多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，屬于顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域，它包括顯微鏡主體、成像模塊，復(fù)合照明模塊，通過(guò)控制系統(tǒng)控制機(jī)械轉(zhuǎn)鏡改變復(fù)合照明模塊的光路，由機(jī)械轉(zhuǎn)鏡選擇與成像模塊匹配的經(jīng)過(guò)不同方式調(diào)制的光照進(jìn)入顯微鏡主體中，對(duì)樣品進(jìn)行照明。該裝置具有四種功能，分別為雙色熒光定位顯微功能、結(jié)構(gòu)光照明顯微功能、光漂白后熒光恢復(fù)功能，明場(chǎng)成像功能，在生物實(shí)驗(yàn)中既可以根據(jù)樣品樣品的特點(diǎn)及對(duì)成像的要求選擇合適的方法對(duì)樣品進(jìn)行高空間分辨率或高時(shí)間分辨率成像，又可以對(duì)同一樣品的同一位置進(jìn)行不同方式的成像，解決了單一顯微方法成像結(jié)果片面性的問(wèn)題。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]生物顯微技術(shù)在生命科學(xué)技術(shù)的研究中起著舉足輕重的作用，且隨著研究生命過(guò)程的發(fā)展及細(xì)化，生物顯微技術(shù)遇到了越來(lái)越多的挑戰(zhàn)。第一個(gè)挑戰(zhàn)為對(duì)所研究樣品中觀察內(nèi)容的尺度越來(lái)越小，細(xì)胞的尺寸為十微米量級(jí)，細(xì)胞器如線粒體葉綠體的尺寸為微米量級(jí)，細(xì)胞內(nèi)的囊泡尺寸在幾百到幾十個(gè)納米的量級(jí)，蛋白質(zhì)的尺寸則大部分小于50納米，要看清楚這些尺度上的生命結(jié)構(gòu)，就對(duì)熒光顯微鏡的空間分辨率提出了很高的要求。第二個(gè)挑戰(zhàn)為對(duì)生命過(guò)程的實(shí)時(shí)觀察，也就是活樣品成像，因?yàn)樯顒?dòng)的時(shí)間尺度在秒或毫秒量級(jí)，熒光顯微鏡的時(shí)間分辨率越高，就可以觀察到越細(xì)致的生命活動(dòng)過(guò)程。另外，熒光顯微系統(tǒng)中使用的照明光的強(qiáng)度也對(duì)生命活動(dòng)過(guò)程及可觀察時(shí)間的長(zhǎng)短有著重要的影響，照明光強(qiáng)度過(guò)高，不僅會(huì)影響樣品的生物活性，甚至?xí)⑺罉悠?，?duì)樣品的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不可逆的影響；熒光顯微鏡所觀察的生物樣品大多需要熒光分子或熒光蛋白質(zhì)標(biāo)記，照明光強(qiáng)太高也會(huì)使特異性標(biāo)記的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不可逆的淬滅效應(yīng)，這樣就縮短了觀察時(shí)間。要得到高空間分辨率，高時(shí)間分辨率，低照明光強(qiáng)度的熒光顯微系統(tǒng)一直為科研的終極目標(biāo)。莊小威、埃里克貝奇格(Eric Bezig)分別于2006年先后提出了焚光定位顯微技術(shù)，打破了恩斯特阿貝(Ernst Abbe)于十八世紀(jì)七十年代提出的光學(xué)成像分辨率理論，可以突破200nm的分辨率極限，將光學(xué)顯微鏡的空間分辨率提高到20nm的范圍。然而這種方法需要用較強(qiáng)的激光對(duì)樣品進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的照射成像，這樣就不適合進(jìn)行活樣品成像。結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)主要由美國(guó)Janelia Farm的Mats Gustafsson研發(fā)，這種方法可以使用低強(qiáng)度照明光實(shí)現(xiàn)高空間分辨率(約10nm)，高信噪比的成像，且成像時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于熒光定位顯微技術(shù)，所以非常適合進(jìn)行活樣品成像。光漂白后恢復(fù)技術(shù)為研究活細(xì)胞生理狀態(tài)下分子運(yùn)動(dòng)信息的重要方法。