā)明提供與包覆層的電接觸部，以及與陽極層的獨立電 接觸部?？梢栽趩为毑襟E中施加非導電層，或者其可以是待施加的其它材料之一的自然氧 化物。例如，鋁的自然氧化物是不導電的，并且本領域已知在導電鋁層上形成氧化鋁絕緣層 的方法。在上述制造過程的情形中，一般可以將鋅層與金屬包覆層共沉積或作為后續(xù)層沉 積在金屬包覆層之上。一旦去除抗蝕劑柱狀物，將穿透電蝕陽極和金屬包覆層設置波導芯 部。典型地，陽極層將為約0. Inm到約IOOnm厚，優(yōu)選從約Inm到約IOOnm厚，從約Inm到 約50nm厚，且在某些情形中從約IOnm到約50nm厚。在圖2中顯示了根據(jù)本發(fā)明此方面的波導基材的實施例。如圖所示，并參考圖1，整個ZMW裝置200同樣包括位于包覆層104中 的芯部102，該芯部進而位于透明基材106的表面上。然而，除前述之外，犧牲陽極層208位 于包覆層104的上表面上，并用于防止應用期間金屬包覆層的過度電化腐蝕。在替代方面中，可以不按標準沉積工藝將分立的陽極部件添加到波導陣列。特別 地，可以將合適的金屬顆粒、條帶等沉積于波導陣列上，只要其具有足夠的尺寸例如足夠大 或足夠小，以致不影響波導的功能，例如阻塞過多數(shù)目芯部的開口。在另一替代性的結構配置中，零模式波導在芯部的末端具有越過包覆層延伸到透 明基材中的空間或體積。特別地，通過提供由芯部產(chǎn)生的體積的另外延伸，相比體積與芯部 共同延伸的零模式波導(例如圖1所示)，可以獲得很多優(yōu)勢。圖3顯示了具有這種替代性 結構的波導的實施例。如圖所示，零模式波導基材300包括穿透包覆層304的芯部302所 述包覆層304沉積于透明基材306上。該波導結構還包括凹陷308，該凹陷是芯部體積向透 明基材306內的延伸或井洞，以增加整個波導結構的體積。特別地，在包括改性的表面(例 如具有加工過的表面，該表面包括活性分子和/或連接分子和/或保護性的表面處理，即用 以抑制非特異性表面締合)的ZMW的情形中，還可以從下方基材表面進一步除去所得到的 活性表面。因此，目標反應(例如在活性表面進行的反應)將落在ZMW的最佳觀察體積的 邊緣或外部。因此，通過使下方基材表面凹陷，可以更好地將活性表面定位于觀察體積內。 圖6中示意性地顯示了該優(yōu)勢。在無凹陷的ZMW中，如圖6的畫面I所示。如圖所示，ZMW基材600包括位于包覆 層604內穿透到透明基材層606的芯部602。在ZNMW芯部602內提供由Xs608表示的活 性表面，該活性表面例如用于執(zhí)行所需的目標反應例如核酸聚合反應，并且該活性表面通 過連接體分子610與下方基材606表面偶聯(lián)。由于連接體610的尺寸以及可能的其它表面 改性，活性表面608可能位于雙察體積(由虛線612示出界限)的邊緣或外部。然而，通過 使下方基材的下表面凹陷，可以減弱這種潛在的問題。特別地，如圖6中的畫面II所示， ZMW620在芯部622的底部包括凹陷下表面624，使得活性表面608充分落在觀察體積內。 這特別提供了具有更易于調節(jié)的觀察體積的零模式波導，例如超過單獨包覆層厚度的可調 性、對位于波導下方的光學體系(optics)的更高信號水平、產(chǎn)生改善的信噪比。除了前面所述的優(yōu)勢之外，檢測區(qū)域體積的增大在統(tǒng)計檢測體積內目標分子的占 有率方面提供優(yōu)勢。在某些情況中，需要分析物在每個約束中均具有且僅具有一個被觀察 的分子。在包覆層的底部和裝置的底面處于同一位置的情形中，該約束具有隨著短的衰減 長度指數(shù)遞減的分布。結果是以下情況很罕見一個分子被定位在檢測區(qū)而第二個分子不 會存在于檢測區(qū)之上，由此對第一分子造成背景噪聲。通過降低底面，分布發(fā)生改變以模擬 階躍函數(shù)，其中裝置的一部分位于檢測區(qū)“內”，具有相對一致的觀察效率，而裝置的另一部 分位于檢測體積“外”，具有將兩個區(qū)域分隔的非常快的指數(shù)衰減。在后一情形中，隨機得到 其中一個分子位于檢測區(qū)內且沒有分子位于指數(shù)衰減區(qū)內的配置的概率大大增加。由深井 洞提供的相對一致性的附加優(yōu)勢是，單分子熒光輸出的水平對位置的依賴性較小，因此，當 由于將熒光團束縛于裝置的柔性連接體而存在一些起伏自由度時，單分子熒光輸出的水平 在時間上更均勻。透明基材306中的凹陷或井洞308典型地具有與芯部相當?shù)臋M截面尺度，例如直 徑，但也可以根據(jù)所需的應用和功能性而改變其深度。
6
