背景技術(shù)：

在常規(guī)(即，寬場(chǎng))熒光顯微鏡中，整個(gè)樣品均勻地浸沒(méi)在來(lái)自光源的光中。光路中的樣品的所有部分被同時(shí)激發(fā)，并且通過(guò)顯微鏡的光電檢測(cè)器或包括大的未聚焦背景部分的相機(jī)來(lái)檢測(cè)得到的熒光。與之相比，共焦顯微鏡在檢測(cè)器前方的光學(xué)共軛平面中使用點(diǎn)照射和針孔，以消除離焦信號(hào)。由于只有通過(guò)非常接近焦平面的熒光產(chǎn)生的光可以被檢測(cè)到，圖像的光學(xué)分辨率，特別是在樣本深度方向上的光學(xué)分辨率比寬場(chǎng)顯微鏡好得多。然而，由于來(lái)自樣本熒光的大部分光在針孔處被阻擋，這種增加的分辨率是以降低信號(hào)強(qiáng)度為代價(jià)——因此，通常需要長(zhǎng)時(shí)間的曝光。

目前的基于熒光的合成測(cè)序(sbs)系統(tǒng)中使用的一些基于光致發(fā)光的掃描儀器(或成像系統(tǒng))的缺點(diǎn)在于它們具有差的共焦性(即，最多為半共焦)。這些半共焦系統(tǒng)具有低信噪比(s/n比)，并且因此不足以消除樣品中的離焦特征。另外，目前的抖動(dòng)聚焦跟蹤方法在成像期間不能保持聚焦。因此，需要新的方法，以用于基于光致發(fā)光的sbs系統(tǒng)中的成像(或掃描)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在所附的權(quán)利要求(其每一個(gè)具有若干方面)的范圍內(nèi)的系統(tǒng)、方法和裝置的各種實(shí)施方式中，沒(méi)有單獨(dú)的一個(gè)對(duì)本文所述的期望屬性負(fù)責(zé)。在不限制所附權(quán)利要求的范圍的情況下，本文描述了一些突出特征。

公開(kāi)了用于進(jìn)行熒光原位測(cè)序的系統(tǒng)和方法。即是說(shuō)，本文提供的一個(gè)實(shí)施例是共焦時(shí)間延遲積分(tdi)線掃描成像系統(tǒng)，其具有高s/n比和高共焦性，以產(chǎn)生樣本的高分辨率圖像。在一個(gè)示例中，共焦tdi線掃描成像系統(tǒng)包括在圖像傳感器前方的各種針孔和/或狹縫孔徑機(jī)構(gòu)，其中各種針孔和/或狹縫孔徑機(jī)構(gòu)用于排斥離焦光。在另一示例中，共焦tdi線掃描成像系統(tǒng)包括在與圖像傳感器共軛的中間圖像平面中的各種針孔和/或狹縫孔徑機(jī)構(gòu)。

本文還提供了結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包括可以用于在成像期間保持聚焦的聚焦跟蹤特征。在一個(gè)示例中，提供了在與待成像的組織樣本相接觸的基底上的聚焦條帶的各種配置。在另一示例中，將條帶切割成組織樣本，從而提供可用作聚焦跟蹤特征的基底的暴露的條帶。

本文還提供了用于處理流動(dòng)池中的組織樣本的流動(dòng)池和方法。即是說(shuō)，本文提供了各種配置和方法，其中在流動(dòng)池的組裝期間將組織樣本放置在流動(dòng)池的反應(yīng)室內(nèi)，然后對(duì)組織樣本進(jìn)行化學(xué)操作。

本文還提供了使用開(kāi)放式容器對(duì)組織樣本進(jìn)行化學(xué)操作的流動(dòng)池。在一個(gè)示例中，可以使用基本上“干”的成像過(guò)程。在另一示例中，可以使用液體浸沒(méi)成像過(guò)程。

一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)在附圖和下文的描述中闡述。其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將從描述和附圖、以及權(quán)利要求中變得顯而易見(jiàn)。

附圖說(shuō)明

圖1圖示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的共焦成像系統(tǒng)的示例的側(cè)視圖。

圖2圖示了圖1所示的共焦成像系統(tǒng)的另一配置。

圖3圖示了圖1和圖2所示的共焦成像系統(tǒng)的傳感器孔徑機(jī)構(gòu)的示例的側(cè)視圖。

圖4a和圖4b圖示了圖1和圖2所示的共焦成像系統(tǒng)的傳感器孔徑機(jī)構(gòu)的另一示例的側(cè)視圖。

圖5a和5b圖示了圖1和圖2所示的共焦成像系統(tǒng)的傳感器孔徑機(jī)構(gòu)的又一示例的側(cè)視圖。

圖6a和圖6b分別圖示了包括用于成像過(guò)程中的改善的聚焦跟蹤的聚焦條帶的結(jié)構(gòu)的示例的平面圖和截面圖。

圖7圖示了當(dāng)在成像過(guò)程中使用時(shí)的圖6a和圖6b所示的結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖。

圖8圖示了包括用于成像過(guò)程中的改善的聚焦跟蹤的聚焦條帶的結(jié)構(gòu)的另一示例的側(cè)視圖。

圖9圖示了用于在成像過(guò)程中提供改善的聚焦跟蹤的另一技術(shù)的側(cè)視圖。

圖10a和圖10b分別圖示了用于保持和處理組織樣本的流動(dòng)池的示例的平面圖和截面圖。

圖11圖示了使用圖10a和圖10b所示的流動(dòng)池來(lái)處理組織樣本的方法的示例的流程圖。

圖12a和圖12b分別圖示了用于保持和處理組織樣本的流動(dòng)池的另一示例的平面圖和截面圖。

圖13a和圖13b圖示了圖12a和圖12b所示的流動(dòng)池的其他側(cè)視圖，并且示出了在測(cè)序室中的不同位置的組織樣本。

圖14a和圖14b分別圖示了圖12a和圖12b所示的流動(dòng)池的粘合部分的示例的平面圖和截面圖。

圖15圖示了使用圖12a和圖12b所示的流動(dòng)池來(lái)處理組織樣本的方法的示例的流程圖。

圖16a和圖16b圖示了使用開(kāi)放式容器來(lái)保持組織樣本的流動(dòng)池的示例和對(duì)其中的組織樣本“干”成像的過(guò)程的示例的側(cè)視圖。

圖17a和圖17b圖示了圖16a和圖16b所示的流動(dòng)池和對(duì)其中的組織樣本成像的液體浸沒(méi)過(guò)程的側(cè)視圖。

圖中所示的各種特征可能不按比例繪制。相應(yīng)地，為了清楚起見(jiàn)，各種特征的尺寸可以任意地?cái)U(kuò)大或縮小。此外，一些附圖可能不繪示給定的系統(tǒng)、方法或裝置的所有部件。

具體實(shí)施方式

下文結(jié)合附圖闡述的詳細(xì)描述旨在作為本發(fā)明的示范性實(shí)施例的描述，并不旨在表示可以實(shí)踐本發(fā)明的僅有的實(shí)施例。在本說(shuō)明書(shū)中通篇使用的術(shù)語(yǔ)“示范性”意指“用作示例、實(shí)例或說(shuō)明”，并且不應(yīng)被解釋為比其他示范性實(shí)施例優(yōu)選或有利。詳細(xì)描述包含具體的細(xì)節(jié)，以用于提供對(duì)本發(fā)明的示范性實(shí)施例的透徹理解。在一些情況下，一些裝置以框圖的形式示出。

