專利名稱：親和捕獲串聯(lián)質(zhì)譜分析設(shè)備和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)和生物化學(xué)分析領(lǐng)域，且特別涉及通過串聯(lián)質(zhì)譜改善分析物及分析物間親和相互作用的鑒定和表征的設(shè)備和方法。
背景技術(shù)：
與高性能且低成本的物質(zhì)分析器相耦聯(lián)的電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)技術(shù)的到來，在過去的十年中允許了質(zhì)譜(MS)在用于生物相關(guān)性大分子研究，包括蛋白質(zhì)從復(fù)雜生物系統(tǒng)中提純，的標(biāo)準(zhǔn)分析工具中占據(jù)一席之地。
例如，在一種稱為肽質(zhì)量指紋的技術(shù)中，質(zhì)譜被用來識(shí)別從生物樣品中提純的蛋白質(zhì)。識(shí)別是通過將純化蛋白質(zhì)的蛋白水解碎片質(zhì)譜與從預(yù)先添加到數(shù)據(jù)庫中的初級(jí)序列預(yù)測(cè)出的質(zhì)量相比較而實(shí)現(xiàn)的。Roepstorff，The Analyst 117299-303(1992)；Pappin et al.，Curr.Biol.3(6)327-332(1993)；Mann et al.，Biol.Mass Spectrom.22338-345(1993)；Yates et al.，Anal.Biochem.213397-408(1993)；Henzel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905011-5015(1993)；James et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.19558-64(1993)。
類似的數(shù)據(jù)庫采掘方法已經(jīng)發(fā)展起來，其采用從碰撞誘導(dǎo)解離(CID)或MALDI源后(post-source)衰變(PSD)獲得的碎片質(zhì)譜來識(shí)別純化的蛋白質(zhì)。Eng et al.，J.Am.Soc.Mass.Spectrom.5976-989(1994)；Griffin et al.，Rapid Commun.Mass Spectrom.91546-1551(1995)；Yates et al.，U.S.Patent Nos.5,538,897和6,017,693；Mannet al.，Anal.Chem.664390-4399(1994)。
允許對(duì)分離蛋白至少部分重新排序的質(zhì)譜技術(shù)也已經(jīng)發(fā)展起來。Chait et al.，Science 26289-92(1993)；Keough et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.967131-6(1999)；Reviewed in Bergman，EXS 8133-44(200)。
便于解析蛋白質(zhì)質(zhì)譜和采掘不受版權(quán)限制的序列數(shù)據(jù)庫的軟件資源現(xiàn)在較容易在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上獲得從而利于蛋白質(zhì)的鑒定。在這之中有蛋白質(zhì)探勘者(http//prospector.ucsf/edu)，PROWL(http//prowl.rockefeller.edu)，和Mascot搜索引擎(Matrix ScienceLtd.，London，UK，www.matrixscience.com)。
盡管高精度的質(zhì)量分配提供了有用的信息——例如，采用上述技術(shù)有利于識(shí)別純化的蛋白質(zhì)——這種信息仍然受到限制。大量額外的分析能力通過MS分析與靶蛋白的酶和/或化學(xué)改性的結(jié)合、進(jìn)行結(jié)構(gòu)組分的說明、翻譯后的改性和進(jìn)一步的蛋白質(zhì)識(shí)別，將被釋放出來。
此外，復(fù)雜的生物材料——例如血液、血清、淋巴液、淋巴、間質(zhì)流體、尿、分泌液、整個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞溶解物和細(xì)胞分泌產(chǎn)物——典型地含有數(shù)百種生物分子、以及妨礙直接質(zhì)譜分析的有機(jī)和無機(jī)鹽。因此，在MS觀察之前典型地需要有大量的樣品制備和純化步驟。
樣品純化的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如液相色譜(離子交換，尺寸排阻、親和及反相色譜)、膜分離、離心、免疫沉淀和電泳，典型地需要大量的起始樣品。甚至在獲得了這么多量的樣品時(shí)，次要組分在這些純化過程中也趨向于丟失，其是由于非特異結(jié)合和稀釋作用而遭受的分析物損失。這些方法常常是高勞動(dòng)強(qiáng)度的。
因此，顯然有對(duì)方法和裝置的需要，其便于使存在于不均勻樣品中的主要和次要蛋白質(zhì)都被質(zhì)譜檢測(cè)且無需大量預(yù)先液相純化。進(jìn)一步還有對(duì)MS平臺(tái)的需要，其在質(zhì)譜分析之前不僅允許易得樣品的純化，而且允許串行的和并行的樣品改性方法。
這些需要通過發(fā)展親和捕獲激光解吸電離方法而部分地滿足。Hutchens et al.，Rapid Commun.Mass Spectrom.7576-580(1993)；U.S.Patent Nos.5,719,060，5,894,063，6,020,208和6,027,942。這種用于大分子MS分析的新策略使用了新穎的激光解吸電離探針，其在至少一個(gè)表面上有親和試劑。該親和試劑從不均勻樣品中吸附所期望的分析物，使它們以一種適合于隨后激光解吸電離的形式在探針表面濃縮。分析物吸收和解吸的耦合避免了離線的純化方法，允許對(duì)更少量的起始樣品進(jìn)行分析且更加有利于在質(zhì)譜分析之前直接在探針表面上的樣品改性方法。
親和捕獲激光解吸電離技術(shù)允許質(zhì)譜應(yīng)用于諸多標(biāo)準(zhǔn)生物定量分析格式，包括免疫，Nelson et al.，Anal.Chem.671153-1158(1995)；和親和色譜，Brockman et al.，Anal.Chem.674581-4585(1995)。親和捕獲激光解吸電離技術(shù)不僅應(yīng)用于肽和蛋白質(zhì)的研究，Hutchens etal.，Rapid Commun.Mass Spectrom.7576-580(1993)；Mouradian etal.，J.Amer.Chem.Soc.1188639-8645(1996)；Nelson et al.，RapidCommun.Mass.Spectrom.91380-1385(1995)；Nelson et al.，J.Monlec.Recognition 1277-93(1999).；Brockman et al.，J.MassSpectrom 331141-1147(1998)；Yip et al.，J.Biol.Chem.27132835-33(1996)，還應(yīng)用于寡核苷酸，Jruinke et al.，Anal.Chem.69904-910(1997)；Tang et al.，Nucl.Acids Res.233126-3131(1995)；Liu etal.，Anal.Chem.673482-90(1995)，細(xì)菌，Bundy et al.，Anal.Chem.711460-1463(1999)，和小分子，Wei et al.，Nature 399243-246(1999)的研究。在商業(yè)水平上，親和捕獲激光解吸電離包含于Ciphergen的蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)(Ciphergen Biosystems，Inc.Fremont，California，USA)中。
盡管親和捕獲激光電離技術(shù)解決了大量的技術(shù)問題，但還存在困難。
當(dāng)這種方法應(yīng)用于從生物樣品中捕獲蛋白質(zhì)時(shí)，通常只有全部蛋白的一皮摩爾被檢測(cè)捕獲并能夠用于隨后分析的。典型地，在色譜表面生物芯片上的親和捕獲并不導(dǎo)致完全的純化。此外，固相提取的樣品中所觀察到的消化效率，與在自由溶液或者二維凝膠變性環(huán)境中進(jìn)行的消化相比較，較差。因此，如果大約50％的是感興趣的蛋白質(zhì)，且成功地消化了這種蛋白的大約10％，那么最多只有大約50飛摩爾的某種肽能夠用于檢測(cè)。
在數(shù)據(jù)庫采掘?qū)嶒?yàn)中，使用有效的胰蛋白酶來消化牛胎球蛋白，據(jù)證實(shí)，例如，甚至用1.0ppm的極限精度(一個(gè)目前大多數(shù)MS技術(shù)不能達(dá)到的水平)，當(dāng)檢測(cè)這種復(fù)雜的真核基因組時(shí)，對(duì)于單個(gè)肽的質(zhì)量只能獲得較差的蛋白質(zhì)ID匹配置信度。對(duì)于兩個(gè)肽，同樣獲得了較低的置信度結(jié)果。只有在提供了3個(gè)肽之后，置信度結(jié)果才回到誤差低于300ppm的質(zhì)量分配。在此情況下，大多數(shù)設(shè)備將需要內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)校驗(yàn)。然而，5個(gè)或更多的肽的情況下，對(duì)于好于1000ppm誤差的質(zhì)量精度，不會(huì)取得進(jìn)一步的置信度。
而且，當(dāng)許多蛋白質(zhì)同時(shí)被消化時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不均勻的肽池，且成功的數(shù)據(jù)庫采掘不僅要求極高的精度，而且要有許多初級(jí)序列信息的實(shí)例。串聯(lián)MS/MS方法已被證實(shí)非常利于提供初級(jí)序列信息。Biemann et al.，Acc.Chem.Res.27370-378(1994)；Spengler et al.，RapidCommun.Mass Spectrom.5198-202(1991)；Spengler et al.，RapidCommun.Mass Sepctrom.6105-108(1992)；Yates et al.，Anal.Chem.671426-1436(1995)；Kaufman et al.，Rapid Commun.Mass.Spectrom.7902-910(1993)；Kaufman et al.，Intern.J.Mass Spectrom.IonProcesses 131355-385(1994)。
然而直到最近，唯一能夠獲得的用于基于激光解吸分析的MS/MS方法是二次(post)源衰變分析(PSD)。雖然PSD能夠?yàn)槠つ査降碾奶峁┫喈?dāng)多的序列信息，但是這種碎片處理的整體效率較低；當(dāng)與此方法中經(jīng)常出現(xiàn)的較差的質(zhì)量精度和穩(wěn)定性相結(jié)合時(shí)，其對(duì)在親和捕獲激光解吸電離探針上常常發(fā)現(xiàn)的少量蛋白質(zhì)進(jìn)行分析的應(yīng)用能力極大地受到了限制。最近，激光解吸電離四極飛行時(shí)間質(zhì)譜(LDI Qq-TOF)已經(jīng)發(fā)展起來，其能夠執(zhí)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)MS/MS分析。Krutchinksy et al.，Rapid Commun.Mass Spectrom.12508-518(1998)。
