專利名稱：受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)，具體涉及一種受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光 斑的生成方法和裝置。
背景技術(shù)：
近年來，隨著受激發(fā)射損耗顯微(StimulatedEmission Depletion (STED) microscopy，簡稱STED)技術(shù)的提出，遠(yuǎn)場光學(xué)顯微成像的分辨率得到極大的改進(jìn)，可以在 活細(xì)胞上看到納米尺度的蛋白質(zhì)。它是從物理上打破衍射光學(xué)極限的遠(yuǎn)場熒光顯微技術(shù)。 其具體原理為使用一束激光在樣品表面聚焦產(chǎn)生一個實心小光斑，僅激發(fā)一個點的熒光 基團(tuán)使其發(fā)熒光，然后再用另一束激光在樣品表面相同位置區(qū)域聚焦產(chǎn)生一個面包圈樣的 空心光斑抑制那個點周圍的熒光強(qiáng)度，這樣就只有中間一個小于衍射極限的點發(fā)光并被觀 察到了。為了使STED顯微鏡的分辨能力可以打破遠(yuǎn)場衍射光學(xué)極限，在相關(guān)技術(shù)中最為 關(guān)鍵的技術(shù)是如何形成面包圈樣的空心聚焦光斑抑制觀察點周圍的熒光激發(fā)，該空心聚焦 光斑稱為抑制光斑。文獻(xiàn)Hell 等 Q010)Far-field optical nanoscopy, Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology 96 :365-398]提至Ij了一禾中基于 0 2π渦旋位相板，使用圓偏光形成面包圈樣的空心聚焦光斑的方法。作為經(jīng)典的空心聚焦光 斑形成方法，它被廣泛應(yīng)用于目前的種種STED顯微鏡產(chǎn)品中。但是，該現(xiàn)有方法的缺點在 于0 圓形渦旋位相板制備非常困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法及裝置，基于0/ π 四象限位相板聚焦，結(jié)合使用徑向偏振光在顯微物鏡的焦點附近得到一個空心聚焦光斑， 作為抑制光斑，用于脈沖或連續(xù)STED顯微鏡中的三維超分辨成像。一種受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法，包括以下步驟(1)將由激光器出射的入射光線調(diào)制為徑向偏振光；(2)將所述的徑向偏振光垂直通過一個0/π四象限位相板表面進(jìn)行位相編碼， 使所述的徑向偏振光產(chǎn)生相對于初始相位的位相延遲，位相延遲的大小由所述的徑向 偏振光的圓形橫截面內(nèi)過特定點所處的平面極坐標(biāo)所決定當(dāng)處于;γ/4<(^<3;Γ/4 或5;Γ/4<(^<7;Γ/4區(qū)間時，位相延遲為0，當(dāng)處于；τ/4或 3幾/4<爐<5幾/4時，位相延遲為π，與該點到圓心的距離無關(guān)，其中，識為所述的ο/π 四象限位相板平面上所述的徑向偏振光垂直ζ軸剖面內(nèi)位置極坐標(biāo)矢量與χ軸的夾角；(3)將經(jīng)過步驟( 位相編碼后的徑向偏振光進(jìn)行遠(yuǎn)場超分辨聚焦，聚焦后在焦 平面附近形成一個面包圈樣的空心聚焦光斑，為受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑。所述的 空心聚焦光斑為中心點的光強(qiáng)小于中心點附近最大光強(qiáng)的的二維暗斑。其中，步驟(1)中所述的激光器發(fā)射的入射光線可以為波長在380 780nm范圍內(nèi)任意波長的可見光，但優(yōu)選波長由STED顯微鏡觀察熒光樣品的熒光吸收與發(fā)射光譜決定。步驟(1)中所述的徑向偏振光的波面形狀優(yōu)選為均勻平面波，也可以使用其它波 面形狀如基本高斯波、貝塞爾-高斯波(Bessel-GaussianBeam)等。步驟(1)中將所述的入射光線調(diào)制為所述的徑向偏振光采用現(xiàn)有技術(shù)來實現(xiàn)，如 米用X· L Wang等(2007) Generation of arbitrary vector beamswith a spatial light modulator and a common path interferometric arrangement，Optics Letters 32(24) 3549-3551中所記載的由微結(jié)構(gòu)光柵與干涉儀組成的空間光調(diào)制器(SLM=Spatial Light Modulator)即可實現(xiàn)；也可以通過徑向偏振轉(zhuǎn)換器將線偏振激光轉(zhuǎn)換為徑向或者徑向激 光來實現(xiàn)。其中，步驟(3)中進(jìn)行遠(yuǎn)場超分辨聚焦可以采取將經(jīng)過位相編碼后的徑向偏振光 通過用于透射聚焦的透鏡來實現(xiàn)，也可以采取將經(jīng)過位相編碼后的徑向偏振光通過用于反 射聚焦的拋物面反射鏡來實現(xiàn)，優(yōu)選采取將經(jīng)過位相編碼后的徑向偏振光通過高數(shù)值孔徑 的消復(fù)色差透鏡實現(xiàn)。所述的高數(shù)值孔徑NA = 1 1. 4，優(yōu)選為NA = 1. 4。本發(fā)明的工作原理如下將從激光器發(fā)出的入射光線，通過徑向偏振轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為徑向偏振光后，進(jìn)一步 將徑向偏振光進(jìn)行位相編碼，打破原有的干涉場，使得光線匯報后產(chǎn)生一個空心聚焦光斑。 如果直接將徑向偏振光(Radially PolarizedBeam)通過透鏡進(jìn)行匯聚時，會在焦點位置處 產(chǎn)生實心的匯聚光斑；但是經(jīng)過位相編碼后，原有的光場分布會被打破，實心的匯聚光斑會 轉(zhuǎn)變成面包圈樣的空心聚焦光斑即光斑中心點為光強(qiáng)極小值。