在生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)不同的生物樣品成像需要選擇不同的熒光顯微鏡，這就使得研究的成本大大提升;另外，若需要對(duì)同一樣品的同一位置進(jìn)行不同尺度的成像，就需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中更換顯微鏡系統(tǒng)，并找到相同的位置，這在操作上是很難做到的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的上述問(wèn)題，提供一種具有四種功能，分別為雙色熒光定位顯微功能、結(jié)構(gòu)光照明顯微功能、光漂白后熒光恢復(fù)功能，明場(chǎng)成像功能的具有多通道雙色熒光定位顯微功能的復(fù)合顯微系統(tǒng)。
[0004]本發(fā)明的目的可通過(guò)下列技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):一種多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，它包括:
[0005]顯微鏡主體，包括樣品臺(tái)、物鏡、光路光學(xué)元件；
[0006]成像模塊；
[0007]復(fù)合照明模塊，包括光源和以下子模塊:
[0008]明場(chǎng)光照明子模塊，光源通過(guò)明場(chǎng)光照明子模塊照射樣品；
[0009]雙色熒光定位照明子模塊，可在普通寬場(chǎng)熒光顯微照明模式、半全內(nèi)反射照明模式和全內(nèi)反射照明模式中連續(xù)調(diào)節(jié)，以獲取不同厚度的樣品空間分辨率雙通道同時(shí)成像結(jié)果;
[0010]結(jié)構(gòu)光照明子模塊，光源通過(guò)結(jié)構(gòu)光照明子模塊進(jìn)行調(diào)制后照射樣品；
[0011]光漂白后熒光恢復(fù)功能照明子模塊，通過(guò)編輯空間光調(diào)制器的調(diào)制圖案，使得光源可以在所觀測(cè)樣品的某一區(qū)域形成高強(qiáng)度的聚焦點(diǎn)，使得標(biāo)記該區(qū)域的熒光分子淬滅；
[0012]機(jī)械轉(zhuǎn)鏡，通過(guò)控制系統(tǒng)控制機(jī)械轉(zhuǎn)鏡改變復(fù)合照明模塊的光路，由機(jī)械轉(zhuǎn)鏡選擇與成像模塊匹配的經(jīng)過(guò)不同方式調(diào)制的光照進(jìn)入顯微鏡主體中，對(duì)樣品進(jìn)行照明。
[0013]所述的照明模塊包括單模光纖激光。
[0014]所述成像模塊與照明模塊相對(duì)應(yīng)，包括以下子模塊:
[0015]明場(chǎng)成像子模塊，光源通過(guò)明場(chǎng)光照明子模塊照射樣品后映射在明場(chǎng)成像子模塊上，凸顯樣品的輪廓和狀態(tài)獲以此取所得信息；
[0016]結(jié)構(gòu)光照明成像子模塊，光源通過(guò)結(jié)構(gòu)光照明子模塊中的可編程空間光調(diào)制器周期性調(diào)制激發(fā)光場(chǎng)，形成高準(zhǔn)確的照明光條紋，之后通過(guò)對(duì)照明光條紋與樣品結(jié)構(gòu)相互作用產(chǎn)生的熒光混頻圖像進(jìn)行后續(xù)頻譜分析重構(gòu)，以獲得超分辨率成像結(jié)果；
[0017]雙色熒光定位成像子模塊，可獲取不同厚度的樣品高空間分辨率雙通道同時(shí)成像結(jié)果；
[0018]光漂白后熒光恢復(fù)成像子模塊，通過(guò)記錄樣品熒光淬滅處熒光恢復(fù)的時(shí)間來(lái)獲取所得?目息。
[0019]所述單模光纖激光提供波長(zhǎng)為405]1111、48811111、56111111、64711111、750111]1的激光照明。
[0020]所述單模光纖激光位于顯微鏡主體的后部接口接入。
[0021 ]所述顯微鏡主體為基本的倒置熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)。
[0022]所述復(fù)合顯微系統(tǒng)還包括拍攝的SCMOS或EMCXD相機(jī)。
