專利名稱：掃描顯微鏡和用于光顯微成像物體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及掃描顯微鏡，具有用于發(fā)射照明光束的光源、用于在待成像物體中產(chǎn)生縱向照明焦點(diǎn)的照明光學(xué)器件和用于通過改變射入方向使照明焦點(diǎn)在待成像物體的待照明目標(biāo)區(qū)域上運(yùn)動的掃描裝置，照明光束沿入射方向射到照明光學(xué)器件的入射光瞳中。
背景技術(shù)：
由現(xiàn)有技術(shù)公開了一些掃描顯微鏡，這些掃描顯微鏡例如使用在突光顯微技術(shù)中，以便用激光激發(fā)用于發(fā)射熒光射束的色素，熒光射束隨后被檢測器檢測，用于成像待檢查的物體。在這種顯微技術(shù)領(lǐng)域上，尤其使用共焦掃描顯微鏡，這種顯微鏡與標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡的不同之處在于在特定的時間點(diǎn)并不照亮整個物體，而是產(chǎn)生一個通常受衍射限制的光斑，借助該光斑逐點(diǎn)掃描物體。由檢測器在各個物體點(diǎn)上檢測到的光信號隨后被匯聚為物體的一幅整體圖像。 這樣的共焦顯微鏡通常具有一個所謂的點(diǎn)掃描器作為掃描裝置，該點(diǎn)掃描器將從光源發(fā)出的照明光束偏轉(zhuǎn)到照明光學(xué)器件的入射光瞳中。照明光學(xué)器件將入射到其入射光瞳中的照明光束變換為聚焦的光分布，該光分布在下文中稱為照明焦點(diǎn)。照明焦點(diǎn)的形狀和大小取決于照明光學(xué)器件的光學(xué)特性、尤其是數(shù)值孔徑。如果照明光束在中心及垂直地、也就是說沿著光軸射到照明光學(xué)器件的入射光瞳中時，照明光學(xué)器件產(chǎn)生一個長形的照明焦點(diǎn)，其橫向于光軸的伸展小于沿著光軸的伸展。照明焦點(diǎn)為了掃描物體而橫向于光軸地運(yùn)動，其方式是，點(diǎn)掃描器例如通過一個可運(yùn)動的鏡裝置改變?nèi)肷浣牵谌肷浣堑倪@種情況下照明光束射到照明光學(xué)器件的入射光瞳中。為了借助共焦顯微鏡進(jìn)行三維成像，物體必須被以上述說明的方式點(diǎn)狀地掃描。由于這樣比較浪費(fèi)，則在近些年來建議了一種在文獻(xiàn)中稱為SPM (Selective PlaneIllumination Microscopy,選擇性平面照明顯微術(shù))的顯微方法。該方法借助一個照明物鏡和一個觀察物鏡工作，所述物鏡彼此呈90度角地布置。該照明物鏡與一個設(shè)置在它前面的柱面透鏡配合作用產(chǎn)生近似平面的照明光分布，所述光分布沿著照明物鏡的光軸穿透過(durchsetzen)物體。這樣的光分布通常也稱為光片或光盤。物體的被這種光片照亮的目標(biāo)區(qū)域通過觀察物鏡成像在一個檢測面、例如一個CXD上，該觀察物鏡的光軸垂直于該光片延伸。如果物體運(yùn)動通過該光片，則可用該裝置拍攝物體的分層圖像。為了產(chǎn)生盡可能薄的光片，照明物鏡必須具有相應(yīng)高的數(shù)值孔徑，其中，照明物鏡的自由工作間距必須相應(yīng)地大，以便避免與觀察物鏡相碰撞。照明物鏡的數(shù)值孔徑相應(yīng)地定義光片的厚度及由此定義沿著觀察物鏡的光軸的光學(xué)分辨率。在W02010/012980 Al中說明的修改后的SPM方法中實(shí)現(xiàn)了用于同一物鏡的照明和檢測。為此，物鏡的入射光瞳被偏心地局部照明(unterle uchtet)，也就是說，照明光束穿過入射光瞳的橫向于光軸偏移的一部分。一個設(shè)置在物鏡前面的柱面透鏡在物體中產(chǎn)生一個照亮的光片，該光片相對物鏡的光軸傾斜地設(shè)置。由該光片照亮的目標(biāo)區(qū)域隨后重新被物鏡成像。
前面所說明的裝置均借助柱面透鏡工作，以便達(dá)到物鏡所希望的傾斜照明。但是，使用這樣的柱面透鏡具有缺點(diǎn)。所述裝置僅被設(shè)計用于借助光片傾斜照明，而不能夠用于任何偏離于此的應(yīng)用情況，例如點(diǎn)狀的共焦掃描。還值得期待的是，產(chǎn)生用于傾斜照明的光片的光強(qiáng)的空間分布可變化。而這借助柱面透鏡是不可能的。此外，更多的文獻(xiàn)可參閱A. H. Voie et al. : “Orthogonal-plane fIuorescence optical sectioning:three-dimensional imaging of macroscopic biolog icalspecimens”，Journal of Microscopy 170,229-236 ( 1993)；J.Huisken, J. Swoger,F. Del Bene, J. ffittbold, E. Η. K. Stelzer: “Optical sectioning de ep inside liveembryos by selective plane illumination microscopy，，，Scie nce 305,1007 (2004)；F. Fahrbach, A. Rohrbach:“Microscopy with non diffracting beams，，,F0M, 2009,Krakau ;C.Dunsby: “Optically sectione d imaging by oblique plane mirror microscopy”，Optics Express Vol. 16,25 (2008)；DE 10 2005 027 077 Al;DE 44 16 558 C2;US 5 952668;WO 2006/127692 A2;DE 10 2006 021 317 B3;W0 2008/128434 Al;US 2009/01354342Al;DE 10 2008 024 568 Al;US 2008/0032414 Al。 在用照明物鏡和單獨(dú)的觀察物鏡工作的方法中，這兩個物鏡通常彼此以90度的角度布置。這種照明物鏡和觀察物鏡彼此垂直的物鏡布置可在成像特定的生物物體時是不利的。例如通常在這樣直角的物鏡布置情況下無碰撞地定位球形物體。這樣的球形物體例如在研究老鼠或家鼠眼睛中的組織培養(yǎng)時被投入應(yīng)用。在此，在常規(guī)的物鏡直角布置時通常會出現(xiàn)由于鄰近組織造成的遮暗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是，對前文所述類型的掃描顯微鏡進(jìn)行改進(jìn)，使得在復(fù)雜的幾何關(guān)系情況下也可無碰撞地光顯微成像。