本發(fā)明屬于光學顯微測量、成像技術，特別是一種基于環(huán)狀可編程led照明的高效率定量相位顯微成像方法。

背景技術：

相位恢復是光學測量與成像的一個重要技術，在生物醫(yī)學和工業(yè)檢測上都發(fā)揮著重要作用。最為經典的定量相位測量方法是干涉法(cuchee,bevilacquaf,depeursingec.digitalholographyforquantitativephase-contrastimaging[j].opticsletters,1999,24(5):291-293.)，利用激光光源分束產生兩束光線，物光透過樣片再與參考光發(fā)生干涉，產生干涉條紋，通過解調算法即可獲得物體的相位延遲。然而，干涉測量方法尤其明顯的缺點：(1)干涉測量一般需要高度相干性的光源(如激光)，從而需要較為復雜的干涉裝置；(2)額外的參考光路的引入導致對于測量環(huán)境的要求變得十分苛刻；(3)高相干性的光源引入的散斑相干噪聲限制了成像系統(tǒng)的空間分辨率與測量精度。

區(qū)別于傳統(tǒng)基于干涉方法的定量相位成像，相位恢復的方法則不需要借助光學的干涉就可以實現(xiàn)定量相位的獲取。通過測量光波場的振幅/強度，利用不同軸向平面上的光強度分布來計算物體的相位分布，利用光強傳輸方程來求解相位是一種典型的直接求取相位法(teaguemr.deterministicphaseretrieval:agreen’sfunctionsolution[j].josa,1983,73(11):1434-1441.)。光強傳輸方程是一個二階橢圓偏微分方程，闡明了沿著光軸方向上光強度的變化量與垂直于光軸的平面上光波相位的定量關系。沿軸向拍攝一系列強度圖像，再利用中心差分公式求得在聚焦位置處的光強軸向微分以及光強分布，再通過數(shù)值求解光強傳輸方程可直接獲取相位信息。與干涉法、迭代相位恢復法相比，光強傳輸方程的方法主要優(yōu)點包括：(1)非干涉，僅僅通過測量物面光強直接求解相位信息，不需要引入額外參考光；(2)非迭代，通過直接求解微分方程獲得相位；(3)可以很好的應用于白光照明，如傳統(tǒng)明場顯微鏡中的科勒照明(illumination)；(4)無需相位解包裹，直接獲取相位的絕對分布，不存在一般干涉測量中的2π相位包裹問題；(5)無須復雜的光學系統(tǒng)，對于實驗環(huán)境沒有苛刻的要求，且對振動不敏感。