測(cè)序

本文所述的系統(tǒng)和方法可以結(jié)合各種核酸測(cè)序技術(shù)使用。這些測(cè)序技術(shù)包含但不限于，用于從直接來(lái)自細(xì)胞或組織的核酸讀取序列信息的原位測(cè)序技術(shù)(lee，jehyuk，等的“fluorescentinsitusequencing(fisseq)ofrnaforgeneexpressionprofilinginintactcellsandtissues”natureprotocols10.3(2015)：442-458；lee，jehyuk，等的“highlymultiplexedsubcellularrnasequencinginsitu”science343.6177(2014)：1360-1363；以及mitra，robid，等的“fluorescentinsitusequencingonpolymerasecolonies”analyticalbiochemistry320.1(2003)：55-65，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文)。特別適用的技術(shù)是這樣的技術(shù)，其中核酸在于基底上的固定位置(例如陣列或組織樣本)，使得它們的相對(duì)位置不改變，并且其中基底被重復(fù)成像。例如，核酸可以共價(jià)或非共價(jià)地附著到基底。這樣的實(shí)施例是特別適用的，其中在不同的顏色信道中獲得圖像，例如，與用于將核苷酸堿基類型彼此區(qū)分的標(biāo)記重合。在一些實(shí)施例中，確定靶核酸的核苷酸序列的方法可以是自動(dòng)化過(guò)程。優(yōu)選的實(shí)施例包含合成測(cè)序(“sbs”)技術(shù)。

sbs技術(shù)通常涉及通過(guò)對(duì)模板鏈反復(fù)添加核苷酸的新生核酸鏈的酶促延伸。在sbs的傳統(tǒng)方法中，在每次遞送中，可以在存在聚合酶的情況下向靶核苷酸提供單核苷酸單體。然而，在本文所述的系統(tǒng)和方法中，在每次遞送中，可以在存在聚合酶的情況下向靶核苷酸提供多種類型的核苷酸單體。

sbs可以利用具有終止子部分的核苷酸單體或缺少任何終止子部分的核苷酸單體。使用缺少終止子的核苷酸單體的方法包含例如焦磷酸測(cè)序和使用γ-磷酸酯標(biāo)記的核苷酸的測(cè)序，如下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的。在使用缺少終止子的核苷酸單體的方法中，在每個(gè)循環(huán)中加入的核苷酸的數(shù)目通常是可變的，并且取決于模板序列和核苷酸遞送的模式。對(duì)于利用具有終止子部分的核苷酸單體的sbs技術(shù)，終止子可以在使用的測(cè)序條件下有效地不可逆轉(zhuǎn)，利用雙脫氧核苷酸的傳統(tǒng)sanger測(cè)序的情況，或者終止子可以是可逆的，如illumina，inc.開(kāi)發(fā)的測(cè)序方法的情況。

sbs技術(shù)可以利用具有標(biāo)記部分的核苷酸單體或缺少標(biāo)記部分的核苷酸單體。相應(yīng)地，可以根據(jù)標(biāo)記的特性來(lái)檢測(cè)摻入(incorporation)事件，例如標(biāo)記的熒光；核苷酸單體的特性，例如分子量或電荷；核苷酸的摻入的副產(chǎn)物，例如焦磷酸鹽的釋放；等等。在測(cè)序試劑中存在兩種或更多種不同的核苷酸的實(shí)施例中，不同的核苷酸可以彼此可區(qū)分，或替代地，兩種或更多種不同的標(biāo)記在使用的檢測(cè)技術(shù)下是無(wú)法區(qū)分的。例如，存在于測(cè)序試劑中的不同核苷酸可以具有不同的標(biāo)記，并且它們可以使用合適的光學(xué)器件來(lái)區(qū)分，如illumina，inc.開(kāi)發(fā)的測(cè)序方法所示范的。

優(yōu)選的實(shí)施例包含焦磷酸測(cè)序技術(shù)。焦磷酸測(cè)序檢測(cè)當(dāng)特定的核苷酸摻入新生鏈時(shí)無(wú)機(jī)焦磷酸鹽(ppi)的釋放(ronaghi,m.,karamohamed,s.,pettersson,b.,uhlen,m.和nyren,p.(1996)“real-timednasequencingusingdetectionofpyrophosphaterelease”analyticalbiochemistry242(1)，84-9；ronaghi，m.(2001)“pyrosequencingshedslightondnasequencing”genomeres.11(1)，3-11；ronaghi，m.，uhlen，m.和nyren，p.(1998)“asequencingmethodbasedonreal-timepyrophosphate”science281(5375)，363；美國(guó)專利no.6,210,891；美國(guó)專利no.6,258,568和美國(guó)專利no.6,274,320，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。在焦磷酸測(cè)序中，釋放的ppi可以通過(guò)atp硫酸化酶立即轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷(atp)來(lái)檢測(cè)，并且經(jīng)由螢光素酶產(chǎn)生的光子檢測(cè)產(chǎn)生的atp水平。待測(cè)序的核酸可以位于基底上(例如，陣列中的特征)，且基底可以被成像，以捕獲由于在核酸在基底上所處的位置的核苷酸的引入而產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。在使用特定的核苷酸類型(例如，a、t、c或g)來(lái)處理基底之后，可以獲得圖像。在添加每種核苷酸類型之后獲得的圖像將在基底上檢測(cè)到的特征方面不同。圖像中的這些差異反映了基底上特征的不同序列內(nèi)容。然而，每個(gè)特征的相對(duì)位置將在圖像中將保持不變。可以使用本文所述的方法來(lái)存儲(chǔ)、處理和分析圖像。例如，對(duì)于從基于可逆的終止子測(cè)序方法的不同檢測(cè)信道獲得的圖像，在使用每種不同的核苷酸類型處理基底之后獲得的圖像可以以與本文所示范的相同的方式來(lái)處理。

在另一示范性類型的sbs中，循環(huán)測(cè)序通過(guò)逐步添加可逆終止子核苷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述可逆終止子核苷酸包含例如可裂解或可降解(例如，光可漂白)染料標(biāo)記，描述于例如wo04/018497和美國(guó)專利no.7,057,026中，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。這種方法正在由illuminainc.商業(yè)化，并且還描述在wo91/06678和wo07/123,744中，其各自通過(guò)引用并入本文。其中兩個(gè)終止子可以被逆轉(zhuǎn)，且熒光標(biāo)記物被裂解的熒光標(biāo)記的終止子的可用性促進(jìn)有效的循環(huán)可逆終止(crt)測(cè)序。聚合酶也可以被共同工程化(co-engineered)，以有效地?fù)饺氩⒀由斐鲞@些改性的核苷酸。

優(yōu)選地，在基于可逆終止子的測(cè)序?qū)嵤├?，在sbs反應(yīng)條件下，標(biāo)記基本上不抑制延伸。然而，檢測(cè)標(biāo)記可以是可移除的，例如，通過(guò)裂解或降解。在將標(biāo)記摻入陣列或其他基底上的核酸特征后，可以捕獲圖像。在特定的實(shí)施例中，每個(gè)循環(huán)涉及將四種不同核苷酸類型同時(shí)遞送至基底，并且每種核苷酸類型具有光譜不同的標(biāo)記。然后可以獲得四個(gè)圖像，每個(gè)圖像使用對(duì)四個(gè)不同標(biāo)記之一為選擇性的檢測(cè)信道。替代地，可以順序地添加不同的核苷酸類型，并且可以在每個(gè)添加步驟之間獲得基底的圖像。在這樣的實(shí)施例中，每個(gè)圖像將顯示已經(jīng)摻入特定類型的核苷酸的核酸特征。由于每個(gè)特征的不同序列內(nèi)容，不同的圖像將存在或不存在不同的特征。然而，特征的相對(duì)位置將在圖像中保持不變。從這樣的可逆終止子-sbs方法獲得的圖像可以如本文所述地進(jìn)行存儲(chǔ)、處理和分析。在圖像捕獲步驟之后，標(biāo)記可以被移除，且可逆終止子部分可以被移除，以用于隨后的核苷酸添加和檢測(cè)的循環(huán)。標(biāo)記的移除(在特定循環(huán)內(nèi)已經(jīng)檢測(cè)到它們之后，且在隨后的循環(huán)之前)可以提供減少背景信號(hào)和循環(huán)之間的串?dāng)_的優(yōu)點(diǎn)。有用的標(biāo)記和移除方法的示例如下所述。

在特定的實(shí)施例中，一些或所有的核苷酸單體可以包含可逆終止子。在這樣的實(shí)施例中，可逆終止子/可裂解熒光體可以包含經(jīng)由3'酯鍵鍵合到核糖部分的熒光體(metzker，genomeres.15：1767-1776(2005)，其通過(guò)引用并入本文)。其他方法已經(jīng)將終止子化學(xué)物質(zhì)與熒光標(biāo)記的裂解分開(kāi)(ruparel等人，procnatlacadsciusa102：5932-7(2005)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文)。ruparel等人描述了可逆終止子的開(kāi)發(fā)，其使用小的3'烯丙基來(lái)阻斷延伸，但是可以通過(guò)使用鈀催化劑的短處理來(lái)容易地解除阻斷。熒光團(tuán)經(jīng)由光可裂解連接體連接到堿基，所述光可裂解連接體可以通過(guò)暴露于長(zhǎng)波紫外光30秒而容易地裂解。因此，二硫鍵還原或光裂解可以用作可裂解的連接體。可逆終止的另一種方法是使用在dntp上放置體染料之后發(fā)生的自然終止。dntp上的帶電荷的體染料的存在可以通過(guò)空間位阻和/或靜電阻礙作為有效的終止子。一個(gè)摻入事件的存在防止進(jìn)一步的摻入，除非染料被移除。染料的裂解移除熒光體并有效地逆轉(zhuǎn)終止。改性核苷酸的示例也描述于美國(guó)專利no.7,427,673和美國(guó)專利no.7,057,026，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。

