本發(fā)明屬于共聚焦顯微領(lǐng)域，特別涉及一種基于相位調(diào)制的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明的顯微方法及裝置。

背景技術(shù)：

共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)形成點(diǎn)光源對(duì)物鏡焦平面處的樣品進(jìn)行掃描。焦平面上的被照射點(diǎn)在探測(cè)針孔處成像，而焦平面以外的點(diǎn)并不會(huì)在探測(cè)針孔處成像。被照射點(diǎn)的圖像信息由探測(cè)針孔后的光電探測(cè)器逐點(diǎn)接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視屏上形成熒光圖像，這樣得到的共聚焦圖像就是樣品內(nèi)物鏡焦平面的光學(xué)橫切面。但是根據(jù)衍射理論，顯微鏡的分辨能力與波長和數(shù)值孔徑有關(guān)，存在衍射極限，雖然減小波長和增大數(shù)值孔徑都能提高分辨率，但都無法突破衍射極限，不能真正大幅度地提高分辨率。

近年來，一些突破衍射極限的超分辨顯微方法逐漸提出。其中受激發(fā)射損耗顯微鏡(sted)通過分子態(tài)的飽和損耗可實(shí)現(xiàn)超分辨，但需使用大功率激光器提高分辨率，很容易發(fā)生熒光漂白現(xiàn)象；隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(storm)則是通過犧牲時(shí)間分辨率來換取空間分辨率，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品像的快速獲取。與受激發(fā)射損耗顯微鏡(sted)和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(storm)相比，結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(sim)的照明只需要單波長光源，且不需要特殊的熒光探針。通過結(jié)構(gòu)光照明，可以將樣品的高頻部分移到光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)傳遞函數(shù)所限制的通帶內(nèi)，并隨后合并頻率信息。由于照明的頻率亦被物鏡的數(shù)值孔徑所限制，傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡僅僅能夠提升兩倍的分辨率。為了克服兩倍分辨率提升的上限，飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(ssim)利用飽和激發(fā)態(tài)所產(chǎn)生的非線性向照明結(jié)構(gòu)光引入高次諧波，所以可以獲取高于光學(xué)傳遞函數(shù)通帶兩倍的頻率。但是由于產(chǎn)生非線性相應(yīng)有極高的光功率要求，飽和結(jié)構(gòu)光照明非常容易產(chǎn)生光致漂白現(xiàn)象，甚至造成固定樣品的損壞，這就解釋了飽和結(jié)構(gòu)光照明不能廣泛的應(yīng)用于生物樣品觀測(cè)的事實(shí)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明在共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上，提出了一種基于相位調(diào)制的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微方法及裝置，可在提升成像分辨率的情況下同時(shí)降低所需成像光強(qiáng)，從而降低了實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)光源的要求，同時(shí)減少了光致漂白的產(chǎn)生。本裝置通過對(duì)激光光源進(jìn)行相位調(diào)制聚焦產(chǎn)生雙峰激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，沿著不同方向進(jìn)行掃描，將高頻部分引入所獲取的像，從而提高了結(jié)構(gòu)光照明顯微成像的橫向和縱向分辨率。同時(shí)采用激光點(diǎn)掃描照明，相對(duì)于寬場(chǎng)飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微成像大大降低了照明所需光強(qiáng)，同時(shí)亦可獲取足夠的高頻分量。

相對(duì)于其他超分辨成像顯微鏡，本發(fā)明是基于共聚焦顯微鏡，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于操作，通過接收激光點(diǎn)掃描激發(fā)的熒光能夠?qū)崿F(xiàn)超分辨顯微成像，可用于光學(xué)顯微成像領(lǐng)域。

一種基于相位調(diào)制的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明的顯微方法，包括步驟：

1)將準(zhǔn)直后的照明光束轉(zhuǎn)換為線偏光；

2)在所述的線偏光上加載第一方向的0-π相位，并調(diào)整線偏光的偏振方向；

3)利用偏振方向調(diào)整后的線偏光對(duì)樣品進(jìn)行掃描，形成激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光的第一激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明圖案，并收集得到第一熒光信號(hào)；

4)在所述的線偏光上加載第二方向的0-π相位，并適應(yīng)調(diào)整線偏光的偏振方向；

5)利用偏振方向調(diào)整后的線偏光對(duì)樣品進(jìn)行掃描，形成激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光的第二激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明圖案，并收集得到第二熒光信號(hào)；

6)對(duì)所述的第一熒光信號(hào)和第二熒光信號(hào)進(jìn)行處理，得到橫向分辨率提升的超分辨圖像。

本發(fā)明中，可采用具有0-π相位圖案的空間光調(diào)制器或者0-π位相板在線偏光上加載0-π相位。

優(yōu)選的，在步驟2)中，利用具有0-π相位圖案的空間光調(diào)制器在所述的線偏光上加載第一方向的0-π相位；在步驟4)中，轉(zhuǎn)動(dòng)所述空間光調(diào)制器上的0-π相位圖案，在所述的線偏光上加載第二方向的0-π相位。