本發(fā)明這樣解決了該任務(wù)，S卩，掃描裝置為了使照明焦點(diǎn)相對照明光學(xué)器件的光軸斜置使照明光束定向在照明光學(xué)器件的入射光瞳的從光瞳中心偏移出的部分區(qū)域上并且為了使照明焦點(diǎn)在待照明的目標(biāo)區(qū)域上運(yùn)動使照明光束的入射方向在該部分區(qū)域中改變，并且設(shè)有一個與照明光學(xué)器件在空間上分開的觀察物鏡，該觀察物鏡被設(shè)置成其光軸基本上垂直于被照明的目標(biāo)區(qū)域且相對照明光學(xué)器件的光軸成一銳角。本發(fā)明首先規(guī)定了，用照明光束對照明光學(xué)器件的入射光瞳進(jìn)行偏心地局部照明，其方式是，照明光束在入射光瞳的從光瞳中心偏移出的部分區(qū)域上通過。入射光瞳的局部照明、也就是說使照明光束并不穿透入射光瞳的整個面積由此不利用完整孔徑的措施不僅在縱向方向上而且在橫向方向上引起(一開始為長形的)照明焦點(diǎn)的擴(kuò)寬。由于照明光束還偏心地射到入射光瞳上，則照明焦點(diǎn)相對照明光學(xué)器件的光軸傾斜地設(shè)置。以此方式擴(kuò)寬及傾斜設(shè)置的照明焦點(diǎn)可被用于構(gòu)成順序地照亮目標(biāo)區(qū)域的光片。為此使用掃描裝置，該掃描裝置負(fù)責(zé)用于照明光束在照明光學(xué)器件的入射光瞳中相應(yīng)的掃描運(yùn)動。該掃描運(yùn)動相應(yīng)于照明光學(xué)器件繞傾斜點(diǎn)的傾斜，該傾斜點(diǎn)位于入射光瞳的區(qū)域中。這意味著，在數(shù)學(xué)意義上顯然不是光線、而是一束光束的照明光束(至少近似地)位置固定地保持在入射光瞳的區(qū)域中，而它在與入射光瞳相隔一段距離地(在掃描裝置的方向上)類似地進(jìn)行相對于平行光軸設(shè)置的參考方向的擺動運(yùn)動。照明光束的傾斜或擺動運(yùn)動將照明光學(xué)器件轉(zhuǎn)換為傾斜設(shè)置的照明焦點(diǎn)橫向于光軸的相應(yīng)運(yùn)動。照明焦點(diǎn)在物體中的運(yùn)動的實(shí)際大小取決于照明光學(xué)器件的具體構(gòu)造。但是重要的是，照明光束的由掃描裝置引起的傾斜根據(jù)本發(fā)明被應(yīng)用于使照明焦點(diǎn)在物體的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)運(yùn)動及由此類似地構(gòu)造一個照明該目標(biāo)區(qū)域的光片。與現(xiàn)有技術(shù)公開的、為了產(chǎn)生光片借助柱面透鏡工作的技術(shù)方案的區(qū)別在于，在根據(jù)本發(fā)明的掃描顯微鏡中，光片借助掃描裝置連續(xù)地構(gòu)造，其中，照明焦點(diǎn)在掃描周期內(nèi)在目標(biāo)區(qū)域上運(yùn)動。為此，其中掃描裝置運(yùn)行的掃描周期被這樣短地調(diào)節(jié)，使得它明顯地低于光檢測器通過照明光學(xué)器件成像目標(biāo)區(qū)域的檢測周期。光檢測器，例如平面檢測器、CCD、CM0S、APD-陣列或類似物相應(yīng)地在時間上“看到”運(yùn)動的照明焦點(diǎn)及由此在空間上并不可分辨出。確切地說，它看到的是光片形式的、空間上相關(guān)聯(lián)的光分布。由于在常規(guī)的共焦掃描顯微鏡中并未設(shè)置一個使照明光束運(yùn)動的掃描裝置，因此本發(fā)明能夠特別有效地產(chǎn)生照明光片。尤其是，基本上可設(shè)置同一顯微鏡構(gòu)造用于不同的應(yīng)用情況。因此，為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的借助光片進(jìn)行對物體的傾斜照明的方案，僅僅需要在一個本身標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)造的共焦掃描顯微鏡中提供用于照明光學(xué)器件的入射光瞳的偏心局部 照明。這例如可借助一個光學(xué)元件實(shí)現(xiàn)，該光學(xué)元件被設(shè)在照明光束的光路中。若掃描顯微鏡接著要再用點(diǎn)狀的照明裝置工作，則光學(xué)元件僅須再次離開照明光束的光路。根據(jù)本發(fā)明的掃描顯微鏡能夠?qū)崿F(xiàn)拍攝物體的高分辨率的截面圖。為此，物體被用光片逐步地掃描。這種掃描例如這樣實(shí)現(xiàn)，即，物體沿著或橫向于照明光學(xué)器件的光軸相對照明光學(xué)器件運(yùn)動。根據(jù)本發(fā)明設(shè)有一個與照明光學(xué)器件在空間上分開的觀察物鏡，該觀察物鏡的光軸基本上垂直于由運(yùn)動的照明焦點(diǎn)產(chǎn)生的光片并且同時相對照明光學(xué)器件的光軸呈銳角地布置。銳角在此指的是一個角，該角小于在常規(guī)布置中設(shè)置的90度的角。該銳角也給出了由照明光學(xué)器件的光軸確定的照明軸線與由觀察物鏡的光軸確定的觀察軸線之間的角度。該角度的值可與現(xiàn)有的具體配置相關(guān)地、尤其是與待檢測物體的形狀相關(guān)地選擇。優(yōu)選地，銳角處于20至80度的角度范圍內(nèi)，其中在該范圍內(nèi)優(yōu)選50度的值。根據(jù)本發(fā)明的傾斜設(shè)置的、進(jìn)行掃描運(yùn)動的照明焦點(diǎn)定義了一個傾斜設(shè)置的物體平面，該平面由觀察物鏡成像。在此，觀察物鏡被這樣地定向，使得其光軸垂直于該物體平面地延伸。本發(fā)明在此能夠?qū)崿F(xiàn)物體平面的特別簡單的定向，其方式是，照明光束根據(jù)所期望的定向在入射到照明光學(xué)器件中時從光瞳中心偏移出。照明光束從光瞳中心偏移得越遠(yuǎn)，照明焦點(diǎn)就越強(qiáng)，由此由運(yùn)動的照明焦點(diǎn)定義的物體平面相對照明光學(xué)器件的光軸被傾斜地設(shè)置。優(yōu)選使用具有相對大的自由工作間距(例如大于Imm)的物鏡系統(tǒng)作為照明光學(xué)器件及觀察物鏡?？梢允褂酶墒轿镧R或利用水或其它液體作為浸入介質(zhì)的浸入物鏡用于照明和觀察。優(yōu)選地，掃描裝置改變照明光束的入射方向，用于在相對照明光學(xué)器件的光軸平行偏移的入射平面內(nèi)產(chǎn)生由運(yùn)動的照明焦點(diǎn)形成的、相對照明光學(xué)器件的光軸傾斜設(shè)置的光片。觀察物鏡在此被設(shè)置成其光軸垂直于產(chǎn)生的光片。假設(shè)照明光學(xué)器件的入射光瞳被構(gòu)造為圓形的，之前所述的入射平面在投射到入射光瞳上的俯視圖中形成一條直線，該直線將由光瞳邊緣定義的圓按照割線的形式在兩個彼此不同的點(diǎn)上切割，而并不與該圓的中心點(diǎn)相交。在之前定義的俯視圖中，照明光束隨后沿著該割線進(jìn)行傾斜運(yùn)動。照明光學(xué)器件將該傾斜運(yùn)動轉(zhuǎn)換為照明焦點(diǎn)沿著一條直線的相應(yīng)運(yùn)動，該直線平行于之前所述的割線地延伸。