在科勒照明系統(tǒng)中，隨著照明數(shù)值孔徑的增大，光學成像系統(tǒng)由相干照明變?yōu)椴糠窒喔烧彰?，如圖1(a)-(c)所示。最終的成像分辨率也會隨之增大，但采集的強度圖像對比度會比較差，使觀察效果不明顯，所以一般照明光闌的數(shù)值孔徑設置為物鏡數(shù)值孔徑的70％～80％，以獲得最佳的觀測效果，這一結論也在絕大多數(shù)顯微鏡操作手冊中得以體現(xiàn)。導致這一結論的根本原因是當顯微成像系統(tǒng)的相干系數(shù)(其定義為照明數(shù)值孔徑與物鏡數(shù)值孔徑之比，σ＝naill/naobj；當σ≈0時成像系統(tǒng)為相干照明系統(tǒng)，而當σ≤1時成像系統(tǒng)為部分相干照明系統(tǒng))變大時，系統(tǒng)傳遞函數(shù)的響應幅值在不斷衰減，致使所觀測的圖像對比度變弱。但是傳遞函數(shù)的截止頻率點在不斷拓展至2倍物鏡分辨率，在圖像強度對比變弱時成像分辨率是在不斷的提高。這里就存在著成像分辨率與圖像可測量對比的選取，在相干照明情況下圖像的對比度是最強的，但是此時的成像分辨率只由物鏡數(shù)值孔徑決定。當相干系數(shù)σ＝1時，成像分辨率可拓展到兩倍物鏡數(shù)值孔徑分辨率，而圖像信息的對比度太弱導致相機無法采集到有用的信號。雖然部分相干照明已經引入基于光強傳輸方程的定量相位成像中(gureyevte,robertsa,nugentka.partiallycoherentfields,thetransport-of-intensityequation,andphaseuniqueness[j].josaa,1995,12(9):1942-1946.[2]paganind,nugentka.noninterferometricphaseimagingwithpartiallycoherentlight[j].physicalreviewletters,1998,80(12):2586.)，但也無法避免在成像分辨率與圖像可探測對比度之間的折中。而led照明作為近年來一種新型的照明調控方式，使顯微成像的手段和方法更為靈活和便捷(zhengg,horstmeyerr,yangc.wide-field,high-resolutionfourierptychographicmicroscopy[j].naturephotonics,2013,7(9):739-745.[2]zuoc,sunj,zhangj,etal.lenslessphasemicroscopyanddiffractiontomographywithmulti-angleandmulti-wavelengthilluminationsusingaledmatrix[j].opticsexpress,2015,23(11):14314-14328.)。如何突破傳統(tǒng)的圓形科勒照明模式，在定量相位成像中達到兩倍物鏡分辨率的同時，保證相機所采集的光強對比度不至于過弱，也就是成像系統(tǒng)中相位的傳遞函數(shù)響應足夠大來保證高信噪比，而這個問題成為定量相位成像技術中的一個技術難題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于環(huán)狀可編程led照明的高效率定量相位顯微成像方法，不僅最終的成像結果可達到2倍于物鏡數(shù)值孔徑的成像分辨率，還使成像系統(tǒng)的相位傳遞函數(shù)響應有較強的魯棒性；提升了定量相位成像質量和重構結果，并且可高度兼容傳統(tǒng)顯微鏡，極大的提高了定量相位成像技術的效率。

實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術解決方案為：一種基于環(huán)狀可編程led照明的高效率定量相位顯微成像方法，步驟如下：

步驟一，對部分相干成像系統(tǒng)的光學傳遞函數(shù)進行推導，在照明光源與顯微物鏡的光瞳函數(shù)是關于光軸對稱情況下，推導在部分相干照明成像系統(tǒng)中弱物體近似下的光學傳遞函數(shù)表達式；

步驟二，傾斜軸對稱相干點光源照明下弱物體近似相位傳遞函數(shù)推導，當照明由圓形部分相干照明圖案退化為傾斜軸對稱相干點光源，即兩個軸對稱的離散相干光源分別內切在物鏡光瞳的邊緣，從led陣列所處的光源面引入兩個傾斜軸對稱相干點光源，并計算在弱物體近似下成像系統(tǒng)的光學傳遞函數(shù)，通過引入離焦來產生相襯圖像，使待測樣品的相位信息可以被傳遞到離焦強度圖像中；

步驟三，軸對稱相干點光源到離散環(huán)狀點光源的拓展，即任何關于軸對稱的照明光源圖案都被分解為許多半徑不同的軸對稱離散相干點光源，其光學傳遞函數(shù)被當成是每一對傾斜軸對稱相干點光源的非相干疊加，即可得到離散情況下的環(huán)狀點光源的光學傳遞函數(shù)；