并列優(yōu)選實(shí)施的，在步驟2)中，利用0-π位相板在所述的線偏光上加載第一方向的0-π相位；在步驟4)中，轉(zhuǎn)動(dòng)0-π位相板，在所述的線偏光上加載第二方向的0-π相位。

優(yōu)選的，在所述的線偏光上加載第二方向的0-π相位時(shí)，轉(zhuǎn)動(dòng)的角度為60°或/和120°，此角度僅為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式之一，也可以采用其他的轉(zhuǎn)動(dòng)角度，轉(zhuǎn)動(dòng)角度只要滿足轉(zhuǎn)動(dòng)的次數(shù)和未知數(shù)的個(gè)數(shù)相同即可解出方程，具體的角度并沒有嚴(yán)格的要求。

本發(fā)明中，根據(jù)復(fù)原所用的級(jí)次以及對(duì)各個(gè)方向分辨率的要求選擇掃描角度，依次加載不同角度方向的0-π相位，得到不同角度方向?qū)?yīng)的第二熒光信號(hào)。

所述的第二熒光信號(hào)僅用于區(qū)別于第一熒光信號(hào)，并不用于限定熒光圖像的數(shù)量，第二熒光信號(hào)表示轉(zhuǎn)動(dòng)某個(gè)角度后得到的熒光圖像，通常需要得到多幅的掃描圖像以求解頻率信息。

本發(fā)明中，在改變掃描光斑的方向來獲取不同的照明圖案時(shí)，轉(zhuǎn)動(dòng)空間光調(diào)制器上的0-π相位圖像或0-π位相板的角度為60°或120°。

本發(fā)明還提供了一種基于相位調(diào)制的的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明的顯微裝置，針對(duì)熒光樣品包括：

(1)激光器，用于發(fā)出激發(fā)光，實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光樣品的照明激發(fā)；

(2)準(zhǔn)直透鏡，用于對(duì)激光器發(fā)出的激光進(jìn)行準(zhǔn)直；

(3)起偏器，用于對(duì)準(zhǔn)直后的激光進(jìn)行起偏，使其成為線偏光；

(4)相位調(diào)制器，用于在線偏光上加載不同方向的0-π相位；

(5)半波片，用于調(diào)整線偏光的偏振方向；

(6)掃描振鏡系統(tǒng)，包括：第一振鏡，用于進(jìn)行x方向上的掃描；和第二振鏡，用于進(jìn)行y方向上的掃描；

(7)掃描鏡，用于激光掃描；

(8)場(chǎng)鏡，用于激光掃描；

(9)二色鏡，用于透過激發(fā)光，反射樣品被激發(fā)后產(chǎn)生的熒光；

(10)顯微物鏡，用于聚焦激光以及收集熒光；

(11)透鏡，用于聚焦激光激發(fā)產(chǎn)生的熒光，將熒光聚焦在光電探測(cè)器平面上；

(12)光電探測(cè)器，將探測(cè)到的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，輸送至計(jì)算機(jī)；

(13)樣品臺(tái)，用于軸向移動(dòng)樣品；

(14)計(jì)算機(jī)，用于處理探測(cè)器的信號(hào)，控制快門的開關(guān)，同時(shí)控制振鏡掃描形成照明圖案。

本發(fā)明中，所述的相位調(diào)制器可以選用具有0-π相位圖案的空間光調(diào)制器，通過轉(zhuǎn)動(dòng)0-π相位圖案來加載不同方向的0-π相位；另外，所述的相位調(diào)制器也可采用0-π位相板，通過轉(zhuǎn)動(dòng)0-π位相板來加載不同方向的0-π相位。

在上述顯微裝置的基礎(chǔ)上，具體操作步驟如下：

(1)激光器發(fā)出照明光束，首先經(jīng)過準(zhǔn)直透鏡準(zhǔn)直得到一束平行光，準(zhǔn)直后的照明光束經(jīng)一個(gè)起偏器后，得到線偏光；線偏光經(jīng)過0-π位相板或具有0-π相位圖案(圖2(a))的空間光調(diào)制器調(diào)制，隨后的半波片被旋轉(zhuǎn)到相位調(diào)制圖案的相應(yīng)取向，通過空間光調(diào)制器光線再次通過半波片，得到一個(gè)具有兩個(gè)峰值的激發(fā)點(diǎn)，其橫切面如圖2(b)；通過振鏡掃描形成一個(gè)照明圖案，如圖2(c)所示；通過改變空間光調(diào)制器的位相圖像，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)半波片到相應(yīng)方向，可以得到不同取向的掃描圖像。改變空間光調(diào)制器上相位圖案或轉(zhuǎn)動(dòng)0-π位相板如圖4(a)和圖5(a)所示，所得到的的激發(fā)光斑形狀如圖4(b)和圖5(b)所示，轉(zhuǎn)動(dòng)相位圖案60°得到的激發(fā)光斑如圖4(b)，轉(zhuǎn)動(dòng)相位圖案120°得到的激發(fā)光斑如圖5(b)所示。光斑經(jīng)過振鏡之后通過掃描鏡和場(chǎng)鏡，透過二色鏡，進(jìn)入物鏡聚焦，激發(fā)出熒光。

