本發(fā)明涉及計(jì)算攝像學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種快速三維顯微成像系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

生命科學(xué)和材料科學(xué)研究對(duì)三維顯微成像提出了更高要求。目前，大多顯微三維成像利用共聚焦顯微鏡或雙光子、多光子顯微鏡，逐點(diǎn)掃描采集熒光樣本，形成不同深度下的圖像。但這些方法存在兩方面缺點(diǎn)。第一，所需激發(fā)光較強(qiáng)，容易造成熒光漂白，而且強(qiáng)光照射可能損傷樣本細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)；第二，對(duì)熒光樣本特定深度成像需要逐點(diǎn)掃描，時(shí)間效率低。因此，上述方法不適用于光敏熒光樣本和生物樣本，而且成像速度慢，不能記錄動(dòng)態(tài)場(chǎng)景。

寬視場(chǎng)顯微鏡則不同，其光通量大，在較弱激發(fā)光下即能成像，而且每個(gè)深度可以直接成像，相比前述方法成像速度快。但利用寬場(chǎng)顯微鏡獲得熒光圖像存在如下問題：激發(fā)光不但激發(fā)了樣本位于物鏡焦平面處熒光信號(hào)，也激發(fā)了非焦平面的熒光信號(hào)，因此，成像傳感器每個(gè)像素點(diǎn)光強(qiáng)是焦平面上熒光強(qiáng)度和非焦平面熒光強(qiáng)度以及噪聲疊加，每個(gè)深度獲得圖像分辨率比前述方法分辨率低。三維顯微成像就需要逐層掃描整個(gè)樣本得到一組不同深度下的圖像序列，然后通過計(jì)算方法消除噪聲和模糊重建樣本三維結(jié)構(gòu)。

光場(chǎng)顯微成像雖然不需要逐層掃描，單次拍攝即能計(jì)算重建樣本三維結(jié)構(gòu)。但該方法犧牲了空間分辨率，導(dǎo)致計(jì)算重建的樣本三維分辨率較低，而且對(duì)于較厚的樣本，重構(gòu)質(zhì)量差。基于多焦光柵的多平面同時(shí)成像方法在傅立葉面同時(shí)加入分束和相位調(diào)制，但為解決色散問題使系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少解決上述技術(shù)問題之一。

為此，本發(fā)明的目的在于提出一種快速三維顯微成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠以普通寬場(chǎng)顯微鏡單張成像速度實(shí)現(xiàn)多深度同時(shí)成像，成像速度快，圖像分辨率高，可用于活體樣本，且系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成像深度間隔便于調(diào)整。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的實(shí)施例提出了一種快速三維顯微成像系統(tǒng)，包括：顯微鏡，用于將顯微樣本放大并成像到像面引出口；視場(chǎng)光闌，位于所述顯微鏡的輸出像面上，用于約束后級(jí)成像視場(chǎng)范圍；窄帶濾光片，位于視場(chǎng)光闌后的第一級(jí)4f系統(tǒng)中間，用于對(duì)來自樣本的信息進(jìn)行窄帶濾光；分束光柵，用于將經(jīng)過所述第一級(jí)4f系統(tǒng)后的顯微輸出圖像在二維空間分束；多焦距透鏡陣列，位于第二級(jí)4f系統(tǒng)的傅立葉面上，用于對(duì)各光束加入不同相位調(diào)制，以在后級(jí)透鏡后焦面得到不同深度圖像；微透鏡陣列，位于所述第二級(jí)4f系統(tǒng)的像面，用于將經(jīng)過分束光柵和多焦距透鏡陣列的不同角度光線調(diào)制到微透鏡后不同空間位置；像感器，位于第三級(jí)4f系統(tǒng)或成像鏡頭像面上，用于記錄經(jīng)前級(jí)調(diào)制的樣本圖像。

另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的快速三維顯微成像系統(tǒng)還可以具有如下附加的技術(shù)特征：