可以與本文所述的方法和系統(tǒng)一起使用的附加的示范性sbs系統(tǒng)和方法被描述于以下文獻(xiàn)中，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)no.2007/0166705，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)no.2006/0188901，美國(guó)專利no.7,057,026，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)no.2006/0240439，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)no.2006/0281109，pct公開(kāi)no.wo05/065814，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)no.2005/0100900，pct公開(kāi)no.wo06/064199，pct公開(kāi)no.wo07/010,251，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)no.2012/0270305和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)no.2013/0260372，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。

一些實(shí)施例可以利用使用少于四種不同標(biāo)記的四種不同核苷酸的檢測(cè)。例如，可以使用美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)no.2013/0079232的摻入材料中描述的方法和系統(tǒng)來(lái)執(zhí)行sbs。作為第一示例，可以在相同波長(zhǎng)下檢測(cè)一對(duì)核苷酸類型，但是基于該對(duì)中的一個(gè)成員與其他成員的強(qiáng)度差異而區(qū)別，或者基于該對(duì)的一個(gè)成員的變化(例如，經(jīng)由化學(xué)修飾、光化學(xué)修飾或物理修飾)，與該對(duì)的其他成員的檢測(cè)到的信號(hào)相比，其導(dǎo)致明顯的信號(hào)出現(xiàn)或消失。作為第二示例，可以在特定條件下檢測(cè)四種不同核苷酸類型中的三種，而第四種核苷酸類型缺乏在這些條件下可檢測(cè)的標(biāo)記，或者在這些條件下被最低限度地檢測(cè)(例如，由于背景熒光引起的最低限度檢測(cè)，等等)。將第三核苷酸類型摻入核酸可以基于其相應(yīng)的信號(hào)的存在來(lái)確定，且將第四核苷酸類型摻入核酸可以基于任何信號(hào)的不存在或最低限度檢測(cè)來(lái)確定。作為第三示例，一種核苷酸類型可以包含在兩個(gè)不同的信道中檢測(cè)到的(多個(gè))標(biāo)記，而在不超過(guò)一個(gè)信道中檢測(cè)到其他核苷酸類型。上述三種示范性配置不被認(rèn)為是相互排斥的，并且可以以各種組合使用。組合所有三個(gè)示例的示范性實(shí)施例是基于熒光的sbs方法，其使用在第一信道中檢測(cè)到的第一核苷酸類型(例如datp，其具有當(dāng)被第一激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)在第一信道中檢測(cè)到的標(biāo)記)，在第二信道中檢測(cè)到的第二核苷酸類型(例如dctp，其具有當(dāng)被第二激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)在第二信道中檢測(cè)到的標(biāo)記)，在第一信道和第二信道兩者中檢測(cè)到的第三核苷酸類型(例如dttp，其具有當(dāng)被第一激發(fā)波長(zhǎng)和/或第二激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)在兩個(gè)信道中檢測(cè)到的至少一個(gè)標(biāo)記)，以及第四核苷酸類型，其缺少標(biāo)記，所述標(biāo)記在任何一個(gè)信道中無(wú)法或最低限度地檢測(cè)到(例如沒(méi)有標(biāo)記的dgtp)。

另外，如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)no.2013/0079232的摻入材料所述，可以使用單個(gè)信道獲得測(cè)序數(shù)據(jù)。在這種所謂的單信道測(cè)序方法中，第一核苷酸類型被標(biāo)記，但在第一圖像生成之后移除標(biāo)記，并且第二核苷酸類型僅在第一圖像生成之后被標(biāo)記。第三核苷酸類型在第一圖像和第二圖像中保留其標(biāo)記，且第四核苷酸類型在兩個(gè)圖像中保持未被標(biāo)記。

一些實(shí)施例利用通過(guò)連接(ligation)技術(shù)的測(cè)序。這樣的技術(shù)利用dna連接酶來(lái)?yè)饺牍押塑账岵⒆R(shí)別這樣的寡核苷酸的摻入。寡核苷酸通常具有不同的標(biāo)記，其與寡核苷酸所雜交的序列中的特定核苷酸的同一性相關(guān)聯(lián)。與其他sbs方法一樣，可以在具有標(biāo)記的測(cè)序試劑的基底(例如，陣列或組織)上的核酸特征的處理之后獲得圖像。每個(gè)圖像將示出已經(jīng)摻入特定類型的標(biāo)記的核酸特征。由于每個(gè)特征的不同的序列內(nèi)容，不同的特征將在不同的圖像中存在或不存在，但是特征的相對(duì)位置將在圖像中保持不變。從基于連接的測(cè)序方法獲得的圖像可以如本文所述地進(jìn)行存儲(chǔ)、處理和分析?？梢耘c本文所述的方法和系統(tǒng)一起使用的示范性sbs系統(tǒng)和方法在以下文獻(xiàn)中描述，美國(guó)專利no.6,969,488、美國(guó)專利no.6,172,218和美國(guó)專利no.6,306,597，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。

一些實(shí)施例可以利用納米孔測(cè)序(deamer，d.w.&akeson，m.“nanoporesandnucleicacids：prospectsforultrarapidsequencing”trendsbiotechnol.18，147-151(2000)；deamer，d.和d.branton，“characterizationofnucleicacidsbynanoporeanalysis”acc.chem.res.35：817-825(2002)；li，j.，m.gershow，d.stein，e.brandin，和j.a.golovchenko，“dnamoleculesandconfigurationsinasolid-statenanoporemicroscope”nat.mater.2：611-615(2003)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文)。在這樣的實(shí)施例中，靶核酸穿過(guò)納米孔。納米孔可以是合成孔或生物膜蛋白，例如α-溶血素。當(dāng)靶核酸穿過(guò)納米孔時(shí)，可以通過(guò)測(cè)量孔的電導(dǎo)率的波動(dòng)來(lái)識(shí)別每個(gè)堿基對(duì)(美國(guó)專利no.7,001,792；soni，g.v.&meller，“a.progresstowardultrafastdnasequencingusingsolid-statenanopores”clin.chem.53，1996-2001(2007)；healy，k.“nanopore-basedsingle-moleculednaanalysis”nanomed.2，459-481(2007)；cockroft，s.l.，chu，j.，amorin，m.&ghadiri，m.r.“asingle-moleculenanoporedevicedetectsdnapolymeraseactivitywithsingle-nucleotideresolution”j.am.chem.soc.130，818-820(2008)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文)。從納米孔測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)可以如本文所述地進(jìn)行存儲(chǔ)、處理和分析。特別地，根據(jù)本文所述的光學(xué)圖像和其他圖像的示范性處理，可以將數(shù)據(jù)作為圖像處理。

一些實(shí)施例可以利用涉及dna聚合酶活性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的方法。可以通過(guò)含熒光團(tuán)聚合酶與γ-磷酸酯標(biāo)記的核苷酸之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)相互作用來(lái)檢測(cè)核苷酸摻入，例如以下文獻(xiàn)中所述，美國(guó)專利no.7,329,492和美國(guó)專利no.7,211,414(其均通過(guò)引用并入本文)，或者可以使用零模式波導(dǎo)來(lái)檢測(cè)核苷酸摻入，例如以下文獻(xiàn)中所述，美國(guó)專利no.7,315,019(其通過(guò)引用并入本文)，以及使用熒光核苷酸類似物和工程聚合酶，例如以下文獻(xiàn)中所述，美國(guó)專利no.7,405,281和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)no.2008/0108082(其均通過(guò)引用并入本文)。照明可以限制在表面栓系聚合酶周圍的zeptoliter級(jí)體積，使得可以在低背景下觀察到熒光標(biāo)記的核苷酸的摻入(levene，m.j.等人“zero-modewaveguidesforsingle-moleculeanalysisathighconcentrations”science299，682-686(2003)；lundquist，p.m.等人“parallelconfocaldetectionofsinglemoleculesinrealtime”opt.lett.33，1026-1028(2008)；korlach，j.等人“selectivealuminumpassivationfortargetedimmobilizationofsinglednapolymerasemoleculesinzero-modewaveguidenanostructures”proc.natl.acad.sci.usa105，1176-1181(2008)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文)。從這些方法獲得的圖像可以如本文所述地進(jìn)行存儲(chǔ)，處理和分析。