因此，有對(duì)能夠提高親和捕獲激光解吸質(zhì)譜靈敏度和質(zhì)量精度的裝置和方法的需要。有對(duì)能夠提高探針上的消化效率從而允許使由于消化不均勻的蛋白質(zhì)混合物而產(chǎn)生的肽易于分解的方法和裝置的需要。有對(duì)能夠提高親和捕獲激光解吸串聯(lián)質(zhì)譜分析效率的裝置和方法的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能夠提高現(xiàn)有親和捕獲激光解吸電離質(zhì)譜分析的靈敏度、質(zhì)量精度、質(zhì)量分辨率的裝置和方法，并提高M(jìn)S/MS的性能。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用這些改進(jìn)的分析性能進(jìn)行生物分子分析方法。
在第一個(gè)方案中，本發(fā)明通過提供一種分析設(shè)備滿足了技術(shù)中這樣和那樣的目的和需要。
本發(fā)明的分析設(shè)備包括，激光解吸電離源、親和捕獲探針界面和串聯(lián)質(zhì)譜儀，其中親和捕獲探針界面能夠嚙合親和捕獲探針并將探針定位從而使它能夠在與串聯(lián)質(zhì)譜儀聯(lián)絡(luò)時(shí)被激光解吸源查詢，因而允許離子從該探針釋放出來并進(jìn)入質(zhì)譜儀。
典型地，激光解吸電離源包括激光激發(fā)源和激光光路系統(tǒng)；該激光光路系統(tǒng)起到將被激發(fā)的光子從激光激發(fā)源傳導(dǎo)到探針界面的作用。在這一實(shí)施例中，激光光路系統(tǒng)典型地向每平方毫米被查詢探針的表面?zhèn)鬟f大約20-1000微焦耳的能量。
激光激發(fā)源從包含連續(xù)激光器和脈沖激光器的組中選擇，且在各種實(shí)施例中從包含氮?dú)饧す馄鳌d:YAG激光器、鉺:YAG激光器和CO2激光器的組中選擇。在本優(yōu)選實(shí)施例中，激光激發(fā)源為脈沖氮?dú)饧す馄鳌?br> 在一組實(shí)施例中，激光光路系統(tǒng)包括從包含透鏡、反射鏡、棱鏡、衰減器和光束分離器的組中選擇的光學(xué)部件。
在另一組實(shí)施例中，激光光路系統(tǒng)包含一個(gè)具有輸入端和輸出端的光學(xué)纖維，且激光激發(fā)源與該光纖的輸入端耦聯(lián)。
在一些光纖激光光路系統(tǒng)實(shí)施例中，激光光路系統(tǒng)還包含光學(xué)衰減器。該衰減器可以安裝在激光激發(fā)源和光纖輸入端之間，能夠起到將激光激發(fā)源耦聯(lián)到光纖輸入端的作用，或者可以安裝在光纖輸出端與探針之間。
在某些光纖光學(xué)系統(tǒng)實(shí)施例中，光纖輸出端具有大約200-400μm的最大直徑，且輸入端具有大約400-1200μm的直徑。
該分析設(shè)備也可以包含探針觀察光學(xué)部件，以允許探針在其與探針界面嚙合之后仍然可見。
在某些實(shí)施例中，激光光路系統(tǒng)可以包含激光耦合器，其將激光激發(fā)源與光纖輸入端耦聯(lián)。如上所述，該耦合器能夠起到光學(xué)衰減器的作用。在其他實(shí)施例中，耦合器在探針與探針界面嚙合之后能夠起到提高探針可視度的作用。
在這些后面的實(shí)施例中，耦合器或光纖被分支并且從所述的激光激發(fā)源中分離一部分能量。選擇地，這種分叉能夠允許導(dǎo)入可見光從而照亮解吸位點(diǎn)。
當(dāng)光學(xué)系統(tǒng)中包含可視化光學(xué)部件時(shí)，或者當(dāng)含纖維激光光路系統(tǒng)包含雙叉或三叉時(shí)，該分析設(shè)備還能夠包含固定CCD照相機(jī)以探測(cè)從所述探針反射回來的光線。
在典型的實(shí)施例中，親和捕獲探針界面包含能夠可逆嚙合親和捕獲探針的探針固定器。該界面還典型地包含本身能夠可逆嚙合探針固定器的探針導(dǎo)入口。
在典型的實(shí)施例中，探針界面還包含探針位置調(diào)節(jié)器組件和界面離子收集系統(tǒng)。當(dāng)探針固定器與導(dǎo)入口嚙合時(shí)，它被安裝在與探針位置調(diào)節(jié)器相接觸的位置；反過來，該探針位置調(diào)節(jié)器能夠相對(duì)于激光電離源(典型地，相對(duì)于激光光路系統(tǒng))和離子收集系統(tǒng)可動(dòng)地定位探針固定器(典型地帶著它所嚙合的探針)。在典型的實(shí)施例中，該調(diào)節(jié)器能夠平行或旋轉(zhuǎn)定位所述的探針固定器。
探針界面還典型地包含與探針導(dǎo)入口相耦聯(lián)的真空抽空系統(tǒng)，該導(dǎo)入口允許探針在低于大氣壓的壓力下被激光解吸電離源查詢。
本發(fā)明的分析設(shè)備包括串聯(lián)質(zhì)譜儀，其在各種實(shí)施例中從包含QqTOF MS，離子阱MS，離子阱TOF MS，TOF-TOF MS和傅立葉變換離子回旋加速器共振MS的組中選擇。
在優(yōu)選實(shí)施例中，串聯(lián)質(zhì)譜儀為QqTOF MS而激光激發(fā)源為脈沖氮?dú)饧す馄鳎结樚幍募す饬髁棵芏却蠹s為最低解吸閾值的2-4倍，且串聯(lián)質(zhì)譜儀具有大約20-50ppm的外部標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量精度。
本發(fā)明的分析設(shè)備被設(shè)計(jì)用來與親和捕獲激光解吸電離源嚙合。此外，任何上述的實(shí)施例都能夠包含與親和捕獲探針界面嚙合的親和捕獲探針。
這些實(shí)施例中的親和捕獲探針典型地具有至少一個(gè)安裝在與激光源有查詢關(guān)系的位置上的樣品吸附表面，樣品吸附表面從包含色譜吸附表面和生物分子親和表面的組中選擇。典型地，這種色譜吸附表面從包含反相、陰離子交換、陽離子交換、固定金屬親和捕獲和混合型表面的組中選擇，且生物分子親和表面的生物分子從包含抗體、受體、核酸、外源凝集素、酶、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、Staph蛋白A和Staph蛋白G的組中選擇。
親和捕獲激光解吸電離探針可以具有多個(gè)能夠放置在與激光源有查詢關(guān)系的位置上并可各自尋址的樣品吸附表面，并且可以包含至少兩個(gè)不同的這種吸附表面。
在其它的實(shí)施例中，本發(fā)明的分析設(shè)備包含一個(gè)與串聯(lián)質(zhì)譜儀的檢測(cè)器對(duì)接的數(shù)字式計(jì)算機(jī)。在一些實(shí)施例中，該設(shè)備還可以包含可由該數(shù)字式計(jì)算機(jī)執(zhí)行的軟件程序，其或者是該計(jì)算機(jī)的一部分或者能夠由該計(jì)算機(jī)傳達(dá)存取。這些實(shí)施例中的軟件程序能夠控制激光解吸電離源，或者控制串聯(lián)質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)采集的至少一個(gè)方面，或者執(zhí)行所述串聯(lián)質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)采集的至少一個(gè)分析路線，或者這些功能的任何一個(gè)子集。
另一方面，本發(fā)明提供了用于分析至少一個(gè)檢測(cè)蛋白的方法。
該方法包括(a)捕捉親和捕獲蛋白生物芯片上的測(cè)試蛋白，(b)在蛋白質(zhì)生物芯片上用分解蛋白制劑產(chǎn)生檢測(cè)蛋白的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物；和(c)用串聯(lián)質(zhì)譜儀分析至少一個(gè)蛋白分解產(chǎn)物。這種方案的這些實(shí)施例中，分析步驟包括(i)將蛋白分解產(chǎn)物從蛋白質(zhì)生物芯片釋放到氣相中以產(chǎn)生相應(yīng)的母體離子肽，(ii)選擇母體離子肽用于隨后的第一質(zhì)譜儀碎裂，(iii)在所選擇的氣相裂解條件下裂解所選擇的母體離子肽以產(chǎn)生離子碎片產(chǎn)物和(iv)生成離子碎片產(chǎn)物的質(zhì)譜。在這種方式中，質(zhì)譜提供了對(duì)檢測(cè)蛋白質(zhì)的分析。
在本發(fā)明這一方案的某些實(shí)施例中，該方法還包括附加步驟(d)，通過將質(zhì)譜遞交給蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫采掘協(xié)議，其是基于質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫中的蛋白理論質(zhì)譜之間緊密配合的方法為數(shù)據(jù)庫中的檢測(cè)蛋白確定至少一種蛋白質(zhì)候選特性，為檢測(cè)蛋白確定至少一種蛋白質(zhì)候選特性。
在這些實(shí)施例的細(xì)節(jié)中，步驟(d)還包括將檢測(cè)蛋白的質(zhì)量和原始檢測(cè)蛋白的種類遞交給該協(xié)議。
在其它實(shí)施例中，該方法還包括(e)將候選特性與檢測(cè)蛋白相比較，其是通過(i)產(chǎn)生(b)中蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物的質(zhì)譜；(ii)將該蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物的質(zhì)譜遞交給計(jì)算機(jī)協(xié)議，其確定了通過使用蛋白質(zhì)水解試劑而預(yù)測(cè)產(chǎn)生的裂解產(chǎn)物候選特性的理論質(zhì)譜與蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物的質(zhì)譜之間的緊密配合方法，借此，該方法表明蛋白質(zhì)生物芯片上的蛋白裂解產(chǎn)物與檢測(cè)蛋白一致。
然而該方法的其它實(shí)施例中還包括步驟(f)，當(dāng)所選擇的母體離子肽與由候選特性預(yù)期的蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物不一致的時(shí)候重復(fù)步驟(c)；并且然后(g)重復(fù)(d)以選擇(f)中的母體離子肽。
在本發(fā)明的這一方案中，檢測(cè)蛋白可以是在第一和第二生物樣品之間差異表達(dá)的蛋白。在一些這樣的實(shí)施例中，第一和第二生物樣品出自于正常源和病態(tài)源。
在第三個(gè)方案中，本發(fā)明提供了表征第一和第二分子結(jié)合配偶體(binding partner)之間結(jié)合相互作用的方法。
在此方案中，該方法包括結(jié)合第二結(jié)合配偶體到第一結(jié)合配偶體上，其中所述的第一結(jié)合配偶體被固定在激光解吸電離探針表面；裂解第二結(jié)合配偶體；而后用串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)量方法探測(cè)至少一個(gè)碎片，其中被探測(cè)碎片的質(zhì)譜表征了該結(jié)合相互作用。
