用于樣品成像的顯微鏡模塊的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 無
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及用于樣品成像的顯微鏡模塊領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0004] 選擇性平面照明顯微鏡（SP頂）是采用光片的形成來照射樣品的技術(shù)，且是能夠 使樣品的光學(xué)切片成像的垂直檢測(cè)系統(tǒng)，所述樣品可以是活的或非活的。在大多數(shù)實(shí)施方 案中，SP頂系統(tǒng)需要大量的樣品制備以保持樣品在正確位置中用于成像。例如，樣品一般 嵌入瓊脂糖圓柱體，其浸沒在填充有浸漬介質(zhì)（例如水）的小室中。人們知道該技術(shù)已經(jīng) 一百多年了，但直到最近才發(fā)現(xiàn)在成像生物樣品中的廣泛應(yīng)用。該技術(shù)的一個(gè)缺點(diǎn)是瓊脂 糖并非與所有生物標(biāo)本兼容。在當(dāng)前SP頂系統(tǒng)中，樣品也嵌入在限定高度的瓊脂糖垂直圓 柱體中。這種布置不允許在樣品的成像或重新定位期間接近所述樣品。這樣的布置限制了 可以被成像樣品的數(shù)目，因?yàn)槔?，它是不可能在瓊脂糖圓柱體的受限的長(zhǎng)度內(nèi)堆疊50個(gè) 樣本。
[0005] SP頂系統(tǒng)被描述于，例如，國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 2004/053558 (Stelzer等人，轉(zhuǎn)讓 給歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室）。本公開教導(dǎo)了顯微鏡，在其中，光的薄條帶（thin strip)(光 片）照明所述樣品（標(biāo)本），并通過一個(gè)檢測(cè)器觀察所述樣品。該檢測(cè)器的軸位于基本上垂 直于照明光束的方向。移動(dòng)樣品通過光的條帶，并且所述探測(cè)器在一系列圖像中記錄來自 樣品的漫射光或來自樣品的熒光。樣品的三維成像可以通過樣品的光學(xué)切片，然后重構(gòu)樣 本的整個(gè)圖像而被創(chuàng)建。
[0006] Shroff等人已經(jīng)開發(fā)出被耦接到常規(guī)顯微鏡的平移底座的用于傳統(tǒng)顯微鏡的模 塊（國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 2012/122027, Shroff等人，轉(zhuǎn)讓給美國(guó)）。所述模塊和倒置顯微 鏡的組合能使同一樣品以兩種彼此相互補(bǔ)充的方式成像。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 公開了用于一種或多種樣品成像的顯微鏡模塊。該顯微鏡模塊包括用于產(chǎn)生沿著 照明光束路徑的照明光束的照明裝置和至少一個(gè)具有檢測(cè)路徑的檢測(cè)裝置。照明光束被布 置為照射一種或多種樣品的下表面。所述照明光束路徑被設(shè)置為與檢測(cè)路徑成一角度。在 本公開的一個(gè)方面，該角度實(shí)質(zhì)上是直角。將樣品放置在培養(yǎng)基中。沒必要將樣品嵌入在 固體或者粘性的載體介質(zhì)（mounting media)中，其可能與生物樣品的存活不相容，且同樣 使樣品的取回和操縱變得復(fù)雜。
[0008] 將樣品放置在樣品座（sample holder)。樣品座的底部對(duì)照明光束至少是部分地 透明的，從而使照明光束可照明樣品。這樣的透明底部的一個(gè)實(shí)例是膜。樣品座包括至少一 個(gè)突出部，在其中樣品被支持。在本公開的一個(gè)方面，所述突出部可以是細(xì)長(zhǎng)的槽的形式， 在其中多個(gè)樣品在培養(yǎng)基中被支持（held)。
[0009] 樣品座被布置為能夠容易地從顯微鏡模塊中移除。這使得樣品可以在顯微鏡模塊 外面的樣品座中培養(yǎng)以及再原狀放置到用于成像的顯微鏡模塊中。
[0010] 本公開的布置使照明物鏡和檢測(cè)物鏡被放置在浸漬介質(zhì)中，所述浸漬介質(zhì)與放置 有樣品的培養(yǎng)基分開。培養(yǎng)基與浸漬介質(zhì)的分開有助于以保持無菌并也允許使用小體積的 培養(yǎng)基。透明底部，浸漬介質(zhì)和培養(yǎng)基具有實(shí)質(zhì)上相同的折射率，以減少光學(xué)像差。
[0011] 本公開還教導(dǎo)了多個(gè)樣本成像的方法，其包括布置照明物鏡以照亮所述多個(gè)樣品 的下表面和布置檢測(cè)物鏡以與照明光束路徑呈大致直角的角度來檢測(cè)來自多個(gè)樣品的發(fā) 出的光。檢測(cè)的光可用于創(chuàng)建多個(gè)樣本的一個(gè)或多個(gè)圖像。
【附圖說明】
