一種具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法
【專利摘要】本發(fā)明技術(shù)涉及一種具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法。該方法利用單元分別可調(diào)的二維空間光調(diào)制器及虛擬針孔算法實(shí)現(xiàn)樣品表面孤立點(diǎn)照明、探測光路針孔成像等共軛成像原理，從而提高共聚焦顯微成像系統(tǒng)速度、圖像分辨率和信噪比。該方法提高共聚焦顯微成像系統(tǒng)速度、圖像分辨率和信噪比等圖像質(zhì)量，并使得在追求成像速度與成像質(zhì)量這一對相互沖突的指標(biāo)過程中用戶根據(jù)需要?jiǎng)討B(tài)快速大范圍內(nèi)調(diào)整。
【專利說明】—種具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明【技術(shù)領(lǐng)域】是光學(xué)顯微成像技術(shù)，更具體的是實(shí)現(xiàn)共軛成像原理的共軛光學(xué)顯微成像【技術(shù)領(lǐng)域】，提供一種具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法。
【背景技術(shù)】
[0002]共聚焦顯微成像技術(shù)就是在照明光路中實(shí)現(xiàn)照明針孔、在成像光路中實(shí)現(xiàn)探測針孔的顯微成像技術(shù)。根據(jù)實(shí)現(xiàn)共軛聚焦的裝置和方式，共聚焦顯微成像技術(shù)大體上可分為三類。第一類是激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù)LSCM (Laser Scanning ConfocalMicroscopy),是通過動(dòng)態(tài)控制振鏡將投射其上的激光斑點(diǎn)對樣品實(shí)現(xiàn)逐行掃描，多行掃描完成樣品整個(gè)觀察視場FOV的掃描。激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù)(LSCM)是產(chǎn)業(yè)化得最早的共聚焦顯微成像技術(shù)。這類方法圖像質(zhì)量與信噪比高，然而時(shí)間效率低，一般在一秒鐘一幅共軛圖像。另外該技術(shù)難于在圖像質(zhì)量與圖像速度這一始終矛盾的技術(shù)指標(biāo)中根據(jù)用戶當(dāng)時(shí)需要快速調(diào)節(jié)。
[0003]第二類是碟片共聚焦顯微成像技術(shù)SDCM (Spinning-disk ConfocalMicroscopy)。該類技術(shù)利用高速旋轉(zhuǎn)刻有多條螺旋排列的孔動(dòng)碟片實(shí)現(xiàn)樣品孤立點(diǎn)照明、孤立點(diǎn)探測(及共軛成像原理)，獲得共聚焦圖像。該類方法提高了共聚焦顯微成像技術(shù)的時(shí)間效率，一般能夠在一秒鐘獲得幾幅甚至幾十幅的共聚焦圖像。另外該技術(shù)在照明光路中添加微陣列聚光鏡，提高照明光源的使用效率。碟片共聚焦顯微成像技術(shù)采用旋轉(zhuǎn)多針孔碟片以及與之匹配的微型聚光鏡實(shí)現(xiàn)多光束掃描的方法，克服了 LSCM效率低，成像速度過慢等缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)并行共聚焦顯微成像，可以實(shí)時(shí)成像。這類方法難度很高，因而造價(jià)昂貴。另外與SLCM—樣，該類技術(shù)也不能快速調(diào)節(jié)圖像質(zhì)量與成像速度來滿足用戶實(shí)際觀察需要。
[0004]第三類技術(shù)是利用結(jié)構(gòu)光實(shí)現(xiàn)照明針孔，獲得顯微鏡SM(StructuredIIlumination Microscopy)。結(jié)構(gòu)光顯微鏡SIM是在落射顯微鏡基礎(chǔ)上增加照明調(diào)制功能，通過采集多幅互補(bǔ)圖像并經(jīng)過計(jì)算機(jī)合成方法來提高圖像在縱向和橫向的分辨率。第三類技術(shù)提高成像效率，同時(shí)降低造價(jià)。中國發(fā)明專利申請200810071654.8提供了一種二維空間光調(diào)制技術(shù)，來提高含有二維空間光調(diào)制器的顯微成像系統(tǒng)的空間分辨率。然而所述發(fā)明中照明空間調(diào)制模式之間必須有較大重疊量:一維調(diào)制模式重疊量為50%,因此時(shí)間效率降低1/2 ;二維照明空間調(diào)制模式重疊量為，時(shí)間效率降低55%。另外，該方法實(shí)現(xiàn)非常有限的調(diào)制模式，不能在較大范圍內(nèi)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)成像速度與成像質(zhì)量。