(2)所述熒光樣品被激光點(diǎn)掃描激發(fā)，得到的熒光先被物鏡收集，經(jīng)二色鏡反射，再經(jīng)透鏡聚焦被光電探測(cè)器接收；

(3)改變空間光調(diào)制器上的0-π相位圖像或轉(zhuǎn)動(dòng)0-π位相板，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)半波片，從而改變掃描光斑的方向，獲取不同的照明圖案，不同角度下激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明圖案如圖4(c)，圖5(c)所示，轉(zhuǎn)動(dòng)60°所得照明圖案如圖4(c)所示，轉(zhuǎn)動(dòng)120°所得照明圖案如圖5(c)所示。

(4)通過采集和處理不同角度下的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明圖案激發(fā)的熒光信號(hào)，得到橫向分辨率提升的超分辨圖像。

本發(fā)明原理如下：

在通用的共聚焦顯微鏡裝置基礎(chǔ)上，首先利用一個(gè)起偏器，將準(zhǔn)直激光起偏為線偏光，經(jīng)過一個(gè)空間光調(diào)制器之后，加載了0-π相位(如圖2(a))，然后通過了一個(gè)半波片，之后經(jīng)過兩個(gè)振鏡，通過振鏡實(shí)現(xiàn)x-y平面掃描，經(jīng)過場(chǎng)鏡和掃描鏡，透過二色鏡，最終得到一個(gè)激光掃描照明圖案(如圖2(c))。激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。

通過改變空間光調(diào)制器上的相位圖案的方向，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)半波片到相應(yīng)方向來改變激發(fā)光斑的空心朝向，如圖4(b)和圖5(b)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)激光照明圖像方向的轉(zhuǎn)動(dòng)，如圖4(c)和圖5(c)。獲取不同激發(fā)圖案下的熒光信號(hào)。通過對(duì)不同方向照明得到的熒光信號(hào)的處理，可以最終得到橫向分辨率提升的圖像。

同時(shí)，本發(fā)明在縱向分辨率的提升上亦有優(yōu)勢(shì)。其優(yōu)勢(shì)在于其光學(xué)切片能力。傳統(tǒng)的寬場(chǎng)照明顯微成像，樣品中非焦平面上的點(diǎn)亦會(huì)被激發(fā)，導(dǎo)致成像質(zhì)量的下降。通過采用結(jié)構(gòu)光照明，軸向上的相干區(qū)域被限制，所以非焦平面上的樣品沒有被照明圖案調(diào)制，因此在焦平面上的被照明圖案調(diào)制的樣品可以被更好的觀察。本發(fā)明采用激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明，由于激光點(diǎn)掃描照明中的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)在軸向受限(如圖6所示)，所以進(jìn)一步提升了結(jié)構(gòu)光照明的光學(xué)切片能力。

本發(fā)明在實(shí)現(xiàn)橫向的超分辨顯微成像的同時(shí)提升了縱向分辨率，在一定程度上達(dá)到了三維超分辨的效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

(1)相對(duì)于原有的共聚焦顯微鏡，通過激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明實(shí)現(xiàn)了橫向超分辨。

(2)通過激光掃描實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)光照明的方法，產(chǎn)生軸向受限的激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，實(shí)現(xiàn)了軸向分辨率的提升。

(3)裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)處理方便。

附圖說明

圖1為一種由空間光調(diào)制器調(diào)制的基于相位調(diào)制的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微裝置示意圖；

圖2為空間光調(diào)制器上所加載的0-π相位圖案，激發(fā)光斑示意圖和得到的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明圖案；圖2(a)為圖1裝置中空間光調(diào)制器上所加載的0-π相位圖案；圖2(b)為圖1中空間光調(diào)制器上所加載的0-π相位后得到的激發(fā)光斑示意圖；圖2(c)為圖1中得到的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明圖案；

圖3為一種由0-π位相板調(diào)制的基于相位調(diào)制的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微裝置示意圖；

圖4為轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)制相位圖案60°后的空間光調(diào)制器上所加載的0-π相位圖像，激發(fā)光斑示意圖和得到的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明圖案；圖4(a)為圖1中轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)制相位圖案60°后的空間光調(diào)制器上所加載的0-π相位圖像；圖4(b)為圖1中轉(zhuǎn)動(dòng)空間光調(diào)制器上相位圖像60°后得到的方向改變的激發(fā)光斑示意圖；圖4(c)為圖1中轉(zhuǎn)動(dòng)空間光調(diào)制器上相位圖像60°后得到的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明圖案；

