專利名稱：使用同心雙錐面鏡實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微的系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種使用同心雙錐面鏡實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微的系統(tǒng)，可廣泛適用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)，生物物理以及材料化學(xué)等領(lǐng)域的研究。
背景技術(shù)：
熒光探針是指在吸收特定波長(zhǎng)的光后，可以把吸收光轉(zhuǎn)換為不同波長(zhǎng)的光發(fā)射出來的一類物質(zhì)的統(tǒng)稱。使用不同的熒光探針可以標(biāo)記樣品內(nèi)部不同的位置，從而可以用來探測(cè)樣品的微觀結(jié)構(gòu)，還可以實(shí)時(shí)觀察熒光標(biāo)記的基因及細(xì)胞在活體動(dòng)物體內(nèi)的活動(dòng)及反應(yīng)。熒光顯微技術(shù)已經(jīng)成為化學(xué)和生物樣品成像的有力工具。困擾熒光顯微技術(shù)的一個(gè)主要問題是樣品離焦部分的熒光信號(hào)帶來的背景干擾。 如何消除背景噪聲，提高顯微圖像的信噪比和分辨率是熒光顯微技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。激光共聚焦熒光顯微術(shù)和全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)是目前最常用的兩種技術(shù)方案。激光共聚焦熒光顯微利用高度聚焦的激光束對(duì)樣品逐點(diǎn)掃描成像，熒光信號(hào)經(jīng)過探測(cè)針孔濾波后被光電倍增管探測(cè)收集，通過計(jì)算機(jī)軟件可以重新組合生成一個(gè)三維圖像。激光共聚焦熒光顯微具有三維成像能力而且還具有很好的空間分辨率，但是由于它采用點(diǎn)掃描成像方式，所以它的成像速度并不快而且也容易對(duì)樣品產(chǎn)生光損傷。全內(nèi)反射(又稱全反射)是指當(dāng)光線從光密介質(zhì)進(jìn)入到光疏介質(zhì)，入射角大于臨界角時(shí)，因?yàn)闆]有折射而都是反射，故稱之為全內(nèi)反射。從幾何光學(xué)的角度來看，當(dāng)發(fā)生全反射時(shí)，光線會(huì)在玻璃界面上完全反射而不進(jìn)入液體溶液中。實(shí)際上，由于波動(dòng)效應(yīng)，有一部分光的能量會(huì)穿過界面滲透到溶液中，這部分光場(chǎng)就是所謂的衰逝波。衰逝波平行于界面?zhèn)鞑?，垂直于界面?qiáng)度指數(shù)衰減。衰逝場(chǎng)強(qiáng)度艮可表示為Ez = E0e~z/dp。其中八=(nf sin2 θ - 22)_1/2定義為衰逝場(chǎng)的穿透深度。是界面處的電場(chǎng)強(qiáng)度，λ是真空中的光波長(zhǎng)，Ii1是光密媒質(zhì)的折射率，η2是光疏媒質(zhì)的折射率。衰逝場(chǎng)的穿透深度非常小，通常只有200nm左右。細(xì)胞內(nèi)的很多重要的生命活動(dòng)過程均存在于細(xì)胞表面。全內(nèi)反射熒光顯微利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的衰逝波激發(fā)樣品，激發(fā)區(qū)域被限定在樣品表面的一薄層范圍內(nèi)OOOnm)，不受到來自樣品內(nèi)深層區(qū)域信號(hào)的干擾，因此具有極高的信噪比和對(duì)比度，近年來已被生物物理學(xué)家們廣泛應(yīng)用于單分子的熒光成像中。另外，全內(nèi)反射熒光顯微成像法不再采用掃描成像而使用CCD相機(jī)，在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得一幅完整的二維圖像，大大提高了成像速度，減少了樣品光損傷，從而成為研究細(xì)胞表面科學(xué)如生物化學(xué)動(dòng)力學(xué)、單分子動(dòng)力學(xué)的最有前途的光學(xué)成像技術(shù)。全內(nèi)反射熒光顯微成像根據(jù)其成像系統(tǒng)的不同可分為棱鏡型和物鏡型兩種。棱鏡型系統(tǒng)在實(shí)現(xiàn)上比較簡(jiǎn)單，也不容易受到入射光信號(hào)的干擾，激光經(jīng)棱鏡耦合照射在樣品與載玻片的界面處(棱鏡與載玻片之間配以折射率匹配的浸沒油)，精確調(diào)整入射角使發(fā)生全反射，熒光信號(hào)由樣品的另一面進(jìn)入顯微物鏡并被CCD探測(cè)。