專利名稱：發(fā)光試料攝像方法、發(fā)光細胞攝像方法及物鏡的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對發(fā)光試料進行攝像的發(fā)光試料攝像方法及在該發(fā)光試料攝像方法中使用的物鏡。此外，本發(fā)明涉及對導入了蟲熒光素酶基因的發(fā)光細胞進行攝像的發(fā)光細胞攝像方法及在該發(fā)光細胞攝像方法中使用的物鏡。
背景技術：
目前，在發(fā)光試料的觀察中，進行來自發(fā)光試料的發(fā)光量的測量。例如，在導入了蟲熒光素酶基因的細胞的觀察中，為了調(diào)查蟲熒光素酶基因的表達的強度(具體而言是表達量)，測量基于蟲熒光素酶活性的來自細胞的發(fā)光量。并且，基于蟲熒光素酶活性的來自細胞的發(fā)光量的測量是通過以下的步驟進行的首先將溶解了細胞的細胞溶解液與含有蟲熒光素、ATP及鎂等的基質(zhì)溶液反應，接著通過利用光電子倍增管的光度計將來自與基質(zhì)溶液反應后的細胞溶解液的發(fā)光量定量。即，發(fā)光量是在溶解了細胞后測量的。由此，能夠?qū)⒛硞€時刻的蟲熒光素酶基因的表達量作為細胞整體的平均值來測量。這里，在將蟲熒光素酶基因等的發(fā)光基因作為報告基因?qū)氲郊毎械姆椒ㄖ校欣缌姿徕}法、脂質(zhì)體 (Lipofectin)法及正電子法等，各方法根據(jù)目的及細胞的種類的不同而分開使用。此外，在作為報告基因而導入了蟲熒光素酶基因的細胞中，在以基于蟲熒光素酶活性的來自細胞的發(fā)光量為指標調(diào)查蟲熒光素酶基因的表達的強度時，可以通過將目的DNA片段連接在導入到細胞中的蟲熒光素酶基因的上游或下游，來調(diào)查該DNA片段給蟲熒光素酶基因的復制帶來的影響；此外，通過將認為會給導入到細胞中的蟲熒光素酶基因的復制帶來影響的復制因子等的基因連接在表達載體上并與蟲熒光素酶基因一起表達，能夠調(diào)查該基因的基因產(chǎn)物給蟲熒光素酶基因的表達帶來的影響。此外，為了沿著時間經(jīng)過而捕捉發(fā)光基因的表達量，需要隨時間經(jīng)過測量來自活細胞的發(fā)光量。并且，來自活細胞的發(fā)光量的隨時間經(jīng)過的測量是通過以下步驟進行的 首先，對培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)器添加作為分光測量計的光度計的功能，接著，利用光度計每一定時間測量來自培養(yǎng)中的整個細胞集團的發(fā)光量。由此，能夠測量具有一定的周期性的表達節(jié)奏等，由此，能夠捕捉細胞全體的發(fā)光基因的表達量的隨時間經(jīng)過的變化。另一方面，在發(fā)光基因的表達為一過性的情況下，在各個細胞中的表達量中有較大的偏差。例如，即使是 HeLa細胞等的克隆的培養(yǎng)細胞，通過細胞膜表面的受體做出的藥劑的響應在各個細胞中也有偏差。進而，分光測量法雖然較迅速，但容器內(nèi)的細胞數(shù)越多光強度越高，所以難以區(qū)別表達量和細胞數(shù)。因而，分光測量法的表達量缺乏定量性。即，有的情況下作為細胞全體的響應沒有被檢測到而幾個細胞響應。因此，在發(fā)光基因的表達是一過性的情況下，不是從細胞全體而是從各個細胞隨時間經(jīng)過測量發(fā)光量是很重要的。并且，使用顯微鏡的來自活的各細胞的發(fā)光量的隨時間經(jīng)過的測量由于各細胞的發(fā)光很弱，所以是通過液體氮溫度水平的冷卻CCD攝像機長時間曝光、或使用安裝有圖像增強器的CCD攝像機和光子計數(shù)裝置來進行的。由此，能夠捕捉活的各細胞的發(fā)光基因的表達量的隨時間經(jīng)過的變化。最近，在生物學領域及醫(yī)學領域的研究中，以活的試料為對象的圖像的動態(tài)變化的隨時間經(jīng)過的觀察的必要性增加。具體而言，在利用發(fā)光或熒光觀察的研究領域中，為了捕捉試料內(nèi)的蛋白質(zhì)分子的動態(tài)功能表達而要求延時或運動圖像攝像。在現(xiàn)狀中，進行以熒光試料為對象攝影的圖像的動態(tài)變化的觀察(例如利用熒光的蛋白質(zhì)單分子的運動圖像觀察)。在熒光試料的攝像的情況下，由于有通過持續(xù)照射激勵光而從熒光試料發(fā)出的光量隨著時間的經(jīng)過而減少的性質(zhì)，所以隨著時間經(jīng)過拍攝能夠在定量的評價中使用的穩(wěn)定的圖像是很困難的，但是能夠以較短的曝光時間拍攝鮮明的、即空間分辨率較高的圖像。