可以通過很多方法制造根據(jù)發(fā)明該方面的改進的零模式波導。例如，在第一優(yōu)選 方面，在沉積金屬包覆層前，制造井洞作為ZMW制造中的附加沉積步驟。特別地，使用抗蝕 劑柱狀物的負像，將透明材料層(例如與下方透明基材具有相同或相似組成的材料)沉積 于透明基材上。然后，將金屬包覆層，和任選的任何附加層例如電蝕陽極層沉積于其上。一 旦從結構中除去柱狀物，就在包覆層中留下具有延伸到透明基材層內的額外體積的波導芯 部。圖4示意性地示出了該過程。如圖4所示，提供具有上表面402的透明基材400。然后，在表面402上沉積抗蝕 劑層404。對抗蝕劑進行曝光并顯影以產(chǎn)生所需波導芯部的負像，如柱狀體406所示。然 后，在基材的曝光表面402上沉積附加透明材料層408以建立圍繞柱狀體406的透明基材 層。透明材料在組成上優(yōu)選與下方的透明基材400相同或相似。例如，在玻璃基材的情形 中，可使用半導體制造領域中公知的各種技術中的任何技術在基材表面沉積SiO2層，所述 技術包括例如在玻璃上旋涂、等離子增強化學氣相沉積、氣相沉積硅隨后氧化成SiO2 (例如 熱氧化)。然后，在透明層408上沉積金屬包覆層410。然后，使用例如剝離(lift-off)或 “敲離(knock-off )”方法從整個基材除去抗蝕柱狀體，產(chǎn)生位于包覆層中的波導結構的開 放芯部412。此外，芯部的體積延伸到附加透明層408中，以便向芯部提供附加的體積。在替代性的工藝中，波導芯部可以用作附加刻蝕步驟中的掩模層。特別地，使用上 述工藝制造ZMW。然后，金屬包覆層充當后續(xù)刻蝕步驟的掩模層。在這種背景中，選擇所用 的刻蝕劑以及刻蝕時間以產(chǎn)生所需的刻蝕空間幾何形狀。例如，當使用各向異性反應離子 刻蝕(RIE)刻蝕基材時，所得到的要素(feature)將具有豎直的側壁且具有與包覆層中的 開口相同的俯視圖。在該情況中，現(xiàn)有技術中已知的方法為，以相對于包覆材料的良好選擇 度來刻蝕基材材料。在各向同性地進行刻蝕(使用濕法化學刻蝕或RIE)的情形中，可以控 制時間以避免導致刻蝕體積顯著大于波導尺度。作為替代或補充，可以使用更加晶態(tài)的基 材，例如石英等，其中刻蝕的各向異性程度更大而不論刻蝕條件如何，從而產(chǎn)生更受限制的 刻蝕空間。作為替代，可以使用干法刻蝕技術。圖5示意性地顯示了該工藝。如圖5所示，ZMW基材500包括穿透位于透明基材506上的金屬包覆層504的ZMW 芯部502，在本發(fā)明的該方面，透明基材包括無機材料，例如玻璃、石英或熔結氧化硅。根據(jù) 本發(fā)明的該方面，包覆層兼任后續(xù)刻蝕步驟的掩模層。特別地，將基材暴露于適當?shù)目涛g劑 (如箭頭508所示)中，刻蝕劑在芯部體積中刻蝕出附加的深度，例如陰影區(qū)508和凹區(qū)510 所示。在某些情形中，可能需要在包覆層中使用在平版印刷技術中更常規(guī)使用的金屬，例如 鉻、金等，因為它們相比其它金屬具有對較苛刻的刻蝕環(huán)境的更高容忍度，或者更好地充當 掩膜材料，提供更高分辨率特征。
權利要求
零模式波導基材，包括透明基材層；不透明包覆層；以及芯部，其包含穿透該包覆層并至少部分延伸到該透明基材層內的孔。
2.如權利要求1所述的零模式波導，其中該透明基材層包含至少第一透明層和第二透 明層，第二透明層位于第一透明層之上，且該包覆層位于第二透明層之上，其中所述孔延伸 穿透該包覆層和第二透明層。
3.如權利要求2所述的零模式波導基材，其中該包覆層包含金屬。
4.如權利要求1所述的零模式波導，還包含話性表面，所述活性表面位于芯部內并且 至少部分位于延伸到透明基材層內的部分芯部中。
5.如權利要求4所述的零模式波導，其中該活性表面包含聚合酶。
6.如權利要求1所述的零模式波導結構，其中該結構包含零模式波導的陣列。
7.如權利要求1所述的零模式波導結構，該零模式波導結構具有IOnm至250nm的橫截 面尺度。
8.如權利要求1所述的零模式波導結構，該零模式波導結構具有約20nm至IOOnm的橫 截面尺度。
9.監(jiān)控反應的方法，該方法包括i.在如權利要求1所述的零模式波導的芯部內提供反應混合物；和 .監(jiān)控該芯部的輻照體積內的反應混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種實施分析反應的基材。該基材包括為提供附加功能元件而制造的零模式波導基材和/或包括增加的體積以定位活性表面的部件和/或減輕下方基材的負面電化學特性的部件。
文檔編號G02B6/10GK101915957SQ20101025653
公開日2010年12月15日 申請日期2007年6月11日 優(yōu)先權日2006年6月12日
發(fā)明者D·B·羅伊特曼, G·奧托, M·?？? P·佩魯索, S·特納 申請人:加利福尼亞太平洋生物科學公司