[0023]所述雙色熒光定位照明子模塊和明場(chǎng)光照明子模塊處于第一照明系統(tǒng)中，結(jié)構(gòu)光照明子模塊和光漂白后熒光恢復(fù)功能照明子模塊處于第二照明系統(tǒng)中，所述第一照明系統(tǒng)、第二照明系統(tǒng)的照明模塊由機(jī)械轉(zhuǎn)鏡調(diào)控。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，該裝置具有四種功能，分別為雙色熒光定位顯微功能、結(jié)構(gòu)光照明顯微功能、光漂白后熒光恢復(fù)功能，明場(chǎng)成像功能。在生物實(shí)驗(yàn)中既可以根據(jù)樣品樣品的特點(diǎn)及對(duì)成像的要求選擇合適的方法對(duì)樣品進(jìn)行高空間分辨率或高時(shí)間分辨率成像，又可以對(duì)同一樣品的同一位置進(jìn)行不同方式的成像，解決了單一顯微方法成像結(jié)果片面性的問(wèn)題。在同一顯微系統(tǒng)中加入不同功能的模塊，降低了科研成本，提升儀器利用率。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1是本發(fā)明的模塊關(guān)系示意圖。
[0026]圖2是實(shí)施例1的復(fù)合照明模塊的具體光路圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
[0028]實(shí)施例1
[0029]圖1所示本發(fā)明中包括顯微鏡主體、SCMOS或EMCCD相機(jī)、復(fù)合照明模塊，所述復(fù)合照明模塊包括光源和明場(chǎng)光照明子模塊、雙色熒光定位照明子模塊、結(jié)構(gòu)光照明子模塊、光漂白后熒光恢復(fù)功能照明子模塊。所述光源經(jīng)各照明子模塊進(jìn)入顯微鏡主體中，并照射在樣品上。所述的樣品選擇映射在明場(chǎng)成像子模塊、雙色熒光定位成像子模塊、結(jié)構(gòu)光照明成像子模塊及光漂白后熒光恢復(fù)成像子模塊上。圖2中雙色熒光定位照明子模塊和明場(chǎng)光照明子模塊處于第一照明系統(tǒng)I中，結(jié)構(gòu)光照明子模塊和光漂白后熒光恢復(fù)功能照明子模塊處于第二照明系統(tǒng)2中，所述第一照明系統(tǒng)1、第二照明系統(tǒng)2的照明模塊由機(jī)械轉(zhuǎn)鏡1-3及機(jī)械轉(zhuǎn)鏡1-4調(diào)控。通過(guò)控制系統(tǒng)控制機(jī)械轉(zhuǎn)鏡1-3及機(jī)械轉(zhuǎn)鏡1-4改變復(fù)合照明模塊的光路，由機(jī)械轉(zhuǎn)鏡1-3及機(jī)械轉(zhuǎn)鏡1-4選擇與四種成像模塊匹配的經(jīng)過(guò)不同方式調(diào)制的光照進(jìn)入顯微鏡主體中，對(duì)樣品進(jìn)行照明。
[°03°]圖2所不，機(jī)械轉(zhuǎn)鏡1-3可以選擇(將全反射鏡、50: 50分光鏡、或全透鏡)鏡片放入到光路中，通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)械轉(zhuǎn)鏡1-3，將其放入到光路中，可以將雙色熒光定位成像模塊的激光導(dǎo)入到第二成像系統(tǒng)中(全反射鏡)，或?qū)朊鲌?chǎng)成像模塊及第二成像系統(tǒng)中(50:50分光鏡)，而通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)械轉(zhuǎn)鏡1-4可以選擇一種模塊中的照明光進(jìn)入到顯微鏡主體里。雙色熒光定位成像模塊及明場(chǎng)成像模塊中由單模光纖激光1-1及單模光纖激光1-2發(fā)出的激光先通過(guò)透鏡2-1及透鏡2-3進(jìn)行準(zhǔn)直，經(jīng)過(guò)分色鏡2-2、分色鏡2-4，并經(jīng)過(guò)反光鏡2_5反射進(jìn)入中繼透鏡2-6及中繼透鏡2-8再進(jìn)入到顯微鏡主體中，機(jī)械轉(zhuǎn)鏡1-3和中繼透鏡2-8之間設(shè)有可改變角度的反射鏡2-7。
[0031]通過(guò)調(diào)節(jié)單模光纖激光1-1及單模光纖激光1-2端口的位置可以對(duì)樣品樣品進(jìn)行寬場(chǎng)照明、半全內(nèi)反射照明、全內(nèi)反射照明中照明方法的選擇，這在熒光定位顯微成像中非常重要。在結(jié)構(gòu)光照明成像模塊中，單模光纖激光1-1及單模光纖激光1-2端口需位于寬場(chǎng)照明位置，從單模光纖激光1-1及單模光纖激光1-2端口發(fā)出的點(diǎn)光源經(jīng)過(guò)中繼透鏡2-6匯聚在準(zhǔn)直透鏡3-2的后焦平面上，通過(guò)準(zhǔn)直透鏡3-2即成為平行光。