以此方式，所期望的、用于照明目標(biāo)區(qū)域的光片被以簡單的方式產(chǎn)生。在進(jìn)一步的有利構(gòu)型中，掃描裝置包括一個控制單元以及一個與該控制單元耦聯(lián)的、用于改變光片的傾斜位置的第一調(diào)節(jié)單元和一個與該控制單元耦聯(lián)的、用于運(yùn)動觀察物鏡的第二調(diào)節(jié)單元。該控制單元在此彼此相一致地控制兩個調(diào)節(jié)單元，使得觀察物鏡以其光軸垂直于被第一調(diào)節(jié)單元調(diào)節(jié)的光片地保持定向。該構(gòu)型能夠?qū)崿F(xiàn)光片以及由該光片定義的物體平面的可變的傾斜調(diào)節(jié)。此外，控制單元通過兩個調(diào)節(jié)單元的適當(dāng)控制負(fù)責(zé)用于跟蹤觀察物鏡，以便確保觀察物鏡在物體平面上的垂直定向。在一個可能構(gòu)型中，照明光學(xué)器件沿著垂直于其光軸的調(diào)節(jié)方向可運(yùn)動地導(dǎo)向。此外，在該構(gòu)型中第一調(diào)節(jié)單元包括一個驅(qū)動裝置，該驅(qū)動裝置使用于改變光片的傾斜位置的照明光學(xué)器件沿著該調(diào)節(jié)方向運(yùn)動。當(dāng)照明光學(xué)器件垂直于其光軸地運(yùn)動時，則照明光束穿過的入射光瞳的部分區(qū)域可遠(yuǎn)離光瞳中心或運(yùn)動到光瞳中心，以便加強(qiáng)或減弱照明焦點(diǎn)的傾斜位置。 在一個替換的實(shí)施形式中，第一調(diào)節(jié)單元包括一個在照明光束的光路中設(shè)置在光源與照明光學(xué)器件之間的、沿著橫向于照明光學(xué)器件的光軸的調(diào)節(jié)方向運(yùn)動地導(dǎo)向的光學(xué)偏移元件和一個驅(qū)動裝置，通過該偏移元件照明光束的入射平面平行于照明光學(xué)器件的光軸地偏移，該驅(qū)動裝置為了改變光片的傾斜位置使該偏移元件沿著調(diào)節(jié)方向運(yùn)動。在此，該偏移元件可借助該驅(qū)動裝置直線地、例如垂直于照明光學(xué)器件的光軸地運(yùn)動，但也是沿著一個彎曲的軌跡運(yùn)動，例如繞著一個擺動軸線擺動。此外，該驅(qū)動裝置可這樣構(gòu)造，使得該偏移元件可完全從照明光束的光路中離開。在此情況下可使用根據(jù)本發(fā)明的掃描顯微鏡如常規(guī)的共焦掃描顯微鏡，這種顯微鏡規(guī)定了物體的點(diǎn)狀照明。該光學(xué)的偏移元件例如是一個透明的、平行平面的或錐形的板，該板引起照明光束從照明光學(xué)器件的入射光瞳的中心所期望的偏移。在一個進(jìn)一步的替換實(shí)施形式中，第一調(diào)節(jié)單元包括一個設(shè)置在照明光學(xué)器件的入射光瞳的區(qū)域中的光闌和一個驅(qū)動裝置，該光闌具有一個部分地透過照明光束的光闌孔并且可沿著垂直于照明光學(xué)器件的光軸的調(diào)節(jié)方向運(yùn)動地導(dǎo)向，該驅(qū)動裝置為了改變光片的傾斜位置使光闌沿著調(diào)節(jié)方向運(yùn)動。光闌孔的大小確定入射到照明光學(xué)器件中的照明光束的有效射束直徑。優(yōu)選地，光闌孔的大小是可變的，使得通過調(diào)節(jié)光闌孔可改變照明焦點(diǎn)的尺寸。光闌孔越小，則照明焦點(diǎn)越強(qiáng)地擴(kuò)寬。根據(jù)本發(fā)明的照明光學(xué)器件的入射光瞳的偏心的局部照明也可以與前面所說明的不同的方式來實(shí)現(xiàn)。例如可考慮，照明光束在其光路上在掃描裝置前平行于照明光學(xué)器件的光軸地偏移并且使其射束直徑根據(jù)所期望的局部照明而減小。照明光束的平行偏移例如可通過設(shè)置傾斜放置的玻璃板實(shí)現(xiàn)。如果掃描裝置如在常規(guī)共焦掃描顯微鏡通常的情況下包含一個可運(yùn)動的鏡裝置，則前述平行偏移可用于使照明光束射到該鏡裝置的反射點(diǎn)上，該反射點(diǎn)相對一個照明光束在常規(guī)的共焦應(yīng)用中射到鏡裝置上的反射點(diǎn)存在偏移。這種已經(jīng)在掃描裝置中實(shí)現(xiàn)的偏移隨后引起了照明光束在照明光學(xué)器件的入射光瞳中的所期望的偏心。優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明的掃描顯微鏡包括一個圖像傳感器，該傳感器與觀察物鏡一起構(gòu)成一個檢測單元，該檢測單元可借助第二調(diào)節(jié)單元運(yùn)動。在該構(gòu)型中，圖像傳感器被與觀察物鏡一起跟蹤，從而確保了圖像傳感器與觀察物鏡始終彼此對準(zhǔn)。在一個特別優(yōu)選的構(gòu)型中，照明光束由一個激發(fā)光束和一個受激發(fā)光束匯聚成，這些光束在入射到掃描裝置之前彼此重疊。照明光學(xué)器件從激發(fā)光束中產(chǎn)生激發(fā)焦點(diǎn)及從受激發(fā)光束中產(chǎn)生受激發(fā)焦點(diǎn)，所述焦點(diǎn)與照明焦點(diǎn)相重疊。在熒光顯微鏡的領(lǐng)域中，這樣一個受激發(fā)光束例如可根據(jù)所謂的STED方法用于使光顯微成像的空間分辨率提高超過衍射極限。在STED方法中，用于標(biāo)記物體的各個區(qū)域的熒光色素通過受激發(fā)光束以其本身已知的方式有目的地受激發(fā)及由此仿佛被關(guān)閉，以便提高分辨能力。在根據(jù)本發(fā)明的掃描顯微鏡中，由于使用STED方法照明焦點(diǎn)的有效性可通過將受激發(fā)光束重疊激發(fā)光束而適用于分辨率提高及由此使得出的光片更薄地形成。當(dāng)受激發(fā)光束在到達(dá)掃描裝置之前已經(jīng)重疊了激發(fā)光束，則這兩個彼此重疊的光束通過掃描裝置同時被傾斜到照明光學(xué)器件的入射光瞳中。優(yōu)選地，受激發(fā)焦點(diǎn)具有空間上的光強(qiáng)分布，該光強(qiáng)分布在一個平面中具有最小值及在該平面的兩側(cè)分別具有一個最大值，在該平面中由激發(fā)焦點(diǎn)和受激發(fā)焦點(diǎn)匯聚成的 照明焦點(diǎn)運(yùn)動用于產(chǎn)生光片。而在常規(guī)的STED-方法的應(yīng)用中，受激發(fā)焦點(diǎn)在橫截面中具有環(huán)形形狀，之前所述的實(shí)施形式設(shè)有受激發(fā)焦點(diǎn)，該焦點(diǎn)在橫截面中(在照明焦點(diǎn)運(yùn)動產(chǎn)生光片的平面的上方及下方)具有兩個強(qiáng)度最大值及在這些最大值之間具有一個最小值。在此，該強(qiáng)度橫截面輪廓優(yōu)選被構(gòu)造成以兩個相同大小的最大值對稱并以一個位于其間的零位置作為最小值。