在一些示例中，所述顯微鏡為寬視場(chǎng)熒光顯微鏡。

在一些示例中，所述分束光柵與所述窄帶濾光片通過所述第一級(jí)4f系統(tǒng)繼接，用于進(jìn)行光束信息復(fù)制和波段截取。

在一些示例中，所述多焦距透鏡陣列的分布和第二級(jí)4f系統(tǒng)的傅立葉面空間位置相對(duì)應(yīng)。

在一些示例中，對(duì)所述顯微鏡輸出的熒光圖像以衍射極限分辨率通過所述微透鏡陣列進(jìn)行調(diào)制。

在一些示例中，還包括：重構(gòu)模塊，所述重構(gòu)模塊通過抽取所述像感器得到圖像的像素點(diǎn)，得到顯微樣本的一組不同深度的成像堆棧，并利用所述成像堆棧重建顯微樣本的三維結(jié)構(gòu)。

在一些示例中，所述第一級(jí)4f系統(tǒng)、第二級(jí)4f系統(tǒng)及第三級(jí)4f系統(tǒng)為透鏡或成像鏡頭。

在一些示例中，所述像感器為SCMOS單色傳感器或其他類型成像傳感器。

在一些示例中，所述分束光柵的分束數(shù)量可調(diào)。

在一些示例中，所述多焦距透鏡陣列與所述分束光柵的分束數(shù)量相匹配。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的快速三維顯微成像系統(tǒng)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成本低廉；同時(shí)，對(duì)熒光樣本成像時(shí)所需的激發(fā)光功率較低，可以最大限度減少激光對(duì)光敏樣本、生物樣本的破壞；另外，該系統(tǒng)在成像過程不需要逐點(diǎn)掃描，成像速度快，圖像分辨率高。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的快速三維顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)框圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的快速三維顯微成像系統(tǒng)的成像光路示意圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

在本發(fā)明的描述中，需要理解的是，術(shù)語(yǔ)“中心”、“縱向”、“橫向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”、“內(nèi)”、“外”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡(jiǎn)化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。此外，術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性。

在本發(fā)明的描述中，需要說明的是，除非另有明確的規(guī)定和限定，術(shù)語(yǔ)“安裝”、“相連”、“連接”應(yīng)做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或一體地連接；可以是機(jī)械連接，也可以是電連接；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個(gè)元件內(nèi)部的連通。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以具體情況理解上述術(shù)語(yǔ)在本發(fā)明中的具體含義。

以下結(jié)合附圖描述根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的快速三維顯微成像系統(tǒng)。

圖1是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的快速三維顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)框圖。如圖1所示，該快速三維顯微成像系統(tǒng)包括：顯微鏡100、視場(chǎng)光闌200、窄帶濾光片300、分束光柵400、多焦距透鏡陣列500、微透鏡陣列600及像感器700。

其中，顯微鏡100用于將顯微樣本放大并成像到像面引出口。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，顯微鏡100為寬視場(chǎng)熒光顯微鏡，以實(shí)現(xiàn)熒光樣本一級(jí)放大，將樣本像面從引出口導(dǎo)出便于后級(jí)處理。

視場(chǎng)光闌200位于顯微鏡100的輸出像面上，用于約束后級(jí)成像視場(chǎng)范圍。

窄帶濾光片300位于視場(chǎng)光闌200后的第一級(jí)4f系統(tǒng)中間，用于對(duì)來自樣本的信息進(jìn)行窄帶濾光。也就是說，通過窄帶濾光片300后，來自樣本的信息僅窄帶通過，從而解決后級(jí)分束光柵帶來的色散問題。需要說明的是，在實(shí)際成像光路中，窄帶濾光片300的并不嚴(yán)格限定，即位置可調(diào)。

其中，4f系統(tǒng)例如為兩個(gè)不同焦距的透鏡或鏡頭，前級(jí)透鏡后焦面和后級(jí)透鏡前焦面重合。如果成像光路像面位于前級(jí)透鏡前焦面上，在后級(jí)透鏡后焦面處將得到被放大或縮小的像面。像面放大縮小比例由后級(jí)透鏡和前級(jí)透鏡焦距比例決定。