棱鏡型系統(tǒng)的缺點(diǎn)是樣品的位置受到棱鏡的限制，并且激發(fā)出的熒光要通過整個(gè)樣品才能被探測(cè)到，降低了成像的對(duì)比度。物鏡型系統(tǒng)中樣品的放置則非常方便，顯微鏡的物鏡既作為收集樣品熒光信號(hào)的接收器，同時(shí)又作為發(fā)生全內(nèi)反射的光學(xué)器件。且可與多種其它技術(shù)相結(jié)合，例如激光微加工，光鑷技術(shù)等，因此展現(xiàn)出更加誘人的應(yīng)用前景。由于細(xì)胞的典型折射率約為1.35，根據(jù) snell定律，要想實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射，顯微物鏡的數(shù)值孔徑NA必須大于1. 35，因此當(dāng)我們使用為 NA = 1. 4的物鏡時(shí)，只有很小的一部分物鏡孔徑范圍(1. 4-1. 35 = 0. 05)可以被利用。在實(shí)驗(yàn)中，為了保證均勻的照明，激光束通常被調(diào)制成為很細(xì)的光環(huán)進(jìn)入顯微物鏡后瞳。如圖 1所示，通常使用一個(gè)圓形擋光板擋住平行光束的中間部分，顯然，擋光板擋住了大部分照明光，所以整個(gè)系統(tǒng)的透過率很低(小于5% )，導(dǎo)致照明亮度不夠。針對(duì)現(xiàn)有物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)透過率低的缺點(diǎn)，本實(shí)用新型提出一種使用同心雙錐面鏡實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微的技術(shù)與裝置。該裝置具有光能利用率高(接近 100% )的優(yōu)點(diǎn)，并且可以方便的實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微與普通寬場(chǎng)熒光顯微的切換。
發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有的物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微方法透過率低的問題，本實(shí)用新型提供一種使用同心雙錐面鏡實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微的系統(tǒng)。本實(shí)用新型的技術(shù)解決方案為一種使用同心雙錐面鏡實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微的系統(tǒng)，包括平行光發(fā)生裝置以及依次設(shè)置在光路上的環(huán)形光束產(chǎn)生裝置、熒光激發(fā)裝置以及成像裝置，所述平行光發(fā)生裝置產(chǎn)生平行光，所述環(huán)形光束產(chǎn)生裝置設(shè)置在平行光的光路上；所述熒光激發(fā)裝置包括設(shè)置在環(huán)形光束產(chǎn)生裝置光路上的雙色鏡11、設(shè)置在雙色鏡11反射光路上的顯微物鏡12以及設(shè)置在顯微物鏡上方的載物臺(tái)13 ；所述成像裝置包括第二反射鏡15、依次設(shè)置在第二反射鏡15反射光路上的筒鏡 16、濾光片17以及CXD相機(jī)18 ；所述第二反射鏡15設(shè)置在載物臺(tái)13的正下方；其特殊之處在于所述環(huán)形光束產(chǎn)生裝置包括與平行光入射方向成45度放置的中空反射鏡6、與平行光同軸設(shè)置的凹面錐鏡7、設(shè)置在凹面錐鏡中心的凸面錐鏡8 ；所述凸面錐鏡8的軸線正對(duì)中空反射鏡6的中心；所述雙色鏡11設(shè)置在中空反射鏡6的環(huán)形光束的反射光路上并與反射光方向成 45度角。上述環(huán)形光束產(chǎn)生裝置還包括望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)，所述望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)包括設(shè)置在中空反射鏡6和雙色鏡11之間的第二透鏡9和第三透鏡10。上述平行光發(fā)生裝置包括激光器1、光纖耦合器2、多模光纖3、第一透鏡4、以及設(shè)置在第一透鏡4后的第一反射鏡5，所述中空反射鏡6設(shè)置在第一反射鏡5的反射光路上。一種使用同心雙錐面鏡實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微的方法，其特殊之處在于包括以下步驟