該有利的構(gòu)型利用了這樣的情況，即STED-激發(fā)在照明焦點(diǎn)在其中運(yùn)動以產(chǎn)生光片的平面內(nèi)不是必須的，甚至是不希望的。在根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案中應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生一個盡可能大面積的且同時盡可能薄的光片，以便可拍攝空間上高分辨率的光學(xué)截面圖。在此，光片的面積通過運(yùn)動的照明焦點(diǎn)的長度定義，而片厚由橫向于照明焦點(diǎn)在其中運(yùn)動的平面的照明焦點(diǎn)的伸展確定。之前說明的受激發(fā)焦點(diǎn)恰恰被這樣形成，使得它僅在焦點(diǎn)橫向伸展方向上、而并不在焦點(diǎn)長度伸展方向上降低激發(fā)焦點(diǎn)的激發(fā)有效性?？煽紤]為根據(jù)本發(fā)明掃描顯微鏡裝配一個元件，該元件用于在掃描周期內(nèi)改變照明光束的強(qiáng)度，在該掃描周期期間照明焦點(diǎn)在該時間范圍上運(yùn)動。該構(gòu)型利用照明目標(biāo)區(qū)域的光片被擴(kuò)展連續(xù)地通過運(yùn)動的照明焦點(diǎn)的情況。由此，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)區(qū)域的調(diào)制的或結(jié)構(gòu)化的照明。為此，在照明焦點(diǎn)掃描目標(biāo)區(qū)域的掃描周期內(nèi)改變照明光束的強(qiáng)度。由此，照明光束的強(qiáng)度在掃描周期內(nèi)的每個任意時間點(diǎn)上及由此在目標(biāo)區(qū)域的每個任意位置上可根據(jù)期望調(diào)節(jié)。例如可使用聲光可調(diào)諧的濾光器(A0TF)、聲光調(diào)制器(AOM)或電光調(diào)制器(Ε0Μ)作為在掃描周期內(nèi)改變照明光束的強(qiáng)度的元件。根據(jù)本發(fā)明的另一個方案，規(guī)定了具有權(quán)利要求13特征的、用于光顯微成像物體的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法可有利地在定位顯微鏡中使用。通過配量照明確保可檢測單個分子。通過質(zhì)心確定檢測到的光子，可確定使用熒光色素的地方。根據(jù)本發(fā)明的方法可特別有利地用于成像球形生物物體，例如大鼠或小鼠眼睛中的培養(yǎng)組織。


本發(fā)明在下述根據(jù)附圖詳細(xì)說明。其中示出了 圖Ia在常規(guī)共焦掃描顯微鏡中使用的、為了產(chǎn)生照明焦點(diǎn)而完全照亮照明光學(xué)器件的入射光瞳的示意圖；圖Ib在圖Ia中示出的照明焦點(diǎn)的俯視圖；圖2a在常規(guī)共焦掃描顯微鏡中使用的、通過傾斜入射到照明光學(xué)器件的入射光瞳中的照明光束進(jìn)行掃描的示意圖；圖2b在圖2a中示出的照明焦點(diǎn)的俯視圖；圖3a根據(jù)本發(fā)明的、用照明光束對照明光學(xué)器件的入射光瞳的局部照明的示意圖；·
圖3b在圖3a中示出的照明焦點(diǎn)的俯視圖；圖4a根據(jù)本發(fā)明的、通過傾斜局部照明照明光學(xué)器件的入射光瞳的照明光束進(jìn)行掃描的示意圖；圖4b在圖4a中示出的照明焦點(diǎn)的運(yùn)動序列的示意圖；圖5作為第一實(shí)施例的共焦掃描顯微鏡；圖6通過在圖5中示出的照明光學(xué)器件的移動斜置照明焦點(diǎn)的示意圖；圖7觀察物鏡定向在斜置的照明焦點(diǎn)上的示意圖；圖8作為第二實(shí)施例的共焦掃描顯微鏡；圖9作為第三實(shí)施例的共焦掃描顯微鏡；圖10作為第四實(shí)施例的共焦掃描顯微鏡；圖11在根據(jù)圖10的掃描顯微鏡中設(shè)置的、用于斜置照明焦點(diǎn)的光闌板的示意圖；圖12作為第五實(shí)施例的按照STED方法工作的共焦掃描顯微鏡；圖13a激發(fā)焦點(diǎn)與受激發(fā)焦點(diǎn)重疊的示意圖；圖13b在圖13a中示出的激發(fā)焦點(diǎn)和受激發(fā)焦點(diǎn)的俯視圖。
具體實(shí)施例方式在下面結(jié)合圖I至4首先說明了根據(jù)本發(fā)明的偏心的光瞳局部照明的原理。特別是解釋了，照明光學(xué)器件10如何從射到照明光學(xué)器件10的入射光瞳14上的照明光束12中以本發(fā)明的方式產(chǎn)生照明焦點(diǎn)16。在此指出，之前所述附圖是純粹的示意圖，這些示意圖應(yīng)僅僅用于簡化對發(fā)明的理解。在圖Ia中首先示意性地示出了對于常規(guī)共焦的、點(diǎn)狀掃描典型的情況，其中，由照明光束12形成的光束利用照明光學(xué)器件10的完整孔徑，也就是說，穿過照明光學(xué)器件10的入射光瞳14的整個面積。在圖Ia中照明光學(xué)器件10的光軸用O1表示。照明光束12在圖Ia示出的情況下平行于照明光學(xué)器件10的光軸O1定向。照明光學(xué)器件10產(chǎn)生照明焦點(diǎn)16形式的聚焦的光分布，該照明焦點(diǎn)沿著光軸O1的伸展大于橫向于光軸O1的伸展。在后續(xù)的說明中，分別結(jié)合一個坐標(biāo)系，該坐標(biāo)系的X軸在附圖平面中水平地及其z軸在附圖平面中垂直地定向，而y軸從附圖平面中指向外。在這種定義中，入射光瞳14平行于x_y平面地設(shè)置，而光軸O1平行于z軸地延伸。
圖Ib示出了在沿光軸O1的觀察方向的俯視圖中的照明焦點(diǎn)16。在常規(guī)布置中，照明焦點(diǎn)16在俯視圖中為圓形。圖2a示出了照明焦點(diǎn)16的位置在照明光束12被在照明光學(xué)器件10的入射光瞳14中傾斜時如何改變。在此，對于在圖2a中示出的情況假設(shè)，由照明光束12構(gòu)成的照射光束的主射束在入射平面中傾斜，該入射平面平行于x-z平面。此外，照明光束12還應(yīng)總是穿透過入射光瞳12的整個面積，也就是說完全地照亮入射光瞳14。照明光束12在入射平面中這樣傾斜，使得它將其入射方向相對光軸O1改變。入射方向的改變由照明光學(xué)器件10轉(zhuǎn)換為照明焦點(diǎn)16橫向于光軸O1的移動。在圖2a中不出的情況中這種運(yùn)動沿著X軸發(fā)生。由于照明光束12還總是穿透過入射光瞳14的整個面積，照明焦點(diǎn)16的縱向延伸保持平行于光軸O1地定向。這也在圖2b中示出的俯視圖中示出，其中照明焦點(diǎn)16分別總是為圓形的。在圖3a中示出了根據(jù)本發(fā)明的照明光學(xué)器件10的入射光瞳14的局部照明。如 圖3a中可見，照明光束12僅僅穿透過入射光瞳14的部分區(qū)域，其中該部分區(qū)域被偏心地設(shè)置，也就是說橫向于光軸O1地從光瞳中心偏移。照明光束12在入射光瞳14中的偏心導(dǎo)致照明焦點(diǎn)16被相對光軸O1斜置。