另一方面，在以發(fā)光試料為對象的圖像的動態(tài)變化的隨時間經(jīng)過的觀察中，由于來自發(fā)光試料的發(fā)光極弱，所以在發(fā)光試料的觀察中，使用安裝有圖像增強器的CCD攝像機進行。在發(fā)光試料的攝像的情況下，由于不需要照射激勵光，所以能夠隨時間經(jīng)過拍攝能夠在定量的評價中使用的穩(wěn)定的圖像。但是，在對微弱的發(fā)光的發(fā)光試料進行攝像的情況下，由于來自發(fā)光試料的發(fā)光量極少，所以有拍攝鮮明的圖像所需的曝光時間變長的問題。此外，由于攝像的時間間隔受每單位時間的光量的制約，所以在對微弱的發(fā)光的發(fā)光試料進行攝像的情況下，有即使能夠以很長的時間間隔、例如以60分鐘以上的間隔隨時間經(jīng)過拍攝鮮明的圖像，也很難以比較短的時間間隔、例如20 30分鐘的間隔連續(xù)拍攝鮮明的圖像的問題。進而，有以非常短的時間間隔、例如5 10分鐘間隔使發(fā)光試料圖像化是非常困難的問題。因此，能夠以小于5分鐘的間隔例如1 3分鐘的間隔得到鮮明的圖像是預料外的情況。一般，攝像所需的時間越長，表達量的變動分析越不正確，定量性越低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于上述問題而做出的，目的是提供一種即使是發(fā)光量較少的發(fā)光試料也能夠以較短的曝光時間、進而實時地拍攝鮮明的圖像的發(fā)光試料攝像方法、發(fā)光細胞攝像方法及物鏡。為了解決上述的問題而達到目的，本發(fā)明的技術方案1所述的發(fā)光試料攝像方法，對發(fā)光試料進行攝像，其特征在于，使用由數(shù)值孔徑NA及投影倍率β表示的(ΝΑ+β)2 的值為0.01以上的物鏡。此外，本發(fā)明是關于發(fā)光細胞攝像方法的發(fā)明，本發(fā)明的技術方案8所述的發(fā)光細胞攝像方法，對導入了蟲熒光素酶基因的發(fā)光細胞進行攝像，其特征在于，使用由數(shù)值孔徑NA及投影倍率β表示的(ΝΑ+β)2的值為0.01以上的物鏡。此外，本發(fā)明是關于物鏡的發(fā)明，本發(fā)明的技術方案9所述的物鏡，在對發(fā)光試料進行攝像的發(fā)光試料攝像方法中使用，其特征在于，由數(shù)值孔徑NA及投影倍率β表示的 (ΝΑ+β)2的值為0.01以上。此外，本發(fā)明是關于物鏡的發(fā)明，本發(fā)明的技術方案16所述的物鏡，在對導入了蟲熒光素酶基因的發(fā)光細胞進行攝像的發(fā)光細胞攝像方法中使用，其特征在于，由數(shù)值孔徑NA及投影倍率β表示的(ΝΑ+β)2的值為0.01以上。此外，本發(fā)明是關于物鏡的發(fā)明，本發(fā)明的技術方案17所述的物鏡，在對發(fā)光試料進行攝像的發(fā)光試料攝像方法中使用，其特征在于，在該物鏡及/或包裝該物鏡的包裝容器上標記有由數(shù)值孔徑NA及投影倍率β表示的(ΝΑ+β)2的值。在有關本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法中，使用由數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β )表示的(ΝΑ+β)2的值為0.01以上的物鏡。由此，具有如下效果即使是發(fā)光量較少的發(fā)光試料(例如發(fā)光蛋白質(zhì)(例如從導入的基因(例如蟲熒光素酶基因)表達的發(fā)光蛋白質(zhì))、 發(fā)光性的細胞或發(fā)光性的細胞的集合體、發(fā)光性的組織試料、發(fā)光性的個體(例如動物或臟器等)等)，也能夠以較短的曝光時間、進而實時地拍攝鮮明的圖像。此外，在有關本發(fā)明的發(fā)光細胞攝像方法中，由于使用由數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β)表示的(ΝΑ+β)2的值為0.01以上的物鏡，所以具有如下效果能夠以導入了蟲熒光素酶基因的發(fā)光細胞為攝像對象、以較短的曝光時間進而實時地拍攝鮮明的圖像。此外，本發(fā)明的物鏡由于由數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β)表示的(ΝΑ+β)2的值為0.01以上，所以具有如下效果即使是發(fā)光量較少的發(fā)光試料(例如發(fā)光蛋白質(zhì)(例如從導入的基因(例如蟲熒光素酶基因)表達的發(fā)光蛋白質(zhì))、發(fā)光性的細胞或發(fā)光性的細胞的集合體、發(fā)光性的組織試料、發(fā)光性的個體(例如動物或臟器等)等)，也能夠以較短的曝光時間、進而實時地拍攝鮮明的圖像。