偏振分光晶體3-3及半波片3-4的作用為調(diào)節(jié)入射光的偏振方向，使其與空間光調(diào)制器3-5所需要的偏振方向相同，通過(guò)計(jì)算機(jī)可編程的空間光調(diào)制器3-5上顯示的條紋間距、密度及方向，可以調(diào)制照明光得到不同的結(jié)構(gòu)光照明，如成像僅需提高信噪比，對(duì)空間分辨率沒(méi)有太高要求，這種情況使用一個(gè)方向、較為稀疏的條紋結(jié)構(gòu)光即可，這樣可簡(jiǎn)化解調(diào)算法，使時(shí)間分辨率變高;若成像對(duì)空間分辨率的要求較高，則需要使用密度較高的條紋結(jié)構(gòu)光，當(dāng)結(jié)構(gòu)光的密度與顯微鏡系統(tǒng)的分辨率極限相同時(shí)，即可獲得結(jié)構(gòu)光照明的最大空間分辨率，為顯微鏡系統(tǒng)分辨率極限的一半，并且這種情況下需要使用0°、45°、90°、135°四個(gè)方向的條紋結(jié)構(gòu)光對(duì)樣品進(jìn)行照明成像，以獲得xy方向相同的空間分辨率提升?？臻g光調(diào)制器上的條紋會(huì)經(jīng)過(guò)聚焦透鏡3-6匯聚在光遮罩3-9的位置，光遮罩3-9可以擋掉沒(méi)有被調(diào)制的光成分，增強(qiáng)結(jié)構(gòu)光的調(diào)制深度。光束進(jìn)一步通過(guò)中繼透鏡3-12、中繼透鏡3-14及顯微鏡主體中的透鏡成像在樣品樣品的焦平面上，當(dāng)可編程的空間光調(diào)制器上的調(diào)制圖案發(fā)生變化時(shí)，無(wú)需改變?nèi)魏喂鈱W(xué)器件的位置即可在樣品焦平面上產(chǎn)生條紋密度不同，方向不同的結(jié)構(gòu)光照明。光漂白后熒光恢復(fù)成像模塊需要在樣品樣品上實(shí)現(xiàn)一個(gè)聚焦光束的照明，這同時(shí)可以通過(guò)可編程的空間光調(diào)制器上的圖案來(lái)實(shí)現(xiàn)，同時(shí)這種方法也可以準(zhǔn)確調(diào)節(jié)這個(gè)聚焦光束在樣品樣品上的位置。圖2中3-1、3-7、3-8、3-10、3-11、3_13均為改變光束方向的反光鏡。
[0032]例如若需要追蹤細(xì)胞分裂的過(guò)程，并研究分裂過(guò)程中某個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)處某兩種蛋白質(zhì)的相對(duì)位置關(guān)系，就可首先使用明場(chǎng)成像功能，大尺度地快速挑選某個(gè)健康的細(xì)胞;之后使用結(jié)構(gòu)光照明顯微成像功能對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行超分辨率快速的成像，追蹤其分裂的過(guò)程，并判斷此細(xì)胞所處的生命階段;在達(dá)到需要的時(shí)間節(jié)點(diǎn)時(shí)使用雙色熒光定位顯微成像功能，對(duì)這兩種蛋白質(zhì)進(jìn)行成像，若使用單一功能的熒光顯微鏡系統(tǒng)幾乎不可能對(duì)同一細(xì)胞進(jìn)行如此多角度多方位的觀察。
[0033]實(shí)施例2
[0034]復(fù)合顯微系統(tǒng)的成像模式為:明場(chǎng)成像(高時(shí)間分辨率，大視野)；雙色熒光定位成像(高空間分辨率xy方向20nm，y方向50nm)；結(jié)構(gòu)光照明成像(高空間分辨率xy方向I OOnm，y方向500nm;高時(shí)間分辨率約360ms每幀，成像范圍2048*2048像素；高信噪比)；光漂白后熒光恢復(fù)成像；明場(chǎng)及雙色熒光定位同時(shí)成像；明場(chǎng)及結(jié)構(gòu)光照明同時(shí)成像；明場(chǎng)及光漂白后熒光恢復(fù)同時(shí)成像。這六種成像模式可以通過(guò)軟件進(jìn)行便捷的選擇。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，它包括: 顯微鏡主體，包括樣品臺(tái)、物鏡、光路光學(xué)元件； 成像模塊； 復(fù)合照明模塊，包括光源和以下子模塊: 明場(chǎng)光照明子模塊，光源通過(guò)明場(chǎng)光照明子模塊照射樣品； 雙色熒光定位照明子模塊，可在普通寬場(chǎng)熒光顯微照明模式、半全內(nèi)反射照明模式和全內(nèi)反射照明模式中連續(xù)調(diào)節(jié)，以獲取不同厚度的樣品空間分辨率雙通道同時(shí)成像結(jié)果；結(jié)構(gòu)光照明子模塊，光源通過(guò)結(jié)構(gòu)光照明子模塊進(jìn)行調(diào)制后照射樣品； 光漂白后熒光恢復(fù)功能照明子模塊，通過(guò)編輯空間光調(diào)制器的調(diào)制圖案，使得光源可以在所觀測(cè)樣品的某一區(qū)域形成高強(qiáng)度的聚焦點(diǎn)，使得標(biāo)記該區(qū)域的熒光分子淬滅； 機(jī)械轉(zhuǎn)鏡，通過(guò)控制系統(tǒng)控制機(jī)械轉(zhuǎn)鏡改變復(fù)合照明模塊的光路，由機(jī)械轉(zhuǎn)鏡選擇與成像模塊匹配的經(jīng)過(guò)不同方式調(diào)制的光照進(jìn)入顯微鏡主體中，對(duì)樣品進(jìn)行照明。