[0005]因此在共聚焦顯微成像領(lǐng)域，還有待發(fā)明既能提高圖像成像質(zhì)量，又能根據(jù)需要提高成像速度的方法，來滿足用戶在觀察過程中，有時(shí)需要高的成像速度來做初步快速觀察或者對活細(xì)胞做跟蹤觀察，有時(shí)需要提高圖像質(zhì)量如橫向分辨率、縱向切片分辨率、圖像對比度、圖像清晰度等要求來提供高質(zhì)量圖片用于發(fā)表。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高共聚焦顯微成像系統(tǒng)速度、圖像分辨率和信噪比等圖像質(zhì)量，并使得在追求成像速度與成像質(zhì)量這一對相互沖突的指標(biāo)過程中用戶根據(jù)需要?jiǎng)討B(tài)快速大范圍內(nèi)調(diào)整的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]一種具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，步驟如下:
[0009]1)將一個(gè)樣品觀察視場分割成N個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明圖案Pi,其中，NS ≧l，i=l，2,..., N ；
[0010]2)生成對應(yīng)于Pi的二維空間光調(diào)制器的微陣列矩陣Di,并控制二維空間光調(diào)制器產(chǎn)生對應(yīng)于Pi的空間調(diào)制照明模式；
[0011]3)圖像探測器曝光并獲取在當(dāng)前照明調(diào)制模式下的樣品圖像Ii,并將樣品圖像Ii提供給計(jì)算控制單元，在圖像探測器完成樣品在Pi的空間調(diào)制照明模式下的曝光后，計(jì)算控制單元通知二維空間光調(diào)制器消除當(dāng)前的照明調(diào)制模式，等待Pi+1的空間調(diào)制照明模式；
[0012]4)計(jì)算控制單元根據(jù)預(yù)先刻度好的二維空間光調(diào)制器與圖像探測器的空間對應(yīng)關(guān)系R，首先計(jì)算出二維空間光調(diào)制器產(chǎn)微陣列模式Di所對應(yīng)的圖像探測器成像面上虛擬針孔位置模式Vi ；
[0013]5)根據(jù)虛擬針孔位置模式Vi對樣品圖像Ii進(jìn)行虛擬針孔運(yùn)算操作，獲取一幅對應(yīng)于在當(dāng)前空間調(diào)制照明模式下實(shí)現(xiàn)了虛擬針孔的改進(jìn)的樣品圖像Fi ；
[0014]6)重復(fù)步驟2)到步驟5)，完成N幅在二維空間調(diào)制照明模式下實(shí)現(xiàn)虛擬針孔的樣品圖像集合F ;
[0015]7)合成樣品圖像集合F，獲得樣品在該視場下完整的共聚焦圖像。
[0016]作為優(yōu)選，步驟I)和步驟2)的順序允許顛倒或者合并，步驟3)和步驟4)的順序允許顛倒。
[0017]作為優(yōu)選，步驟I)中，將樣品觀察視場分割成N個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明圖案Pi的方法為:通過分割能夠控制樣品照明斑點(diǎn)個(gè)數(shù)、位置和各斑點(diǎn)大小的二維空間光調(diào)制器的微陣列矩陣Di，使其產(chǎn)生N幅空間互補(bǔ)的照明模式，N幅照明模式的疊加恰好覆蓋樣品的整個(gè)觀察視場。
[0018]作為優(yōu)選，步驟I)所述的N個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明圖案Pi的子塊拼合后，恰好沒有疊加、沒有空隙的完整覆蓋樣品的觀察視場。