具體而言，具有如下效果能夠以導入了蟲熒光素酶基因的發(fā)光細胞為攝像對象、以較短的曝光時間進而實時地拍攝鮮明的圖像。此外，本發(fā)明的物鏡與以往的物鏡相比具備數(shù)值孔徑較大和倍率較小兩者，所以如果使用本發(fā)明的物鏡則能夠高分辨率拍攝較大范圍。由此，能夠?qū)⒗缫苿拥陌l(fā)光試料或分布在較大范圍內(nèi)的發(fā)光試料作為攝像對象。此外，本發(fā)明的物鏡在該物鏡及/或包裝該物鏡的包裝容器(包裝)上標記有由數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β )表示的(ΝΑ+ β )2的值(例如0. 01以上)。由此，具有如下效果例如進行發(fā)光圖像觀察的人只要確認標記的(ΝΑ+ β )2的值，就能夠容易選擇適合以較短的曝光時間進而實時拍攝發(fā)光試料的物鏡。進而，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在相同的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)的多個細胞中，基因表達的變動模式不同。進而，根據(jù)本發(fā)明者鉆研的光學條件，表明在用數(shù)值孔徑(NA)/投影倍率(β)的平方表示攝像裝置的物鏡的光學條件為0. 071以上的情況下，能夠提供在1 5分鐘以內(nèi)進行圖像化、還能夠進行圖像分析的細胞圖像。將通過儲存型的攝像裝置對這些發(fā)光圖像進行顯微鏡觀察的發(fā)光分析系統(tǒng)稱作發(fā)光顯微鏡。發(fā)光顯微鏡優(yōu)選地具有具備用來遮光的開閉蓋(或開閉窗)的遮光機構，通過該遮光機構的開閉來設置或更換所需的生物體試料。根據(jù)目的，也可以通過手動或自動地進行對收容生物體試料的容器進行化學或物理刺激的操作。在后述的本發(fā)明的優(yōu)選的一實施方式中，發(fā)光顯微鏡搭載有公知或獨自的培養(yǎng)裝置。培養(yǎng)裝置具備將溫度、濕度、ΡΗ、外部空氣成分、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)液成分維持為最佳的功能，以便能夠長期間進行系統(tǒng)內(nèi)的分析。


圖1是表示用來實施本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法的裝置的結構的一例的圖。圖2是表示標記有(ΝΑ/ β )2的值的物鏡2的一例的圖。圖3是簡略地表示物鏡的圖。圖4是表示目前市售的一般的顯微鏡的物鏡的像的亮度(ΝΑ/ β)2的一例的圖。
圖5是表示在實施例1中使用的物鏡的數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β )的條件的圖。圖6是表示在實施例2中使用的物鏡的數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β )的條件的圖。圖7是表示在實施例2中攝像的HeLa細胞的圖像的圖。圖8是表示在實施例3中使用的物鏡的數(shù)值孔徑(NA)的條件的圖。圖9是表示在實施例3中攝像的HeLa細胞的圖像的圖。圖10是表示在實施例3中使用的物鏡的(ΝΑ/β )2的值與圖9所示的圖像的發(fā)光強度的關系的圖。
具體實施例方式以下，基于附圖詳細地說明本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法、發(fā)光細胞攝像方法及物鏡的實施方式。另外，并不由該實施方式來限定本發(fā)明。參照圖1說明用來實施本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法的裝置的結構。圖1是表示用來實施本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法的裝置的結構的一例的圖。如圖1所示，用來實施本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法的裝置是用來在較短的曝光時間內(nèi)進而實時地對作為攝像對象的樣本1進行攝像的裝置，由物鏡2、聚光透鏡3、CXD攝像機4和監(jiān)視器5構成。另外，該裝置也可以還具備如圖示那樣的變焦透鏡6。樣本1是發(fā)光試料，例如是發(fā)光蛋白質(zhì)(例如從導入的基因(蟲熒光素酶基因、水母發(fā)光蛋白基因、本y夕夕基因等)表達的發(fā)光蛋白質(zhì))、發(fā)光性細胞、發(fā)光性細胞的集合體、發(fā)光性組織試料、發(fā)光性的臟器、發(fā)光性的個體(動物等)。