一些sbs實(shí)施例包含對(duì)核苷酸摻入延伸產(chǎn)物中時(shí)對(duì)釋放的質(zhì)子的檢測(cè)。例如，基于釋放的質(zhì)子的檢測(cè)的測(cè)序可以使用可從iontorrent(guilford，ct，lifetechnologies子公司)商購(gòu)的電檢測(cè)器和相關(guān)技術(shù)，或者以下文獻(xiàn)中所述的測(cè)序方法和系統(tǒng)us2009/0026082a1；us2009/0127589a1；us2010/0137143a1；或us2010/0282617a1，其均通過(guò)引用并入本文。本文所述的使用動(dòng)力學(xué)排除來(lái)擴(kuò)增靶核酸的方法可以容易地應(yīng)用于用于檢測(cè)質(zhì)子的基底。更具體地，本文所述的方法可以用于產(chǎn)生用于檢測(cè)質(zhì)子的擴(kuò)增子的克隆群體。

上述核酸測(cè)序方法可以有利地以多重格式進(jìn)行，使得同時(shí)操縱多種不同的靶核酸。在特定的實(shí)施例中，不同的靶核酸可以在常見(jiàn)的反應(yīng)容器中或特定基底的表面上進(jìn)行處理。這允許方便地遞送測(cè)序試劑，移除未反應(yīng)的試劑，以及以多重方式檢測(cè)摻入事件。在使用表面結(jié)合靶核酸的實(shí)施例中，靶核酸可以是陣列格式。在陣列格式中，靶核酸可以以空間上可區(qū)分的方式結(jié)合到表面。靶核酸可以通過(guò)以下方式結(jié)合，直接共價(jià)附著、附著到珠?；蚱渌w粒，或者結(jié)合到聚合酶或附著于表面的其他分子。陣列可以包含每個(gè)位點(diǎn)的靶核酸的單個(gè)復(fù)制(也稱為特征)，或者可以在每個(gè)位點(diǎn)或特征處存在具有相同序列的多個(gè)復(fù)制?？梢酝ㄟ^(guò)擴(kuò)增方法產(chǎn)生多個(gè)復(fù)制，例如下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的橋擴(kuò)增或乳液pcr。

本文所述的方法可以使用具有各種密度中的任何一個(gè)特征的陣列，包含例如至少大約10特征/cm²，100特征/cm²，500特征/cm²，1,000特征/cm²，5,000特征/cm²，10,000特征/cm²，50,000特征/cm²，100,000特征/cm²，1,000,000特征/cm²，5,000,000特征/cm²，或更高。其他基底可以包含在相似密度范圍的核酸特征。

本文所述的方法的優(yōu)點(diǎn)在于，它們提供了以并行方式對(duì)多個(gè)靶核酸快速且有效的檢測(cè)。因此，本公開(kāi)提供了能夠使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)制備和檢測(cè)核酸的集成系統(tǒng)，例如上面示范的那些。因此，本公開(kāi)的集成系統(tǒng)可以包含流體部件，其能夠?qū)U(kuò)增試劑和/或測(cè)序試劑遞送到一個(gè)或多個(gè)固定化的dna片段，系統(tǒng)包括諸如泵、閥、儲(chǔ)存器、流體管線等部件。流動(dòng)池可以在集成系統(tǒng)中配置為和/或用于檢測(cè)靶核酸。示范性流動(dòng)池例如在以下文獻(xiàn)中描述，us2010/0111768a1和美國(guó)專利no.8,951,781，其均通過(guò)引用并入本文。如流動(dòng)池所示范的，集成系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)流體部件可以用于擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法。以核酸測(cè)序?qū)嵤├秊槔上到y(tǒng)的流體組件中的一種或多種可以用于本文所述的擴(kuò)增方法，并用于以上述示范的測(cè)序方法中的測(cè)序試劑的遞送。替代地，集成系統(tǒng)可以包含單獨(dú)的流體系統(tǒng)，以執(zhí)行擴(kuò)增方法并執(zhí)行檢測(cè)方法。在沒(méi)有限制的情況下，能夠形成擴(kuò)增的核酸并確定核酸的序列的集成測(cè)序系統(tǒng)的示例包含但不限于miseq^tm平臺(tái)(illumina，inc.，sandiego，ca)，以及美國(guó)專利no.8,951,781中所述的裝置，其通過(guò)引用并入本文。

共焦成像系統(tǒng)

下文參照?qǐng)D1、圖2、圖3、圖4a、圖4b、圖5a和圖5b來(lái)描述共焦tdi線掃描成像系統(tǒng)，其具有高s/n比和高共焦性，以產(chǎn)生高分辨率圖像。

在某些實(shí)施例中，共焦tdi線掃描成像系統(tǒng)包含檢測(cè)器陣列，其通過(guò)限制檢測(cè)器陣列的掃描軸線維度來(lái)實(shí)現(xiàn)掃描軸線上的共焦性。例如，共焦性可以在檢測(cè)器陣列的單個(gè)軸線中實(shí)現(xiàn)，使得共焦性僅在該維度中發(fā)生。因此，與共焦性在兩個(gè)維度上實(shí)現(xiàn)的典型的共焦系統(tǒng)相比，共焦tdi線掃描成像系統(tǒng)可以配置為使得共焦性不在多于一個(gè)維度上實(shí)現(xiàn)。

共焦tdi線掃描成像系統(tǒng)也可以配置為通過(guò)檢測(cè)器陣列的元件的不同子集來(lái)順序地檢測(cè)樣本的不同部分，其中元件的子集之間的電荷轉(zhuǎn)移進(jìn)行的速率與正在成像的樣本的表觀運(yùn)動(dòng)同步并且方向相同。例如，共焦tdi線掃描成像系統(tǒng)可以掃描樣本，使得幀傳輸裝置通過(guò)與樣本的表觀移動(dòng)對(duì)準(zhǔn)并同步的線性陣列的堆疊產(chǎn)生樣本的連續(xù)視頻圖像，由此隨著圖像從一行移動(dòng)到下一行，存儲(chǔ)的電荷隨之移動(dòng)。電荷的積累可以在該行電荷從檢測(cè)器的一端移動(dòng)到串行寄存器(或者在幀傳輸ccd的情況下，到裝置的存儲(chǔ)區(qū)域)所需的整個(gè)時(shí)間內(nèi)集成。示范性共焦tdi線掃描成像系統(tǒng)例如在美國(guó)專利no.7329860中描述，其通過(guò)引用并入本文。圖1圖示了根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施例的共焦成像系統(tǒng)100的示例的側(cè)視圖。共焦成像系統(tǒng)例如是tdi線掃描成像系統(tǒng)，其具有高s/n比和高共焦性，以產(chǎn)生高分辨率圖像。

目前公開(kāi)的共焦成像系統(tǒng)100適用于基于光致發(fā)光的掃描儀器(或成像系統(tǒng))，其用于基于熒光的sbs系統(tǒng)。

共焦成像系統(tǒng)100包括光源孔徑110、光束分離器112、透鏡114、傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130和tdi圖像傳感器146。在共焦成像系統(tǒng)100中，組織樣本120布置在相對(duì)于透鏡114的共焦平面124。組織樣本120是例如在sbs過(guò)程中待成像(或掃描)的樣本組織。

傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130定位在tdi圖像傳感器146前方的光學(xué)共軛平面中，以基本上消除離焦信號(hào)并提供高共焦性。即是說(shuō)，傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130的各種實(shí)施例包含針孔或狹縫，以基本上消除離焦信號(hào)。當(dāng)用于原位測(cè)試技術(shù)時(shí)，基本上消除離焦信號(hào)在技術(shù)上可能是有利的。

如上文介紹的，原位測(cè)序技術(shù)涉及在不從組織提取核酸的情況下，從直接來(lái)自組織的核酸讀取序列信息。這可以與這樣的測(cè)序技術(shù)形成對(duì)照，其涉及從組織提取核酸，以便從提取的核酸讀取序列信息。因此，原位測(cè)序可以提供對(duì)細(xì)胞的基因型或基因表達(dá)與其形態(tài)和局部環(huán)境之間的關(guān)系的更深入地了解。