在本發(fā)明此方案的某些實(shí)施例中，在第二結(jié)合配偶體結(jié)合到第一結(jié)合配偶體之前，第一結(jié)合配偶體首先被固定于親和捕獲探針的表面。
這種固定能夠通過將第一結(jié)合配偶體直接結(jié)合到親和捕獲探針上，例如共價(jià)鍵合，而實(shí)現(xiàn)。典型的共價(jià)鍵合實(shí)施例包括第一結(jié)合配偶體的胺與所述探針表面羰基二咪唑(carbonyldiimidazole)的殘基之間，以及所述第一結(jié)合配偶體的氨基或硫醇基團(tuán)與探針表面的環(huán)氧基團(tuán)之間的共價(jià)鍵合。
該固定也能夠通過直接的非共價(jià)結(jié)合，例如第一結(jié)合配偶體與探針表面的金屬，如金或鉑，之間的配位或絡(luò)合結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。該固定還能夠通過第一結(jié)合配偶體與從包括反相、陰離子交換、陽離子交換固定金屬親和捕獲和混合型表面的組中選擇的色譜吸附表面相互作用而實(shí)現(xiàn)。
選擇地，該固定可以是間接的，但雖然是間接的也可以是共價(jià)的。在后面的某些實(shí)施例中，第一結(jié)合配偶體能夠采用共價(jià)結(jié)合并通過銜接物，例如可裂解的銜接物而固定。間接固定也能夠是非共價(jià)的，例如通過生物素/抗生物素蛋白，生物素/抗生蛋白鏈菌素的相互作用而固定到探針上。
在本發(fā)明的這一方案中，第一分子結(jié)合配偶體能夠從包含蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物和脂類的組中選擇。典型地，第一結(jié)合配偶體是蛋白質(zhì)，其可以是從包含多細(xì)胞真核生物、單細(xì)胞真核生物、原核生物和病毒的組中選擇的有機(jī)體中自然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或者可以是非自然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，例如重組融合蛋白質(zhì)。
在第一結(jié)合配偶體是蛋白質(zhì)的實(shí)施例中，該蛋白能夠從包含混合于其它蛋白中的抗體、受體、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞周期蛋白和核糖體蛋白的組中選擇。
第二結(jié)合配偶體與固定的第一結(jié)合配偶體的結(jié)合，在典型的實(shí)施例中，受到第一結(jié)合配偶體與生物樣品相接觸的影響；該樣品可以是從包含血液、淋巴液、尿、腦脊髓液、分泌滑液、乳汁、唾液、玻璃狀液、水狀體液、粘液和精液的組中選擇的流體，或者是細(xì)胞溶解產(chǎn)物，或者某些其它形式的樣品。
在各種實(shí)施例中，包括第一結(jié)合配偶體是蛋白質(zhì)的實(shí)施例，第二結(jié)合配偶體可以是蛋白質(zhì)。選擇地，第二結(jié)合配偶體也可以是存在于組合庫中的化合物，其中第二結(jié)合配偶體與第一結(jié)合配偶體的結(jié)合受到第一結(jié)合配偶體與部分化學(xué)合成組合庫相接觸的影響。然而在另一個(gè)選擇中，第二結(jié)合配偶體可以是生物遲豫組合庫的組分，例如相遲豫庫。
在某些典型的實(shí)施例中，裂解受到第二結(jié)合配偶體與酶相接觸的影響；當(dāng)?shù)诙Y(jié)合配偶體是蛋白質(zhì)時(shí)，酶典型的是特殊的內(nèi)在蛋白酶，例如胰島素、Glu-C(V8)蛋白酶、內(nèi)部蛋白酶Arg-C(半胱氨酸蛋白酶)、Asn-N蛋白酶和Lys-C蛋白酶。選擇地，裂解可以受到所述第二結(jié)合配偶體與液相化學(xué)試劑，例如CNBr，相接觸的影響。
在一些實(shí)施例中，該方法還包括，在第二結(jié)合配偶體與所述第一結(jié)合配偶體結(jié)合之后，裂解第二結(jié)合配偶體之前，使第二結(jié)合配偶體變性。
在多種實(shí)施例中，該方法還包括步驟，在第二結(jié)合配偶體裂解之后，用第一洗脫液，有時(shí)用第二洗脫液，沖洗探針，第二洗脫液在至少由一個(gè)洗脫特性與第一洗脫液有差別，例如pH、離子強(qiáng)度、去污強(qiáng)度和憎水性。
在典型的實(shí)施例中，在裂解之后且在探測(cè)第二結(jié)合配偶體碎片之前，該方法還包括步驟，將能量吸收分子施加到探針。在優(yōu)選實(shí)施例中，探針隨后與本發(fā)明分析設(shè)備的親和捕獲探針界面嚙合，且用該設(shè)備的激光源將第二結(jié)合配偶體的碎片電離并從探針釋放。
該設(shè)備能夠用來生成這種方法的多種有效的測(cè)量方法，包括測(cè)量所有離子質(zhì)量的方法，測(cè)量一部分碎片的質(zhì)量的方法，以及單一離子的監(jiān)控方法。
有效地，該方法的實(shí)施例包括步驟在第二結(jié)合配偶體碎片被質(zhì)譜測(cè)量之后，將碎片測(cè)量結(jié)果與通過應(yīng)用裂解酶裂解規(guī)則到第二結(jié)合配偶體初始氨基酸序列而作出的預(yù)測(cè)相比較，借此，這種比較便表征出了分子間的相互作用。
如果第二結(jié)合配偶體的特性未知，該方法還可以包括，在這種比較之前，通過MS/MS分析來確定第二結(jié)合配偶體的特性。這種MS/MS分析可以包括步驟，質(zhì)譜測(cè)定地選擇第二結(jié)合配偶體的第一碎片；在氣相中裂解第二結(jié)合配偶體的第一碎片，而后將碎片頻譜與從預(yù)先添加到數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)出的碎片頻譜相比較。氨基酸序列數(shù)據(jù)能夠從包括實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和預(yù)知數(shù)據(jù)的組中選擇，且該解離，在典型的實(shí)施例中，為碰撞誘導(dǎo)解離。
在該方法的一些實(shí)施例中，第一結(jié)合配偶體從包括抗體、T細(xì)胞受體和MHC分子的組中選擇。在其它實(shí)施例中，第一結(jié)合配偶體是受體且第二結(jié)合配偶體從包括該受體的拮抗劑、該受體部分拮抗劑、該受體的對(duì)抗劑和該受體的部分對(duì)抗劑的組中選擇。在其它的實(shí)施例中，第一結(jié)合配偶體是糖蛋白受體且第二結(jié)合配偶體是外源凝集素。
在第四個(gè)方案中，本發(fā)明提供了探測(cè)分析物的方法，該方法包括將親和捕獲探針與本發(fā)明分析設(shè)備的親和捕獲探針界面相嚙合，該親和捕獲探針還具有分析物的限制物；用該設(shè)備的激光源從探針將分析物或碎片釋放或電離；而后通過串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)量被釋放的離子來探測(cè)該分析物。
在這一方案中，該方法還能夠包括，在解吸和電離步驟之后且在探測(cè)之前，實(shí)現(xiàn)該釋放離子的碰撞誘導(dǎo)解離。在這種解離之前，在一些實(shí)施例中一部分離子可以選擇出來以用于碰撞解離。
在其它的實(shí)施例中，可以執(zhí)行將分析物吸附于探針上的先行步驟，而在另外的實(shí)施例中，在吸附分析物之后且在該探針與該探針界面嚙合之前，可以執(zhí)行用能量吸收分子將該探針與該分析物粘著接觸的步驟。


本發(fā)明上述的及其它的目的和優(yōu)點(diǎn)將通過參考下列詳細(xì)的結(jié)合附圖的說明而顯而易見，附圖中類似的符號(hào)自始至終代表類似的部分，其中圖1扼要地表示了本發(fā)明分析設(shè)備的一個(gè)實(shí)施例；圖2更詳細(xì)地展示了本發(fā)明分析設(shè)備中優(yōu)選使用的正交QqTOF串聯(lián)質(zhì)譜儀的元件；圖3顯示了單一BPH和前列腺癌患者的精液蛋白質(zhì)特征測(cè)驗(yàn)圖；圖4展示了一種圖3中可檢測(cè)的上調(diào)的(upregulated)蛋白探針上分離的結(jié)果；圖5展示了在富集生物標(biāo)記物候選物被暴露并用胰島素進(jìn)行原位消化之后，用單一相MS分析探測(cè)的肽；圖6展示了在本發(fā)明分析設(shè)備上相同純化蛋白質(zhì)肽的LDIQq-TOF MS分析；和圖7展示了所選擇的富集生物標(biāo)記物候選物二倍荷電離子從本發(fā)明分析設(shè)備上獲得的MS/MS結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
I.定義正如此處所使用的，下面特別列出的術(shù)語具有如下的定義。如果沒有另外定義，此處使用的所有術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中的專業(yè)人士所通常理解的含義。
“分析物”是指希望被探測(cè)的樣品的任何組分。該術(shù)語可以涉及該樣品中的單一組分或多個(gè)組分。
“探針”是指這樣的裝置，當(dāng)被定位嚙合并與激光解吸電離源具有查詢關(guān)系且在大氣壓或低于大氣壓的壓力下與氣相離子質(zhì)譜儀保持并行聯(lián)絡(luò)時(shí)，能夠用于引導(dǎo)來自于分析物的離子進(jìn)入質(zhì)譜儀。正如此處所使用的，該“探針”典型地與探針界面可逆嚙合。
“親和捕獲探針”是指通過足以允許該探針從不均勻混合物中抽提和濃縮分析物的相互作用來結(jié)合分析物的探針。濃縮的純度并不要求。該結(jié)合相互作用典型地是通過將分析物吸附到探針吸附表面而介導(dǎo)的。術(shù)語蛋白質(zhì)芯片(ProteinChip)陣列是指本發(fā)明所使用的可以在商業(yè)上從Ciphergen生物系統(tǒng)有限公司，F(xiàn)remont，California，獲得的親和捕獲探針。
“吸附”是指分析物對(duì)吸附劑的可探測(cè)的非共價(jià)結(jié)合。
“吸附劑”是指任何能夠吸附分析物的物質(zhì)。此處使用的術(shù)語“吸附劑”既涉及單一的材料(“一元吸附劑”)(例如，一種化合物或一種功能基團(tuán))也涉及多種不同的材料(“多元吸附劑”)。多元吸附劑中的吸附材料涉及如“吸附劑物質(zhì)”。例如，探針基質(zhì)上的激光尋址吸附表面能夠包括以許多具有不同結(jié)合特性的不同吸附劑物質(zhì)(例如，陰離子交換材料、金屬螯合劑或抗體)為特征的多元吸附劑。
“吸附表面”是指具有吸附劑的表面。
“色譜吸附表面”是指具有能夠色譜識(shí)別或分離分析物的吸附劑的表面。因此該術(shù)語包括具有陰離子交換部分、陽離子交換部分、反相部分、金屬親和捕獲部分和混合型吸附劑的表面，正如那些在色譜技術(shù)領(lǐng)域中所能夠理解的術(shù)語。
“生物分子親和表面”是指具有包括能夠特異結(jié)合的生物分子的表面。
“特異結(jié)合”是指兩種同時(shí)存在于不均勻(非均勻)樣品中的分子物種相對(duì)于與樣品中其它分子物種的結(jié)合更傾向于彼此相互結(jié)合的能力。典型地，特異結(jié)合相互作用比偶然結(jié)合相互作用在反應(yīng)中的識(shí)別能力高至少兩倍，更典型地超過10-100倍。當(dāng)能夠確定分析物存在于不均勻(非均勻)樣品中時(shí)，在用來探測(cè)分析物時(shí)，特異結(jié)合足以用于識(shí)別。典型地，特異結(jié)合反應(yīng)的親和力或親合力至少大約10-7M，在具有更大特異性的特異結(jié)合反應(yīng)中典型地具有至少10-8M到至少大約10-9M的親和力或親合力。