[0019]作為優(yōu)選，步驟I)所述的N個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明圖案Pi (i=l，2，…，N)為:N個(gè)空間互補(bǔ)的線狀照明，所述的N個(gè)線狀照明拼合后，恰好沒有疊加、沒有空隙的完整覆蓋樣品的觀察視場。
[0020]作為優(yōu)選，步驟I)所述的N個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明圖案Pi (i=l,2,…，N)為:二維點(diǎn)陣照明，所述賓N個(gè)空間互補(bǔ)的二維點(diǎn)陣照明模塊拼合后，恰好沒有疊加、沒有空隙的完整覆蓋樣品的觀察視場。
[0021]作為優(yōu)選，所述的二維空間光調(diào)制器與圖像探測器時(shí)間同步，在前一幅Pi的空間調(diào)制照明模式準(zhǔn)備好后才開始對樣品成像曝光，在完成對樣品在前一幅Pi的空間調(diào)制照明模式下圖像曝光完畢之后，后一幅pi+1的空間調(diào)制照明模式才開始照射到樣品上。[0022]作為優(yōu)選，在顯微成像系統(tǒng)每次更換維二維空間光調(diào)制器或者圖像探測器之后，需要重新對該系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)先刻度，重新獲取二維空間光調(diào)制器的微陣列矩陣與圖像探測器的二維像素陣列的空間對應(yīng)關(guān)系R。
[0023]作為優(yōu)選，所述的二維空間光調(diào)制器與圖像探測器的空間對應(yīng)關(guān)系R，是一個(gè)對二維空間物體平面操作的矩陣，該矩陣包含二維平移、繞著光軸Z軸轉(zhuǎn)動(dòng)、一個(gè)二維空間光調(diào)制器單元對應(yīng)M*M個(gè)圖像探測器的放大因子。
[0024]作為優(yōu)選，步驟4)中，所述的根據(jù)虛擬針孔位置模式Vi為二維矩陣，矩陣單元值是O或1，分別表示相反的透光狀態(tài)或阻擋狀態(tài)。
[0025]作為優(yōu)選，步驟5)中，對樣品圖像Ii進(jìn)行虛擬針孔Vi運(yùn)算操作為:“與”運(yùn)算=Vi(j，k)為I的單元所對應(yīng)的Ii (j, k)值不變，Vi (1，m)為O的單元所對應(yīng)的Ii (1，m)值取零；其中，(j，k), (I, m)為二維圖像的像素位置(X，y)座標(biāo)。
[0026]作為優(yōu)選，步驟7)中，合成N個(gè)空間互補(bǔ)的虛擬針孔算法輸出的樣品圖像集合Fi方法為:對N個(gè)F圖像進(jìn)行簡單的空間疊加，在同一個(gè)座標(biāo)位置(j，k)對N幅圖像進(jìn)行求和。
[0027]作為優(yōu)選，所述的二維空間光調(diào)制器是單元為數(shù)字快速可調(diào)的數(shù)字微鏡設(shè)備。
[0028]本發(fā)明的有益效果如下:
[0029]本發(fā)明利用單元分別可調(diào)的二維空間光調(diào)制器及虛擬針孔算法實(shí)現(xiàn)樣品表面孤立點(diǎn)照明、探測光路針孔成像等共軛成像原理，從而提高共聚焦顯微成像系統(tǒng)速度、圖像分辨率和信噪比等圖像質(zhì)量，并使得在追求成像速度與成像質(zhì)量這一對相互沖突的指標(biāo)過程中用戶根據(jù)需要?jiǎng)討B(tài)快速大范圍內(nèi)調(diào)整。
[0030]本發(fā)明所述的方法，首先利用二維空間光調(diào)制器與圖像探測器之間的空間對應(yīng)關(guān)系，一次性建立二維空間光調(diào)制器二維微陣列矩陣Di與圖像探測器二維像素陣列的空間對應(yīng)關(guān)系R，從而建立與孤立照明針孔即空間調(diào)制模式對應(yīng)的探測照明虛擬針孔陣列Vi，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)共軛成像原理，提高圖像在XY平面的圖像分辨率、清晰度、對比度，減少樣品離焦信號的影響，實(shí)現(xiàn)樣品2D切片及縱向分辨率。