此外，樣本ι具體而言也可以是導入了蟲熒光素酶基因的發(fā)光細胞。這里，作為發(fā)光試料的來源的生物學材料可以舉出例如真核動物、來自藍色細菌的細胞或組織。在醫(yī)學用途中，可例示包括從哺乳類、特別是人的要檢查的部位通過活組織檢查切除的細胞的試料。在再生醫(yī)療中，至少一部分是人工改良或合成的生物體試料，能夠用于檢查是否良好地維持生物學活性的目的。另一方面，本發(fā)明的檢測對象并不限于來自動物的細胞或生物體組織，也可以是來自植物或昆蟲的細胞或生物體組織。在菌、病毒中，能夠?qū)⑼ㄟ^以往的光度計不能執(zhí)行的容器內(nèi)的各部分的分析作為對象。通過將無數(shù)的試料(例如每1孔(well) 100萬個以上)累積在孔或培養(yǎng)皿等容器內(nèi)，能夠通過光度計迅速地得到強大的發(fā)光量。在本發(fā)明中，由于生成了通過肉眼完全看不到的各個發(fā)光試料的圖像，所以即使各個細胞以能夠識別的程度的密度收容在容器內(nèi)，也能夠分析個別的細胞乃至生物體組織。這樣的個別的分析包括僅將發(fā)光的細胞統(tǒng)計性合計或平均化的分析方法。由此，能夠進行有關每1個細胞的正確的相互作用的評價。此外，在混合存在多個的發(fā)光試料中，能夠識別具有同樣的發(fā)光量或發(fā)光模式的細胞群或組織區(qū)域。作為收容樣本1的試料容器，可以舉出培養(yǎng)皿、玻璃載片、微板、流腔(flow cell)。這里，容器底面當然是透光性的材料(玻璃、塑料等)，更優(yōu)選為具有寬度較寬(或扁平)的底面的容器，以便容易得到2維數(shù)據(jù)。在將多個收容部分一體化的孔或試管中，各收容部分的分隔部分整面優(yōu)選由遮光性的材料或染料成形。此外，對于培養(yǎng)皿等具有上部開口的容器，優(yōu)選地覆蓋防蒸發(fā)用的蓋，并且對蓋的內(nèi)表面實施防反射用的覆膜或染色對于提高S/N比方面更優(yōu)選。也可以代替這樣的硬質(zhì)的蓋而在容器內(nèi)的試料的上表面上配置礦物油那樣的液狀的蓋。也可以使用來載置試料容器的試料臺如一般的顯微鏡那樣在X軸方向及Y軸方向上移動，根據(jù)需要而變更為其它攝像用的視場。物鏡2的由數(shù)值孔徑(NA) 及投影倍率(β)表示的(ΝΑ+β)2的值為0.01以上。這里，物鏡2也可以以倒立形式配置在樣本1的下方。物鏡2也可以通過適當?shù)募訜釞C構(珀耳帖元件、熱風加熱器等)加熱，以使活的發(fā)光試料在如培養(yǎng)條件的恒溫環(huán)境下穩(wěn)定地發(fā)揮功能。物鏡2還可以在作為光軸方向的Z軸方向上驅(qū)動(在圖中是上下方向)。裝備有Z軸驅(qū)動機構，將物鏡2沿著Z 軸(光軸方向)自動驅(qū)動。作為物鏡2的Z軸驅(qū)動機構，作為例子可以舉出齒條小齒輪機構及摩擦輥機構。此外，物鏡2根據(jù)希望的倍率可以適當?shù)刈龀捎徒?。此外，選擇哪個倍率可以根據(jù)要評價(或分析)的試料的尺寸而任意地設定。具體而言，可以是能夠觀察細胞及組織的程度的低倍率(例如從5倍到20倍)或者能夠觀察細胞內(nèi)或細胞外的微小物質(zhì)的程度的高倍率(例如從40倍到100倍)。聚光透鏡3將經(jīng)由物鏡2到達的來自樣本1 的發(fā)光聚集。CXD攝像機4是0°C左右的冷卻CXD攝像機，經(jīng)由物鏡2及聚光透鏡3對樣本 1進行攝像。監(jiān)視器5輸出由CXD攝像機4拍攝的圖像。此外，優(yōu)選地通過監(jiān)視器5具備以運動圖像顯示發(fā)光試料的圖像信息的機構，提供以實時的影像觀察有關1個以上的希望的細胞的活性的變化那樣的分析方法。由此，能夠以具有臨場感和跳動感的影像，按時間序列觀察細胞單位或組織單位的發(fā)光狀況。并且，在物鏡2及物鏡2的包裝容器(包裝)上，標記(ΝΑ/β)2的值。這里，參照圖 2對標記了(ΝΑ/β)2的值的物鏡2的一例進行說明。圖2是表示標記了(ΝΑ/β)2的值的物鏡2的一例的圖。在以往的物鏡上，標記有透鏡種類(例如“PlanApo”)、倍率/NA油浸(例如“100X1.40oil”)及無限遠/蓋玻璃厚(例如“⑴/0.17”)。但是，在本發(fā)明的物鏡(物鏡2)上，除了透鏡種類(例如“PlanApo”)、倍率/NA油浸(例如“ 100X 1. 40oil”)及無限遠/蓋玻璃厚(例如“⑴/0.17”)以外，還標記有射出開口角(例如“(嫩鄺)2:0.05”)。