通過(guò)校準(zhǔn)傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130以基本上消除離焦信號(hào)，僅允許來(lái)自恰好聚焦在傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130處的共焦平面的光到達(dá)圖像檢測(cè)器。因此，相對(duì)于基本上不消除離焦信號(hào)的系統(tǒng)，可以增加組織的特定深度內(nèi)的核酸的光學(xué)分辨(來(lái)自恰好聚焦在狹縫處的共焦平面)。這種類型的光學(xué)切片模擬移除了組織的不需要的部分(在不移除任何組織的情況下)。此外，狹縫的寬度(或針孔的尺寸)可能與分辨率相關(guān)，更小的狹縫寬度(或更小的針孔)提供更高的分辨率。

在操作中，光源150穿過(guò)光源孔徑110、然后穿過(guò)光束分離器112、然后穿過(guò)透鏡114并撞擊在共焦平面124處的組織樣本120上。光源150是用于在成像(或掃描)過(guò)程期間照射組織樣本120的激發(fā)光源。在這樣做時(shí)，組織樣本120發(fā)射相對(duì)于傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130和tdi圖像傳感器146的某些聚焦熒光152，以及某些離焦熒光154。聚焦熒光152穿過(guò)傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130并到達(dá)tdi圖像傳感器146，而離焦熒光154被傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130中的針孔或狹縫排斥。在一個(gè)示例中，tdi圖像傳感器146是長(zhǎng)線性傳感器，例如3200×64像素傳感器，以捕獲組織樣本120的高分辨率圖像。

圖2示出了共焦成像系統(tǒng)100的另一配置，其中傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130定位在與tdi圖像傳感器146共軛的中間圖像平面160中。在共焦成像系統(tǒng)100的該配置中，附加的一對(duì)透鏡162布置在傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130(其在中間圖像平面160處)和tdi圖像傳感器146之間。下文參照?qǐng)D3、圖4a、圖4b、圖5a和圖5b示出和描述了用于排斥離焦光的傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130的示例的更多細(xì)節(jié)。

圖3圖示了圖1和圖2所示的共焦成像系統(tǒng)100的傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130的示例的側(cè)視圖。即是說(shuō)，圖3示出了tdi圖像傳感器146的示例，其包含像素148的3200×64陣列，(即，3200列×64行，其中第一列為列#1)。在該示例中，傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130包括位置可切換的兩個(gè)孔徑，—一個(gè)孔徑用于tdi圖像傳感器146的奇數(shù)列，且另一孔徑用于tdi圖像傳感器146的偶數(shù)列。即是說(shuō)，傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130包含包括狹縫134的第一孔徑板132和包括狹縫138的第二孔徑板136。孔徑板132和孔徑板136由對(duì)共焦成像系統(tǒng)100中存在的波長(zhǎng)非光學(xué)透明的材料形成。例如，孔徑板132和孔徑板136可以由涂覆有圖案化的不透明層(例如鉻)的玻璃基底形成。另外，孔徑板132和孔徑板136的高度和長(zhǎng)度可以取決于tdi圖像傳感器146的總尺寸。

孔徑板132和孔徑板136兩者可以相對(duì)于tdi圖像傳感器146的像素148的列定位?？讖桨?32和孔徑板136的位置是機(jī)械地可切換的，使得在任何給定的時(shí)刻，僅一個(gè)孔徑板位于tdi圖像傳感器146的前方。例如，在控制器(未示出)的控制下，孔徑板132和孔徑板136可以以旋轉(zhuǎn)或位移的方式可切換?？讖桨?32涉及為使得，當(dāng)在tdi圖像傳感器146的前方時(shí)，狹縫134的位置基本上對(duì)應(yīng)于tdi圖像傳感器146的奇數(shù)像素列的位置。即是說(shuō)，孔徑板132對(duì)tdi圖像傳感器146的奇數(shù)像素列打開(kāi)，并阻擋偶數(shù)列。與之相比，孔徑板136被設(shè)計(jì)為使得，當(dāng)在tdi圖像傳感器146的前方時(shí)，狹縫138的位置基本上對(duì)應(yīng)于tdi圖像傳感器146的偶數(shù)像素列的位置。即是說(shuō)，孔徑板136對(duì)tdi圖像傳感器146的偶數(shù)像素列打開(kāi)，并阻擋奇數(shù)列。

在孔徑板132和孔徑板136中，放置對(duì)應(yīng)于每隔一個(gè)的(即，每第二個(gè))像素列的槽確保了充分的離焦光排斥。另外，傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130不僅限于兩個(gè)孔徑板。如果需要，可以使用多于兩個(gè)孔徑板以進(jìn)一步改善共焦性，但是要折衷地減少掃描速度。例如，傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130可以包括三個(gè)孔徑板。第一孔徑板在第一像素列處具有狹縫，然后在其后的每三個(gè)像素列處具有狹縫。第二孔徑板在第二像素列處具有狹縫，然后在其后的每三個(gè)像素列處具有狹縫。第三孔徑板在第三像素列處具有狹縫，然后在其后的每三個(gè)像素列處具有狹縫。再次重復(fù)，三個(gè)孔徑板的位置是機(jī)械地可切換的，使得在任何給定的時(shí)刻，僅一個(gè)孔徑板位于tdi圖像傳感器146的前方。

孔徑板132中的狹縫134和孔徑板136中的狹縫138具有寬度w。寬度w由tdi圖像傳感器146的像素148的尺寸確定。在共焦成像系統(tǒng)100中，在一個(gè)示例中，狹縫134和狹縫138的寬度w可以從大約1μm到大約12μm，或者在在另一示例中為大約9μm?？讖桨?32中的狹縫134與孔徑板136中的狹縫138之間的間隔可以取決于tdi圖像傳感器146的像素148的節(jié)距p。作為非限制性示例，孔徑板132中的狹縫134與孔徑板136中的狹縫138之間的間隔可以基本上與tdi圖像傳感器146的像素148的節(jié)距p相同。另外，孔徑板132中的狹縫134與孔徑板136中的狹縫138的長(zhǎng)度可以取決于tdi圖像傳感器146的總尺寸。作為非限制性示例，孔徑板132中的狹縫134與孔徑板136中的狹縫138的長(zhǎng)度可以基本上與tdi圖像傳感器146沿著狹縫134和狹縫138的長(zhǎng)度的相同維度的寬度相同。

孔徑板132和孔徑板136的切換循環(huán)與tdi線掃描速度同步，特別是tdi掃描讀出中的一個(gè)切換循環(huán)或整數(shù)個(gè)循環(huán)。在操作中，在第一成像或掃描半循環(huán)中，孔徑板132切換到tdi圖像傳感器146前方的位置，由此tdi圖像傳感器146的奇數(shù)像素列被打開(kāi)，而偶數(shù)像素列被阻擋。在該半循環(huán)中，捕獲tdi圖像傳感器146的奇數(shù)像素列的圖像數(shù)據(jù)。然后，在下一個(gè)成像或掃描半循環(huán)中，孔徑板132被切換掉，且孔徑板136被切換到tdi圖像傳感器146前方的位置，由此tdi圖像傳感器146的偶數(shù)像素列被打開(kāi)，而奇數(shù)像素列被阻擋。在該半循環(huán)中，捕獲tdi圖像傳感器146的偶數(shù)像素列的圖像數(shù)據(jù)。孔徑板132和孔徑板136的運(yùn)動(dòng)與高速tdi成像過(guò)程同步。在一個(gè)示例中，孔徑板132和孔徑板136可以以約5khz至約35khz的速率切換。

圖4a和圖4b圖示了圖1和圖2所示的共焦成像系統(tǒng)100的傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130的另一示例的側(cè)視圖。在該示例中，僅在tdi圖像傳感器146前方使用一個(gè)孔徑，其中一個(gè)孔徑可以側(cè)向地位移，以交替地允許或阻擋奇數(shù)和偶數(shù)像素列。在一個(gè)示例中，參照?qǐng)D3所述的孔徑板132設(shè)置在tdi圖像傳感器146前方，且在成像或掃描過(guò)程期間機(jī)械地側(cè)向地位移。圖4a在相對(duì)于tdi圖像傳感器146的第一位置中的孔徑板132和狹縫134，其中奇數(shù)像素列被打開(kāi)，且偶數(shù)像素列被阻擋。與之相比，圖4b示出了在相對(duì)于tdi圖像傳感器146的第二位置中的孔徑板132和狹縫134，其中偶數(shù)像素列被打開(kāi)，且奇數(shù)像素列被阻擋。