[0031]其次，利用二維空間光調(diào)制器的獨(dú)立可調(diào)單元實(shí)現(xiàn)對樣品的照明斑點(diǎn)大小、位置、個(gè)數(shù)等實(shí)現(xiàn)控制。當(dāng)樣品被照明斑點(diǎn)之間的距離超過針孔成像的衍射二級環(huán)半徑之后，針孔照明斑點(diǎn)之間可以近似當(dāng)成針孔成像，樣品不同照明斑點(diǎn)之間的干擾降低。根據(jù)用戶對成像速度與質(zhì)量的要求，可以動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)樣品斑點(diǎn)的個(gè)數(shù)和大小:增加斑點(diǎn)面積或者增加斑點(diǎn)個(gè)數(shù)(即減少照明斑點(diǎn)之間距離)都提高成像質(zhì)量，反之降低斑點(diǎn)面積或者降低斑點(diǎn)個(gè)數(shù)都提聞成像速度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1是本發(fā)明的流程圖；
[0033]圖2是將樣品觀察視場分割成N=IO —維空間互補(bǔ)照明模式下的普通分辨率板的圖片；
[0034]圖3是將樣品觀察視場分割成N=30 —維空間互補(bǔ)的照明模式下所采集到的分辨率板的圖片；
[0035]圖4是二維空間調(diào)制照明模式的一種實(shí)施例；[0036]圖5、圖6是圖像質(zhì)量與速度動(dòng)態(tài)可調(diào)效果圖，其中，圖5是在樣品視場分割個(gè)數(shù)N=I時(shí)，圖像質(zhì)量相當(dāng)于普通顯微明場成像，成像速度在全視場情況下高達(dá)100幀每秒，對于特定ROI區(qū)域成像，可以上千上萬；圖6是在樣品視場分割個(gè)數(shù)N=IO時(shí)，一維空間調(diào)制照明模式下，依次10幅空間互補(bǔ)照明圖案，分別獲得10幅樣品虛擬針圖像，合成后的質(zhì)量較聞圖像。
【具體實(shí)施方式】
[0037]以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0038]本發(fā)明所使用的二維空間光調(diào)制器為數(shù)字微鏡設(shè)備(digitalmirrordevice, DMD)也可以是液晶LCD或者別的能夠?qū)φ丈淦渖系墓膺M(jìn)行微小區(qū)域的開關(guān)控制。
[0039]對于DMD，對于照射在上面的光，可以有選擇地反射:處于“開”狀態(tài)的微鏡將光反射如照明光路落射倒樣品；處于“關(guān)”狀態(tài)的微鏡將光反射出照明光路，使其不能落射倒樣
品O
[0040]對于液晶IXD，開關(guān)的執(zhí)行是通過數(shù)字調(diào)節(jié)每一個(gè)像素即液晶單元的電壓來控制該單元是通過光還是阻擋光的透射。
[0041]在顯微成像系統(tǒng)所包含二維空間光調(diào)制器在光路中與攝像頭的空間關(guān)系調(diào)整、對準(zhǔn)、固定以后，二維空間光調(diào)制器的微陣列矩陣與圖像探測器的圖像傳感器像素陣列空間對應(yīng)關(guān)系就是唯一確定的。在每次更換維空間光調(diào)制器或者圖像探測器之后，需要對系統(tǒng)重新進(jìn)行預(yù)先刻度，即重新獲取二維空間光調(diào)制器的二維的微陣列矩陣與圖像探測器二維像素陣列的空間對應(yīng)關(guān)系R。這個(gè)空間對應(yīng)關(guān)系R可以是一個(gè)對二維空間物體平面操作的矩陣，該矩陣包含二維平移、繞著光軸Z軸轉(zhuǎn)動(dòng)、一個(gè)二維空間光調(diào)制器單元對應(yīng)于M*M個(gè)圖像探測器的放大因子等。這個(gè)空間對應(yīng)關(guān)系R在系統(tǒng)的以后使用過程中可以保持不變，除非改變或者移動(dòng)了攝像頭。如果改變或者移動(dòng)了二維空間光調(diào)制器，也是需要重新校對空間對應(yīng)關(guān)系R。
[0042]如圖1所示的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，具體步驟以下:
[0043]步驟一，用戶根據(jù)成像質(zhì)量、成像速度，將一個(gè)樣品觀察視場分割成N (N 3 I)個(gè)空間互補(bǔ)的平面圖案Pi (1=1,2,…，N)，其分割方式滿足將所有N個(gè)圖案的子塊拼合起來剛好覆蓋待觀察樣品視場的全部。如果希望圖像質(zhì)量高，那么就產(chǎn)生幾十個(gè)甚至上百個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明模式圖(N就是幾十或者幾百)。如果希望獲取圖像的速度高，那么就將樣品視場的照明分割成I個(gè)或者幾個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明模式圖(N就是I個(gè)或者幾個(gè))；另外一個(gè)提高成像速度的途徑是采用大孔徑的照明針孔，就是平面照明模式圖中包含的照明斑點(diǎn)面積增大。因此，本發(fā)明所述的方法能夠?qū)崿F(xiàn)大范圍的圖像質(zhì)量與速度動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。