如以上說明，在用來實施本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法的裝置中，物鏡2的由數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β )表示的(ΝΑ+ β)2的值為0. 01以上。由此，即使是發(fā)光量較少的發(fā)光試料(例如發(fā)光蛋白質(zhì)(例如從導入的基因(例如蟲熒光素酶基因)表達的發(fā)光蛋白質(zhì))、發(fā)光性的細胞或發(fā)光性的細胞的集合體、發(fā)光性的組織試料、發(fā)光性的個體(例如動物或臟器)等)，也能夠以較短的曝光時間、進而實時地拍攝鮮明的圖像。具體而言，以導入了蟲熒光素酶基因的發(fā)光細胞為攝像對象，能夠以較短的曝光時間、進而實時地拍攝鮮明的圖像。此外，物鏡2與以往的物鏡相比，數(shù)值孔徑較大且倍率較小，所以如果使用物鏡2 則能夠以高分辨率攝像較大范圍。由此，能夠?qū)⒗缬谢顒拥陌l(fā)光試料或移動的發(fā)光試料、 或分布在較大范圍內(nèi)的發(fā)光試料作為攝像對象。此外，物鏡2在該物鏡2及/或包裝該物鏡2的包裝容器(包裝)上標記了由數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β )表示的(ΝΑ+ β )2的值(例如0. 01以上)。由此，如果例如進行發(fā)光圖像觀察的人確認了標記的(ΝΑ+ β)2的值，則能夠容易選擇適合以較短的曝光時間、進而實時地對發(fā)光試料進行攝像的物鏡。以往，在使用蟲熒光素酶基因的報告基因檢測中，由于在將細胞溶解后測量發(fā)光量，所以只能捕捉某個時刻的表達量，并且成為作為細胞全體的平均值的計測。此外，在一邊培養(yǎng)一邊進行的計測中，雖然能夠捕捉細胞群體的表達量的隨時間經(jīng)過的變化，但不能捕捉各個細胞中的表達量的變化。并且，為了通過顯微鏡觀察各個細胞的發(fā)光，由于來自活的細胞的發(fā)光量極弱，所以必須利用液氮溫度水平的冷卻CCD攝像機長時間曝光，或利用安裝有圖像增強器的CCD攝像機進行光子計數(shù)等。因此，發(fā)光檢測的攝像機成為昂貴而大規(guī)模的設備。但是，在通過顯微鏡觀察表示作為報告基因產(chǎn)物的蟲熒光素酶活性的各個細胞的發(fā)光時，如果利用用來實施本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法的裝置，則能夠不安裝圖像增強器而使用0°C左右的冷卻CCD攝像機取得定量的圖像。即，如果利用用來實施本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法的裝置，則能夠通過0°C左右的冷卻CCD攝像機觀察在活的狀態(tài)下各個細胞的發(fā)光，所以不需要用來進行圖像增強器或光子計數(shù)的裝置。即，能夠以低成本進行發(fā)光試料的攝像。此外，如果利用用來實施本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法的裝置，則能夠一邊培養(yǎng)一邊隨時間經(jīng)過觀察各個活的細胞的發(fā)光，還能夠?qū)崟r地觀察。此外，如果利用用來實施本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法的裝置，則對于相同的細胞能夠監(jiān)視不同條件下的藥劑或刺激的響應。這里，為了使本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法、發(fā)光細胞攝像方法及物鏡的理解變得容易，對以往的物鏡及使用它的發(fā)光圖像觀察簡單地進行說明。一般，顯微鏡觀察中的空間分辨率ε用下述的算式1表示。ε =0.61 X λ+NA......(算式 1)(在算式1中，λ是光的波長，NA是數(shù)值孔徑。)此外，觀察范圍的直徑d用下述的算式2表示。d = D+M......(算式 2)(在算式2中，D是視場數(shù)，M是倍率。另外，視場數(shù)一般為22至沈。)以往，顯微鏡用物鏡的焦距在國際標準中為45mm。并且，最近開始使用使焦距為 60mm的物鏡。如果以該焦距為前提設計NA較大、即空間分辨率較高的透鏡，則動作距離 (WD) —般為0.5mm左右，此外，在長WD設計的透鏡中也是8mm左右。在使用這樣的物鏡的情況下，觀察范圍是0. 5mm直徑左右。但是，在進行分散到盤或玻璃底盤上的細胞群或組織、個體的觀察的情況下，有時觀察范圍會達到Icm 幾cm。在想要以高分辨率觀察這樣的范圍時，必須在低倍率的同時以較大的值維持NA。