這也可由根據(jù)圖3b的俯視圖中可見，其中，照明焦點(diǎn)16不再為圓形，而是在X軸方向上長于在y軸方向上。通過對入射光瞳14的局部照明此外引起了照明焦點(diǎn)16的擴(kuò)寬，也就是說，照明焦點(diǎn)16整體上大于在完全照亮入射光瞳14的情況。在圖4a中不出了偏心地局部照明入射光瞳14的照明光束12在入射光瞳14中傾斜的情況。在此，對于圖4a中示出的情況應(yīng)假設(shè)，形成照明光束12的照射光束的主射束在于光軸O1平行的入射平面中傾斜，該平面平行于y-ζ平面。這意味著，該照明光束12在圖4a中從附圖平面傾斜出及傾斜到該平面中。照明光束12的傾斜通過照明光學(xué)器件10在轉(zhuǎn)換為斜置的照明焦點(diǎn)16沿著y軸的相應(yīng)移動。因此，照明焦點(diǎn)16在圖4a中從該附圖平面中移動出及移動到該平面中。這在圖4b的示圖中被再一次示出。在圖4b中示出的照明焦點(diǎn)16的運(yùn)動序列清楚地說明了如何通過照明焦點(diǎn)16的運(yùn)動在掃描周期內(nèi)構(gòu)成光片18。這里，之前所述的掃描周期為在其中照明光束12進(jìn)行一次完整的傾斜運(yùn)動的時間。掃描周期短于檢測時間，在該檢測時間內(nèi)，在圖4a和4b中未示出的光檢測器工作以生成圖像，也就是檢測運(yùn)動的照明焦點(diǎn)。這意味著，光檢測器在時間上及由此在空間上不分辨地檢測運(yùn)動的照明焦點(diǎn)16。相反，它檢測光片18形式的連貫的或連續(xù)的光分布。圖5不出了不意圖中的作為第一實(shí)施例的共焦掃描顯微鏡。掃描顯微鏡100被這樣構(gòu)造，按照圖3和4中草擬的照明原理來工作。在此要指出的是，在圖5的示意圖中刪除了掃描顯微鏡100的一些組件，這些組件對于理解發(fā)明的技術(shù)方案并不是重要的。掃描顯微鏡100構(gòu)成一個共焦突光顯微鏡，該顯微鏡具有激光光源20,該光源發(fā)射照明光束12。照明光束12的波長被這樣選擇，使得在應(yīng)用顯微方法中使用的熒光色素通過照明光束12被激發(fā)用于發(fā)出熒光射束。照明光束12射到一個鏡子22上，該鏡子將照明光束12定向在圖中純示意性示出的電鍍鏡裝置24上。該電鍍鏡裝置24用于這樣地偏轉(zhuǎn)照明光束12，使得其進(jìn)行在圖4a中示出的掃描運(yùn)動。為此，電鍍鏡裝置24借助于在圖5中未詳細(xì)示出的鏡驅(qū)動裝置相應(yīng)地運(yùn)動。接著，照明光束12通過掃描透鏡26和鏡筒透鏡28射入并最終射到照明光學(xué)器件10上。沿著其照明光束12射到照明光學(xué)器件10上的光軸在圖5中用O2表示。光軸O2平行地偏移于照明光學(xué)器件10的從中心穿透過入射光瞳14的光軸Op此外，射入照明光學(xué)器件10中的照明光束12并不完全照亮入射光瞳。這意味著，照明光束12僅穿透過入射光瞳14的部分區(qū)域及由此并不利用照明光學(xué)器件10的整個孔徑。入射光瞳14的局部照明由光闌29引起，該光闌相應(yīng)地修剪由激光光源20發(fā)射出的照明光束12的橫截面。光闌29在圖5中示出的實(shí)施例中設(shè)置在鏡子22的前面。但是，它也可被設(shè)置在照明光束12的光路中的其它位置上。光闌29的光闌孔可被可變地調(diào)節(jié)，由此，射到照明光學(xué)器件10的入射光瞳14上的照明光束12的橫截面以及入射光瞳14的局部照明可任意地變化。為了能夠可變地調(diào)節(jié)被照明光束穿透過的入射光瞳14的偏心區(qū)域，照明光學(xué)器件10在圖5中用雙箭頭A示出的調(diào)節(jié)方向上被可運(yùn)動地導(dǎo)向。調(diào)節(jié)方向A垂直于照明光學(xué)器件10的光軸Op 一個與照明光學(xué)器件10耦聯(lián)的第一驅(qū)動裝置30用于使照明光學(xué)器件10沿著調(diào)節(jié)方向A運(yùn)動。該驅(qū)動裝置30通過一個控制單元32控制。圖5中示出的組件24，26，28，30和32是一個總體上用33表示的掃描裝置的部件，該掃描裝置用于使照明光束12在照明光學(xué)器件10的入射光瞳14中如其在圖4a和4b中示出的那樣傾斜。掃描裝置33與照明光學(xué)器件10配合作用產(chǎn)生光片18，該光片照亮一個設(shè)置在物體支座34上的物體36的待成像的目標(biāo)區(qū)域。掃描顯微鏡100此外具有一個觀察物鏡38，該物鏡這樣地在樣品36上定向，使得其在圖5中用O3表示的光軸垂直地豎立在光片18上。由于光片18相對照明光學(xué)器件10的光軸O1傾斜，觀察物鏡38的光軸O3和照明光學(xué)器件10的光軸O1圍成一個銳角α，該銳角小于90度。在圖5中示出的實(shí)施例中該角α為大約60度。觀察物鏡38通過一個鏡筒透鏡40將物體36的借助光片18照亮的目標(biāo)區(qū)域成像到光敏傳感器42上。在此，觀察物鏡38的光軸O3垂直于該光檢測器42的光接收面44。觀察物鏡38、鏡筒透鏡40和光檢測器42構(gòu)成一個檢測單元46，該檢測單元可借助于一個垂直于O3定向的第二驅(qū)動裝置47在光片16上擺動，如在圖5中通過雙箭頭B示出的那樣。第二驅(qū)動裝置47同樣通過控制單元32控制。控制單元32控制兩個驅(qū)動裝置30和47，使得包含觀察物鏡38的檢測單元46在照明光學(xué)器件10沿著調(diào)節(jié)方向A移動時通過在擺動方向B上的擺動被這樣地跟蹤，使得接收物鏡38以其光軸O3保持垂直地定向在位置可變的光片18上。照明光學(xué)器件10沿著調(diào)節(jié)方向A的移動和檢測單元46在擺動方向B上的擺動通過控制單元32被這樣地彼此協(xié)調(diào)，使得始終保持觀察物鏡38在光片18上的直角定向。在圖6的示意圖中示出了，在圖5中示出的實(shí)施例中照明光學(xué)器件10垂直于光軸O1的移動如何造成照明焦點(diǎn)16的可變的斜置。在圖6的左側(cè)部分附圖中所示，當(dāng)照明光束12射到照明光學(xué)器件10的入射光瞳14中心上時，長形的照明焦點(diǎn)16沿著光軸O1定向。如果照明光學(xué)器件10垂直于其光軸O1地移動，使得照明光束12從光瞳中心移動到光瞳邊緣，則照明焦點(diǎn)16相對光軸O1增大傾斜地設(shè)置。這更清楚地說明了，可如何通過照明光學(xué)器件10的移動改變由照明焦點(diǎn)16產(chǎn)生的光片18的定向。
