專利名稱：掃描共焦顯微術(shù)中的改進以及與之相關(guān)的改進的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及掃描共焦顯微術(shù)，更特別地涉及對安裝在掃描共焦顯微系統(tǒng)中的樣本的一個或多個區(qū)域的選擇性照明(illustration)。
背景技術(shù)：
共焦顯微鏡通常用于觀察半透明顯微物體的內(nèi)部細節(jié)，特別是在生物應(yīng)用中，其通常采用熒光照明。這種顯微鏡的基本特征是利用通過小孔(pinhole)聚焦的光照射樣本并且結(jié)合對通過相同小孔返回的光的觀察，結(jié)果是檢測到的光基本上與該小孔在樣本內(nèi)的特定像平面相關(guān)，而不是與樣本上方或下方的平面相關(guān)。這樣能夠在該樣本內(nèi)獲得準確的深度分辨率。通常，將激光器用于在小孔處提供非常緊聚焦的強光束。如上所述，這種系統(tǒng)給出了有關(guān)該樣本中僅ー個點的信息。然而，利用兩個可選的和全然不同的方法能夠擴展這種原理，從而提供該樣本的擴展像(image)。在第一種方法中，稱作‘掃描光斑(scanning spot)’，在感興趣的區(qū)域上對小孔進行光學(xué)掃描，記錄返回的強度，以便重建樣本的像。在第二種方法中，平行照射許多小孔，以同時給出整個感興趣區(qū)域的信息。一種這樣的配置是‘Nipkow盤(disk)’，其中將小孔設(shè)置在盤中，然后使該盤旋轉(zhuǎn)以給出該區(qū)域的多次掃描的覆蓋。這種方法特別適合應(yīng)用于對活細胞的高速成像，這是目前生物學(xué)中相當(dāng)受關(guān)注的課題。然而，本發(fā)明與各種形式的共焦掃描有關(guān)，但尤其涉及采用多個小孔的共焦掃描。ー些已知的分析技術(shù)涉及向樣本的選定區(qū)域投送強光束，以便改變該選定區(qū)域中的樣本材料屬性。例如，在熒光顯微術(shù)中所使用的許多染料在暴露于非常強的光源時會‘漂白(bleach)，。漂白特定的區(qū)域使該區(qū)域被‘標記’ 一使其與其他本來不可區(qū)分開的相鄰區(qū)域區(qū)分開，從而允許該區(qū)域在移動和顯影時被追蹤。這種‘光致漂白后的熒光恢復(fù)(Fluorescence Recovery After Photobleaching)’(或者 FRAP)允許細胞內(nèi)的傳送機能被監(jiān)視。通常，擴散過程將使漂白斑在一時間段之后恢復(fù)，該時間段是由擴散的速率決定的。對于粘性低的媒質(zhì)，這ー過程會非?？?，在微秒數(shù)量級。目標照射(targetedillumination)的第二個實例是光催化(photoactivation)。ー些染料在被非常強的光源催化時會改變其熒光色。同樣，這使某一區(qū)域被‘標記’并且允許傳送機能被研究。掃描光斑共焦系統(tǒng)非常適于目標照射應(yīng)用。單個掃描光斑覆蓋了樣本的所有部分，所以在光斑位于感興趣區(qū)域上方的同時提高激光功率產(chǎn)生了目標照射。盡管這種方法較慢且低效，但是ー些年來目標照射已經(jīng)可用在掃描光斑系統(tǒng)中。然而，對于旋轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)并非如此，其中光學(xué)裝置的平行照射無法顯著提高指定區(qū)域上的光強度
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于將光束輸入到從掃描共焦顯微系統(tǒng)的共焦掃描頭延伸到顯微鏡的光路中以照射安裝在顯微鏡中的樣本的選定區(qū)域的組件，其中所述組件包括
一光輸入端，用于接收來自光源的光束；