4[0025]1產(chǎn)生平行光束；2產(chǎn)生環(huán)形光束將平行光穿過45度設(shè)置的中空反射鏡6，垂直入射到凸面錐鏡8上，再被凸面錐鏡 8反射到凸面錐鏡8外圓周側(cè)的凹面錐鏡7上，再被凹面錐鏡7反射至中空反射鏡6，再被中空反射鏡6反射形成環(huán)形光束；3環(huán)形光束經(jīng)熒光激發(fā)裝置后對(duì)樣品進(jìn)行熒光激發(fā)；4將激發(fā)出的熒光信號(hào)成像。上述步驟3還包括全內(nèi)反射熒光顯微與寬場(chǎng)熒光顯微的切換使凸面錐鏡8沿著凹面錐鏡7的軸線方向往返移動(dòng)，調(diào)節(jié)環(huán)形光束在載物臺(tái)與被測(cè)樣品界面處的匯聚角，當(dāng)環(huán)形光束在載物臺(tái)與被測(cè)樣品界面處的匯聚角小于臨界角時(shí)為寬場(chǎng)熒光顯微；當(dāng)環(huán)形光束在載物臺(tái)與被測(cè)樣品界面處的匯聚角大于等于臨界角時(shí)，則為全內(nèi)反射熒光顯微。上述步驟2還包括環(huán)形光束發(fā)散角的調(diào)節(jié)環(huán)形光束經(jīng)過由第二透鏡9和第三透鏡10組成的望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)后入射雙色鏡。上述步驟4還包括圖像清晰度的調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)C⑶相機(jī)18的增益系數(shù)、CXD制冷溫度以及曝光時(shí)間，得到清晰的顯微圖像。上述步驟3的具體步驟如下環(huán)形光束經(jīng)過雙色鏡入射顯微物鏡，通過顯微物鏡匯聚至載物臺(tái)，通過在載物臺(tái)和被測(cè)樣品的界面處產(chǎn)生的衰逝波照射被測(cè)樣品；在衰逝波的激發(fā)下被測(cè)樣品發(fā)出熒光信號(hào)經(jīng)顯微物鏡收集后，再穿過雙色鏡11入射至第二反射鏡 15。上述步驟4的具體步驟如下入射至第二反射鏡15的熒光信號(hào)經(jīng)過筒鏡16和濾光片17進(jìn)入CXD相機(jī)18成像。本實(shí)用新型具有的優(yōu)點(diǎn)1、本實(shí)用新型使用同心雙錐面鏡產(chǎn)生環(huán)形光束并用于全內(nèi)反射熒光顯微，與普通的全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)相比，本實(shí)用新型光能幾乎為零浪費(fèi)，光能利用率高(接近 100% )，因而適用于微型的低功率半導(dǎo)體激光器作為照明光源，便于全內(nèi)反射熒光顯微系統(tǒng)的集成。2、本實(shí)用新型通過沿軸向移動(dòng)凸面錐鏡與凹面錐鏡內(nèi)的相對(duì)位置，改變平行光環(huán)光場(chǎng)的占空比，也就是改變環(huán)形光束在載物臺(tái)與被測(cè)樣品界面處的匯聚角，從而可以方便地實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微與寬場(chǎng)熒光顯微的切換。全內(nèi)反射熒光顯微只能觀察到界面處非常薄的一層樣品發(fā)出的熒光，信噪比非常高；而寬場(chǎng)顯微雖然信噪比較低，但是它可以深入到樣品內(nèi)部觀察，比較方便。通常在進(jìn)行全內(nèi)反射熒光顯微實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，都需要進(jìn)行同一位置寬場(chǎng)顯微圖像的對(duì)比。如圖4和圖5所示。3、本實(shí)用新型所使用的激光功率密度很低，對(duì)生物組織的破壞以及激光漂白效應(yīng)非常小。首先，與點(diǎn)掃描的激光共聚焦技術(shù)相比，全內(nèi)反射熒光顯微是一種寬場(chǎng)顯微技術(shù)， 寬場(chǎng)顯微技術(shù)本身就具有弱的光漂白以及光損傷效應(yīng)；另外，本實(shí)用新型使用同心雙錐面鏡產(chǎn)生環(huán)形光束，透過率接近100%，因此可以使用低功率的激光器，進(jìn)一步減小了光損傷的可能性。
圖1是現(xiàn)有的使用擋光板產(chǎn)生環(huán)形光束的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本實(shí)用新型使用同心雙錐面鏡產(chǎn)生環(huán)形光束示意圖；圖3是本實(shí)用新型使用同心雙錐面鏡實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微的系統(tǒng)光路圖；附圖標(biāo)記為1-激光器，2-光纖耦合器，3-多模光纖，4-第一透鏡，5-第一反射鏡，6-中空反射鏡，7-凹面錐鏡，8-凸面錐鏡，9-第二透鏡，10-第三透鏡3，11-雙色鏡， 12-顯微物鏡，13-載物臺(tái)，14-樣品，15-第二反射鏡，16-筒鏡，17-濾光片，18-CCD相機(jī)。