在圖7中再一次示出了，觀察物鏡38如何被定向到由照明光學(xué)器件10產(chǎn)生的照明焦點(diǎn)16上。則觀察物鏡38的光軸O3垂直于照明焦點(diǎn)16的縱向伸展地延伸。此外，在圖7中再一次表明，如何通過照明光束12在照明光學(xué)器件10的入射光瞳14中的傾斜從運(yùn)動的照明焦點(diǎn)16中產(chǎn)生光片18。圖8示出了作為第二實(shí)施例的掃描顯微鏡200。掃描顯微鏡200的那些與圖5中示出的掃描顯微鏡100的組件相一致的組件設(shè)有在圖5中使用的參考標(biāo)記并且在下面不再說明。根據(jù)圖8的實(shí)施例與圖5中示出的實(shí)施例的區(qū)別在于，代替觀察光學(xué)器件10，可在擺動方向C上擺動地導(dǎo)向一個透明的平面平行的板50、例如玻璃板，以便調(diào)節(jié)照明光束12在照明光學(xué)器件10的入射光瞳14中的偏心入射。該平面平行的板50設(shè)置在鏡筒透鏡28與入射光瞳14之間的照明光束12的光路中。它相對照明光學(xué)器件10的光軸O1傾斜地定向。由此，照明光束12在穿透該平面平行的板50時具有平行偏移，該偏移可使該照明光束偏心地入射到照明光學(xué)器件10的入射光瞳14中。
照明光束12的平行偏移可變化，其方式是，驅(qū)動裝置30在擺動方向C上傾斜該平面平行的板50，該板可繞一個垂直于圖8的附圖平面延伸的擺動軸線51擺動地支承。圖9示出了作為第三實(shí)施例的掃描顯微鏡300。該掃描顯微鏡300相對圖8中示出的顯微鏡200被如下修改，使得該平面平行的板50被替換為一個透明的、錐形的板60。當(dāng)照明光束入射穿過該錐形的板60時，該錐形的板60也引起照明光束12的偏移。驅(qū)動裝置30在該實(shí)施例中并不使該錐形的板60垂直于照明光學(xué)器件10的光軸O1、而是沿著一個調(diào)節(jié)方向D地運(yùn)動，該調(diào)節(jié)方向相對光軸O1傾斜。圖10示出了作為第四實(shí)施例的掃描顯微鏡400。該實(shí)施例與圖8中示出的實(shí)施例的區(qū)別在于，為了實(shí)現(xiàn)照明光束12偏心地入射到入射光瞳14中而代替平面平行的板50地設(shè)有一個可沿著調(diào)節(jié)方向A運(yùn)動地導(dǎo)向的光闌板52。該光闌板52具有一個可變的光闌孔54，該孔使照明光束12在穿透過光闌孔54時這樣地修剪其橫截面，使得實(shí)現(xiàn)了入射光瞳14所希望的局部照明。由于光闌孔54可被任意地調(diào)節(jié)，則在圖10中示出的實(shí)施例中也可放棄在之前的實(shí)施例中設(shè)置的光闌元件29。在圖11中再次示意性示出了光闌板52的作用方式。當(dāng)驅(qū)動裝置30使光闌板52垂直于照明光學(xué)器件10的光軸O1移動時，照明光束12的、穿透過光闌孔54的部分從光瞳中心偏移出。如果照明光束12的穿透部分從光瞳中心移動到光瞳邊緣，則照明焦點(diǎn)16相對光軸O1增大傾斜地設(shè)置。在圖11中示出了由于與入射光瞳14相距一定間距而較簡單地示出的光闌板54。但是由此指出，光闌板54優(yōu)選盡可能近地設(shè)置在入射光瞳14旁，以便不會不利地影響照明光束12在入射光瞳14中的設(shè)置用于運(yùn)動照明焦點(diǎn)16的傾斜運(yùn)動。圖12不出了作為第五實(shí)施例的掃描顯微鏡。該掃描顯微鏡500與圖5中不出的實(shí)施例相比被如下修改，該顯微鏡被這樣設(shè)計，即，使用本身已知的STED-方法實(shí)現(xiàn)超過衍射極限的空間分辨率。在此需指出的是，這種變化不僅僅對于圖5中示出的實(shí)施例、而且對于所有其它的實(shí)施例都是可能的。掃描顯微鏡500包括一個激發(fā)光源61,該光源發(fā)射激發(fā)光束62,該光束的波長被這樣選擇，使得使用的熒光色素被激發(fā)用于輸出熒光射束。此外，掃描顯微鏡500包括一個受激發(fā)光源64，該光源發(fā)射受激發(fā)光束66，該受激發(fā)光束以進(jìn)一步在下面說明的方式與激發(fā)射束62相重疊并且其波長被這樣選擇，使得被激發(fā)光束62照亮的熒光色素通過受激發(fā)射而受激發(fā)及由此似乎被關(guān)閉。由受激發(fā)光源64發(fā)出的受激發(fā)光束66穿透過一個相板68，該相板用于調(diào)節(jié)受激發(fā)光束66的期望的強(qiáng)度包絡(luò)。激發(fā)光束62穿透過一個光闌70并且射到一個鏡子72上，該鏡子朝著分束器74的方向反射激發(fā)光束62。分束器74被這樣構(gòu)造,使得在它反射穿透過相板68和另一光闌76的受激發(fā)光束66期間，它允許激發(fā)光束62透過。以此方式，激發(fā)光束62和其強(qiáng)度包絡(luò)受相板68影響的受激發(fā)光束66彼此重疊。這兩個彼此重疊的光束62和66形成照明光束12。在圖13a和13b中示出了，激發(fā)光束62和受激發(fā)光束66形成照明光束12的重疊如何造成所應(yīng)用的顯微方法的分辨能力的提高。在照明射束12在此由激發(fā)光束62和受激發(fā)光束66重疊構(gòu)成之后,照明光學(xué)器件 10產(chǎn)生一個激發(fā)焦點(diǎn)80以及一個受激發(fā)焦點(diǎn)82，這些焦點(diǎn)以其重疊得出在圖13a和13b中用84表示的照明焦點(diǎn)。在此，在圖13a和13b中示出的激發(fā)焦點(diǎn)80的形狀相應(yīng)于在圖3和4中示出的照明焦點(diǎn)16的形狀。在圖13b中，激發(fā)焦點(diǎn)80、受激發(fā)焦點(diǎn)82和得出的照明焦點(diǎn)84在一個平行于x_z平面的截面中示出。如由此示圖中清楚可見，受激發(fā)焦點(diǎn)82具有空間的光強(qiáng)分布，在該光強(qiáng)分布中光強(qiáng)在一個平面內(nèi)等于零，在該平面內(nèi)由激發(fā)焦點(diǎn)80和受激發(fā)焦點(diǎn)82匯聚成的照明焦點(diǎn)84在其中運(yùn)動，而該光強(qiáng)分布在該平面的兩側(cè)均具有最大值。前述平面在圖13b中用86表示。它平行于一個平面，該平面包含y軸并且其與x-z平面的交叉線與X軸形成一個角度。該角度與使用的照明光學(xué)器件10的最大張開角以及照明光束12的擴(kuò)寬以及偏心相關(guān)。當(dāng)激發(fā)焦點(diǎn)80在該運(yùn)動平面86的上方及下方與受激發(fā)焦點(diǎn)82重疊時，激發(fā)焦點(diǎn)80的激發(fā)有效性從運(yùn)動平面86之上及之下降下來。激發(fā)焦點(diǎn)80的有效激發(fā)部分在圖13b中被用陰影示出。在圖13b中，激發(fā)焦點(diǎn)62仿佛沿通過線88示出的方向收縮。該收縮方向88垂直地豎立在運(yùn)動平面86上。激發(fā)焦點(diǎn)80與受激發(fā)焦點(diǎn)82的重疊引起了有效激發(fā)的光片似乎被變薄，由此提高了空間分辨率。參考標(biāo)號表10照明光學(xué)器件12照明光束14入射光瞳16照明焦點(diǎn)18 光片20激光光源22 鏡子24鏡裝置26掃描透鏡28鏡筒透鏡