換言之，由于NA是透鏡半徑與焦距的比，所以能夠在NA較大的狀態(tài)下觀察較大范圍的物鏡需要是低倍率的。結果，這樣的物鏡成為大口徑。另外，在大口徑的物鏡的制造中，一般對于光學材料的物性的均勻性或鍍層的均勻性、還有對透鏡形狀也要求較高的精度。此外，在顯微鏡觀察的情況下，光學系統(tǒng)的透過率、物鏡的數(shù)值孔徑、C⑶攝像機的芯片面上的投影倍率及CCD攝像機的性能等對圖像的亮度有較大的影響。并且，圖像的亮度是通過將數(shù)值孔徑(NA)用投影倍率(β)除后的值的平方、即(ΝΑ/β)2來評價的。這里， 如圖3所示，在物鏡中，一般在入射開口角NA與射出開口角ΝΑ’之間有下述算式3的關系， NA' 2是表示達到觀察者的眼睛或CXD攝像機等的亮度的值。NA，= NA+ β......(算式 3)(在算式3中，NA是入射開口角(數(shù)值孔徑)，ΝΑ，是射出開口角，β是投影倍率。)在一般的物鏡中，ΝΑ，較高是0.04，ΝΑ，2是0.0016。此外，調(diào)查了目前市售的一般的顯微鏡的物鏡的圖像的亮度(ΝΑ/β )2的值，如圖4所示，是從0. 0005到0. 002的范圍。但是，即使利用安裝有圖4所示的目前市售的物鏡的顯微鏡，例如觀察在細胞內(nèi)表達蟲熒光素酶基因并發(fā)光的細胞，也不能通過目視觀察來自該細胞的發(fā)光，并且即使觀察使用冷卻到0°C左右的CCD攝像機攝像的發(fā)光圖像也不能確認來自細胞的發(fā)光。另外，在觀察發(fā)光試料的情況下，不需要熒光觀察所需的激勵光的投影。例如，在落射熒光觀察中， 物鏡滿足激勵光投影透鏡和將熒光聚光而形成圖像的透鏡的兩者的功能。所以，為了通過圖像觀察光量較少的發(fā)光，需要具有較大的NA和較小的β的特性的物鏡。并且，結果該物鏡有變?yōu)榇罂趶降内厔?。另外，在這樣的物鏡中，要求不考慮激勵光投影的功能而使功能簡單化以便容易設計、制造。此外，在利用發(fā)光或熒光觀察的研究領域中，為了捕捉試料內(nèi)的蛋白質(zhì)分子的動態(tài)的功能表達而要求延時(time lapse)或運動圖像攝影。最近，進行利用熒光的蛋白質(zhì)單分子的運動圖像觀察。在這些攝像中，單位時間的攝像幀數(shù)越多，圖像每1幀的曝光時間越短。在這樣的觀察中，需要明亮的光學系統(tǒng)、特別是明亮的物鏡。但是，由于發(fā)光蛋白質(zhì)的光量比熒光少，所以每1幀的攝像大多需要例如20分鐘的曝光時間。以這樣的曝光時間進行延時觀察僅限于動態(tài)變化非常緩慢的試料。例如，在約1小時內(nèi)分裂一次的細胞中，不能觀察其周期內(nèi)的變化。因而，為了在較高地維持信噪比的同時將較少的光量高效地圖像化， 提高光學系統(tǒng)的亮度是很重要的。遵循以上的內(nèi)容制造的本發(fā)明的物鏡與一般市售的物鏡(例如參照圖4)相比，具有較大的NA和較小的β的特性。由此，本發(fā)明的物鏡的ΝΑ’ 2是較大的值。S卩，本發(fā)明的物鏡可以說是明亮的物鏡。由此，如果使用本發(fā)明的物鏡那樣的明亮的物鏡，則能夠利用圖像觀察來自光量較少的發(fā)光試料的發(fā)光。此外，為了觀察更暗的像，通過將數(shù)值孔徑較大的本發(fā)明的物鏡安裝在實體顯微鏡上，即使不安裝圖像增強器，通過冷卻到0°C左右的CXD攝像機也能夠通過圖像觀察細胞的發(fā)光。此外，雖然有使用液氮冷卻的CCD攝像機提高靈敏度的方法，但在此情況下CCD攝像機變得非常昂貴、大規(guī)模。此外，如果僅單純地提高靈敏度，則外來噪聲也增加，所以高S/N比的測量很困難。但是，如果使用本發(fā)明的物鏡，則通過珀耳帖冷卻的CCD攝像機也能夠通過圖像觀察細胞的發(fā)光，所以能夠不導致外來噪聲(例如宇宙射線)造成的S/N比降低而正確地進行發(fā)光測量。此外，本發(fā)明的物鏡是例如5 IOcm左右的大口徑。由此，能夠?qū)⒁酝荒茏鳛閿z像對象的移動的發(fā)光試料、或分布在較大范圍、例如相當于5 50mm直徑、優(yōu)選為例如10 30mm直徑的區(qū)域中的發(fā)光試料等作為攝像對象。該較大的觀察范圍可以通過物鏡的倍率及變焦機構自如地調(diào)節(jié)。以上的本發(fā)明的方法及裝置也可以通過用來控制所需的裝置結構或聯(lián)動的軟件或以該軟件為特征的計算機程序的方式來提供。此外，通過將本發(fā)明的方法或裝置與相同或單獨配置的數(shù)據(jù)庫電連接，能夠不受圖像容量或分析信息量的限制而提供高速且可靠性與質(zhì)量較高的分析結果。實施例1在本實施例1中，研究能夠通過圖像觀察導入了蟲熒光素酶基因的HeLa細胞的發(fā)光那樣的物鏡的(ΝΑ/β)2的條件。