“能量吸收分子”及相應(yīng)的首字母縮寫詞“EAM”是指能夠，當(dāng)粘附于探針上時(shí)，從激光解吸電離源吸收能量并隨后促進(jìn)與之接觸的分析物解吸和電離的分子。該詞語包括在美國(guó)專利Nos.5,719,060，5,894,063，6,020,208和6,027,942中所述的所有分子，其公開的內(nèi)容其中包括其全部的參考文獻(xiàn)。該詞語顯然包括苯乙烯酸衍生物、芥子酸膽堿酸(“SPA”)、氰羥基苯乙烯酸(“CHCA”)和二羥基苯酸。
“串聯(lián)質(zhì)譜儀”是指任何氣相離子質(zhì)譜儀，其能夠?qū)﹄x子混合物中的離子執(zhí)行兩個(gè)連續(xù)階段的基于m/z的識(shí)別。該詞語包括具有兩個(gè)質(zhì)量分析儀的質(zhì)譜儀以及具有能夠在質(zhì)量分析之前選擇性獲得或保留離子的單一質(zhì)量分析儀的質(zhì)譜儀。因此該詞語顯然包括QqTOF質(zhì)譜儀、離子阱質(zhì)譜儀、離子阱-TOF質(zhì)譜儀、TOF-TOF質(zhì)譜儀，和傅立葉變換離子回旋加速器共振質(zhì)譜儀。
“洗脫液”是指試劑，典型地是溶液，其用于影響或調(diào)節(jié)分析物對(duì)吸附表面吸附劑的吸附。此處洗脫液也涉及如“選擇性閾值調(diào)節(jié)劑”。
“洗脫特性”是指洗脫液的物理或化學(xué)特性，其有利于它影響或調(diào)節(jié)分析物對(duì)吸附表面吸附劑吸附的能力。如果，當(dāng)使分析物與洗脫劑接觸時(shí)，分析物對(duì)洗脫劑的親和程度不同，則兩種洗脫劑具有不同的洗脫特性。洗脫特性包括，例如，pH、離子強(qiáng)度、無序程度、去污強(qiáng)度和溫度。
“生物樣品”和“生物學(xué)樣品”都是指來自于能夠復(fù)制的有機(jī)體至少一部分的樣品。正如此處所使用的，生物樣品能夠來自于任何已知的分類學(xué)領(lǐng)域，包括病毒、原核生物、單細(xì)胞真核生物和多細(xì)胞真核生物。生物樣品能夠來自于有機(jī)體的整體或其一部分，包括來自于其培養(yǎng)部分。生物樣品能夠處于適合于上下文的任何物理形式，包括勻漿、亞細(xì)胞組分、溶解產(chǎn)物和流體。
“生物分子”是指能夠在生物樣品中發(fā)現(xiàn)，但不需要必須來自于生物樣品的有機(jī)分子，例如類固醇、氨基酸、核酸、糖、多肽、多聚核苷酸、復(fù)合碳水化合物和脂類。
“有機(jī)小分子”是指尺寸可以與那些通常在藥物中使用的有機(jī)分子相比較的有機(jī)分子。該術(shù)語不包括有機(jī)生物聚合物(例如，蛋白質(zhì)、核酸等等)。此處使用的有機(jī)小分子典型地尺寸范圍最高達(dá)大約5000Da、高達(dá)大約2500Da、高達(dá)大約2000Da或者高達(dá)大約1000Da。
“生物聚合物”是指能夠在生物樣品中發(fā)現(xiàn)，但不需要必須來自于生物樣品的聚合物，例如多肽、多聚核苷酸、多聚糖和多聚甘油酯(例如，二或三甘油酯)。
“碎片”是指分析物的化學(xué)、酶或物理破碎產(chǎn)物。碎片可以處于中性或離子狀態(tài)。
此處可以互換使用的術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”是指自然發(fā)生的或合成的聚合物包括氨基酸單體(殘基)，其中此處的氨基酸單體包括自然發(fā)生的氨基酸、自然發(fā)生的氨基酸結(jié)構(gòu)變體，和能夠參與肽鍵的合成的非自然發(fā)生類似物。多肽能夠被調(diào)節(jié)，例如通過附加碳水化合物殘基形成糖蛋白。術(shù)語“多肽”、 “肽”和“蛋白質(zhì)”包括糖蛋白和非糖蛋白。
“多聚核苷酸”和“核酸”都是指自然發(fā)生的或合成的聚合物包括核苷酸單體(堿基)。多聚核苷酸包括自然發(fā)生的核酸，例如脫氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)，以及核酸類似物。核酸類似物包括那些包含非自然發(fā)生的堿基的類似物，和那些不是用自然發(fā)生的磷酸二酯鍵連接的核苷酸單體。核苷酸類似物包括，例如(且不限于此)亞磷酸硫酯(phosphorothioates)、亞磷酸二硫酯(phosphorodithioates)、磷酸三酯、磷酸分支酸鹽(phosphoramidates)、磷酸硼烷、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-氧-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNAs)，以及類似物。
如此處所使用地，“分子結(jié)合配偶體”——及同等地，“特異結(jié)合配偶體”——是指顯示特異結(jié)合的分子對(duì)，典型地是生物分子對(duì)。不限于此的例子如受體和配體、抗體和抗原、生物素和抗生物素蛋白，以及生物素和抗生蛋白鏈菌素。
“受體”是指分子，典型地是大分子，其能夠在生物樣品中發(fā)現(xiàn)，但不需要必需來自于生物樣品，且其能夠參與與配體的特異結(jié)合。該術(shù)語還包括保留特異配體結(jié)合能力的碎片和衍生物。
“配體”是指能夠參與與設(shè)計(jì)的受體或抗體特異結(jié)合的任何組分。
“抗體”是指基本上由至少一個(gè)免疫球蛋白基因編碼的多肽或至少一個(gè)免疫球蛋白基因的碎片，其能夠參與與配體的特異結(jié)合。該術(shù)語包括自然發(fā)生的形式，以及碎片和衍生物。在此處所使用的術(shù)語領(lǐng)域內(nèi)的碎片包括那些被用各種肽酶，例如Fab、Fab’和F(ab)’2碎片消化而產(chǎn)生的碎片，那些通過化學(xué)分解而產(chǎn)生的碎片，通過化學(xué)碎裂而產(chǎn)生的碎片，以及重組的碎片，只要該碎片保留與靶分子特異結(jié)合的能力。典型的重組碎片，如通過例如噬菌體顯像而產(chǎn)生的，包括單鏈Fab和scFv(“單鏈可變區(qū)域”)碎片。該術(shù)語領(lǐng)域內(nèi)的衍生物包括抗體(或其碎片)，其序列被調(diào)節(jié)，但仍然能夠特異結(jié)合靶分子，包括種間嵌合體和人抗體。正如此處所使用的，抗體是能夠通過任何已知的技術(shù)，包括通過噬菌體顯像，或者類似技術(shù)從天然B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的收獲物、雜種細(xì)胞、重組表達(dá)系統(tǒng)。
“抗原”是指能夠被抗體結(jié)合的配體?？乖恍枰敲庖咴？乖c抗體相接觸的部分被命名為“抗原決定簇”。
“流量密度(Fluence)”是指?jìng)鬟f到被查詢影象每單位面積上的能量。
II.親和捕獲探針串聯(lián)質(zhì)譜儀在第一個(gè)方案中，本發(fā)明提供了一種分析設(shè)備，其結(jié)合了親和捕獲激光解吸電離進(jìn)樣的優(yōu)點(diǎn)和串聯(lián)質(zhì)譜儀高精度、高質(zhì)量分辨率的優(yōu)點(diǎn)。該結(jié)合比現(xiàn)有的用于執(zhí)行已知技術(shù)操作的設(shè)備具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。而且，該新設(shè)備使發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的新方法成為可能，也使對(duì)特異結(jié)合配偶體之間分子相互作用的識(shí)別和表征的，比現(xiàn)有方法更迅速、更有效、更靈敏的新方法成為可能。首先先總體上簡(jiǎn)要描述一下該設(shè)備；其后，再更詳細(xì)地說明該親和捕獲探針界面的特性。
簡(jiǎn)要地，參考圖1，設(shè)備100包括激光解吸/電離源13；親和捕獲探針界面10，和串聯(lián)質(zhì)譜儀14。圖1所示的是一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，其中激光源12是脈沖氮?dú)饧す馄?，而串?lián)質(zhì)譜儀14是正交四極飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(QqTOF)串聯(lián)MS。
激光解吸/電離源激光解吸/電離源13產(chǎn)生高能光子，被適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)和引導(dǎo)，其解吸和電離粘著于親和捕獲探針16的蛋白質(zhì)及其它分析物。激光解吸/電離源13包括激光源12、激光光路系統(tǒng)11和，選擇地，探針觀察光學(xué)部件18。
激光解吸/電離源13通過使用脈沖激光器12，或者，作為選擇，通過機(jī)械地或電子地切割從連續(xù)激光器12傳來的光束而產(chǎn)生脈沖激光能量。典型地，脈沖激光是優(yōu)先選擇的。優(yōu)選的脈沖激光源包括氮?dú)饧す馄?、Nd:YAG激光器、鉺:YAG激光器和CO2激光器。此處優(yōu)選的是脈沖氮?dú)饧す馄鳎驗(yàn)槠湔嫉睾?jiǎn)單且成本相對(duì)較低。
從激光器12發(fā)出的光子通過激光光路系統(tǒng)11而被引導(dǎo)撞擊探針16的表面。光學(xué)系統(tǒng)11能夠包含一個(gè)由透鏡、反射鏡、棱鏡、衰減器和/或光束分割器組成的配置，其起到收集、引導(dǎo)、聚焦、再分離和控制每一束激光脈沖強(qiáng)度的作用，從而將處于聚焦點(diǎn)形式的具有適當(dāng)解吸流量密度的解吸能量傳遞到探針16上。
選擇地，光學(xué)系統(tǒng)11能夠包含一個(gè)光纖陣列，其起到收集、引導(dǎo)和再分離每一束激光脈沖能量的作用在這一實(shí)施例中，激光器12的輸出端與光纖的輸入端用光學(xué)耦合器耦聯(lián)；該耦合器典型地包含一個(gè)焦距和直徑均適合于光纖輸入端數(shù)值孔徑的透鏡。
進(jìn)入光纖的能量數(shù)量能夠通過仔細(xì)調(diào)節(jié)透鏡相對(duì)于纖維的位置而加以控制；在此實(shí)例中，纖維的光學(xué)耦合器還能夠作為光學(xué)衰減器。在另一個(gè)優(yōu)選配置中，激光器全部的輸出能量都被輸入到纖維中且衰減器置于光纖輸出端與光學(xué)系統(tǒng)解吸點(diǎn)聚焦元件之間。在另外一個(gè)優(yōu)選配置中，光學(xué)衰減器置于激光器和光纖耦合器之間。在所有的實(shí)例中，光學(xué)衰減器均是用來保證傳遞適當(dāng)?shù)募す饬髁棵芏鹊教结?6的表面，且獨(dú)立于激光器12的輸出能量。典型的激光流量密度處于20-1000微焦/平方毫米的量級(jí)。
正如所證實(shí)的那樣，當(dāng)接收從激光器傳來的聚焦的能量時(shí)，纖維光學(xué)部件可能常常被損壞，故將纖維輸入端的接收面積最大化是有利的，這樣傳入的激光能量的流量密度低于纖維的損壞閾值。后者也簡(jiǎn)化了在調(diào)整光學(xué)耦合器相對(duì)于激光器和光學(xué)纖維的位置時(shí)對(duì)光纖激光束的校準(zhǔn)。然而，為了在探針16上獲得相當(dāng)高的解吸流量密度水平，在使用典型的氮?dú)饧す馄鱾鬟f最大能量為大約200μJ/激光脈沖時(shí)，最大引出端纖維直徑不應(yīng)超過400μm(微米)。這一問題的解決在于引入錐形光學(xué)纖維，其輸入端具有400-1200微米量級(jí)的直徑而輸出端具有200-400微米的直徑。