[0044]本實(shí)施例中，將樣品觀察視場分割成N (N ^ I)個(gè)空間互補(bǔ)的平面圖案Pi (i=l,2，…，N)的方法為:通過分割能夠控制樣品照明斑點(diǎn)個(gè)數(shù)、位置和各斑點(diǎn)大小的二維空間光調(diào)制器的單元模式，使其產(chǎn)生N幅空間互補(bǔ)的照明模式，這些照明模式的疊加覆蓋樣品整個(gè)觀察視場。為了提高時(shí)間效率，N個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明圖案Pi (i=l,2,…，N)的子塊拼合起來剛好沒有疊加、沒有空隙的覆蓋樣品當(dāng)前觀察視場的全部。N個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明圖案？1 (1=1,2,…，N)可以是常規(guī)的線掃共聚焦技術(shù)的N個(gè)空間互補(bǔ)的線狀照明，也可以是二維點(diǎn)陣照明。[0045]步驟二，生成對應(yīng)于Pi的二維空間光調(diào)制器的微陣列矩陣Di,并控制二維空間光調(diào)制器產(chǎn)生對應(yīng)于Pi的空間調(diào)制照明模式，為對樣品在該幅Pi的空間調(diào)制照明模式下成像做好準(zhǔn)備。
[0046]本實(shí)施例中，使用數(shù)字微鏡設(shè)備(DMD)作為二維空間光調(diào)制器，通過改變寫入到每個(gè)微鏡單元所對應(yīng)的內(nèi)存的數(shù)字，可以使部分微鏡單元將照射其上的光信號轉(zhuǎn)出光路從而不能到達(dá)樣品，另外一部分微鏡單元?jiǎng)t允許照射其上的光信號到達(dá)樣品，從而實(shí)現(xiàn)對應(yīng)于一個(gè)互補(bǔ)圖案Pi (1=1,2,…，N)的空間調(diào)制照明模式照射在待測樣品表面。
[0047]步驟三，在照射在待測樣品表面Pi的空間調(diào)制照明模式形成后，在圖像探測器曝光并獲取在該空間調(diào)制照明模式下的樣品圖像Ii，并將圖像Ii提供給計(jì)算控制單元，在圖像探測器完成樣品在Pi的空間調(diào)制照明模式下的曝光后，計(jì)算控制單元通知二維空間光調(diào)制器消除當(dāng)前的照明調(diào)制模式，等待pi+1的空間調(diào)制照明模式。
[0048]步驟四，計(jì)算控制單元根據(jù)一個(gè)預(yù)先刻度好的二維空間光調(diào)制器與圖像探測器的空間對應(yīng)關(guān)系R，計(jì)算出二維空間光調(diào)制器微陣列矩陣Di所對應(yīng)的圖像探測器成像面上虛擬針孔位置模式虛擬針孔位置模式Vi可以是簡單的二維矩陣，例如矩陣單元值是O或1，如果I代表透過針孔，O就代表阻擋，I或O代表的意思相反也可以。虛擬針孔的孔徑大小是由所對應(yīng)的二維空間光調(diào)制器如DMD的照明模式來定，如果要求成像速度高，孔徑就選用大孔徑。
[0049]步驟五，對樣品圖像Ii進(jìn)行虛擬針孔Vi運(yùn)算操作可以是簡單的快速“與”運(yùn)算=Vi(j，k)為I的單元所對應(yīng)的Ii (j, k)值不變，Vi (1，m)為O的單元所對應(yīng)的Ii (1，m)值取零；其中(j，k)，(1，m)為二維圖像(也是矩陣)的像素位置(X，y)座標(biāo)。
[0050]步驟六，重復(fù)步驟二到步驟五，完成N幅在二維空間調(diào)制照明模式下實(shí)現(xiàn)虛擬針孔的樣品圖像集合F。
[0051]步驟七，合成N個(gè)空間互補(bǔ)的虛擬針孔算法輸出的樣品圖像集合F方法可以是對N個(gè)F圖像進(jìn)行簡單的空間疊加，即在同一個(gè)座標(biāo)位置(j，k)對N、幅圖像進(jìn)行簡單求和。
[0052]圖2所示的是將樣品觀察視場分割成N=IO —維空間互補(bǔ)照明模式下的普通分辨率板的圖片。該照明模式是每隔開10條線提供一條DMD微鏡為“開”狀態(tài)。這樣照明全視場需要10個(gè)這樣的照明模式，采集對應(yīng)的10幅這樣的照片。