步驟四，原始圖像采集，環(huán)狀led照明圖案與物鏡光瞳內切時，沿光線傳播方向移動載物臺并利用相機采集兩幅離焦強度圖像與一幅聚焦位置強度圖；

步驟五，定量相位反卷積重構，將由相機采集的三幅強度圖像進行中心軸向差分，去除強度圖像中的對于吸收率的成分，并對其進行傅里葉變換，在頻域中除以相位的傳遞函數(shù)，加上正則化參數(shù)防止除零的情況發(fā)生，再對整體進行逆傅里葉變換，即可得到基于環(huán)狀led照明下的定量相位顯微圖像。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其顯著優(yōu)點：(1)推導出了在部分相干照明情況下傾斜軸對稱點光源的系統(tǒng)相位傳遞函數(shù)，并推廣運用到離散環(huán)狀點光源的光學傳遞函數(shù)。(2)提出了離散情況下的環(huán)狀照明模式，并將此照明模式運用到定量相位的成像方法中。(3)將環(huán)狀照明引入顯微成像系統(tǒng)中，并且在成像系統(tǒng)中加入了聚光鏡，不僅提升了系統(tǒng)的光能利用率，而且使系統(tǒng)照明數(shù)值孔徑達0.95以上。(4)led陣列的可編程控制方式使環(huán)狀照明孔徑靈活可調，以適用于不同數(shù)值孔徑的顯微物鏡，提高了系統(tǒng)的兼容性和靈活性。

下面結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細描述。

附圖說明

圖1是相干照明、部分相干照明與離散環(huán)狀照明成像系統(tǒng)的光源圖案示意圖。

圖2是基于環(huán)狀可編程led照明的定量相位成像的顯微鏡光路示意圖。

圖3是在不同離焦距離下對應各種不同照明光源模式的系統(tǒng)相位傳遞函數(shù)對比示意圖。

圖4為本發(fā)明顯微成像方法的流程示意圖。

圖5為本發(fā)明成像方法對人肺癌細胞的定量相位成像結果示意圖。

圖6為利用本發(fā)明成像方法和高數(shù)值孔徑的顯微物鏡得到的高分辨率人宮頸癌細胞的定量相位示意圖。

具體實施方式

如圖2所示，本發(fā)明是基于環(huán)狀可編程led照明的高效率定量相位顯微成像系統(tǒng)，該成像系統(tǒng)的實際硬件平臺包括led陣列、載物臺、聚光鏡、待測樣品、顯微物鏡、成像筒鏡、相機，本系統(tǒng)采用了環(huán)狀照明圖案并在光路中加入了聚光鏡。其中l(wèi)ed陣列放置在聚光鏡的前焦面位置，并且led陣列的中心處于顯微物鏡的光軸上，顯微物鏡的后焦面與成像筒鏡的前焦面重合，相機的成像平面放置在成像筒鏡的后焦面位置；成像時載物臺上的待測樣品調節(jié)到顯微物鏡的前焦面位置，構成無窮遠校正成像系統(tǒng)。環(huán)狀照明圖案顯示在所述led陣列上，每個被點亮的led單元發(fā)出的光經過聚光鏡匯聚變成部分相干光線照射在待測樣品上，該待測樣品被放置在載物臺上，光線透過待測樣品，經過成像筒鏡匯聚后照射相機的成像平面，再沿光軸方向移動載物臺并采集三幅強度圖像。

為了滿足成像方法所需的最小頻域采樣率，所述的顯微物鏡數(shù)值孔徑為naobj，環(huán)狀照明圖案上每個被點亮的led單元到led陣列中心的距離為l，且滿足其中f為聚光鏡的焦距，一般在10-20mm之間。顯微物鏡放大率為mag，相機像元尺寸為δxcam，照明光線的波長為λ，且滿足本發(fā)明中為了滿足不同數(shù)值孔徑的顯微物鏡的需求，環(huán)狀照明圖案半徑大小可通過重新編程的方法來改變大小，即滿足條件此時照明圓環(huán)半徑大小始終與物鏡數(shù)值孔徑相匹配，如圖1(d)所示。

led陣列中包括若干個(至少261個)led單元，它們等間隔排布形成一個二維陣列。其中每個led單元均為紅綠藍三色led單元，其典型波長為紅光633nm、綠光525nm和藍光465nm。每個led單元之間中心間距d典型值1-4mm。led陣列并不需要進行單獨加工，一般在市場上可直接購置。表1給出了一個市面上可購置的led陣列的產品參數(shù)。在此led陣列中，led單元共有32行、32列，一共1024個，每個led單元的亮度在2000cd/m2以上。