典型地，解吸點(diǎn)應(yīng)該聚焦到使每一束脈沖產(chǎn)生的離子最大化的尺寸，其是通過在保持足以誘發(fā)解吸和電離的流量密度的同時(shí)，查詢最大的探針16面積而實(shí)現(xiàn)的。在耦聯(lián)四極-四極飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀的激光解吸/電離源中，當(dāng)使用典型的氮?dú)饧す馄鱾鬟f大約200微焦/脈沖的最大能量時(shí)，最適宜的激光點(diǎn)面積已被確定為在0.2-0.4平方毫米的范圍。
激光解吸/電離源13能夠包含，典型作為光學(xué)系統(tǒng)11的組成部分，探針觀察光學(xué)部件18。觀察光學(xué)部件18能夠包含照明源、透鏡、反射鏡、棱鏡、分色反射鏡、帶通濾波器和CCD相機(jī)以允許照明和觀察解吸點(diǎn)，例如，探針6被激光查詢的區(qū)域。
當(dāng)激光光路系統(tǒng)11包含光學(xué)纖維時(shí)，觀察光學(xué)部件18能夠利用光學(xué)纖維本身發(fā)出的光線。
例如，纖維光學(xué)耦合器能夠被分為兩部分(被分叉)以分離一小部分的激光激發(fā)能量，從而作為一種用來監(jiān)視所施加的激光能量的方法，或者它能夠被分為兩部分以允許引入可見光來照亮解吸點(diǎn)。
在這兩個(gè)實(shí)施例的第一個(gè)實(shí)施例中，一小部分的激發(fā)能量被引導(dǎo)撞擊作為激光能量回路組成部分的攝相探測(cè)器，其經(jīng)過校準(zhǔn)能夠反射回有效數(shù)量的傳遞給探針16的激光能量。在第二個(gè)實(shí)施例中，可見光被引導(dǎo)照亮解吸點(diǎn)使得觀察這一區(qū)域成為可能，其是或者通過一組單獨(dú)的耦聯(lián)CCD相機(jī)的攝相光學(xué)部件，或者通過在光纖和激光激發(fā)源之間使用棱鏡或分色鏡，其將反射到光纖主路的光線引導(dǎo)到CCD相機(jī)上，而實(shí)現(xiàn)的。選擇地，棱鏡或分色鏡能夠成直線地置于光學(xué)纖維照明纖維支路和照明源之間以允許任何耦合到此支路的反射回來的圖象被引導(dǎo)撞擊CCD相機(jī)。在另外一個(gè)實(shí)施例中，該纖維能夠被分成三叉，從而一支傳遞解吸/電離激光脈沖，另一支傳遞用于照明解吸點(diǎn)的可見光，而第三支將從解吸點(diǎn)反射回來的光線遞交給CCD相機(jī)。對(duì)于這些當(dāng)中的每一個(gè)觀察方案，合適的帶通濾波器應(yīng)該布置在CCD相機(jī)和觀察光學(xué)系統(tǒng)之間，以避免將隨著傳入的激光脈沖的直接反射而發(fā)生的可能具有破壞性的高能光子傳遞到探針表面，或者避免二次光子作為受傳入的激光脈沖的電子激發(fā)的直接后果而從探針表面逸出。
探針界面親和捕獲探針界面10能夠可逆嚙合親和捕獲探針16，定位探針16使之與激光源12具有查詢關(guān)系，并同時(shí)與串聯(lián)質(zhì)譜儀14保持聯(lián)絡(luò)；該聯(lián)絡(luò)可支持從大氣壓到低于大氣壓的壓力。
探針界面10包括探針固定器、探針導(dǎo)入口、探針位置調(diào)節(jié)器組件、真空和氣動(dòng)組件置，及界面離子收集系統(tǒng)。
探針固定器是探針界面10的部件，其被定形以便和探針16的形狀因數(shù)(form factor)相一致。當(dāng)探針16為蛋白質(zhì)芯片陣列(Ciphergen生物系統(tǒng)有限公司，F(xiàn)remont，CA USA)時(shí)，探針固定器與蛋白質(zhì)芯片陣列的形狀因數(shù)相一致。
探針固定器能夠固定單一的探針16或者多個(gè)探針16。固定器將每一個(gè)探針16定位于相對(duì)于離子收集系統(tǒng)界面合適的方位，以被激光解吸/電離源13查詢。
探針固定器與位置調(diào)節(jié)器組件緊密接觸。
該調(diào)節(jié)器組件能夠相對(duì)于激光解吸/電離源13和離子收集系統(tǒng)界面移動(dòng)探針16的相對(duì)位置，從而探針的不同區(qū)域都能夠被查詢且由于此照射而產(chǎn)生的離子被收集以引入到串聯(lián)質(zhì)譜儀14中。
該調(diào)節(jié)器包括在使探針的位置相對(duì)于激光解吸/電離源和離子收集系統(tǒng)的位置保持恒定的同時(shí)支持探針16平行和/或旋轉(zhuǎn)移動(dòng)的電化學(xué)裝置。這種電化學(xué)裝置包括但不限于機(jī)械或光學(xué)位置傳感器、螺線管、步進(jìn)馬達(dá)、DC或AC同步馬達(dá)，其直接或間接地與線性移動(dòng)調(diào)節(jié)器、線性或圓周移動(dòng)導(dǎo)軌、萬向節(jié)、軸承，或軸桿連通。
探針導(dǎo)入口允許探針固定器，包括所裝載的探針16，置于探針位置調(diào)節(jié)器組件上而不引入不恰當(dāng)水平的大氣氣體進(jìn)入探針界面10和串聯(lián)質(zhì)譜儀14。
為了實(shí)現(xiàn)后者，探針導(dǎo)入口使用了真空抽空系統(tǒng)(探針導(dǎo)入口抽空系統(tǒng))以泵出大氣氣體，在將芯片移入工作位置之前獲得靶端口壓力。在探針交換期間，探針調(diào)節(jié)器組件將探針從工作位置(與激光解吸源13和離子收集系統(tǒng)成一直線的位置)移動(dòng)到交換位置。在這樣的操作中，調(diào)節(jié)器能夠在即將迅速提升到大氣壓的交換口與質(zhì)譜儀輸入端之間提供密封。在密封了質(zhì)譜儀輸入端之后，大氣氣體被探針導(dǎo)入口加壓系統(tǒng)導(dǎo)入到探針導(dǎo)入口內(nèi)。這便消除了探針固定器大氣表面與導(dǎo)入口之間的壓力差，允許探針固定器從探針位置調(diào)節(jié)組件移開。
伴隨著先前已分析探針16的移走和新探針16的安裝，探針固定器被放回到其位置調(diào)節(jié)器和樣品裝載過程開始的位置。如前所述，探針導(dǎo)入口能夠用抽空系統(tǒng)抽吸到低于大氣壓的壓力。一旦到達(dá)靶樣品的導(dǎo)入壓力，探針調(diào)節(jié)系統(tǒng)就將探針16從交換位置移動(dòng)到工作位置，并在此操作中打開對(duì)質(zhì)譜儀輸入端的密封。
選擇地，當(dāng)離子在處于大氣壓的解吸室中產(chǎn)生并最終引導(dǎo)到離子光學(xué)部件上時(shí)，其將離子引導(dǎo)到質(zhì)譜儀輸入端，并不需要對(duì)探針導(dǎo)入口進(jìn)行抽空和加壓，因?yàn)槠浔槐３衷诖髿鈮合隆?br> 探針導(dǎo)入口抽空系統(tǒng)包括真空泵、壓力傳感器、真空兼容管道和連接配件，以及真空兼容閥，當(dāng)共同工作時(shí)，其允許伴隨著樣品交換的同時(shí)對(duì)保留在導(dǎo)入口中的大氣氣體進(jìn)行受控抽空，從而探針16能夠被移動(dòng)到工作位置。真空泵能夠是(但不限制于此)單極或多極油機(jī)械泵、渦管泵，或無油膜片泵。在優(yōu)選實(shí)施例中，真空兼容閥為電控螺線管閥。在相同實(shí)施例中，壓力傳感器為能夠在從大氣壓到1毫托的壓力范圍工作的電子傳感器。這種壓力傳感器包括(但不限于此)熱電偶計(jì)和pirani計(jì)。在相同實(shí)施例中，此系統(tǒng)相同操作是在由模擬邏輯回路或數(shù)字微處理器提供的邏輯控制下實(shí)現(xiàn)的，其中模擬邏輯回路或數(shù)字微處理器與壓力計(jì)和位置傳感器的輸入一致以允許作為整個(gè)系統(tǒng)操作一部分的樣品口自動(dòng)抽空。
探針導(dǎo)入口加壓系統(tǒng)包括氣體源、壓力傳感器、氣體引導(dǎo)管道或配件，和氣體兼容閥，當(dāng)共同工作時(shí)，其允許受控導(dǎo)入對(duì)交換口加壓的氣體，從而允許將探針固定器從調(diào)節(jié)組件移走。
在一個(gè)實(shí)施例中，氣體源是未經(jīng)處理的大氣氣體。在另一實(shí)施例中，氣體源是首先被引導(dǎo)通過吸水劑阱，并在導(dǎo)入加壓系統(tǒng)之前選擇地再通過特殊的過濾器的大氣氣體。在另外一個(gè)實(shí)施例中，在使用大氣氣體的場(chǎng)合，加壓密封氣體是通過由干燥不活潑氣體如氮?dú)饣蛉魏斡谐杀拘б娴亩栊詺怏w組成的純化源而提供的。
在優(yōu)選實(shí)施例中，加壓系統(tǒng)的氣體引導(dǎo)管道、配件、某些閥和壓力傳感器是在抽空系統(tǒng)中所使用的。在相同的實(shí)施例中，此系統(tǒng)相同的操作是在由模擬邏輯回路或數(shù)字微處理器提供的邏輯控制下實(shí)現(xiàn)的，其中模擬邏輯回路或數(shù)字微處理器利用壓力計(jì)和位置傳感器的輸入以允許作為整個(gè)系統(tǒng)操作一部分的樣品口自動(dòng)加壓。
探針界面壓力控制系統(tǒng)起到了在位于探針16樣品存在(吸附)表面和離子收集系統(tǒng)之間的解吸室中提供選擇性背景氣壓的作用?？梢越邮艿慕馕覊毫Ψ秶鷱拇髿鈮阂恢钡?.1微托。優(yōu)選的壓力范圍為1托到1毫托。探針界面壓力控制系統(tǒng)包括氣體源、氣體導(dǎo)入管道和配件、氣體流量控制器和壓力傳感器。氣體源能夠是未經(jīng)處理的大氣氣體。在另一個(gè)實(shí)施例中，氣體源是首先被引導(dǎo)通過吸水劑阱并在導(dǎo)入控制系統(tǒng)之前選擇地再通過特殊的過濾器的大氣氣體。在另外一個(gè)實(shí)施例中，控制氣體是通過由干燥不活潑氣體如氮?dú)饣蛉魏斡谐杀拘б娴亩栊詺怏w組成的純化源而提供的。氣體流量控制器可以是手動(dòng)控制的流量限流器。選擇地，氣體流量控制可以通過使用電子控制流量限流器而實(shí)現(xiàn)。在優(yōu)選實(shí)施例中，優(yōu)選解吸室壓力的閉環(huán)控制是在由模擬邏輯回路或數(shù)字微處理器提供的邏輯控制下，以自動(dòng)的模式實(shí)現(xiàn)的，其中模擬邏輯回路或數(shù)字微處理器靈敏地與自動(dòng)氣體流量控制器相互作用以從壓力計(jì)獲得預(yù)先確立的讀數(shù)。
界面離子收集系統(tǒng)包括靜電離子收集組件、可選的氣動(dòng)離子收集組件和靜電或RF離子引導(dǎo)裝置。靜電離子收集組件包括DC靜電透鏡元件配置，其起到收集在解吸室中解吸的離子并將其引導(dǎo)到質(zhì)譜儀輸入端的作用。
在一個(gè)實(shí)施例中，該組件包括兩個(gè)靜電元件。第一個(gè)元件包括探針固定器和探針表面，而第二個(gè)是分離透鏡。分離透鏡被放置在離陣列表面0.2-4mm遠(yuǎn)的地方。分離透鏡包含直徑范圍為2-20mm的孔徑，其圍繞從解吸點(diǎn)中心延伸到質(zhì)譜儀輸入端中心的法線軸同心地放置。獨(dú)立的DC電勢(shì)施加到該組件的每一個(gè)元件。
在優(yōu)選實(shí)施例中，分離透鏡包含直徑10mm的孔徑且被放置于距離陣列表面1mm遠(yuǎn)的地方。在相同的實(shí)施例中，10伏電勢(shì)差在分離器和陣列之間建立。
氣動(dòng)離子收集組件包括氣體源、引導(dǎo)管道、氣壓傳感器和氣體逸出口，從而能夠產(chǎn)生預(yù)先確定的氣體流量以幫助解吸室中的解吸離子整體移動(dòng)到質(zhì)譜儀輸入端內(nèi)。