由于抑制光對樣品熒光激 發(fā)的抑制能力與其光強(qiáng)正相關(guān)，因此，當(dāng)聚焦光斑內(nèi)光強(qiáng)呈面包圈樣的空心狀分布時，會對 光斑中心點周圍的熒光激發(fā)效應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，而光斑中心點由于抑制光光強(qiáng)很弱，在非 線性效應(yīng)作用下將不產(chǎn)生抑制作用，從而可以將實際熒光激發(fā)區(qū)域限制在衍射極限以下， 達(dá)到超分辨掃描的目的。本發(fā)明還提供了一種用于實現(xiàn)所述的受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方 法的裝置，包括用于產(chǎn)生入射光線的激光器；用于將激光器產(chǎn)生的入射光線調(diào)制為徑向偏振光的空間光調(diào)制器；用于對徑向偏振光進(jìn)行位相編碼的0/ π四象限位相板；用于對經(jīng)過位相編碼后的徑向偏振光進(jìn)行遠(yuǎn)場超分辨聚焦的聚焦器件；所述的激光器、空間光調(diào)制器、0/ π四象限位相板和聚焦器件位于同軸光路上。其中，所述的激光器為能發(fā)射波長為380 780nm內(nèi)任意波長的可見光的激光器， 而優(yōu)選的發(fā)射波長由STED顯微鏡觀察樣品的熒光吸收與發(fā)射光譜決定。其中，所述的0/π四象限位相板，對于垂直通過該位相板表面的徑向偏振光，當(dāng) 所述的徑向偏振光的圓形橫截面內(nèi)過特定點所處的平面極坐標(biāo)處于不同位置時，其位相延 遲不同，具體位相延遲量Δ α由如下公式?jīng)Q定
權(quán)利要求
1.一種受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法，包括以下步驟(1)將由激光器出射的入射光線調(diào)制為徑向偏振光；(2)將所述的徑向偏振光垂直通過一個O/π四象限位相板表面進(jìn)行位相編碼，使 所述的徑向偏振光產(chǎn)生相對于初始相位的位相延遲，位相延遲的大小由所述的徑向偏 振光的圓形橫截面內(nèi)過特定點所處的平面極坐標(biāo)所決定當(dāng)處于;γ/4<(^<3;Γ/4 或5;Γ/4<(^<7;Γ/4區(qū)間時，位相延遲為0，當(dāng)處于；τ/4或 3;r/4S^<5;r/4時，位相延遲為π，其中，識為所述的ο/π四象限位相板平面上所述的 徑向偏振光垂直ζ軸剖面內(nèi)位置極坐標(biāo)矢量與χ軸的夾角；(3)將經(jīng)過步驟(2)位相編碼后的徑向偏振光進(jìn)行遠(yuǎn)場超分辨聚焦，聚焦后在焦平面 附近形成一個面包圈樣的空心聚焦光斑，為受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑。
2.如權(quán)利要求ι所述的受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法，其特征在于，所 述的步驟(1)中，入射光線為波長在380 780nm范圍內(nèi)的可見光。
3.如權(quán)利要求1所述的受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法，其特征在于，所 述的步驟(1)中，徑向偏振光的波面形狀為均勻平面波。
4.如權(quán)利要求1所述的受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法，其特征在于，所 述的步驟(3)中進(jìn)行遠(yuǎn)場超分辨聚焦采取將經(jīng)過位相編碼后的徑向偏振光通過高數(shù)值孔 徑 的消復(fù)色差透鏡實現(xiàn)。
5.如權(quán)利要求4所述的受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法，其特征在于，所 述的高數(shù)值孔徑NA= 1 1.4。
6.一種用于實現(xiàn)如權(quán)利要求1 5任一所述的受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成 方法的裝置，包括用于產(chǎn)生入射光線的激光器；用于將激光器產(chǎn)生的入射光線調(diào)制為徑向偏振光的空間光調(diào)制器；用于對徑向偏振光進(jìn)行位相編碼的0/ π四象限位相板；用于對經(jīng)過位相編碼后的徑向偏振光進(jìn)行遠(yuǎn)場超分辨聚焦的聚焦器件；所述的激光器、空間光調(diào)制器、0/π四象限位相板和聚焦器件位于同軸光路上。
7.如權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于，所述的激光器為能發(fā)射波長為380 780nm 內(nèi)任意波長的可見光的激光器。
8.如權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于，所述的空間光調(diào)制器為由微結(jié)構(gòu)光柵與干 涉儀組成的空間光調(diào)制器。
9.如權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于，所述的聚焦器件為高數(shù)值孔徑的消復(fù)色差 透鏡，所述的高數(shù)值孔徑NA = 1 1. 4。
10.如權(quán)利要求9所述的裝置，其特征在于，所述的高數(shù)值孔徑NA=1.4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種受激發(fā)射損耗顯微鏡中抑制光斑的生成方法和裝置，該方法基于0/π四象限位相板聚焦，結(jié)合使用徑向偏振光在顯微物鏡的焦點附近得到一個空心聚焦光斑，作為抑制光斑，用于脈沖或連續(xù)STED顯微鏡中的三維超分辨成像。該裝置包括位于同軸光路上的激光器、空間光調(diào)制器、0/π四象限位相板和聚焦器件。該裝置結(jié)構(gòu)簡單、成本低。
文檔編號G02B21/00GK102122079SQ201110070648
公開日2011年7月13日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者劉旭, 匡翠方, 李旸暉, 郝翔 申請人:浙江大學(xué)