-射束(beam)引導(dǎo)裝置，用于根據(jù)樣本的選定區(qū)域的形狀來控制光束的路徑；以及-射束耦合器，用于將光束選擇性地耦合到從共焦掃描頭到顯微鏡的光路中，其中由射束引導(dǎo)裝置來控制射束方向以便照射選定區(qū)域。特別地，光束的強度可足以漂白樣本選定區(qū)域的熒光部分或者以其它方式改變其光學(xué)屬性，使得例如FRAP或者光催化實驗?zāi)軌蜻M行。該顯微系統(tǒng)的安排(其中來自該組件的光束被選擇性地輸入到共焦頭所使用的相 同端口中)是有益的，因為這允許耦合(切換)裝置被設(shè)置在顯微鏡外。因此，能夠在無需進入顯微鏡內(nèi)部或者無需在顯微鏡內(nèi)容納附加部件的情況下實現(xiàn)本發(fā)明。為了留有足夠空間供該組件插在共焦掃描頭與顯微鏡端口之間，該組件可以包括光中繼器(optical relay)，用以將在共焦掃描頭與顯微鏡之間的光路上形成的樣本像從該組件的顯微鏡側(cè)中繼(relay)到該組件的掃描共焦頭側(cè)。因此共焦掃描頭的工作基本上不會因引入該組件而受到影響。優(yōu)選的是，該光中繼器包括在光路中限定了孔的擋板(baffle)，用以減少雜散光的透身寸(transmission)?？梢栽谏涫詈掀髋c顯微鏡之間提供場鏡(field lens)以會聚光束。射束耦合器可以包括反射元件，該反射元件能被選擇性地插入在共焦掃描頭與顯微鏡之間的光路中，以促進透射的光束注射(inject)到光路中。反射元件可以采用反射鏡(miiTor)的形式。有利的是，反射元件可以是分束器，以允許樣本在該組件的照射期間被觀察。在優(yōu)選實施例中，該組件包括用于選擇性地改變所透射光束的直徑以調(diào)整在該樣本處生成的照射光斑尺寸的裝置。這可以通過在通過該組件的射束路徑中選擇性插入具有不同光學(xué)屬性的望遠鏡來實現(xiàn)。優(yōu)選的是，將前、后望遠鏡透鏡安裝在各自的可旋轉(zhuǎn)支架上，以允許將每個支架上安裝的透鏡選擇性地插入光束路徑中。該組件還可以包括用于調(diào)整輸入到該組件中的光束的方向和橫向位移的裝置。為此，可以安裝輸入射束準直器(collimator),以便允許改變其定向(orientation)以實現(xiàn)這些調(diào)整。在優(yōu)選實施例中，該準直器具有與每一端相鄰的圓柱形外表面，并且與這些表面中的每個表面相接觸地提供兩個螺紋調(diào)整器(adjuster)。所述調(diào)整器的軸優(yōu)選基本上平行，并且適當(dāng)操縱所述調(diào)整器以允許根據(jù)需要對光束路徑進行調(diào)整。以平行配置(而不是以垂直調(diào)整器對)提供所述調(diào)整器使它們能夠被安裝成使得都能夠由用戶從該組件的一側(cè)接近。在優(yōu)選實施例中，射束引導(dǎo)裝置包括兩個樞轉(zhuǎn)地(PiVOtably)安裝的反射鏡，它們的樞轉(zhuǎn)軸(pivotal axes)基本上相互垂直，以允許在兩個正交方向(即在該樣本平面中的X和y方向)上改變射束的方向。此外，可以提供透鏡以將射束的這些角偏轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫猩涫灰?。該引?dǎo)裝置可操作來將射束朝著樣本上的一個或多個離散點引導(dǎo)，或者操縱射束以使得基本上均勻地照射預(yù)定區(qū)域。優(yōu) 選的是，提供將樞轉(zhuǎn)地安裝的反射鏡之一成像到另一個反射鏡上的裝置，例如光中繼器。在一個實施例中，該中繼器包括兩個透鏡對?？梢栽谠摌修D(zhuǎn)地安裝的反射鏡之間的光路中提供附加的反射鏡，以減少其占用的空間的長度。特別地，附加的反射鏡可以包括相互正交配置的一對平面反射鏡，以便使入射在它們之一上的射束的方向反轉(zhuǎn)。