氣體源能夠是未經(jīng)處理的大氣氣體。在另一個(gè)實(shí)施例中，氣體源是首先被引導(dǎo)通過吸水劑阱再在導(dǎo)入系統(tǒng)之前選擇地通過特殊過濾器的大氣氣體。在另外一個(gè)實(shí)施例中，離子收集氣體是通過由干燥不活潑氣體如氮?dú)饣蛉魏斡谐杀拘б娴亩栊詺怏w組成的純化源而提供的。
氣體流量控制器能夠是手動(dòng)控制的流量限流器。選擇地，氣流控制能夠通過使用電子控制流量限流器而實(shí)現(xiàn)。壓力傳感器能夠是(但不限于此)熱電偶計(jì)和priani計(jì)。氣體出口置于探針16后面以引導(dǎo)主體氣體圍繞探針流動(dòng)并流到同心放置于解吸點(diǎn)和質(zhì)譜儀輸入端的法線軸。
在優(yōu)選實(shí)施例中，氣體流量通過使用模擬或數(shù)字控制電路而受到自動(dòng)回路控制，從而產(chǎn)生了足夠的離子掃描(sweeping)流量而不過度加壓解吸室。
界面離子收集系統(tǒng)的最后一個(gè)部件是離子引導(dǎo)裝置。離子引導(dǎo)裝置起到了將所收集的離子傳遞到質(zhì)譜儀14的作用。它可以屬于靜電或RF種類。優(yōu)選實(shí)施例是多極RF離子引導(dǎo)裝置。后者的一個(gè)例子是四極或六極離子導(dǎo)管。在下面更詳細(xì)說明的優(yōu)選Qq-TOF設(shè)備中，離子導(dǎo)管是四極RF離子導(dǎo)管。離子被分別由靜電和氣動(dòng)離子收集系統(tǒng)產(chǎn)生的靜電或氣動(dòng)加速力引導(dǎo)進(jìn)入離子引導(dǎo)裝置。在優(yōu)選實(shí)施例中離子引導(dǎo)裝置的DC靜電電勢(shì)比分離透鏡的典型地小10-20伏。
串聯(lián)質(zhì)譜儀本發(fā)明的分析設(shè)備還包括串聯(lián)質(zhì)譜儀14。串聯(lián)質(zhì)譜儀14能夠有效地從包括正交四極飛行時(shí)間(Qq-TOF)、離子阱(IT)、離子阱飛行時(shí)間(IT-TOF)、飛行時(shí)間-飛行時(shí)間(TOF-TOF)和離子回旋加速器共振(ICR)等類型的組中選擇。
此處優(yōu)選的，并在下面進(jìn)一步說明的，是正交Qq-TOF MS。
QqTOF MS的主要實(shí)力是優(yōu)越的質(zhì)量精度和分辨能力；提高的肽靈敏度和低mw范圍；以及通過采用低能碰撞誘導(dǎo)解離(CID)而產(chǎn)生的優(yōu)良ms/ms性能。具有電噴霧電離源的正交QqTOF能夠從AB/MDS Sciex(QSTARTM；AB/MDS-Sciex，F(xiàn)oster City，California，USA)在商業(yè)上獲得。
參考圖2，簡(jiǎn)要地概括了QqTOF的原理和特點(diǎn)。
離子在第一個(gè)四極透鏡“q0”之前的解吸室內(nèi)產(chǎn)生。q0中的壓力典型地維持在大約0.01-1托，但也能夠維持在大氣壓下。在這一方法中，解吸離子在其形成之后不久便通過與背景氣體碰撞而迅速冷卻。
這種離子的整體冷卻或衰減提供了三個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)。
首先，冷卻消除了解吸離子的起始能量分布并將其總能量降低到接近其熱能的程度。這簡(jiǎn)化了正交分離的要求，彌補(bǔ)了離子位置和能量的不同，因此改進(jìn)了最終的分辨能力。分辨率改善的直接結(jié)果是將質(zhì)量精度提高到了較低的ppm水平。
碰撞冷卻的第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于其能夠降低長(zhǎng)期離子衰變的速率。氣體碰撞緩和了內(nèi)部激勵(lì)并改善了肽和蛋白質(zhì)離子的穩(wěn)定性。當(dāng)離子在壓力大約為1托的背景氣體的存在下產(chǎn)生時(shí)，這種穩(wěn)定化效應(yīng)似乎被最大化了。其他人公開的測(cè)量表明能夠有效地消除小基群的損失和背景碎片，改善了高mw蛋白質(zhì)和其它不穩(wěn)定生物聚合物(例如甘油共軛物，DNA，等等)的傳遞。還會(huì)發(fā)生更快的衰變機(jī)制(即時(shí)型和源內(nèi)型衰變)。
q0碰撞冷卻的最后一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)生進(jìn)入質(zhì)量分析器的偽連續(xù)離子流。q0中的離子碰撞引起解吸云沿著q0的軸線展開。這一展開產(chǎn)生了一種情況，即其中各種解吸過程開始重疊，產(chǎn)生了對(duì)類似電噴霧的離子進(jìn)入分析器的連續(xù)引導(dǎo)。
通過q0之后，離子進(jìn)入到第二個(gè)四極22(“Q1”)。這一四極起到了或者作為離子導(dǎo)管或者作為質(zhì)量過濾器的作用。在這里產(chǎn)生了用于ms/ms或單一離子監(jiān)視(SIM)實(shí)驗(yàn)的離子選擇。
離開Q1之后，離子進(jìn)入到位于碰撞室26的第三個(gè)四極24(“q2”)中。在簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)期間，q2行使簡(jiǎn)單rf離子導(dǎo)管的功能。對(duì)于ms/ms實(shí)驗(yàn)，q2用大約10-2托的碰撞氣體填充以促進(jìn)低能CID。
離開q2之后，離子通過施加到q2出口與聚焦柵極28之間的DC電勢(shì)差略微加速。這種加速“偏向”沿Y軸的離子速度，因而此處其速度與其m/z的平方根成反比。如果全部的具有不同m/z的離子在正交分離和自由飛行之后都要撞擊探測(cè)器的話，就必須實(shí)現(xiàn)這種偏向。如果這種偏向沒有實(shí)現(xiàn)，不同m/z的離子將以相同的Y軸速度進(jìn)入正交分離區(qū)域。
正如飛行時(shí)間中所一直存在的，具有較低m/z的離子會(huì)在具有較大m/z的離子之前撞擊探測(cè)器。沿Y軸的絕對(duì)位移水平產(chǎn)生了離子沿Z軸的飛行時(shí)間和離子的Y軸速度。如果探測(cè)器被放置在某一個(gè)相對(duì)于中間態(tài)mw離子而言最優(yōu)化的位置上，則較輕的離子將“射擊低于”探測(cè)器，到達(dá)圖2中探測(cè)器的右側(cè)。相反地，具有較大m/z的離子將“射擊超過”探測(cè)器而到達(dá)圖2中探測(cè)器的左側(cè)。結(jié)果，如果要所有的離子都撞擊同一個(gè)探測(cè)器位點(diǎn)，就有必要使所有的離子都維持恒定的Z軸和Y軸速度比率。前述的柵極偏向方法就實(shí)現(xiàn)了這一目的。
通過聚焦柵極28之后，離子到達(dá)了正交分離元件的調(diào)節(jié)器區(qū)域30。調(diào)節(jié)器30以接近10,000脈沖/秒(10KHz)的速度被脈動(dòng)調(diào)節(jié)。離子被推入到離子光學(xué)系統(tǒng)的加速器柱32內(nèi)，而后離開它進(jìn)入到正交飛行時(shí)間(O-TOF)的自由飛行區(qū)域34中。當(dāng)離子進(jìn)入離子放射鏡36時(shí)，能量校正便完成了。在放射鏡中，離子被轉(zhuǎn)向并被引導(dǎo)撞擊V形排列的微通道板探測(cè)器38而產(chǎn)生快反應(yīng)。
這種原型配置的其它可選擇方法也可以采用。
例如，上面提過的幾何結(jié)構(gòu)在高加速能量下帶來了執(zhí)行O-TOF的困難。已經(jīng)較好地確定出，離子探測(cè)肽和蛋白質(zhì)的靈敏度隨著全體離子能量的上升而改善。對(duì)于人胰島素(MW＝5807.65Da)，當(dāng)使用典型的微通道板探測(cè)器時(shí)，在35keV的離子能量下，探測(cè)效率接近100％。如果離子被加速到具有20或30keV的能量，則自由飛行管襯里40和其它相關(guān)部件就必須分別浮動(dòng)到-20kV或-30kV。在這種電勢(shì)下，在簡(jiǎn)單離子光學(xué)元件上提供穩(wěn)定電絕緣的困難是眾所周知的。在這種電勢(shì)下安全而可靠地浮動(dòng)多個(gè)元件是困難的。一個(gè)解決辦法就是采用后加速技術(shù)。
與上述裝置不同，這種可供選擇的裝置采用了探測(cè)器后加速器(未顯示)。離子在離開正交分離元件之后被加速到具有大約4keV的能量，而自由飛行區(qū)域被浮動(dòng)到-4kV。隨著離子進(jìn)入后加速器探測(cè)器組件便實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步的加速。在該組件中，離子經(jīng)過保持在襯里電勢(shì)下的場(chǎng)維持柵極。然后離子在場(chǎng)維持柵極和探測(cè)器初級(jí)離子轉(zhuǎn)換表面之間建立起來的場(chǎng)中再一次受到加速。這種加速場(chǎng)處于10-20kV的量級(jí)，跨度為4-10mm。
因?yàn)檎辉O(shè)計(jì)將飛行時(shí)間的測(cè)量與離子的形成分離，實(shí)現(xiàn)了許多的優(yōu)點(diǎn)。
激光流量密度相關(guān)問題，例如由于離子屏蔽和離子加速場(chǎng)疊加而產(chǎn)生的峰展寬，會(huì)因?yàn)殡x子的解吸熱柱流在正交分離和加速進(jìn)入TOF質(zhì)量分析器之前有更長(zhǎng)的時(shí)間(典型地為幾毫秒)進(jìn)行擴(kuò)展和冷卻而被消除。另外，正交分離消除了大量的大峰和基線異常，其在傳統(tǒng)分離波譜的高激光能量開始時(shí)會(huì)由于過多的EAM中性負(fù)荷所產(chǎn)生的化學(xué)噪音而被觀察到。因?yàn)橹行粤Ｗ釉谡{(diào)節(jié)器區(qū)域中不被分離，只有離子能被傳遞到探測(cè)器中，從而化學(xué)噪音被相當(dāng)?shù)販p小了。
這些因素能夠允許在平行連續(xù)或遲豫離子分離方法中使用比通常所使用的要大2-3倍的激光流量密度。其最終結(jié)果便是，甚至在較差的樣品-EAM均一性的情況下，幾乎完全消除了跟蹤和搜索“掃描點(diǎn)”的需要，也改善了外部標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量精度的確定(典型的誤差為20-50ppm)，改善了定量分析的再現(xiàn)性，并改善了信號(hào)噪音比。另外的好處是消除了執(zhí)行低或高激光能量掃描以分析具有較寬m/z范圍的離子的需要。現(xiàn)在單一的激光流量密度就能夠用來探測(cè)所有低和高mw的離子，大大簡(jiǎn)化了對(duì)未知混合物的分析方法。
當(dāng)該裝置與傳統(tǒng)的平行分離辦法相比較時(shí)，可能其中一個(gè)給人印象最深的優(yōu)點(diǎn)便是其不需要對(duì)剛性樣品進(jìn)行定位的能力。因?yàn)門OF測(cè)量被基本上從離子形成過程中消除了，離子的原始位置也就不再重要了。而且，由于離子的形成在高壓環(huán)境中無需伴隨施加高壓分離場(chǎng)便實(shí)現(xiàn)了，所以對(duì)進(jìn)入系統(tǒng)的固態(tài)樣品的設(shè)計(jì)要求便大大降低了。在保持優(yōu)良的外部標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量精度性能的同時(shí)，可以采用簡(jiǎn)單的方法代替二維樣品控制器。另外，樣品存在表面不再需要用金屬或其它導(dǎo)電介質(zhì)制作。