具體實(shí)施方式
如圖2所示，本實(shí)用新型使用兩個(gè)頂角90度的錐面反射鏡(一個(gè)凸面鏡8，一個(gè)凹面鏡7)同心放置，凹面錐鏡7中心有孔，凸面錐鏡8可在凹面錐鏡7中心孔內(nèi)軸向移動(dòng)。 平行光束穿過一個(gè)與入射光方向成45度放置的中空反射鏡7后，正入射凸面錐鏡8，光線經(jīng)凸面錐8反射90度后，再由凹面錐7反射90度，最后再經(jīng)由中空反射鏡6反射90度后，可以產(chǎn)生一個(gè)平行的環(huán)形光束。移動(dòng)凸面錐鏡8與凹面錐鏡7的相對(duì)位置可以改變環(huán)形光束的占空比。與圖1的使用圓型擋光板產(chǎn)生空心光環(huán)的方法相比，本實(shí)用新型的技術(shù)方案顯然具有非常高的光能利用率，而且可以很容易的改變光環(huán)的占空比。使用同心雙錐面鏡實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微的系統(tǒng)光路如圖3所示。激光器1發(fā)出的光束通過光纖耦合器2耦合進(jìn)入多模光纖3。再通過多模光纖3去除空間相干性后，由第一透鏡4準(zhǔn)直為平行光束。調(diào)節(jié)第一反射鏡5使平行光束穿過中空反射鏡6后正入射凸面錐8，光線經(jīng)凸面錐鏡8反射90度后，再由凹面錐鏡7反射90度，最后再經(jīng)由中空反射鏡6 反射90度后，可以產(chǎn)生一個(gè)平行的環(huán)形光束。移動(dòng)凸面錐鏡8與凹面錐鏡7的相對(duì)位置可以改變環(huán)形光束的占空比。第二透鏡9和第三透鏡10組成的望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)用來調(diào)整光環(huán)光場(chǎng)的發(fā)散角，從而可以調(diào)整作用在樣品上衰逝場(chǎng)的面積。環(huán)形光束由雙色鏡11反射進(jìn)入顯微物鏡12，由顯微物鏡12匯聚在載玻片的界面處產(chǎn)生衰逝波。微調(diào)載物臺(tái)13使得樣品14 位于衰逝場(chǎng)中。衰逝波激發(fā)出的熒光信號(hào)經(jīng)顯微物鏡12收集后，再穿過雙色鏡11，經(jīng)第二反射鏡15改變方向，最后經(jīng)過筒鏡16和濾光片17進(jìn)入CXD相機(jī)18?？刂艭XD相機(jī)18的增益系數(shù)、CCD制冷溫度以及曝光時(shí)間，從而得到清晰的全內(nèi)反射熒光顯微圖像。平移凸面錐鏡8改變凸面錐鏡8與凹面錐鏡7內(nèi)的相對(duì)位置，可以改變平行光環(huán)光場(chǎng)的占空比，當(dāng)環(huán)形光束在載玻片與溶液界面處的匯聚角小于臨界角時(shí)，全反射條件將被破壞，一部分折射光線將會(huì)進(jìn)入溶液及樣品內(nèi)部，從而可以實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微與寬場(chǎng)熒光顯微的切換。實(shí)施例1 本實(shí)用新型裝置對(duì)直徑1 μ m熒光小球進(jìn)行寬場(chǎng)熒光顯微與全內(nèi)反射熒光顯微的成像實(shí)驗(yàn)比較。標(biāo)尺10 μ m，實(shí)驗(yàn)中顯微物鏡為63X，NA= 1.4顯微物鏡，激光器選用倍頻YAG激光器，波長(zhǎng)532nm。實(shí)驗(yàn)時(shí)調(diào)節(jié)凸面錐鏡8在凹面錐鏡7內(nèi)的相對(duì)位置，可以實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微與寬場(chǎng)熒光顯微的切換。寬場(chǎng)熒光顯微圖像，可以看到離焦位置的熒光小球帶來的背景噪聲。全內(nèi)反射熒光顯微圖像，只能看到焦平面處的熒光小球，而且對(duì)比度很高。實(shí)施例2 本實(shí)用新型裝置對(duì)鈴蘭切片進(jìn)行寬場(chǎng)熒光顯微與全內(nèi)反射熒光顯微的成像實(shí)驗(yàn)比較。標(biāo)尺10 μ m，實(shí)驗(yàn)中顯微物鏡為100X，NA= 1. 45顯微物鏡，激光器選用倍頻YAG激光器，波長(zhǎng)532nm。實(shí)驗(yàn)時(shí)調(diào)節(jié)凸面錐鏡8在凹面錐鏡7內(nèi)的相對(duì)位置，可以實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微與寬場(chǎng)熒光顯微的切換是寬場(chǎng)熒光顯微圖像，可以看到離焦位置的樣品自發(fā)熒光。全內(nèi)反射熒光顯微圖像，只能看到界面處的熒光信號(hào)，圖像對(duì)比度很高。