本實施例1的攝像對象(上述實施方式中的樣本1)是轉(zhuǎn)染了蟲熒光素酶基因 "pGL3 control vector" ( 口乂力社(公司名))的HeLa細胞。另外，在該HeLa細胞的發(fā)光圖像觀察時，在將HeLa細胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)1天，用通過Hanks平衡鹽類溶液清洗后，置換為含有ImM的蟲熒光素的Hanks平衡鹽類溶液。在本實施例1中使用的物鏡(上述實施方式中的物鏡2)的數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β )的條件如圖5所示。圖5是表示在實施例1中使用的物鏡的數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β)的條件的圖。如圖5所示，物鏡的NA 是從0. 074到0. 4的值，物鏡的β是從0. 27到1. 5的值。在本實施例1中使用的CXD攝像機(上述實施方式中的CCD攝像機4)是0°C的冷卻CCD攝像機，該CCD攝像機的像素數(shù)是765 X 510、像素尺寸是9 μ mX9 μ m、芯片的面積是6. 89X4. 59 (mm2)、量子效率是550nm 下55%的規(guī)格。另外，在本實施例1中，HeLa細胞的攝像是在將所使用的整個裝置(例如參照圖1)用暗幕覆蓋的狀態(tài)下進行的。在本實施例1中，如圖5所示，示出了在研究的所有的(ΝΑ/β)2的條件下能夠進行發(fā)光圖像的觀察的情況。由此，表示只要使用(ΝΑ/β)2為0.071以上的物鏡，就能夠進行導入了蟲熒光素酶基因的HeLa細胞的發(fā)光圖像觀察。實施例2在本實施例2中，以不同的曝光時間研究能夠通過圖像觀察導入了蟲熒光素酶基因的HeLa細胞的發(fā)光那樣的物鏡的(ΝΑ/β)2的條件。本實施例2的攝像對象與上述的實施例1相同。此外，在本實施例2中使用的物鏡的數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β )的條件如圖6所示。圖6是表示在實施例2中使用的物鏡的數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β)的條件的圖。另外，在本實施例2中使用的物鏡對應于上述實施例1的圖5記載的“0. 4Χ”、“0. 83Χ”及“1. 5Χ”。此外，在本實施例2中使用的C⑶攝像機與上述的實施例1相同。并且，曝光時間如圖6所示，是1分鐘或5分鐘。另外，與上述的實施例1同樣，在本實施例2中，HeLa細胞的發(fā)光圖像攝像也在將所使用的整個裝置用暗幕覆蓋的狀態(tài)下進行。在本實施例2中，如圖7所示，在利用“0. 4Χ”的物鏡以5分鐘的曝光時間拍攝的圖像Α、利用“0. 83Χ”的物鏡以5分鐘的曝光時間拍攝的圖像B、利用“1. 5Χ”的物鏡以5分鐘的曝光時間拍攝的圖像C、以及利用“1. 5Χ”的物鏡以1分鐘的曝光時間拍攝的圖像D的所有的圖像中，能夠進行發(fā)光圖像觀察。從而，在使用(ΝΑ/β)2為0.071以上的物鏡的情況下，即使曝光時間為1分鐘，也能夠進行導入了蟲熒光素酶基因基因的HeLe細胞的發(fā)光圖像觀察。實施例3在本實施例3中，將能夠通過圖像觀察導入了蟲熒光素酶基因的HeLa細胞的發(fā)光那樣的物鏡的(ΝΑ/β)2的條件設為更高倍率來進行研究。本實施例3的攝像對象與上述的實施例1或?qū)嵤├?相同。此外，在本實施例3中使用的物鏡是奧林巴斯公司制造的“UApo40X Oil Iris”。另外，物鏡的數(shù)值孔徑(NA)的條件如圖8所示，各數(shù)值孔徑(NA)是通過改變物鏡的光圈來設定的。圖8是表示在實施例3 中使用的物鏡的數(shù)值孔徑(NA)的條件的圖。如圖8所示，數(shù)值孔徑(NA)的值是從0.65到 1.35。并且，物鏡(A E)的投影倍率(β)的值在聚光透鏡中都設定為8倍。由此，如圖 8所示，物鏡的(ΝΑ/β )2的值在0. 007 0. 028內(nèi)變動。此外，在本實施例3中使用的CXD 攝像機是奧林巴斯公司制造的“DP30BW”，其工作溫度為5°C，像素數(shù)是1360X10M，像素尺寸是6 μ mX6 μ m，芯片的面積(mm2)是13.8X9. 18。并且，曝光時間是2分鐘。另外，與上述的實施例1及實施例2同樣，在本實施例3中，HeLa細胞的攝像也在將所使用的整個裝置用暗幕覆蓋的狀態(tài)下進行。