30驅(qū)動裝置32控制單元34物體支座36 物體38觀察物鏡40鏡筒透鏡42光檢測器44光接收面 46檢測單元47驅(qū)動裝置50平面平行的板51擺動軸線52光闌板54光闌孔60錐形板61激發(fā)光源62激發(fā)光束64受激發(fā)光源66受激發(fā)光束68 相板70 光闌72 鏡子74分束器76 光闌80激發(fā)焦點(diǎn)82受激發(fā)焦點(diǎn)84照明焦點(diǎn)86運(yùn)動平面88收縮方向
權(quán)利要求
1.掃描顯微鏡(100，200，300，400，500)，具有用于發(fā)射照明光束(12)的光源(20,61,64),用于在待成像的物體(36)中產(chǎn)生長形的照明焦點(diǎn)(16，84)的照明光學(xué)器件(10)，和掃描裝置(33)，用于使照明焦點(diǎn)(16，84)在待成像的物體(36)的待照明的目標(biāo)區(qū)域上通過改變?nèi)肷浞较蚨\(yùn)動，照明光束(12)在該入射方向上射到照明光學(xué)器件(10)的入射光瞳(14)上，其特征在干，掃描裝置(33)為了使照明焦點(diǎn)(16，84)相對照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)斜置使照明光束(12)定向在照明光學(xué)器件(10)的入射光瞳(14)的從光瞳中心偏移出的部分區(qū)域上并且為了使照明焦點(diǎn)(16，84)在待照明的目標(biāo)區(qū)域上運(yùn)動使照明光束(12)的入射方向在該部分區(qū)域中改變，并且設(shè)有ー個與照明光學(xué)器件(10)在空間上分開的觀察物鏡(38)，該觀察物鏡被設(shè)置成其光軸(O3)基本上垂直于被照明的目標(biāo)區(qū)域且相對照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)成ー銳角(α )。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的掃描顯微鏡(100，200，300，400，500)，其特征在于，掃描裝置(33)在入射平面內(nèi)改變照明光束(12)的入射方向，以產(chǎn)生由運(yùn)動的照明焦點(diǎn)(16，84)形成的、相對照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)斜置的光片(18)，該入射平面相對照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)平行偏移，并且觀察物鏡(38)以其光軸(O3)垂直于該光片(18)地設(shè)置。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的掃描顯微鏡(100，200，300，400，500)，其特征在于，掃描裝置(33)包括控制單元(32)以及與該控制単元(32)耦聯(lián)的、用于改變光片(18)的傾斜位置的第一調(diào)節(jié)單元(30，50，52，60)和與該控制単元(32)耦聯(lián)的、用于運(yùn)動觀察物鏡(38)的第二調(diào)節(jié)單元(47)，并且該控制單元(32)使所述兩個調(diào)節(jié)單元(30，50，52，60 ；47)彼此相協(xié)調(diào)地控制，使得觀察物鏡(38)保持定向?yàn)槠涔廨S(O3)垂直于由第一調(diào)節(jié)單元(30，50，52，60)調(diào)節(jié)的光片(18)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的掃描顯微鏡(100)，其特征在干，照明光學(xué)器件(10)沿著ー個垂直于其光軸(O1)的調(diào)節(jié)方向(A)被運(yùn)動地導(dǎo)向，并且，第一調(diào)節(jié)單元包括驅(qū)動裝置(30)，該驅(qū)動裝置使照明光學(xué)器件(10)沿著調(diào)節(jié)方向(A)運(yùn)動以改變光片(18 )的傾斜位置。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的掃描顯微鏡(200，300)，其特征在于，第一調(diào)節(jié)單元包括在照明光束(12)的光路中設(shè)置在光源(20)與照明光學(xué)器件(10)之間的、可沿著橫向于照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)的調(diào)節(jié)方向(A, C, D)運(yùn)動地導(dǎo)向的光學(xué)偏移兀件(50,60)，通過該光學(xué)偏移元件，照明光束(12)的入射平面平行于照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)地偏移，和驅(qū)動裝置(30)，該驅(qū)動裝置使偏移元件(50，60)沿著調(diào)節(jié)方向(Α，C，D)運(yùn)動以改變光片(18)的傾斜位置。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的掃描顯微鏡(200,300),其特征在于,光學(xué)偏移兀件是ー個透明的、平面平行的或錐形的板(50，60 )。
7.根據(jù)權(quán)利要求2至6中之一所述的掃描顯微鏡(400)，其特征在于，第一調(diào)節(jié)單元包括設(shè)置在照明光學(xué)器件(10)的入射光瞳(14)的區(qū)域中的光闌(52)，該光闌具有部分地穿透過照明光束(12)的光闌孔(54)并且可沿著垂直于照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)運(yùn)動地導(dǎo)向，和驅(qū)動裝置(30)，該驅(qū)動裝置使該光闌(52)沿著調(diào)節(jié)方向(A)運(yùn)動以改變光片(18)的傾斜位置。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中之一所述的掃描顯微鏡(100，200，300，400，500)，其特征在于光檢測器(42)，該光檢測器與觀察物鏡(38)構(gòu)成檢測單元(46)，該檢測単元可借助第二調(diào)節(jié)單元(47)運(yùn)動。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的掃描顯微鏡(100，200，300，400，500)，其特征在于，掃描裝置(33)具有鏡裝置(24)和鏡驅(qū)動裝置，該鏡裝置將由光源(20，61，64)發(fā)射的照明光束(12)反射到入射光瞳(14)從光瞳中心偏移出的部分區(qū)域中，該鏡裝置可通過該鏡驅(qū)動裝置運(yùn)動以改變照明光束(12)的入射方向。