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述的照明模塊包括單模光纖激光。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述單模光纖激光提供波長(zhǎng)為405nm、488nm、56Inm、647nm、750nm的激光照明。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述單模光纖激光位于顯微鏡主體的后部接口接入。5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述成像模塊與照明模塊相對(duì)應(yīng)，包括以下子模塊: 明場(chǎng)成像子模塊，光源通過(guò)明場(chǎng)光照明子模塊照射樣品后映射在明場(chǎng)成像子模塊上，凸顯樣品的輪廓和狀態(tài)獲以此取所得信息； 結(jié)構(gòu)光照明成像子模塊，光源通過(guò)結(jié)構(gòu)光照明子模塊中的可編程空間光調(diào)制器周期性調(diào)制激發(fā)光場(chǎng)，形成高準(zhǔn)確的照明光條紋，之后通過(guò)對(duì)照明光條紋與樣品結(jié)構(gòu)相互作用產(chǎn)生的熒光混頻圖像進(jìn)行后續(xù)頻譜分析重構(gòu)，以獲得超分辨率成像結(jié)果； 雙色熒光定位成像子模塊，可獲取不同厚度的樣品高空間分辨率雙通道同時(shí)成像結(jié)果; 光漂白后熒光恢復(fù)成像子模塊，通過(guò)記錄樣品熒光淬滅處熒光恢復(fù)的時(shí)間來(lái)獲取所得?目息O6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述成像模塊與照明模塊相對(duì)應(yīng)，包括以下子模塊: 明場(chǎng)成像子模塊，光源通過(guò)明場(chǎng)光照明子模塊照射樣品后映射在明場(chǎng)成像子模塊上，凸顯樣品的輪廓和狀態(tài)獲以此取所得信息； 結(jié)構(gòu)光照明成像子模塊，光源通過(guò)結(jié)構(gòu)光照明子模塊中的可編程空間光調(diào)制器周期性調(diào)制激發(fā)光場(chǎng)，形成高準(zhǔn)確的照明光條紋，之后通過(guò)對(duì)照明光條紋與樣品結(jié)構(gòu)相互作用產(chǎn)生的熒光混頻圖像進(jìn)行后續(xù)頻譜分析重構(gòu)，以獲得超分辨率成像結(jié)果； 雙色熒光定位成像子模塊，可獲取不同厚度的樣品高空間分辨率雙通道同時(shí)成像結(jié)果; 光漂白后熒光恢復(fù)成像子模塊，通過(guò)記錄樣品熒光淬滅處熒光恢復(fù)的時(shí)間來(lái)獲取所得?目息O7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述顯微鏡主體為基本的倒置熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述復(fù)合顯微系統(tǒng)還包括拍攝的SCMOS或EMCCD相機(jī)。9.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述雙色熒光定位照明子模塊和明場(chǎng)光照明子模塊處于第一照明系統(tǒng)中，結(jié)構(gòu)光照明子模塊和光漂白后熒光恢復(fù)功能照明子模塊處于第二照明系統(tǒng)中，所述第一照明系統(tǒng)、第二照明系統(tǒng)的照明模塊由機(jī)械轉(zhuǎn)鏡調(diào)控。
【文檔編號(hào)】G02B21/36GK106094189SQ201610452347
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月20日
【發(fā)明人】王瑩
【申請(qǐng)人】金華納觀生物科技有限公司