表1led陣列的物理參數(shù)

led陣列中每個led單元均可通過單獨點亮，點亮led單元的具體方法為現(xiàn)有常規(guī)技術，實現(xiàn)電路可以采用(但不限于)單片機、arm、或者可編程邏輯器件等現(xiàn)有技術即可實現(xiàn)，具體實現(xiàn)方法可參考相關文獻(如郭寶增,鄧淳苗：基于fpga的led顯示屏控制系統(tǒng)設計[j].液晶與顯示,2010,25(3):424-428)。

本發(fā)明利用上述基于環(huán)狀可編程led照明的成像系統(tǒng)實現(xiàn)高效率定量相位顯微成像方法步驟如下：

步驟一，對部分相干照明系統(tǒng)的光學傳遞函數(shù)進行推導。在照明光源與顯微物鏡的光瞳函數(shù)是關于光軸對稱情況下，推導在部分相干照明成像系統(tǒng)中弱物體近似下的光學傳遞函數(shù)表達式。

具體實施過程為：在基于環(huán)狀可編程led照明的高效率定量相位顯微成像系統(tǒng)構成的無窮遠校正成像系統(tǒng)中，對于非相干照明((σ＞＞1))來說，在相機的成像平面所采集的強度圖像為

其中，r為空域中的二維變量，h(r)為成像系統(tǒng)的振幅點擴散函數(shù)，t(r)為物體的復振幅，iu(r)表示在光源面上所有點光源產生的強度的疊加。

而對于相干照明成像系統(tǒng)來說光強圖像則可表示為

對于一個部分相干成像系統(tǒng)來說，在相機成像平面所采集的光強與成像系統(tǒng)之間的關系可表示為

其中a0為復振幅中的振幅平均值，tcc(0；0)是入射光線對物體的透射分量，φ(u)表示物體相位的傅里葉變換，而tcc(u；0)則可用弱物體近似下的光學傳遞函數(shù)wotf來描述：

wotf(u)≡tcc(u；0)＝∫∫s(u')p(u'+u)p(u')du'

以上公式即為弱物體近似下成像系統(tǒng)的光學傳遞函數(shù)(wotf)。其中u表示在頻域極坐標系中的二維變量，u'為頻域中臨時積分變量，s(u)為在聚光鏡的前焦面上的光源分布，p(u)為顯微物鏡的光瞳函數(shù)，其絕對值可表達為

其中ρp為顯微物鏡光瞳的歸一化截止頻率。

步驟二，傾斜軸對稱相干點光源照明下弱物體近似相位傳遞函數(shù)推導。當照明由圓形部分相干照明圖案退化為傾斜軸對稱相干點光源，即兩個軸對稱的離散相干光源分別內切在物鏡光瞳的邊緣。從led陣列所處的光源面引入兩個傾斜軸對稱相干點光源，并計算在弱物體近似下成像系統(tǒng)的光學傳遞函數(shù)，通過引入離焦來產生相襯圖像，使待測樣品的相位信息可以被傳遞到離焦強度圖像中。

具體實施過程為：如果光源分布s(u)與顯微物鏡光瞳p(u)是軸對稱分布的，wotf是實函數(shù)并且是偶函數(shù)，樣品在聚焦位置處的相位信息并不能被傳遞到光強信息中。通過軸向離焦的方式在wotf中引入相襯與虛部分量，在顯微物鏡的后焦面處的光瞳函數(shù)可表達為

將此光瞳函數(shù)代入wotf，即可得到在離焦情況下的復光學傳遞函數(shù)：

其中振幅的傳遞函數(shù)ha(u)和相位傳遞函數(shù)hp(u)分別對應著wotf的實數(shù)部分和虛數(shù)部分，可表示為：

ha(u)＝2a0re[wotf(u)]

hp(u)＝2a0im[wotf(u)]