在操作中，在第一成像或掃描半循環(huán)中，孔徑板132定位在tdi圖像傳感器146的前方，使得奇數(shù)像素列被打開(kāi)，且偶數(shù)像素列被阻擋，如圖4a所示。在該半循環(huán)中，捕獲tdi圖像傳感器146的奇數(shù)像素列的圖像數(shù)據(jù)。然后，在下一個(gè)成像或掃描半循環(huán)中，孔徑板132的位置在tdi圖像傳感器146的前方機(jī)械地位移，使得偶數(shù)像素列被打開(kāi)，且奇數(shù)像素列被阻擋，如圖4b所示。在該半循環(huán)中，捕獲tdi圖像傳感器146的偶數(shù)像素列的圖像數(shù)據(jù)。再次重復(fù)，孔徑板132的運(yùn)動(dòng)可以與高速tdi成像過(guò)程同步，其中切換速率可以從約5khz到約35khz。

圖5a和圖5b圖示了圖1和圖2所示的共焦成像系統(tǒng)100的傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130的又一示例的側(cè)視圖。在該示例中，傳感器孔徑機(jī)構(gòu)130是靜止的、電子控制的空間光調(diào)制器140。空間光調(diào)制器140可以是例如基于液晶顯示器(lcd)的裝置或微機(jī)電系統(tǒng)(mems)鏡裝置。窗口或狹縫142可以電子地設(shè)置在空間光調(diào)制器140中?？臻g光調(diào)制器140中的窗口或狹縫142的尺寸、數(shù)量和位置被電子地控制。

在共焦成像系統(tǒng)100中，空間光調(diào)制器140可以在兩種狀態(tài)下使用。例如，圖5a示出了空間光調(diào)制器140的第一狀態(tài)，其中窗口或狹縫142電子地打開(kāi)，其基本上與tdi圖像傳感器146的像素148的奇數(shù)列對(duì)準(zhǔn)。與之相比，圖5b示出了空間光調(diào)制器140的第二狀態(tài)，其中窗口或狹縫142電子地打開(kāi)，其基本上與tdi圖像傳感器146的像素148的偶數(shù)列對(duì)準(zhǔn)?？臻g光調(diào)制器140的切換頻率與高速tdi成像過(guò)程同步。在一個(gè)示例中，空間光調(diào)制器140的切換頻率為大約5khz至大約35khz。在共焦成像系統(tǒng)100中，空間光調(diào)制器140不限于兩種狀態(tài)，可以是兩種以上的狀態(tài)。

成像過(guò)程中的聚焦跟蹤機(jī)構(gòu)

本發(fā)明的某些實(shí)施例提供了包括聚焦跟蹤特征的結(jié)構(gòu)，所述聚焦跟蹤特征可以用于在成像期間保持聚焦，如下文參照?qǐng)D6a、圖6b、圖7、圖8和圖9所示。例如，目前公開(kāi)的聚焦跟蹤機(jī)構(gòu)適合于輔助基于激光的聚焦技術(shù)。

圖6a和圖6b分別圖示了包括用于成像過(guò)程中的改善的聚焦跟蹤的聚焦條帶的結(jié)構(gòu)600的示例的平面圖和截面圖。在該示例中，結(jié)構(gòu)600包括底部基底610和頂部基底612，它們之間布置有間隙614。組織樣本120可以放置在底部基底610或頂部基底612中一個(gè)任一個(gè)上，或兩者上。底部基底610和頂部基底612可以是例如玻璃、塑料或硅基底。一組聚焦條帶616設(shè)置在頂部基底612的面向間隙614的側(cè)面上。聚焦條帶616可以由例如鉻、金或其他半導(dǎo)體友好的高反射材料形成?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)光刻工藝在頂部基底612上形成聚焦條帶616。每個(gè)聚焦條帶616具有厚度t和寬度w。在一個(gè)示例中，聚焦條帶616具有大約50nm的厚度t和大約50μm的寬度w。聚焦條帶616設(shè)置在節(jié)距p上。在一個(gè)示例中，聚焦條帶616的節(jié)距p為大約1100μm。

在圖6和本文的其他地方，條帶形狀被示范為基準(zhǔn)或光導(dǎo)。然而，應(yīng)當(dāng)理解，除了條帶以外或作為條帶的替代，可以使用其他形狀和設(shè)計(jì)。圖7圖示了當(dāng)在成像過(guò)程中使用時(shí)的圖6a和圖6b所示的結(jié)構(gòu)600的側(cè)視圖。圖7示出了通過(guò)基底來(lái)允許成像的應(yīng)用。圖7示出了與透鏡618和透鏡聚焦光束620相關(guān)的結(jié)構(gòu)600，其中透鏡618和透鏡聚焦光束620可以是基于激光的聚焦機(jī)構(gòu)。在該示例中，通過(guò)頂部基底612進(jìn)行成像，并且其中聚焦條帶616沿著掃描方向(參見(jiàn)圖6a)布置。聚焦條帶616用于輔助聚焦跟蹤，其中每個(gè)聚焦條帶616與組織樣本120具有物理關(guān)系。即是說(shuō)，聚焦條帶616在與其上可以聚焦透鏡聚焦光束620的組織樣本120的基本相同的平面中提供物理特征。

圖8圖示了包括用于成像過(guò)程中的改善的聚焦跟蹤的聚焦條帶616的結(jié)構(gòu)600的另一示例的側(cè)視圖。圖8示出了不通過(guò)基底來(lái)允許成像的應(yīng)用。在該示例中，頂部基底612被省略，且組織樣本120放置在底部基底610的上表面上。聚焦條帶616設(shè)置在底部基底610的上表面上，其抵靠組織樣本120。在熒光成像過(guò)程中使用的透鏡114和光源150設(shè)置在組織樣本120的暴露側(cè)上。與之相比，透鏡618和基于激光的透鏡聚焦光束620(如圖7中所描述的)設(shè)置在組織樣本120的底部基底610側(cè)上。

在該配置中，作為基于激光的聚焦機(jī)構(gòu)的透鏡618和透鏡聚焦光束620在底部基底610上使用聚焦條帶616。從基于激光的聚焦機(jī)構(gòu)到熒光成像機(jī)構(gòu)提供反饋回路。即是說(shuō)，透鏡618、透鏡聚焦光束620和聚焦條帶616用于產(chǎn)生聚焦誤差信號(hào)630到熒光成像機(jī)構(gòu)(即，透鏡114和光源150)。聚焦誤差信號(hào)630用于在成像(或掃描)過(guò)程期間保持聚焦。

圖9圖示了用于在成像過(guò)程中提供改善的聚焦跟蹤的另一技術(shù)的側(cè)視圖。在該示例中，組織樣本120放置在底部基底610的頂部，且條帶122被切割成組織樣本120以暴露底部基底610的條帶。暴露的基底的條帶可以由例如基于激光的聚焦機(jī)構(gòu)(例如，透鏡618和透鏡聚焦光束620)用作聚焦特征。

用于處理組織樣本的流動(dòng)池

目前，流動(dòng)池室中的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程不是最佳的。本發(fā)明的某些實(shí)施例提供了流動(dòng)池和用于處理組織樣本的方法，如下文參考圖10a至圖17b所述。

在特定的實(shí)施例中，用于處理組織的流動(dòng)池的有利特征包括但不一定限于以下中的一個(gè)或多個(gè)(1)至少臨時(shí)接近允許組織樣本放置在其上的流動(dòng)池的表面，(2)便于組裝流動(dòng)池部件，以至少部分地將組織樣本封閉在流動(dòng)室中，所述流動(dòng)室允許流體與組織樣本接觸，且允許形成用于觀察組織樣本的檢測(cè)區(qū)域，以及(c)便于拆卸，以允許組織樣本被移除，用于隨后的分析(例如完整的組織或其完整部分)或用于重新使用流動(dòng)池。在特定的實(shí)施例中，流動(dòng)池的完整性將在拆卸和重新組裝后基本相同。在一些實(shí)施例中，不要工具來(lái)進(jìn)行組裝或拆卸。然而，在一些情況下，為便于使用，可以提供手動(dòng)工具，而不需要使用電動(dòng)工具。