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在本實施例3中，如圖9所示，對于用NA為從0. 83到1. 35的物鏡拍攝的從圖像 B到圖像E，能夠容易確認HeLa細胞的發(fā)光。S卩，從圖9的圖像B到圖像E能夠容易觀察發(fā)光。另一方面，對于用NA為0.65的物鏡拍攝的圖像A，難以定量地確認發(fā)光。另外，圖9所示的各圖像是通過改變40倍的物鏡(奧林巴斯公司制造的“UApo40X Oil Iris”)的光圈位置來使其NA從0.65到1.35階段性地改變來進行攝像的。由此，在曝光時間是2分鐘的情況下，表示只要(ΝΑ/β)2的值為0.01以上，就能夠進行導入了蟲熒光素酶基因的HeLa細胞的發(fā)光圖像觀察。這里，根據(jù)在實施例3中使用的(圖8所示的)物鏡的(ΝΑ/β )2的值與圖9所示的圖像(圖像Α、圖像B及圖像C)的發(fā)光強度的關系(參照圖10)，研究適合于細胞的發(fā)光圖像觀察的物鏡的(ΝΑ/β )2的條件。圖10是表示以物鏡的(ΝΑ/β )2的值為橫軸繪制圖9 所示的圖像(圖像Α、圖像B及圖像C)的發(fā)光強度的圖。另外，所謂的發(fā)光強度，是從來自包括發(fā)光而明亮的區(qū)域的規(guī)定的區(qū)域(例如在圖9的圖像A中用四邊形表示的區(qū)域)整體的光強度(CCD攝像機的輸出值)減去來自不包括發(fā)光而明亮的區(qū)域(包括不發(fā)光而黑暗的區(qū)域)且具有與上述規(guī)定的區(qū)域的面積相同的面積的區(qū)域整體的光強度(CCD攝像機的輸出值)后的值。如圖10所示，能夠根據(jù)各圖像的發(fā)光強度的偏差(能夠取得圖像的發(fā)光強度的范圍)定量地檢測到在圖9的圖像A的發(fā)光強度與圖像B的發(fā)光強度之間有顯著差異、以及在圖9的圖像B的發(fā)光強度與圖像C的發(fā)光強度之間有顯著差異。此外，在圖10中圖9的圖像A的發(fā)光強度也包括負的值，所以由圖10可知，圖9的圖像A不適合發(fā)光圖像觀察。因而，根據(jù)以上的研究，表示只要物鏡的(ΝΑ/β)2的值是0.01以上，就能夠充分且可靠地進行細胞的發(fā)光圖像觀察。即，表示適于細胞的圖像觀察的物鏡的(ΝΑ/β)2的值是0.01以上。工業(yè)實用性以上，有關本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法、發(fā)光細胞攝像方法及物鏡適合在例如以蟲熒光素等的發(fā)光基因為報告基因、控制基因表達的啟動子或增強子的分析、研究復制因子等的效應物基因或各種藥劑等的效果等的報告基因檢測中使用。
權利要求
1.一種發(fā)光試料攝像方法，對發(fā)光試料進行攝像，其特征在于，使用由物鏡的數(shù)值孔徑NA、及、投影倍率β表示的、(ΝΑ+β)2的值為0.01以上的物鏡和聚光透鏡。
2.如權利要求1所述發(fā)光試料攝像方法，其特征在于， 上述發(fā)光試料是發(fā)光蛋白質(zhì)。
3.如權利要求2所述發(fā)光試料攝像方法，其特征在于， 上述發(fā)光蛋白質(zhì)是由導入的基因表達的。
4.如權利要求3所述發(fā)光試料攝像方法，其特征在于， 上述基因是蟲熒光素酶基因。
5.如權利要求1所述發(fā)光試料攝像方法，其特征在于， 上述發(fā)光試料是發(fā)光性的細胞或發(fā)光性的細胞的集合體。
6.如權利要求1所述發(fā)光試料攝像方法，其特征在于， 上述發(fā)光試料是發(fā)光性的組織試料。
7.如權利要求1所述發(fā)光試料攝像方法，其特征在于， 上述發(fā)光試料是發(fā)光性的個體。
8.一種發(fā)光細胞攝像方法，對導入了蟲熒光素酶基因的發(fā)光細胞進行攝像，其特征在于，使用由數(shù)值孔徑NA及投影倍率β表示的(ΝΑ+β)2的值為0.01以上的物鏡。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種能夠以較短的曝光時間、進而實時地拍攝鮮明的圖像的發(fā)光試料攝像方法、發(fā)光細胞攝像方法及物鏡。在本發(fā)明的發(fā)光試料攝像方法中，使用由數(shù)值孔徑(NA)及投影倍率(β)表示的(NA/β)2的值為0.01以上的物鏡(2)、聚光透鏡(3)、0℃左右的冷卻CCD攝像機(4)、監(jiān)視器(5)，以較短的曝光時間進而實時地拍攝作為發(fā)光試料的樣本(1)。
文檔編號G02B21/36GK102156345SQ20111008687
公開日2011年8月17日 申請日期2005年11月28日 優(yōu)先權日2004年11月26日
發(fā)明者鈴木浩文 申請人:奧林巴斯株式會社