圖5為轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)制相位圖案120°后的空間光調(diào)制器上所加載的0-π相位圖像，激發(fā)光斑示意圖和得到的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明圖案；圖5(a)為圖1中轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)制相位圖案120°后的空間光調(diào)制器上所加載的0-π相位圖像；圖5(b)為圖1中轉(zhuǎn)動(dòng)空間光調(diào)制器上相位圖像120°后得到的方向改變的激發(fā)光斑示意圖；圖5(c)為圖1中轉(zhuǎn)動(dòng)空間光調(diào)制器上相位圖像120°后得到的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明圖案；

圖6為軸向受限的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此。

實(shí)施例1

如圖1所示，為一種由空間光調(diào)制器調(diào)制的基于相位調(diào)制的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微裝置，包括激光器1，準(zhǔn)直透鏡2，起偏器3，空間光調(diào)制器4a，半波片5，x方向掃描振鏡6，y方向掃描振鏡7，掃描透鏡8，場(chǎng)鏡9，二色鏡10，物鏡11，樣品12，載物臺(tái)13，透鏡14，光電探測(cè)器15，計(jì)算機(jī)16和空間光調(diào)制器控制盒17。

采用圖1所示的裝置實(shí)現(xiàn)針對(duì)熒光樣品的基于相位調(diào)制的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微方法，其過程如下：

(1)激光器1發(fā)出照明光，經(jīng)過準(zhǔn)直透鏡2準(zhǔn)直；

(2)準(zhǔn)直后的照明光經(jīng)起偏器3起偏成線偏振光；

(3)起偏后的照明光經(jīng)過空間光調(diào)制器4a加載0-π相位，然后經(jīng)過半波片5，經(jīng)過x方向掃描振鏡6，y方向掃描振鏡7，通過掃描鏡8，場(chǎng)鏡9，透過二色鏡10，經(jīng)過物鏡11聚焦在樣品12上，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品x-y平面上的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明。激發(fā)出的熒光被物鏡11收集，經(jīng)二色鏡10反射，被透鏡14收集，由光電探測(cè)器15持續(xù)接收熒光信號(hào)，傳輸?shù)接?jì)算機(jī)16中。

(4)利用空間光調(diào)制器控制盒17改變空間光調(diào)制器4a上的0-π相位相位圖案的方向，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)半波片，得到不同方向的激發(fā)光斑繼而得到不同的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明圖案，如圖2(c)、圖4(c)和圖5(c)。

(5)計(jì)算機(jī)16對(duì)不同方向照明得到熒光圖像進(jìn)行處理，可以得到橫向分辨率提升的超分辨圖像。

實(shí)施例2

如圖3所示，為一種由0-π位相板調(diào)制的基于相位調(diào)制的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微裝置，，包括激光器1，準(zhǔn)直透鏡2，起偏器3，0-π位相板4b，半波片5，x方向掃描振鏡6，y方向掃描振鏡7，掃描透鏡8，場(chǎng)鏡9，二色鏡10，物鏡11，樣品12，載物臺(tái)13，透鏡14，光電探測(cè)器15和計(jì)算機(jī)16。

采用圖3所示的裝置實(shí)現(xiàn)針對(duì)熒光樣品的基于相位調(diào)制的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微方法，其過程如下：

(1)激光器1發(fā)出照明光，經(jīng)過準(zhǔn)直透鏡2準(zhǔn)直；

(2)準(zhǔn)直后的照明光經(jīng)起偏器3起偏成線偏振光；

(3)起偏后的照明光經(jīng)過0-π位相板4b加載0-π相位，然后經(jīng)過半波片5，經(jīng)過x方向掃描振鏡6，y方向掃描振鏡7，通過掃描鏡8，場(chǎng)鏡9，透過二色鏡10，經(jīng)過物鏡11聚焦在樣品12上，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品x-y平面上的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明。激發(fā)出的熒光被物鏡11收集，經(jīng)二色鏡10反射，被透鏡14收集，由光電探測(cè)器15持續(xù)接收熒光信號(hào)，傳輸?shù)接?jì)算機(jī)16中。

(4)轉(zhuǎn)動(dòng)0-π位相板4b，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)半波片，得到不同方向的激發(fā)光斑，得到不同的激光掃描飽和結(jié)構(gòu)光照明圖案，如圖2(c)、圖4(c)和圖5(c)。

(5)計(jì)算機(jī)16對(duì)不同方向照明得到熒光圖像進(jìn)行處理，可以得到橫向分辨率提升的超分辨圖像。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施舉例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。