[0012] 圖1示出的用于樣品成像的現(xiàn)有技術(shù)的SPIM布置的概況。
[0013] 圖2示出在本公開的一個(gè)方面中使用的SP頂布置的概況。
[0014] 圖3不出了顯微鏡模塊的概況。
[0015] 圖4示出了在其中放置樣品細(xì)長(zhǎng)槽。
[0016] 本發(fā)明的詳細(xì)描述
[0017] 本發(fā)明現(xiàn)在將在附圖的基礎(chǔ)上進(jìn)行描述。應(yīng)該理解的是，本文中所描述的本發(fā)明 的實(shí)施例和方面僅僅是示例，并且不以任何方式限制權(quán)利要求的保護(hù)范圍。本發(fā)明由權(quán)利 要求及其等同物限定。應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的一個(gè)方面或?qū)嵤┓桨傅奶卣骺梢耘c本發(fā)明 的不同的方面和/或?qū)嵤┓桨傅奶卣鬟M(jìn)行組合。
[0018] 圖1示出SP頂?shù)幕驹聿⒃诿绹?guó)專利號(hào)US 7554725中描述更廣泛，其公開通 過引用并入本文。該裝置10包括激光器20,它產(chǎn)生通過照明物鏡25的光片30來照射試樣 40的切片。光片30沿著照明光束路徑35。檢測(cè)物鏡65被布置成使得檢測(cè)方向55與光片 30的平面是大致直角的（即垂直于照明光束路徑35)。
[0019] 樣品40可以圍繞旋轉(zhuǎn)軸45旋轉(zhuǎn)，且光片30可以被布置為照明試樣40的光學(xué)切 片。激光20通常激發(fā)樣品40中的熒光團(tuán)以在許多方向發(fā)出熒光。
[0020] 檢測(cè)器50通過檢測(cè)物鏡65和光學(xué)裝置66檢測(cè)從樣品40中的熒光團(tuán)所發(fā)射的熒 光的部分，所述熒光團(tuán)已經(jīng)被所述光片30中的輻射激發(fā)。檢測(cè)器50具有成像裝置60,例 如(XD照相機(jī)，其連接到具有存儲(chǔ)器存儲(chǔ)（memory store) 80的處理器70。所述存儲(chǔ)器存儲(chǔ) 80存儲(chǔ)來自樣品40的每個(gè)光學(xué)切片的各個(gè)圖像85,且處理器70可以創(chuàng)建試樣40的三維 圖象。
[0021] 圖2示出本公開中使用的顯微鏡裝置200的實(shí)施例。相同的附圖標(biāo)記被用來指示 在圖1和2圖中的相同的元件。本公開中沒有必要將樣品40嵌入在瓊脂糖中，因?yàn)闃悠?0 在該裝置中被支持的足夠穩(wěn)定，這將在下面解釋。
[0022] 激光20產(chǎn)生通過反射鏡（mirror)67和照明物鏡25的光片30以照明樣品40的 切片。光片30通過樣品40的下表面而進(jìn)入樣品40。從樣品40所發(fā)射的熒光的很大一部 分是通過檢測(cè)物鏡65,被反射鏡27反射，并通過光學(xué)裝置66聚焦到檢測(cè)器50中的成像裝 置60以形成圖像。來自檢測(cè)器50的圖像被傳遞到處理器70,然后存儲(chǔ)在所述存儲(chǔ)器存儲(chǔ) 80作為各個(gè)圖像85。
[0023] 圖3示出具有照明物鏡210和檢測(cè)物鏡220的顯微鏡模塊300的例子。照明物鏡 210通過照明光束（光片）沿著照明光束路徑215照射。通過照明物鏡210的照明光束路 徑215和通過檢測(cè)物鏡220檢測(cè)路徑225被布置成大致相互是直角的。照明物鏡210和檢 測(cè)物鏡220兩者位于浸沒介質(zhì)230中，其包括通常為脫氣的水或浸油（immersion oil)。水 的脫氣確保氣泡不存在于浸漬介質(zhì)230中。
[0024] 通過照明物鏡210的照明光束路徑215位于樣品座240之下，其與樣品座240的 平面呈約30°C。因此檢測(cè)路徑225以與樣品座240的平面呈大約60°進(jìn)行定位。照明物 鏡210和檢測(cè)物鏡220周圍的柔性塑料環(huán)防止浸漬介質(zhì)230的泄漏。
[0025] 具有壁250的樣品座240由生物相容性材料（諸如但不限于PEEK)制成，并具有 由薄的透明膜制成的底260,所述透明膜為諸如Dupont生產(chǎn)的Teflon? FEP薄膜，具有的 折射率基本上類似于浸漬介質(zhì)230和/或培養(yǎng)基280中的折射率，以減少光學(xué)像差。因此， 底部260中的透明膜允許輻射通過到位于透明膜260的正面（top side)上的樣品270上。 形成底部260的透明膜由生物相容的娃有機(jī)樹脂膠（silicone glue)或通過夾持連接到樣 品座240的壁250上。所述透明膜在不被壁250支持的區(qū)域是彎曲的，以在張力下保持透 明膜。樣品座240是在頂部開口，且開口使得方便進(jìn)入和移除樣品270,如果需要的話。所 述透明膜經(jīng)等離子體處理，以使其親水，從而有助于防止在浸漬介質(zhì)230中形成氣泡。
[0026] 在合適的培養(yǎng)基280中，樣品270位于所述透明膜中的彎曲區(qū)域中。培養(yǎng)