[0053]圖3所示的是將樣品觀察視場分割成N=30 —維空間互補(bǔ)的照明模式下所采集到的分辨率板的圖片。該照明模式是每隔開10條線提供一條DMD微鏡為“開”狀態(tài)。這樣照明全視場需要10個(gè)這樣的照明模式，采集對應(yīng)的10幅這樣的照片。
[0054]相比圖2與圖3可以看出，空間互補(bǔ)模式多，被照明部分樣品的彼此干擾就小。
[0055]圖4是一種二維空間調(diào)制模式的實(shí)施例，是在X方向每10個(gè)空間調(diào)制單元打開一個(gè)，在Y方向每10個(gè)空間調(diào)制單元打開一個(gè)。這種調(diào)制模式是10X10點(diǎn)陣照明模式。
[0056]圖5、圖6是圖像質(zhì)量與速度動(dòng)態(tài)可調(diào)效果圖，其中，圖5是在樣品視場分割個(gè)數(shù)N=I時(shí)，圖像質(zhì)量相當(dāng)于普通顯微明場成像，成像速度在全視場情況下高達(dá)100幀每秒，對于特定ROI區(qū)域成像，可以上千上萬；圖6是在樣品視場分割個(gè)數(shù)N=IO時(shí)，一維空間調(diào)制照明模式下，依次10幅空間互補(bǔ)照明圖案，分別獲得10幅樣品虛擬針圖像，合成后的質(zhì)量較高圖像。在局部ROI區(qū)域成像情況下，速度也可以達(dá)到幾十甚至幾百幀每秒，使得速度和質(zhì)量滿足活細(xì)胞跟蹤觀察需要。[0057]上述實(shí)施例僅是用來說明本發(fā)明，而并非用作對本發(fā)明的限定。只要是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)，對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、變型等都將落在本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，步驟如下: 1)將一個(gè)樣品觀察視場分割成N個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明圖案Pi,其中，NS1，i=l,2,..., N ； 2)生成對應(yīng)于Pi的二維空間光調(diào)制器的微陣列矩陣Di,并控制二維空間光調(diào)制器產(chǎn)生對應(yīng)于Pi的空間調(diào)制照明模式； 3)圖像探測器曝光并獲取在當(dāng)前照明調(diào)制模式下的樣品圖像Ii,并將樣品圖像Ii提供給計(jì)算控制單元，在圖像探測器完成樣品在Pi的空間調(diào)制照明模式下的曝光后，計(jì)算控制單元通知二維空間光調(diào)制器消除當(dāng)前的照明調(diào)制模式，等待Pi+1的空間調(diào)制照明模式； 4)計(jì)算控制單元根據(jù)預(yù)先刻度好的二維空間光調(diào)制器與圖像探測器的空間對應(yīng)關(guān)系R，首先計(jì)算出二維空間光調(diào)制器產(chǎn)微陣列模式Di所對應(yīng)的圖像探測器成像面上虛擬針孔位置模式Vi ； 5)根據(jù)虛擬針孔位置模式Vi對樣品圖像Ii進(jìn)行虛擬針孔運(yùn)算操作，獲取一幅對應(yīng)于在當(dāng)前空間調(diào)制照明模式下實(shí)現(xiàn)了虛擬針孔的改進(jìn)的樣品圖像Fi ； 6)重復(fù)步驟2)到步驟5)，完成N幅在二維空間調(diào)制照明模式下實(shí)現(xiàn)虛擬針孔的樣品圖像集合F ; 7)合成樣品圖像集合F，獲得樣品在該視場下完整的共聚焦圖像。
2.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，步驟I)和步驟2)的順序允許顛倒或者合并，步驟3)和步驟4)的順序允許顛倒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，步驟I)中，將樣品觀察視場分割成N個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明圖案Pi的方法為:通過分割能夠控制樣品照明斑點(diǎn)個(gè)數(shù)、位置和各斑點(diǎn)大小的二維空間光調(diào)制器的微陣列矩陣Di，使其產(chǎn)生N幅空間互補(bǔ)的照明模式，N幅照明模式的疊加恰好覆蓋樣品的整個(gè)觀察視場。