概括地講，激光解吸電離(LDI)Qq-TOF MS相對(duì)于現(xiàn)有的LDI-TOF MS技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)提高了外部標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量精度(典型地20-50ppm)；(2)提高了分辨率；(3)提高了ms/ms效率；(4)提高了用單一高激光能量水平產(chǎn)生信號(hào)的簡(jiǎn)易性，其消除了對(duì)高和低能掃描的需要；(5)通過使用TDC技術(shù)和比最低解吸閾值高2-4倍的激光流量密度提高了定量分析能力；(6)降低了對(duì)二維樣品調(diào)節(jié)器的要求；(7)對(duì)樣品存在的探針表面使用塑料部件的潛力(例如，注射模制的二維探針陣列)；(8)通過使用單一離子監(jiān)測(cè)降低了化學(xué)噪音并提高了測(cè)量處于EAM化學(xué)噪音領(lǐng)域的離子的能量。
激光解吸電離(LDI)Qq-TOF MS相對(duì)于現(xiàn)有MALDI-PSD方法，在蛋白質(zhì)表征和識(shí)別中具有如下優(yōu)點(diǎn)。
LDI-QqTOF提供了更高的物質(zhì)分辨能力和質(zhì)量精度；在數(shù)據(jù)庫采掘過程中，該提高的能力降低了錯(cuò)誤陽性數(shù)據(jù)庫擊中的數(shù)量，簡(jiǎn)化了識(shí)別方法。而且，QqTOF還提供了比能夠用PSD MS/MS獲得的靈敏度大超過一個(gè)數(shù)量級(jí)的靈敏度。
本發(fā)明的分析設(shè)備證實(shí)了MS/MS驚人的能力以及對(duì)于單一MS分析低于20ppm的質(zhì)量分配誤差。后者允許對(duì)大量的保留在單一親和捕獲探針表面上的蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行識(shí)別。
其它部件親和捕獲探針串聯(lián)MS設(shè)備100典型地還包括與串聯(lián)質(zhì)譜儀探測(cè)器對(duì)接的數(shù)字計(jì)算機(jī)。數(shù)字計(jì)算機(jī)典型地還與激光解吸源12對(duì)接，允許該計(jì)算機(jī)既控制離子的產(chǎn)生又參與數(shù)據(jù)的采集和分析。
分析軟件可以被裝載在計(jì)算機(jī)上或者處于遠(yuǎn)程控制，但可訪問地與計(jì)算機(jī)聯(lián)絡(luò)。例如，計(jì)算機(jī)能夠與因特網(wǎng)相連從而允許使用能夠在萬維網(wǎng)上獲得的分析軟件包，例如蛋白質(zhì)探勘者、PROWL或者M(jìn)ascot搜索引擎。分析軟件也能夠遠(yuǎn)遠(yuǎn)地駐留在LAN或WAN服務(wù)器上。
親和捕獲探針為了引導(dǎo)分析物，例如下面將在本部分所詳細(xì)說明的，至少一個(gè)吸附了分析物的親和捕獲探針16被嚙合在探針界面10上，并處于能被激光解吸/電離源13查詢的位置，且傳遞解吸離子進(jìn)入串聯(lián)質(zhì)譜儀14。
探針16典型地具有一個(gè)或更多的吸附表面18，它們的表面可以彼此互不相同(18a，18b，18c，18d)。典型地，如果有多個(gè)吸附表面18，所有的都暴露在探針16的公共面上。
吸附表面18典型地或者是色譜吸附表面或者是生物分子親和表面。
色譜親和表面含有能夠色譜鑒別或者分離分析物能力的吸附劑。這種表面于是包括陰離子交換部分、陽離子交換部分、反相部分、金屬親和捕獲部分，和混合模式吸附劑，這些術(shù)語在色譜技術(shù)中能夠理解。生物分子親和表面含有包含能夠特異結(jié)合的生物分子的吸附劑。這種表面因而能夠包含抗體、受體、核酸、外源凝集素、酶、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、Staph蛋白A和Staph蛋白G。吸附表面將在下面的部分作進(jìn)一步的說明。
界面10將探針16放置在與激光解吸/電離源13有查詢關(guān)系的位置上。典型地，希望激光器能夠查詢探針吸附表面18。此外，界面10將探針16吸附表面18放置在與激光解吸/電離源13有查詢關(guān)系的位置。如果吸附表面18只定位在探針16的一個(gè)表面上，探針16和/或界面10的探針固定器可以形成不對(duì)稱的尺寸，這樣便將探針16沿著吸附表面18存在的方向強(qiáng)制性插入到激光解吸源13中。
當(dāng)探針16具有多個(gè)吸附表面18時(shí)，將希望激光源12能夠直接尋址每一個(gè)吸附表面18。這能夠通過采用提供激光源12和/或可動(dòng)界面10，或者采用其組合，將它光學(xué)嵌入到激光源12和界面10之間而實(shí)現(xiàn)。
探針16能夠是親和捕獲探針，如目前在單一MS分析中所使用的(例如，那些從Ciphergen生物系統(tǒng)有限公司，F(xiàn)remont，CA USA商業(yè)上獲得的)。
III親和探針串聯(lián)MS設(shè)備的應(yīng)用本發(fā)明的上述分析設(shè)備提供了重大的優(yōu)點(diǎn)，并提供了新穎的方法，用于(1)蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)和識(shí)別及(2)表征特異結(jié)合配偶體之間的相互作用，現(xiàn)在將對(duì)其依次進(jìn)行說明。
總體而言，上述分析設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)包括在單一物質(zhì)MS中執(zhí)行高質(zhì)量精度測(cè)量的能力，及串聯(lián)MS模式與親和捕獲探針技術(shù)，特別是與特異受體結(jié)合系統(tǒng)，相結(jié)合的能力。
A.蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和識(shí)別
1.本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)蛋白質(zhì)生物學(xué)家試圖解決的一系列相關(guān)問題是蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、識(shí)別和測(cè)定開發(fā)(assay development)。蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)是一個(gè)在一種例如因?yàn)槠鸬搅俗鳛樵\斷的標(biāo)志或者執(zhí)行了關(guān)鍵細(xì)胞功能的作用而在生物學(xué)角度感興趣的系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的過程。蛋白質(zhì)識(shí)別是確定識(shí)別所發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的過程。測(cè)定開發(fā)是開發(fā)可靠的測(cè)定以探測(cè)蛋白質(zhì)的過程。相對(duì)于先前的技術(shù)，本發(fā)明的方法為執(zhí)行這些過程的專業(yè)人員提供了優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明最主要的優(yōu)點(diǎn)是它提供了可執(zhí)行從蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)到蛋白質(zhì)識(shí)別到測(cè)定開發(fā)操作步驟的單一平臺(tái)?；赟ELDI技術(shù)的單一平臺(tái)的提供顯著地降低了從發(fā)現(xiàn)到測(cè)定確認(rèn)之間的時(shí)間在使用先前技術(shù)時(shí)要花費(fèi)數(shù)月時(shí)間的操作，而現(xiàn)在能夠只需數(shù)周或者數(shù)天。本發(fā)明的方法還顯著地減少了進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所要求的樣品數(shù)量。在先前的方法中所需要的微摩爾量的分析物，本方法能夠用皮摩爾量的分析物執(zhí)行相同的實(shí)驗(yàn)。這便克服了當(dāng)樣品稀少或難以增濃時(shí)的明顯障礙。
先前，蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)和分離要伴隨著使用二維凝膠或WesternBlots。然而，在凝膠之間相互比較以探測(cè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)是一個(gè)困難的過程。
所發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)現(xiàn)在能夠通過使用質(zhì)譜方法識(shí)別。重要的蛋白質(zhì)在有蛋白酶的凝膠中能夠被分離并最終裂解，且肽碎片能夠用質(zhì)譜儀和適當(dāng)?shù)纳镄畔W(xué)方法分析。然而，凝膠與當(dāng)前的質(zhì)譜儀方法不兼容，從而肽段必須從凝膠中移出。因?yàn)楹竺娴倪^程不可避免地會(huì)導(dǎo)致樣品損失，該方法需要有大量的起始蛋白和材料。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)稀少時(shí)，如重要蛋白可能遇到的情況，這便增加了處理的難度。
一旦該蛋白質(zhì)被識(shí)別出來，專業(yè)人員就需要開發(fā)可靠的測(cè)定以探測(cè)該蛋白質(zhì)。典型地，其涉及開發(fā)ELISA測(cè)定。這種技術(shù)，反過來，需要生產(chǎn)抗體。這可能是一個(gè)耗時(shí)的任務(wù)，特別是在如果感興趣的蛋白難以產(chǎn)生足以用于免疫的數(shù)量的情況下。
因此，先前的技術(shù)可能需要有三種不同的技術(shù)以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)識(shí)別和蛋白測(cè)定。本發(fā)明的方法能夠用一種技術(shù)實(shí)現(xiàn)這些。
2.蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)、識(shí)別和測(cè)定開發(fā)(Assay Development)方法本發(fā)明的用于蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、識(shí)別和測(cè)定開發(fā)的方法包括制備不同的映射(map)以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)或感興趣的蛋白質(zhì)，用親和捕獲探針串聯(lián)MS識(shí)別蛋白質(zhì)，和使用親和捕獲探針激光解吸電離色譜表面測(cè)定或親和捕獲探針激光解吸電離生物特異性表面測(cè)定進(jìn)行驗(yàn)證。