分束光柵400用于將經(jīng)過第一級(jí)4f系統(tǒng)后的顯微輸出圖像在二維空間分束。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，分束光柵400與窄帶濾光片300通過第一級(jí)4f系統(tǒng)繼接，用于進(jìn)行光束信息復(fù)制和波段截取。分束光柵400例如位于第一級(jí)4f系統(tǒng)的像面上。

多焦距透鏡陣列500位于第二級(jí)4f系統(tǒng)的傅立葉面上，用于對(duì)各光束加入不同相位調(diào)制，以在后級(jí)透鏡后焦面得到不同深度圖像。具體地，即在復(fù)制的各光束傅立葉面上利用多焦距透鏡陣列加入不同相位調(diào)制。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)各光束加入不同相位調(diào)制，多焦距透鏡陣列500的分布和第二級(jí)4f系統(tǒng)的傅立葉面空間位置嚴(yán)格對(duì)應(yīng)。

微透鏡陣列600位于第二級(jí)4f系統(tǒng)的像面，用于將經(jīng)過分束光柵400和多焦距透鏡陣列500的不同角度光線調(diào)制到微透鏡后不同空間位置。具體地說，由于不同深度成像光束角度不同，因此通過微透鏡陣列600將這些不同深度的信息調(diào)制到傳感器不同空間位置，從而實(shí)現(xiàn)不同深度同時(shí)成像。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)顯微鏡100輸出的熒光圖像以衍射極限分辨率通過微透鏡陣列600或其他強(qiáng)度或相位進(jìn)行調(diào)制。

像感器700位于第三級(jí)4f系統(tǒng)或成像鏡頭像面上，用于記錄經(jīng)前級(jí)調(diào)制的樣本圖像。也就是說，像感器700和微透鏡陣列600間通過第三級(jí)4f系統(tǒng)或成像鏡頭繼接，對(duì)經(jīng)前級(jí)調(diào)制后的各光束同時(shí)成像。具體地，像感器700例如為SCMOS單色傳感器或其他類型成像傳感器。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述的第一級(jí)4f系統(tǒng)、第二級(jí)4f系統(tǒng)及第三級(jí)4f系統(tǒng)例如為透鏡或成像鏡頭。也即是說，各級(jí)繼接的4f系統(tǒng)既可以用透鏡實(shí)現(xiàn)，也可以用成像鏡頭實(shí)現(xiàn)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，為保證像面以衍射極限分辨率采樣，各級(jí)4f系統(tǒng)的放大倍數(shù)、各光學(xué)器件的數(shù)值孔徑需要匹配。本發(fā)明的實(shí)施例主要針對(duì)窄帶成像，需要在成像光路加入窄帶濾光片，解決分束光柵帶來的色散問題。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，分束光柵400的分束數(shù)量可調(diào)?；诖耍嘟咕嗤哥R陣列500與分束光柵400的分束數(shù)量相匹配。例如，分束光柵400將入射光分為5*5維的光束，實(shí)際應(yīng)用可以根據(jù)需要調(diào)整分束光柵400的設(shè)計(jì)，增加或減少分束數(shù)量或空間分布。基于此，多焦透鏡陣列500為和分束光柵400匹配，也采用5*5的多焦透鏡陣列。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該系統(tǒng)例如還包括重構(gòu)模塊(圖中未示出)。利用單次拍攝的圖片，每個(gè)微透鏡后相同位置的像素對(duì)應(yīng)樣本同一深度成像結(jié)果。重構(gòu)模塊通過抽取像感器700得到圖像的像素點(diǎn)，得到顯微樣本的一組不同深度的成像堆棧，并利用成像堆棧重建顯微樣本的三維結(jié)構(gòu)，從而消除非焦面信號(hào)影響，實(shí)現(xiàn)顯微樣本三維結(jié)構(gòu)的重建。在具體實(shí)施例中，重構(gòu)模塊計(jì)算重建過程在普通PC機(jī)或工作站等硬件系統(tǒng)上即可實(shí)現(xiàn)。

在具體實(shí)施例中，由于采用了窄帶濾光片，因此，本發(fā)明實(shí)施例的快速三維顯微成像系統(tǒng)既能應(yīng)用于熒光樣本成像，也可用于明場(chǎng)顯微成像。