圖10a和圖10b分別圖示了用于保持組織樣本并進(jìn)行各種類型的反應(yīng)化學(xué)中的任何一種(例如sbs化學(xué)過(guò)程)的流動(dòng)池1000的示例的平面圖和截面圖。在該示例中，流動(dòng)池1000包括使用o型環(huán)1014聯(lián)接在一起的底部基底1010和頂部基底1012。o型環(huán)1014可以由氟橡膠、硅酮或具有工藝相容性的任何其他材料形成。即是說(shuō)，底部基底1010具有用于接收o型環(huán)1014的凹槽1016且頂部基底1012具有用于接收o型環(huán)1014的凹槽1018。在組裝時(shí)，o型環(huán)1014裝配在底部基底1010的凹槽1016中和頂部基底1012的凹槽1018中，且被夾在底部基底1010和頂部基底1012之間。o型環(huán)1014的尺寸設(shè)定為使得，當(dāng)?shù)撞炕?010、頂部基底1012和o型環(huán)1014組裝在一起時(shí)，底部基底1010和頂部基底1012之間具有空間或間隙。在該空間或間隙中，o型環(huán)1014限定流動(dòng)池1000中的反應(yīng)室1020。另外，頂部基底1012具有入口1022和出口1024，用于使液體(例如，試劑)流入和/或流經(jīng)流動(dòng)池1000的反應(yīng)室1020。此外，在一個(gè)示例中，底部基底1010、頂部基底1012和o型環(huán)1014可以使用螺釘1026保持在一起。圖10b還示出了流動(dòng)池1000的反應(yīng)室1020內(nèi)的組織樣本120。

圖11圖示了使用圖10a和圖10b所示的流動(dòng)池1000來(lái)處理組織樣本的方法1100的示例的流程圖。方法1100可以包含但不限于以下步驟。

在步驟1110，提供流動(dòng)池的第一基底。例如，提供流動(dòng)池1000的底部基底1010。

在步驟1115，樣本組織放置在第一基底上。例如，組織樣本120放置在流動(dòng)池1000的底部基底1010上。

在步驟1120，提供第二基底，并將其組裝到第一基底，其中反應(yīng)室形成在樣本組織周圍。例如，提供頂部基底1012，并使用o型環(huán)1014和螺釘1026將其組裝到底部基底1010。在這樣做時(shí)，o型環(huán)1014在組織樣本120周圍限定反應(yīng)室1020。

在步驟1125，對(duì)樣本組織進(jìn)行化學(xué)操作。例如，使用入口1022和出口1024，使液體流入和/或流經(jīng)流動(dòng)池1000的反應(yīng)室1020，對(duì)組織樣本120進(jìn)行化學(xué)操作(例如sbs化學(xué)操作)。在該示例中，組織樣本120的成像或掃描過(guò)程可以通過(guò)底部基底1010和/或頂部基底1012發(fā)生。

方法可以包含伴隨測(cè)序或其他核酸檢測(cè)技術(shù)(例如本文別處闡述的那些)的成像步驟。替代地，方法可以包含獲取組織樣本的物理形式或結(jié)構(gòu)的圖片、圖像或其他表示的步驟。該表示可以經(jīng)由光場(chǎng)、熒光或其他顯微技術(shù)獲得，并且可以可選地通過(guò)使用染料或標(biāo)記來(lái)輔助。該表示與空間分辨核酸檢測(cè)結(jié)果的比較可用于定位具有組織的可識(shí)別特征的遺傳信息?？梢员恍薷囊杂糜诒疚乃龅难b置和方法的用于核酸的空間檢測(cè)的示范性方法在以下文獻(xiàn)中描述，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)no.2014/0066318a1和pct申請(qǐng)公開(kāi)no.wo2014/060483a1，其均通過(guò)引用并入本文。

圖12a和圖12b分別圖示了用于保持組織樣本并進(jìn)行各種類型的反應(yīng)化學(xué)中的任何一種(例如sbs化學(xué)過(guò)程)的流動(dòng)池1200的另一示例的平面圖和截面圖。在該示例中，流動(dòng)池1200包括底部基底1210和頂部基底1212。底部基底1210和頂部基底1212使用夾在其之間的粘合層1214結(jié)合在一起。開(kāi)口設(shè)置在粘合層1214中，從而在流動(dòng)池1200中形成反應(yīng)室1216，其更多的細(xì)節(jié)在圖14a和圖14b中示出。另外，入口1218和出口1220設(shè)置在頂部基底1212中。入口1218和出口1220用于使液體(例如，試劑)流入和/或流經(jīng)流動(dòng)池1200中的反應(yīng)室1216。

粘合層1214用于將底部基底1210和頂部基底1212聯(lián)接在一起。在一個(gè)示例中，粘合層1214是雙面膠帶的層，例如紫外(uv)固化雙面膠帶。

在流動(dòng)池1200的反應(yīng)室1216內(nèi)，組織樣本可以放置在頂部基底上、底部基底上、或兩個(gè)基底上。例如，圖12b示出了在反應(yīng)室1216內(nèi)且在底部基底1210上的組織樣本120。在另一示例中，且現(xiàn)在參考圖13a，反應(yīng)室1216內(nèi)的組織樣本120在頂部基底1212上。在又一示例中，且現(xiàn)在參考圖13b，在反應(yīng)室1216內(nèi)，第一組織樣本120在底部基底1210上，且第二組織樣本120在頂部基底1212上。

現(xiàn)在參考圖14a和圖14b，其分別是作為圖12a和圖12b所示的流動(dòng)池1200的粘合部分的粘合層1214的示例的平面圖和截面圖。即是說(shuō)，圖14a和圖14b示出了粘合層1214中的開(kāi)口1230，其用于形成流動(dòng)池1200的反應(yīng)室1216。在一個(gè)示例中，粘合層1214的厚度為大約100μm。

圖15圖示了使用圖12a和圖12b所示的流動(dòng)池1200來(lái)處理組織樣本的方法1500的示例的流程圖。方法1500可以包含但不限于以下步驟。

在步驟1510，提供流動(dòng)池的第一基底。例如，提供流動(dòng)池1200的底部基底1210。

在步驟1515，將樣本組織放置在第一基底上。例如，將組織樣本120放置在流動(dòng)池1200的底部基底1210上。

在步驟1520，提供第二基底，然后使用粘合層將其聯(lián)接到第一基底，其中粘合層在樣本組織周圍限定反應(yīng)室。例如，提供頂部基底1212，然后使用粘合層1214(例如，紫外固化雙面膠帶)將其聯(lián)接到底部基底1210，其中粘合層1214中的開(kāi)口1230在組織樣本120周圍形成反應(yīng)室1216。在紫外固化雙面膠帶的情況下，紫外固化操作可以發(fā)生在形成粘合層1214與底部基底1210和頂部基底1212之間的結(jié)合的該步驟中。

在步驟1525，對(duì)樣本組織進(jìn)行化學(xué)操作。例如，使用入口1218和出口1220，使液體流入和/或流經(jīng)流動(dòng)池1200的反應(yīng)室1216，并對(duì)組織樣本120進(jìn)行化學(xué)操作(例如sbs化學(xué)操作)。在該示例中，組織樣本120的成像或掃描過(guò)程可以通過(guò)底部基底1210和/或頂部基底1212發(fā)生。再次重復(fù)，成像可以作為核酸檢測(cè)技術(shù)的一部分進(jìn)行，和/或確定組織樣本的形狀或形式。

圖16a和圖16b圖示了使用開(kāi)放式容器來(lái)保持組織樣本的流動(dòng)池1600的示例和對(duì)其中的組織樣本“干”成像的過(guò)程的示例的側(cè)視圖。在該示例中，流動(dòng)池1600包括開(kāi)放式容器1610。兩個(gè)或更多個(gè)管相對(duì)于開(kāi)放式容器1610設(shè)置，作為它的(多個(gè))入口和/或(多個(gè))出口。例如，管1612和管1614相對(duì)于開(kāi)放式容器1610設(shè)置，其中管1612的一端且管1614的一端在開(kāi)放式容器1610內(nèi)。即是說(shuō)，管1612和管1614用于使液體1620(例如，試劑)流入和/或流經(jīng)開(kāi)放式容器1610。此外，圖16a和圖16b示出了開(kāi)放式容器1610內(nèi)的組織樣本120。

在開(kāi)放式容器1610中成像組織樣本120的過(guò)程中，圖16a示出了填充有液體1620的開(kāi)放式容器1610以及發(fā)生在組織樣本120上的化學(xué)操作?，F(xiàn)在參考圖16b，在使用管1612和管1614完成化學(xué)操作時(shí)，開(kāi)放式容器1610基本上排出液體1620，然后組織樣本120的成像或掃描過(guò)程通過(guò)沒(méi)有液體1620的氣隙發(fā)生。即是說(shuō)，圖16b示出了基本上“干”的成像過(guò)程。在開(kāi)放式容器1610中可能保持一些最小量的水分含量，使得組織樣本120可能不完全干燥。