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至9中之一所述的掃描顯微鏡(100，200，300，400，500)，其特征在于，照明光學(xué)器件(10)的入射光瞳(14)的由照明光束(12)穿透過的部分區(qū)域占入射光瞳(14)的整個面積的約O. 1%至50%，及入射平面相對照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)的平行偏移為入射光瞳(14)的半徑的約4% 至 96%。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的掃描顯微鏡(500),其特征在于，照明光束(12)由激發(fā)光束(62)和受激發(fā)光束(66)匯聚成，這些光束在入射到掃描裝置(33)之前彼此重疊，并且照明光學(xué)器件(10)從激發(fā)光束(62)中產(chǎn)生激發(fā)焦點(diǎn)(80)及從受激發(fā)光束(66)中產(chǎn)生受激發(fā)焦點(diǎn)(82)，這些焦點(diǎn)彼此重疊為照明焦點(diǎn)(84)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的掃描顯微鏡(500)，其特征在于，受激發(fā)焦點(diǎn)(82)具有空間上的光強(qiáng)分布，該光強(qiáng)分布在ー個平面(86)中具有最小值及在該平面(86)的兩側(cè)分別具有最大值，由激發(fā)焦點(diǎn)(80)和受激發(fā)焦點(diǎn)(82)匯聚成的照明焦點(diǎn)(84)在該平面中運(yùn)動用于產(chǎn)生光片(18)。
13.用于光顯微成像物體(36)的方法，具有以下步驟發(fā)射照明光束(12)，借助照明光學(xué)器件(10)在待成像的物體(36)中產(chǎn)生ー個長形的照明焦點(diǎn)(16，84)，通過改變?nèi)肷浞较蚴拐彰鹘裹c(diǎn)(16，84)在物體(36)的待照明的目標(biāo)區(qū)域上運(yùn)動，照明光束(12)沿著該入射方向射到照明光學(xué)器件(10)的入射光瞳(14)中，其特征在干，為了相對照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)斜置照明焦點(diǎn)(16，84)，照明光束(12)被定向在入射光瞳(14)的從光瞳中心偏移出的部分區(qū)域上，并且為了使照明焦點(diǎn)(16，84)在待照明的目標(biāo)區(qū)域上運(yùn)動而在該部分區(qū)域內(nèi)改變照明光束(12)的入射方向，并且用傾斜設(shè)置的照明焦點(diǎn)(16，84)照明的目標(biāo)區(qū)域通過ー個與照明光學(xué)器件(10)在空間上分開的觀察物鏡(38)成像，該觀察物鏡被設(shè)置成其光軸(O3)基本上垂直于被照明的目標(biāo)區(qū)域并且與照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)成ー銳角(α )。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在干，為了產(chǎn)生由運(yùn)動的照明焦點(diǎn)(16，84)構(gòu)成的光片(18)，照明光束(12)的入射方向被在ー個入射平面內(nèi)改變，該入射平面相對照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)平行地偏移，并且觀察物鏡(38)的光軸(O3)垂直于該光片(18)地設(shè)置。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，改變光片(18)的傾斜位置及與光片(18)的傾斜位置的改變相一致地移動觀察物鏡(38)，使得該觀察物鏡(38)保持定向?yàn)槠涔廨S(O3)垂直于被調(diào)節(jié)的光片(18)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，觀察物鏡(38)與ー個光檢測器(42)共同地運(yùn)動。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16中之一所述的方法，其特征在干，照明光束(12)由激發(fā)光束(62)和受激發(fā)光束(66)匯聚而成，并且從激發(fā)光束(62)中產(chǎn)生激發(fā)焦點(diǎn)(80)及從受激發(fā)光束(66)中產(chǎn)生受激發(fā)焦點(diǎn)(82)，這些焦點(diǎn)彼此重疊成照明焦點(diǎn)(84)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在干，受激發(fā)焦點(diǎn)(82)的空間強(qiáng)度分布這樣地調(diào)節(jié)，使得它在ー個平面(86)中具有最小值及在該平面(86)的兩側(cè)分別具有最大值，在該平面中，移動由激發(fā)焦點(diǎn)(80)和受激發(fā)焦點(diǎn)(82)匯聚成的照明焦點(diǎn)(84)以產(chǎn)生光片(18)。
全文摘要
掃描顯微鏡(100，200，300，400，500)包括用于發(fā)射照明光束(12)的光源(20，61，64)，用于在待成像的物體(36)中產(chǎn)生長形的照明焦點(diǎn)(16，84)的照明光學(xué)器件(10)，和掃描裝置(33)，用于通過改變?nèi)肷浞较蚴拐彰鹘裹c(diǎn)(16，84)在待成像的物體(36)的待照明的目標(biāo)區(qū)域上運(yùn)動，照明光束(12)在該入射方向上射到照明光學(xué)器件(10)的入射光瞳(14)上。掃描裝置(33)為了使照明焦點(diǎn)(16，84)相對照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)斜置使照明光束(12)定向在照明光學(xué)器件(10)的入射光瞳(14)的從光瞳中心偏移出的部分區(qū)域上并且為了使照明焦點(diǎn)(16，84)在待照明的目標(biāo)區(qū)域上運(yùn)動使照明光束(36)的入射方向在該部分區(qū)域中改變。設(shè)有一個與照明光學(xué)器件(10)在空間上分開的觀察物鏡(38)，該觀察物鏡以其光軸(O3)基本上垂直于被照明的目標(biāo)區(qū)域地及相對照明光學(xué)器件(10)的光軸(O1)成一銳角(α)地設(shè)置。
文檔編號G02B21/06GK102830488SQ20121019922
公開日2012年12月19日 申請日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者W·克內(nèi)貝爾, H·烏利齊 申請人:徠卡顯微系統(tǒng)復(fù)合顯微鏡有限公司