權(quán)利要求1.一種使用同心雙錐面鏡實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微的系統(tǒng)，包括平行光發(fā)生裝置以及依次設(shè)置在光路上的環(huán)形光束產(chǎn)生裝置、熒光激發(fā)裝置以及成像裝置，所述平行光發(fā)生裝置產(chǎn)生平行光，所述環(huán)形光束產(chǎn)生裝置設(shè)置在平行光的光路上； 所述熒光激發(fā)裝置包括設(shè)置在環(huán)形光束產(chǎn)生裝置光路上的雙色鏡(11)、設(shè)置在雙色鏡 (11)反射光路上的顯微物鏡(1 以及設(shè)置在顯微物鏡上方的載物臺(tái)(13)；所述成像裝置包括第二反射鏡(15)、依次設(shè)置在第二反射鏡(1 反射光路上的筒鏡 (16)、濾光片(17)以及CCD相機(jī)(18)；所述第二反射鏡(15)設(shè)置在載物臺(tái)(13)的正下方； 其特征在于所述環(huán)形光束產(chǎn)生裝置包括與平行光入射方向成45度放置的中空反射鏡(6)、與平行光同軸設(shè)置的凹面錐鏡(7)、設(shè)置在凹面錐鏡中心的凸面錐鏡(8)；所述凸面錐鏡8的軸線正對(duì)中空反射鏡(6)的中心；所述雙色鏡(11)設(shè)置在中空反射鏡(6)的環(huán)形光束的反射光路上并與反射光方向成 45度角。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用同心雙錐面鏡實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微的系統(tǒng)，其特征在于所述環(huán)形光束產(chǎn)生裝置還包括望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)，所述望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)包括設(shè)置在中空反射鏡 (6)和雙色鏡(11)之間的第二透鏡(9)和第三透鏡(10)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的使用同心雙錐面鏡實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微的系統(tǒng)，其特征在于所述平行光發(fā)生裝置包括激光器(1)、光纖耦合器O)、多模光纖(3)、第一透鏡 G)、以及設(shè)置在第一透鏡(4)后的第一反射鏡(5)，所述中空反射鏡(6)設(shè)置在第一反射鏡 (5)的反射光路上。
專利摘要本實(shí)用新型涉及使用同心雙錐面鏡實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微的系統(tǒng)，包括平行光發(fā)生裝置以及依次設(shè)置在光路上的環(huán)形光束產(chǎn)生裝置、熒光激發(fā)裝置以及成像裝置，平行光發(fā)生裝置產(chǎn)生平行光，環(huán)形光束產(chǎn)生裝置設(shè)置在平行光的光路上；環(huán)形光束產(chǎn)生裝置包括與平行光入射方向成45度放置的中空反射鏡、與平行光同軸設(shè)置的凹面錐鏡、設(shè)置在凹面錐鏡中心的凸面錐鏡；本實(shí)用新型解決了現(xiàn)有的物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微方法透過率低的問題，具有光能利用率高接近100％的優(yōu)點(diǎn)，并且可以方便地實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射熒光顯微與普通寬場(chǎng)熒光顯微的切換。本實(shí)用新型完全可對(duì)單個(gè)細(xì)胞，甚至單個(gè)細(xì)胞器進(jìn)行成像，滿足大多數(shù)活體生物實(shí)驗(yàn)的要求。
文檔編號(hào)G02B21/36GK202102170SQ20102056868
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2010年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月20日
發(fā)明者嚴(yán)紹輝, 葉彤, 姚保利, 雷銘 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院西安光學(xué)精密機(jī)械研究所