上式中re和im分別表示對函數(shù)求取實部與虛部。在led陣列所處的光源面引入兩個傾斜軸對稱相干點光源，其光源分布s(u)為

s(u)＝δ(u-ρs)+δ(u+ρs)

其中δ表示單位沖激函數(shù)，ρs為點光源到光源中心的頻率歸一化距離。將s(u)代入wotf中，并且不同點光源到中心距離對應不同情況下的光源分布，當ρs≠0時光源產生兩軸對稱傾斜照明光，此時的相位傳遞函數(shù)為：

其中|p(u-ρs)|和|p(u+ρs)|為一對被傾斜點光源移位的物鏡光瞳函數(shù)。而當ρs＝0時兩個被移動的光瞳函數(shù)在中心位置彼此重疊，此時便對應著相干情況下的相位傳遞函數(shù)，當引入傍軸近似與弱離焦近似時相干情況下的相位傳遞函數(shù)便可推導到光強傳輸方程在頻域中的傳遞函數(shù)：

hp(u)＝|p(u)|sin(πλz|u|²)≈|p(u)|πλz|u|²。

步驟三，軸對稱相干點光源到離散環(huán)狀點光源的擴展。在相干模式分解理論中，任何關于軸對稱的照明光源圖案都可以被分解為許多半徑不同的軸對稱離散相干點光源。其光學傳遞函數(shù)可以被當成是每一對傾斜軸對稱相干點光源的非相干疊加，即可得到離散情況下的環(huán)狀點光源的光學傳遞函數(shù)。

具體實施過程為：任何關于軸對稱的部分相干照明的光源圖案都可以被分解為許多軸對稱相干點光源，其光學傳遞函數(shù)可以被當成是每一對傾斜軸對稱相干點光源的非相干疊加。最終顯示在led陣列上的環(huán)狀光源表示為：

其中n為被點亮的led數(shù)量，在頻域中每一個被點亮的led光源到led陣列的中心距離為ρp，即環(huán)狀led照明圖案基本內切與顯微物鏡光瞳，如圖1(d)所示。為了滿足成像方法所需的最小頻域采樣率，所采用的顯微物鏡數(shù)值孔徑為naobj，其放大倍率為mag，相機像元尺寸為δxcam，這幾者之間滿足利用相干模式分解理論可以得到在離散情況下的環(huán)狀led照明的相位傳遞函數(shù)。

如圖3所示，通過對比不同光源的照明模式在光學系統(tǒng)中的相位傳遞函數(shù)響應幅值大小，離散環(huán)狀點光源(圖3(b)和圖3(d))的相位傳遞函數(shù)在歸一化空間頻率內基本上是相對平坦的常數(shù)并且沒有過零點(傳遞函數(shù)過零點的會導致過零點附近的空間頻率無法恢復，所以應盡量避免函數(shù)過零點的出現(xiàn))；由于4顆led組成的環(huán)狀照明無法保證該傳遞函數(shù)在大部分方向保證足夠的響應，所以從圖3(d)可以看出該二維相位傳遞函數(shù)基本可以保證大部分方向上的頻譜響應覆蓋；圖3(a)中所示的相干照明情況下的相位傳遞函數(shù)響應雖然幅值較大，但是其空間頻率被物鏡限制在相干衍射極限，導致最終的相位重構分辨減低；圖3(c)中的相位傳遞函數(shù)雖然可以將傳遞函數(shù)的截止頻率拓展至兩倍物鏡空間頻率，但是其響應幅值在10^-3左右，即在相干系數(shù)σ＝0.99的傳統(tǒng)圓形科勒照明下，所產生相位對比度是不足以被相機探測到的，導致重構信噪比非常低。