也就是說，本發(fā)明實(shí)施例的快速三維顯微成像系統(tǒng)主要包括圖像采集和計(jì)算重構(gòu)兩部分。其中圖像采集部分由熒光顯微鏡，窄帶濾光片，分束光柵，多焦距透鏡陣列，微透鏡陣列和像感器組成。分束光柵通過像面調(diào)制實(shí)現(xiàn)光束信息復(fù)制。多焦距透鏡陣列在復(fù)制的光束傅立葉面上加入不同相位調(diào)制，實(shí)現(xiàn)樣本不同深度信息從不同角度同時(shí)成像到后級(jí)的微透鏡陣列。微透鏡陣列將像面上不同角度光線調(diào)制到微透鏡后對(duì)應(yīng)像感器不同像素點(diǎn)。計(jì)算重構(gòu)部分利用獲取的不同深度圖像信息，計(jì)算重構(gòu)樣本三維圖像。相比其他成像方法，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于單次拍攝實(shí)現(xiàn)樣本不同深度同時(shí)成像，成像速度快，可用于活體樣本；相比多焦光柵方法，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成像深度間隔便于調(diào)整。

作為具體的示例，本發(fā)明實(shí)施例的系統(tǒng)的原理可概述為：利用寬場(chǎng)顯微鏡高倍物鏡，在輸出的樣本熒光圖像面上加入分束光柵，然后在傅立葉面上加入相位調(diào)制，再以極限分辨率通過微透鏡陣列，經(jīng)微透鏡陣列調(diào)制后，實(shí)現(xiàn)不同角度光線對(duì)應(yīng)到樣本不同深度，再調(diào)整每個(gè)微透鏡對(duì)應(yīng)傳感器上像素范圍，使傳感器能夠同時(shí)獲得的不同深度圖像，然后利用計(jì)算方法消除非焦面信息影響，重建樣本三維結(jié)構(gòu)。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于激發(fā)光源功率低，可應(yīng)用于光敏樣本和生物樣本成像，減少熒光漂白和對(duì)樣本的損傷；成像速度快，可以普通寬場(chǎng)顯微鏡單張成像速度實(shí)現(xiàn)多深度同時(shí)成像，圖像分辨率高。

綜上，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的快速三維顯微成像系統(tǒng)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成本低廉；同時(shí)，對(duì)熒光樣本成像時(shí)所需的激發(fā)光功率較低，可以最大限度減少激光對(duì)光敏樣本、生物樣本的破壞；另外，該系統(tǒng)在成像過程不需要逐點(diǎn)掃描，成像速度快，圖像分辨率高。

為了便于更好地理解本發(fā)明，以下結(jié)合圖2，以具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明上述實(shí)施例的快速三維顯微成像系統(tǒng)做進(jìn)一步詳細(xì)描述。

在本實(shí)施例中，結(jié)合圖2，該系統(tǒng)例如包括：顯微鏡100、視場(chǎng)光闌200、窄帶濾光片300、分束光柵400、多焦距透鏡陣列500、微透鏡陣列600及像感器700。