將它們安裝為使得能夠沿著平行于入射射束的線調(diào)整它們的位置，以提供聚焦調(diào)整。在優(yōu)選配置中，提供瞄準透鏡以將射束引導(dǎo)裝置所引起的光束的角偏轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫猩涫灰啤？梢匀绱税惭b瞄準透鏡，以使得能夠利用例如兩個相互正交的螺紋調(diào)整器相對于通過它的光路橫向調(diào)整其位置。這使得該組件所輸入的光束與來自共焦頭的觀察射束對準(al i gnment)?？梢栽谠摻M件的顯微鏡側(cè)的像平面中的光路中選擇性地插入目標(target)，以輔助該組件的校準。還提供了一種顯微系統(tǒng)，其包括本文中所描述的顯微鏡、照相機、共焦掃描頭、光輸入組件，以及與該組件相耦合的光源，其中該系統(tǒng)包括用于控制射束引導(dǎo)裝置和光源這二者的控制器，以便照射樣本的選定區(qū)域。在優(yōu)選實施例中，該控制器可操作來輸出控制信號到射束引導(dǎo)裝置，其將射束的運動限定為基本上等長的步進(step)序列。這可以用于以適當(dāng)恒定的速度在樣本上移動所引導(dǎo)的光束，使得對選定區(qū)域的照射基本上均勻。而且，這可以簡化所需步進的計算。該控制器可以以大于該系統(tǒng)照相機分辨率的分辨率計算步進，從而提供射束的更平滑、更準確的運動。優(yōu)選的是，該分辨率大約是60倍或更大。控制器中可以包括存儲器，其配置為將用于控制光源的指令集與用于控制射束引導(dǎo)裝置的指令集分開存儲，使得這兩個指令集能夠相互獨立地更新。在優(yōu)選實施例中，該控制器可操作來并行處理用于控制光源的指令和用于控制射束引導(dǎo)裝置的指令。該控制器可以包括FPGA，其被編程為計算將被輸出到引導(dǎo)裝置和光源的控制參數(shù)。特別地，其可以配置為并行運行計算這些參數(shù)的程序。這相對于使用兩個或更多獨立處理器提高了控制參數(shù)之間的同步性，因為這些程序能夠根據(jù)公共時鐘在FPGA上運行。本發(fā)明還提供了一種光開關(guān)，其用于在共焦頭的光輸入端與光束輸入組件的光輸入端之間選擇性地切換光源所輸出的光束。該光開關(guān)可以包括平面反射鏡和用于改變反射鏡定向的驅(qū)動器。該驅(qū)動器優(yōu)選為直接驅(qū)動DC電機。其可以包括用于生成指示反射鏡定向的信號的旋轉(zhuǎn)編碼器。在一種實施方案中，反射鏡能夠在第一位置與第二位置之間切換，在第一位置處光束未入射在反射鏡上，而是直接穿過該開關(guān)到達共焦頭輸入端，在第二位置處光束轉(zhuǎn)向透射到光束輸入組件的光輸入端。有利的是，可以在通過光開關(guān)的每個光路中提供光中繼器，以降低對于開關(guān)的角度失準的敏感性。該中繼器把輸入到開關(guān)組件的光轉(zhuǎn)移(transfer)到其輸出端，并且將所輸入的射束聚焦到輸入端與輸出端之間的點。優(yōu)選的是，該點接近于該開關(guān)的反射鏡(當(dāng)處于第二位置吋)。該中繼器可以是位于開關(guān)組件的輸入端和兩個輸出端處的透鏡的形式。優(yōu)選的是，在輸入端和輸出端中的每ー個處提供一對消色差透鏡(例如Edmund X08-050)。優(yōu)選的是，反射鏡能夠在兩個止端(end stop)之間切換并且控制裝置與驅(qū)動器耦合，以使反射鏡在其止端之間的行程(travel)的第一部分期間加速并且在其行程的第二部分期間減速。可以在單點共焦掃描顯微系統(tǒng)中采用該組件，但是其特別針對多點共焦掃描顯微系統(tǒng)。根據(jù)另ー個方面，本發(fā)明提供了一種校準包括本文所述的光輸入組件的顯微系統(tǒng)的方法，包括以下步驟
(a)根據(jù)預(yù)定的射束引導(dǎo)裝置設(shè)置來依次照射至少六個點中的每個點；