當成像系統(tǒng)切換到不同數(shù)值孔徑的顯微物鏡時，通過對led陣列重新編程改變環(huán)狀照明圖案使其重新內切與顯微物鏡光瞳，即滿足條件此時照明圓環(huán)半徑大小始終與物鏡數(shù)值孔徑相匹配，計算此時光學成像系統(tǒng)參數(shù)對應的環(huán)狀照明的相位傳遞函數(shù)。

步驟四，原始圖像采集。將環(huán)狀led光源作為定量相位顯微成像系統(tǒng)的照明光源，環(huán)狀led照明圖案與物鏡光瞳內切時，沿光線傳播方向移動載物臺并利用相機采集兩幅離焦強度圖像與一幅聚焦位置強度圖。

步驟五，定量相位反卷積重構。將由相機采集的三幅強度圖像進行中心軸向差分，去除強度圖像中的對于吸收率的成分，并對其進行傅里葉變換，在頻域中除以相位的傳遞函數(shù)，加上正則化參數(shù)防止除零的情況發(fā)生，再對整體進行逆傅里葉變換，即可得到基于環(huán)狀led照明下的定量相位顯微圖像。

具體實施過程為：傳統(tǒng)的光強傳輸方程可表示為：

其中i(r)為在聚焦面上的光強分布，φ(r)為待測物體的相位。此光強傳輸方程可利用泊松方程快速傅里葉變換求解并且可寫成頻域拉普拉斯濾波形式

其中分別為弱離焦情況下采集的三幅光強圖像的傅里葉變換，而1/(πλz|u|²)為逆拉普拉斯形式對應著相干照明和弱離焦近似的情況下的相位傳遞函數(shù)的逆形式。而對更一般的部分相干照明來說，弱物體近似的光學傳遞函數(shù)的正向形式為：

其中系統(tǒng)的相位傳遞函數(shù)對應著弱物體近似下的光學傳遞函數(shù)的虛部，通過相位傳遞函數(shù)的逆形式，便可得到物體定量相位的傅里葉變換，在進行逆傅里葉變換即可得到在環(huán)狀led照明下的定量相位分布

其中表示逆傅里葉變換，參數(shù)α表示正則化參數(shù)，通常其為一較小的值，防止出現(xiàn)分母為零的情況。

通過以上步驟和流程，如圖4所示的重構流程圖，將本發(fā)明成像方法運用于未染色人類癌細胞的定量相位成像。圖5是本發(fā)明成像方法對人肺癌細胞的定量相位成像結果，其中圖5(a1)與圖5(a2)分別為相干照明和環(huán)狀照明下的整個相機成像區(qū)域上定量相位結果；從圖5(a)中選取三個子區(qū)域定量相位并計算其相位梯度圖像作對比，如圖5(b)、圖5(c)和圖5(d)，可看到環(huán)狀照明情況下的相位成像分辨率是高于傳統(tǒng)的相干照明情況的。在兩種照明情況下的三個相位子區(qū)域中分別選取兩點，并繪制兩點之間的相位變化曲線，從這些曲線變化可以看出環(huán)狀照明方案比傳統(tǒng)的相干照明下的分辨率高出一倍(在第一幅相位一維剖線圖中，三角形虛線的變化孔徑頻率是原點實線的兩倍)，所以本發(fā)明所提出基于環(huán)狀led照明可達到兩倍于物鏡的成像分辨率。圖6為利用本發(fā)明成像方法與高數(shù)值孔徑的顯微物鏡所得到的人體宮頸癌細胞的高分辨率定量相位圖與高分辨率相位梯度圖。其中顯微物鏡的數(shù)值孔徑為0.75，環(huán)狀照明圖案通過重新編程的方式與物鏡光瞳內切，最終達到的成像分辨率為兩倍物鏡分辨率。通過選取三個子區(qū)域進行放大，如圖6(c1)-(c3)，可以清晰地觀察到宮頸癌細胞核質與細胞質中的顆粒狀細胞器。