現(xiàn)在參考圖17a和圖17b，可以使用液體浸沒(méi)成像過(guò)程。例如，圖17a示出了填充有液體1620的開(kāi)放式容器1610以及發(fā)生在組織樣本120上的化學(xué)操作。成像透鏡(例如，透鏡114)定位在開(kāi)放式容器1610的外部，且不浸沒(méi)在液體1620中。在完成化學(xué)操作時(shí)，圖17b示出了仍填充有液體1620的開(kāi)放式容器1610，且成像透鏡(例如，透鏡114)下降到開(kāi)放式容器1610中暴并浸沒(méi)在液體1620中。在該示例中，組織樣本120的成像或掃描過(guò)程在沒(méi)有氣隙的情況下發(fā)生。在沒(méi)有氣隙的情況下，可以改善分辨率和s/n比，以及更容易聚焦。

在參照?qǐng)D1至圖17b的前述詳細(xì)描述中，參考結(jié)構(gòu)和/或流動(dòng)池的部件的相對(duì)位置(例如流動(dòng)池的頂部基底和底部基底的相對(duì)位置)，在整個(gè)描述中使用術(shù)語(yǔ)“頂”、“底”、“之上”、“下”和“上”應(yīng)該理解，結(jié)構(gòu)和/或流動(dòng)池是功能性的，而不管它們?cè)诳臻g中的取向如何。

實(shí)施例的以上詳細(xì)描述參考了附圖，其示出了本公開(kāi)的具體實(shí)施例。具有不同結(jié)構(gòu)和操作的其他實(shí)施例不脫離本公開(kāi)的范圍。術(shù)語(yǔ)“發(fā)明”等是參照本說(shuō)明書(shū)中提出的申請(qǐng)人的發(fā)明的許多替代方面或?qū)嵤├哪承┚唧w實(shí)例使用的，并且其使用和不存在均不意圖限制申請(qǐng)人的發(fā)明或權(quán)利要求的范圍。本說(shuō)明書(shū)僅為了方便讀者而分為兩部分。標(biāo)題內(nèi)容不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。定義意在作為發(fā)明描述的一部分。應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，可以改變本發(fā)明的各種細(xì)節(jié)。此外，前方的描述僅是為了說(shuō)明的目的，而不是為了限制的目的。

在本申請(qǐng)中，除非另有明確說(shuō)明或在所使用的情境中被以其他方式理解，諸如“可”、“能夠”、“可能”或“可以”等的條件語(yǔ)言通常旨在表示某些實(shí)施例包含某些特征、元件和/或步驟，而其他實(shí)施例不包含。因此，這樣的條件語(yǔ)言通常并非意圖暗示特征、元件和/或步驟以任何方式對(duì)于一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例是必需的，或者在有或沒(méi)有用戶輸入或提示的情況下，一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例必然包含用于確定這些特征、元件和/或步驟是否被包含或?qū)⒃谌魏翁囟▽?shí)施例中被執(zhí)行的邏輯。在本申請(qǐng)中，已經(jīng)引用了各種出版物、專利和/或?qū)＠暾?qǐng)。這些出版物的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本申請(qǐng)中。

術(shù)語(yǔ)“包括”旨在是開(kāi)放的，不僅包含列舉的元件，而且還包含任何附加的元件。

已經(jīng)描述了許多實(shí)施例。然而，應(yīng)當(dāng)理解，可以進(jìn)行各種修改。相應(yīng)地，其他實(shí)施例在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

上述方法的各種操作可以通過(guò)能夠執(zhí)行操作的任何合適的裝置來(lái)執(zhí)行，例如各種硬件和/或軟件部件、電路、和/或模塊。通常，圖中所示的任何操作都可以由能夠執(zhí)行操作的相對(duì)應(yīng)的功能裝置執(zhí)行。

可以使用各種不同技術(shù)中的任何一種來(lái)表示信息和信號(hào)。例如，可以在上述描述中被引用的數(shù)據(jù)、指令、命令、信息、信號(hào)、位、符號(hào)和芯片可以由電壓、電流、電磁波、磁場(chǎng)或粒子、光場(chǎng)或粒子、或其任何組合來(lái)表示。

結(jié)合本文公開(kāi)的實(shí)施例描述的各種說(shuō)明性邏輯塊、模塊、電路和算法步驟可以實(shí)現(xiàn)為電子硬件、計(jì)算機(jī)軟件或兩者的組合。為了清楚地說(shuō)明硬件和軟件的這種可互換性，已經(jīng)在其功能方面一般地描述了各種說(shuō)明性部件、塊、模塊、電路和步驟。這種功能是否被實(shí)現(xiàn)為硬件或軟件取決于特定的應(yīng)用以及對(duì)整個(gè)系統(tǒng)施加的設(shè)計(jì)約束。所描述的功能可以針對(duì)每個(gè)特定的應(yīng)用以不同的方式實(shí)現(xiàn)，但是這種實(shí)現(xiàn)決定不應(yīng)被解釋為導(dǎo)致脫離本發(fā)明的實(shí)施例的范圍。

結(jié)合本文公開(kāi)的實(shí)施例描述的各種說(shuō)明性塊、模塊和電路可以使用以下來(lái)實(shí)現(xiàn)或執(zhí)行：通用處理器、數(shù)字信號(hào)處理器(dsp)、專用集成電路(asic)、現(xiàn)場(chǎng)可編程門陣列(fpga)或其他可編程邏輯裝置、分離的門或晶體管邏輯、分立的硬件部件、或設(shè)計(jì)為執(zhí)行本文所述功能的它們的任何組合。通用處理器可以是微處理器，但是替代地，處理器可以是任何常規(guī)的處理器、控制器、微控制器或狀態(tài)機(jī)。處理器還可以被實(shí)現(xiàn)為計(jì)算裝置的組合，例如dsp和微處理器的組合、多個(gè)微處理器、結(jié)合dsp內(nèi)核的一個(gè)或多個(gè)微處理器、或任何其他這樣的配置。

結(jié)合本文公開(kāi)的實(shí)施例描述的方法或算法的步驟以及功能可以直接實(shí)現(xiàn)在硬件中、在由處理器執(zhí)行的軟件模塊中、或兩者的組合中。如果實(shí)現(xiàn)為軟件，則功能可以作為一個(gè)或多個(gè)指令或代碼在有形的、非暫時(shí)性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上存儲(chǔ)和傳輸。軟件模塊可以駐留在以下之中：隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(ram)、閃存、只讀存儲(chǔ)器(rom)、電可編程rom(eprom)、電可擦除可編程rom(eeprom)、寄存器、硬盤、可移動(dòng)盤、cdrom，或本領(lǐng)域已知的任何其他形式的存儲(chǔ)介質(zhì)。存儲(chǔ)介質(zhì)聯(lián)接到處理器，使得處理器可以從存儲(chǔ)介質(zhì)讀取信息并將信息寫(xiě)入存儲(chǔ)介質(zhì)。替代地，存儲(chǔ)介質(zhì)可以與處理器是一體的。如本文所使用的，磁盤和光盤包含光碟(cd)、激光盤、光學(xué)盤、數(shù)字通用光盤(dvd)、軟盤和藍(lán)光盤，其中磁盤通常磁性地再現(xiàn)數(shù)據(jù)，而光盤用激光光學(xué)地再現(xiàn)數(shù)據(jù)。以上的組合也應(yīng)當(dāng)包含在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的范圍內(nèi)。處理器和存儲(chǔ)介質(zhì)可以駐留在asic中。sic可以駐留在用戶終端中。替代地，處理器和存儲(chǔ)介質(zhì)可以作為分立的部件駐留在用戶終端中。

為了概括本公開(kāi)，本文已經(jīng)描述了本發(fā)明的某些方面、優(yōu)點(diǎn)和新穎特征。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明的任何特定實(shí)施例，不一定都可以實(shí)現(xiàn)所有這些優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明可以以下方式來(lái)實(shí)現(xiàn)或?qū)嵤鋵?shí)現(xiàn)或優(yōu)化本文教導(dǎo)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)或優(yōu)點(diǎn)的組，而不一定實(shí)現(xiàn)本文可教導(dǎo)或建議的其他優(yōu)點(diǎn)。

上述實(shí)施例的各種修改將是顯而易見(jiàn)的，并且在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，本文限定的通用原理可以應(yīng)用于其他實(shí)施例。因此，本發(fā)明并非旨在限于本文所示的實(shí)施例，而是與本文公開(kāi)的原理和新穎特征一致的最廣泛的范圍相符合。