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，步驟I)所述的N個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明圖案Pi的子塊拼合后，恰好沒有疊加、沒有空隙的完整覆蓋樣品的觀察視場。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，步驟I)所述的N個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明圖案Pi (i=l,2,…，N)為:N個(gè)空間互補(bǔ)的線狀照明，所述的N個(gè)線狀照明拼合后，恰好沒有疊加、沒有空隙的完整覆蓋樣品的觀察視場。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，步驟I)所述的N個(gè)空間互補(bǔ)的平面照明圖案Pi (1=1,2,…，N)為:二維點(diǎn)陣照明，所述賓N個(gè)空間互補(bǔ)的二維點(diǎn)陣照明模塊拼合后，恰好沒有疊加、沒有空隙的完整覆蓋樣品的觀察視場。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，所述的二維空間光調(diào)制器與圖像探測器時(shí)間同步，在前一幅Pi的空間調(diào)制照明模式準(zhǔn)備好后才開始對樣品成像曝光，在完成對樣品在前一幅Pi的空間調(diào)制照明模式下圖像曝光完畢之后，后一幅Pi+1的空間調(diào)制照明模式才開始照射到樣品上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，在顯微成像系統(tǒng)每次更換維二維空間光調(diào)制器或者圖像探測器之后，需要重新對該系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)先刻度，重新獲取二維空間光調(diào)制器的微陣列矩陣與圖像探測器的二維像素陣列的空間對應(yīng)關(guān)系R。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，所述的二維空間光調(diào)制器與圖像探測器的空間對應(yīng)關(guān)系R，是一個(gè)對二維空間物體平面操作的矩陣，該矩陣包含二維平移、繞著光軸Z軸轉(zhuǎn)動(dòng)、一個(gè)二維空間光調(diào)制器單元對應(yīng)M*M個(gè)圖像探測器的放大因子。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，步驟4)中，所述的根據(jù)虛擬針孔位置模式Vi為二維矩陣，矩陣單元值是O或I，分別表示相反的透光狀態(tài)或阻擋狀態(tài)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，步驟5)中，對樣品圖像Ii進(jìn)行虛擬針孔Vi運(yùn)算操作為:“與”運(yùn)算=Vi (j，k)為I的單元所對應(yīng)的Ii (j，k)值不變，Vi (I，m)為O的單元所對應(yīng)的Ii (1，m)值取零；其中，(j，k), (I, m)為二維圖像的像素位置(X, y)座標(biāo)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，步驟7)中，合成N個(gè)空間互補(bǔ)的虛擬針孔算法輸出的樣品圖像集合Fi方法為:對N個(gè)F圖像進(jìn)行簡單的空間置加，在同一個(gè)座標(biāo)位置(j，k)對N幅圖像進(jìn)行求和。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具備空間光調(diào)制照明的共聚焦顯微成像方法，其特征在于，所述的二維空間光調(diào)制器是單元為數(shù)字快速可調(diào)的數(shù)字微鏡設(shè)備。
【文檔編號】G02B21/00GK103744172SQ201310731783
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】易定容 申請人:麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司