(b)利用照相機記錄姆個點的位置；
(C)確定每個點的照相機像素位置；以及
(d)將像素位置(X，y)和射束引導(dǎo)裝置設(shè)置(U，V)對輸入到以下方程中
權(quán)利要求
1.ー種光開關(guān)，用于在路徑之間選擇性地切換光束，其包括用于接收來自光源的光束的光輸入端；至少兩個輸出路徑，姆個輸出路徑導(dǎo)向相應(yīng)的光輸出端；用于選擇性地插入光束中以將光束引導(dǎo)到選定的輸出路徑的平面反射鏡；用于改變反射鏡的定向的驅(qū)動器;以及在通過光開關(guān)的每個光路中提供的光中繼器，以減少對于開關(guān)中的角度失準的敏感性，其中每個中繼器被安排為將輸入到開關(guān)的光轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的選定輸出路徑，并且將輸入射束聚焦到輸入端與輸出端之間接近于反射鏡的點，其中所述中繼器包括在光輸入端處的聚焦透鏡和在每個光輸出端處的相應(yīng)的準直透鏡，其中所述反射鏡能夠在兩個終點止動裝置之間切換，并且控制裝置耦合到驅(qū)動器以在反射鏡的在所述終點止動裝置之間的行程的第一部分期間加速反射鏡并且在其行程的第二部分期間減速反射鏡。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的光開關(guān)，其中在輸入端和輸出端的每個處提供一對消色差透鏡。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的光開關(guān)，其中所述驅(qū)動器包括直接驅(qū)動DC電機。
4.根據(jù)前面任一項權(quán)利要求所述的光開關(guān)，其中所述光開關(guān)包括用于生成指示反射鏡的定向的信號的旋轉(zhuǎn)編碼器。
5.根據(jù)前面任一項權(quán)利要求所述的光開關(guān)，其中所述反射鏡能夠在兩個終點止動裝置之間切換，并且控制裝置耦合到驅(qū)動器以在反射鏡的在所述終點止動裝置之間的行程的第一部分期間加速反射鏡并且在其行程的第二部分期間減速反射鏡。
6.根據(jù)前面任一項權(quán)利要求所述的光開關(guān)，其中通過驅(qū)動器使得所述反射鏡相對于每個終點止動裝置偏置。
7.根據(jù)前面任一項權(quán)利要求所述的光開關(guān)，其中所述反射鏡能夠在第一位置與第二位置之間進行切換，其中在第一位置處光束不入射到所述反射鏡，而在第二位置處光束被所述反射鏡轉(zhuǎn)向。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于將光束輸入到從掃描共焦顯微系統(tǒng)的共焦掃描頭(102)延伸到顯微鏡(104)的光路中以照射安裝在顯微鏡中的樣本的選定區(qū)域的組件(100)和方法。所述組件包括光輸入端，用于接收來自光源的光束；射束引導(dǎo)裝置(8、12)，用于根據(jù)樣本的選定區(qū)域的形狀來控制光束的路徑；以及射束耦合器(16)，用于將光束選擇性地耦合到從共焦掃描頭(102)到顯微鏡(104)的光路中，其中由射束引導(dǎo)裝置來控制射束方向以便照射選定區(qū)域。本發(fā)明還描述了一種包括這種組件的掃描共焦顯微系統(tǒng)，以及校準該系統(tǒng)的方法。此外，公開了一種用于在兩個路徑之間選擇性地切換光束的光開關(guān)。
文檔編號G02B21/00GK102914861SQ201210236769
公開日2013年2月6日 申請日期2007年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月14日
發(fā)明者R.A.霍爾特, G.R.西利 申請人:珀金埃爾默新加坡私人有限公司