具體地，結(jié)合圖2所示，顯微樣本107位于顯微鏡100的顯微物鏡106的焦面上。激光光源104發(fā)出的激發(fā)光通過二向色鏡105反射后經(jīng)物鏡106聚焦后激發(fā)樣本107的熒光信號(hào)。熒光信號(hào)經(jīng)物鏡106后，透過二向色鏡105，再經(jīng)反射鏡103和管鏡102后成像到像面引出口101。在像面位置放置視場(chǎng)光闌200，限制視場(chǎng)大小，便于系統(tǒng)調(diào)節(jié)。進(jìn)一步通過第一級(jí)4f系統(tǒng)201繼接像至分束光柵400。為解決分束光柵的色散問題，在第一級(jí)4f系統(tǒng)201中間加入窄帶濾光片300。經(jīng)分束光柵后，原光束被分為5*5份，其傅立葉面在空間上完全分開。多光束經(jīng)第二級(jí)4f系統(tǒng)501調(diào)整后送微透鏡陣列600。為實(shí)現(xiàn)不同深度同時(shí)成像到第二級(jí)4f系統(tǒng)501后焦面，在第二級(jí)4f系統(tǒng)501中間的傅立葉面上針對(duì)不同光束加入不同相位調(diào)制。本實(shí)施例采用5*5多焦距透鏡陣列500。由于各光束對(duì)應(yīng)的透鏡焦距不同，加入了不同相位調(diào)制，在第二級(jí)4f系統(tǒng)501后焦面會(huì)得到不同深度成像。由于不同深度成像來自不同方向的光束，這些光束經(jīng)位于像面上的微透鏡陣列600調(diào)制后，將不同深度光束對(duì)應(yīng)到空間不同角度，再經(jīng)過第三級(jí)4f系統(tǒng)601調(diào)整放大倍數(shù)后，在像感器上，每個(gè)微透鏡對(duì)應(yīng)5*5個(gè)像素，不同角度光束對(duì)應(yīng)到像感器不同空間位置，實(shí)現(xiàn)不同深度同時(shí)采集成像。像感器700位于第三級(jí)4f系統(tǒng)601像面后一個(gè)微透鏡焦距處，實(shí)現(xiàn)不同深度信息與微透鏡后特定像素準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)。

在本實(shí)施例中，上述的顯微鏡100既可以是傳統(tǒng)的商業(yè)顯微鏡，也可以根據(jù)不同應(yīng)用選擇倒置顯微鏡，也可以是正置顯微鏡，并不局限于示意圖2中所示的倒置顯微鏡形式，其構(gòu)成以及作用對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言都是已知的，此處不再詳細(xì)贅述。

進(jìn)一步，在本實(shí)施例中，通過對(duì)上述系統(tǒng)采集到的不同深度同時(shí)成像圖片的處理，恢復(fù)顯微樣本三維結(jié)構(gòu)的計(jì)算過程。首先對(duì)采集到的圖像進(jìn)行抽取，由于每個(gè)微透鏡后對(duì)應(yīng)5*5個(gè)不同深度的信息，首先需要抽取相同深度信息組成該深度成像。由于經(jīng)第二級(jí)4f系統(tǒng)501的放大，單個(gè)微透鏡以衍射極限分辨率對(duì)成像采樣，不會(huì)造成空間分辨率損失。對(duì)25個(gè)深度信息抽取完畢，依據(jù)深度次序可以得到一組樣本不同深度成像堆棧。進(jìn)一步可以利用傳統(tǒng)三維解卷積方法計(jì)算重構(gòu)高分辨三維圖像。

在本發(fā)明實(shí)施例的系統(tǒng)中，需要注意的是，各級(jí)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑的匹配。物鏡本身提供的數(shù)值孔徑，在通過分束光柵以及微透鏡陣列時(shí)，都會(huì)在各自維度上發(fā)生數(shù)值孔徑的擴(kuò)展，兩者的擴(kuò)展程度需要保持一致才能使得最終成像面不出現(xiàn)混疊或者采樣不足的情況。

在本發(fā)明實(shí)施例的系統(tǒng)中，需要注意的是，各級(jí)4f系統(tǒng)放大倍數(shù)的確定。為保證空間分辨率不損失，同時(shí)充分利用像感器像素，必須確保各級(jí)放大倍數(shù)準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)微透鏡以衍射極限分辨率對(duì)不同深度成像采樣，保證不同深度信息準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)到微透鏡對(duì)應(yīng)的像感器指定位置像素。如果4f系統(tǒng)放大倍數(shù)不匹配，可能造成成像空間分辨率下降或不同深度信息混疊。

綜上，本發(fā)明實(shí)施例的快速三維顯微成像系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)單相機(jī)下單次曝光采集高分辨率和高精度的樣本三維數(shù)據(jù)。該系統(tǒng)首次實(shí)現(xiàn)的單相機(jī)的多深度同時(shí)采集系統(tǒng)，具有很廣闊的應(yīng)用前景。與傳統(tǒng)掃描方法相比，該系統(tǒng)將光學(xué)設(shè)計(jì)和計(jì)算重構(gòu)相結(jié)合，減少了采樣時(shí)間，避免了熒光樣本漂白。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同限定。