該過程可如下進(jìn)行。提供感興趣的蛋白質(zhì)或者通過，例如，使用保留物差異定位(difference mapping)研究來發(fā)現(xiàn)感興趣的蛋白質(zhì)。這些方法在，例如，WO 98/59362(Hutchens和Yip)中有說明。簡(jiǎn)單地說，兩種在某些重要方面(例如，正常的與患病的；功能性的與非功能性的)不同的生物樣品用保留物色譜方法檢測(cè)。該方法包括將樣品暴露于多個(gè)不同的色譜親和和洗滌條件下，接著用親和捕獲探針激光解吸電離檢測(cè)“保留蛋白”。在兩個(gè)樣品之間差異表達(dá)的蛋白便是作進(jìn)一步檢測(cè)的候選物。因?yàn)樗鼈円呀?jīng)在質(zhì)譜儀上檢測(cè)過，故這些候選物蛋白的分子量是已知的。
通常，除了感興趣的蛋白質(zhì)之外還有許多蛋白質(zhì)保留在芯片上。因此下一選擇步驟便是改進(jìn)親和及洗滌條件，使蛋白質(zhì)或者感興趣的蛋白質(zhì)保留下來從而為進(jìn)一步分析精簡(jiǎn)樣品。(這些在Hutchens和Yip的專利公開中也有說明。)盡管對(duì)單一感興趣的蛋白的捕獲較理想，但捕獲不超過大約10個(gè)可檢測(cè)蛋白則更加可取。該精煉方法為感興趣的蛋白提供了改進(jìn)的色譜測(cè)定。
然后保留蛋白在探針上用精選的蛋白水解試劑裂解，為隨后的研究產(chǎn)生肽池。用特異的內(nèi)在蛋白酶例如胰島素消化更具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵摿呀饽Ｊ揭阎遗c生物信息學(xué)方法，包括存儲(chǔ)于數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的硅解離，兼容。然后產(chǎn)物肽用高分辨率、高精度的MS-MS(例如具有質(zhì)量分配誤差小于百萬分之二十且分辨率大約10,000)分析。此時(shí)，似乎還不清楚特異肽段是興趣蛋白的產(chǎn)物還是某一其它保留蛋白的產(chǎn)物。盡管如此，該分析仍然通過選擇一個(gè)肽碎片(可能是隨機(jī)的，可能基于與興趣蛋白相一致的信息)和將該肽進(jìn)行氣相裂解而進(jìn)行。其中一個(gè)此類的方法是碰撞誘導(dǎo)解離(CID)。肽不需要從芯品分離出來，因?yàn)镸S-MS設(shè)備是在質(zhì)譜儀中將興趣肽與其它肽分離的。這將產(chǎn)生所選擇肽段的進(jìn)一步的裂解模式。
使用在技術(shù)上已經(jīng)建立的方法，例如數(shù)據(jù)庫采掘協(xié)議，從碎裂模式中獲得的信息用來查詢蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫從而為產(chǎn)生該肽段的蛋白質(zhì)生成一個(gè)或更多的假定識(shí)別候選物。該協(xié)議通常執(zhí)行匹配緊密度分析的方法，其衡量蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)質(zhì)譜與選擇碎片實(shí)際質(zhì)譜的匹配程度。然后數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)基于蛋白碎片與數(shù)據(jù)庫蛋白一致性可信度的測(cè)量而被定級(jí)。了解均為已知的母體蛋白和原始物種的質(zhì)量，將有助于限制所產(chǎn)生的候選物的識(shí)別數(shù)量。
然后，產(chǎn)生肽碎片的假定特征蛋白質(zhì)被校核。利用從假定特征候選物初級(jí)序列數(shù)據(jù)庫中和所使用的蛋白水解試劑的解離模式中獲取的知識(shí)，便能夠預(yù)知肽碎片，特別地，和它們的分子量，這是從特征候選物被蛋白水解試劑解離的碎片中所應(yīng)該產(chǎn)生的。然后，這一系列預(yù)知碎片與基于質(zhì)量而保留在芯片上的蛋白質(zhì)水解之后所產(chǎn)生的實(shí)際碎片系列相比較。如果計(jì)算出了預(yù)知碎片，那么就可以確信假定特征候選物實(shí)際地與某種保留在芯片上的蛋白的識(shí)別相一致。如果沒有，那么就必須通過排除的方法試驗(yàn)其它假定特征候選物直到產(chǎn)生碎片的蛋白質(zhì)被識(shí)別出來。在這種狀況下，所產(chǎn)生的與識(shí)別蛋白相一致的碎片能夠從所產(chǎn)生的已計(jì)算過的碎片全體中排除出去。
如果在改進(jìn)了親和及洗脫條件之后只有一種蛋白質(zhì)保留下來，那么就能夠計(jì)算出全部的肽碎片，從而該過程便結(jié)束了。然而，如果有多于一種的蛋白質(zhì)保留下來，情況就可能更加復(fù)雜。例如，分析中所使用的碎片可以是由感興趣的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的，或者它可以是由保留在芯片上但不是感興趣蛋白的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的。這種情況下，用所說明過的MS-MS方法重復(fù)對(duì)未計(jì)算出的肽碎片的分析的步驟直到識(shí)別出感興趣的蛋白質(zhì)或識(shí)別出所有的保留蛋白是有用的。
最后，感興趣蛋白能夠通過通過親和捕獲探針激光解吸電離方法，或者采用已被保留蛋白質(zhì)確定的色譜表面或者能夠被開發(fā)用來在親和捕獲探針激光解吸電離定量分析中使用的生物特異性表面，來做定量分析。生物特異性表面建立包括為識(shí)別蛋白提供結(jié)合配偶體，比如抗體，或者受體，如果一種受體已知的話，并將其結(jié)合在芯片的表面。然后，感興趣的蛋白質(zhì)就能夠用已經(jīng)說明過的SELDI做定量分析了。
B.分子相互作用的表征本發(fā)明的分析設(shè)備第一次使得為特異結(jié)合配偶體之間相互作用的研究提供一種靈敏、有效、單平臺(tái)的方法成為可能。
特異結(jié)合相互作用處于廣譜生物過程的核心。此外，測(cè)量和表征這種相互作用的能力對(duì)于全面了解這種過程是必需的先決條件；在臨床水平上，測(cè)量和表征這種相互作用的能力對(duì)于理解這種過程中的病理失常和合理設(shè)計(jì)能夠用于調(diào)節(jié)，或者甚至廢除這種相互作用的試劑是很重要的。
在有組織性的真核組織水平上，例如，哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞間的信號(hào)便是通過神經(jīng)遞質(zhì)與其同源受體間的相互作用而傳播的。理解這種結(jié)合相互作用的分子機(jī)制對(duì)于全面了解這種信號(hào)機(jī)理是必需的。在臨床水平上，理解這種結(jié)合相互作用的分子機(jī)制對(duì)于全面了解信號(hào)病狀的機(jī)制，和對(duì)于合理設(shè)計(jì)減輕這種信號(hào)病狀的藥劑是必需的，藥劑有利于疾病的治療，其范圍從帕金森病到精神分裂癥，從強(qiáng)迫性行為紊亂到癲癇癥。
在循環(huán)水平上，例如，B細(xì)胞受體與循環(huán)抗原的相互作用便是引發(fā)B細(xì)胞克隆擴(kuò)展、分化和抗體特異性體液免疫反應(yīng)所必需的。對(duì)于有利于抗原識(shí)別的抗原決定簇的了解，對(duì)全面了解免疫反應(yīng)是很關(guān)鍵的。在臨床水平上，這種理解對(duì)于設(shè)計(jì)提供更強(qiáng)的體液免疫的疫苗是重要的。類似地，T細(xì)胞受體與證明和抗原存在細(xì)胞上的MHC有聯(lián)系的肽之間的相互作用對(duì)于引發(fā)細(xì)胞免疫是關(guān)鍵的。對(duì)有利于抗原識(shí)別的T細(xì)胞決定簇的理解對(duì)于設(shè)計(jì)能提供更強(qiáng)體液免疫的疫苗是重要的。
在單個(gè)細(xì)胞水平上，對(duì)細(xì)胞外信號(hào)的表型反應(yīng)是通過至少一個(gè)，更經(jīng)常地是一連串的細(xì)胞間的相互作用，從細(xì)胞表面受體與配體的起始相互作用到轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)到細(xì)胞核的胞質(zhì)內(nèi)相互作用，再到蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互作用，而傳播的，然后基因表達(dá)的不同模式導(dǎo)致了能夠觀察到的表型反應(yīng)。
例如，雌激素和孕酮通過卵巢細(xì)胞的差異結(jié)合對(duì)于排卵是必需的。了解類固醇激素受體與激素配體，以及另一方面，了解配體受體與基因組類固醇激素反應(yīng)元件的結(jié)合相互作用的分子機(jī)制對(duì)于理解激素反應(yīng)是重要的。反過來，這種理解對(duì)于理解不孕癥，及對(duì)于合理設(shè)計(jì)旨在取消排卵、著床和/或胎兒成活力的藥劑——例如RU486——是重要的。
這種相互作用不僅在真核系統(tǒng)中，而且在原核系統(tǒng)中及在原核與真核的相互作用中也能夠發(fā)現(xiàn)。例如，某些革蘭氏陰性菌具有侵入真核eurethra所必需的菌毛；從而理解這種相互作用對(duì)于全面了解該病理過程，及對(duì)于合理設(shè)計(jì)能夠防止這種侵入的藥劑是重要的。
已經(jīng)有許多技術(shù)被用于該技術(shù)領(lǐng)域，用來研究和定位(map)特異結(jié)合配偶體之間的分子間相互作用。每一種都具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。
在其中的第一個(gè)方法中，一個(gè)特異結(jié)合配偶體成員被固定在填充在色譜柱中的吸附劑上。為了定位(map)與第一(被結(jié)合)結(jié)合配偶體接觸的第二(自由)結(jié)合配偶體的結(jié)構(gòu)內(nèi)的位置，第二(自由)結(jié)合配偶體被解離。盡管特異化學(xué)解離(例如，通過CNBr)或者甚至非特異化學(xué)水解也能做到，但典型地，這種解離是通過特異的蛋白水解酶。因此，消化液通過該柱以結(jié)合那些仍然與第一(固定)結(jié)合配偶體結(jié)合的第二(自由)結(jié)合配偶體。
而后，第二結(jié)合配偶體的肽被典型地用鹽或pH梯度洗提，而后肽通過使用MALDI或者電噴霧電離引導(dǎo)進(jìn)入質(zhì)譜儀中而被識(shí)別。
這種方法具有多個(gè)眾所周知的，而且顯著的問題。首先，需要有大量純化的第一結(jié)合配偶體以產(chǎn)生特異吸附。第二，需要有大量的，典型是純化的，第二結(jié)合配偶體以用于消化、解吸和洗提，因?yàn)檫@些階段的每一個(gè)都存在稀釋效應(yīng)和分析物損失。而且，盡管隨后的質(zhì)譜分析可能是高靈敏度的，然而液相分析與MS相連接偶爾也會(huì)產(chǎn)生分析物的損失。
也許更根本的缺點(diǎn)是，通過在結(jié)合第一結(jié)合配偶體之前解離第二結(jié)合配偶體，使第二結(jié)合配偶體上只有那些適當(dāng)保持其分子結(jié)構(gòu)的肽碎片才會(huì)結(jié)合，并隨后被探測(cè)。如果，例如，抗體與抗原的結(jié)合是不連續(xù)的，而不是線性的，決定簇，這種不連續(xù)的決定簇會(huì)被裂解所破壞；不能再維持與固定化抗體的結(jié)合，從而這種抗原決定簇便不能被探測(cè)到。
該技術(shù)中的第二個(gè)方法是使用點(diǎn)突變來定位在蛋白結(jié)合配偶體內(nèi)那些有利于分子間結(jié)合的殘基。
后一方法需要已克隆蛋白質(zhì)結(jié)合配偶體，產(chǎn)生期望的點(diǎn)突變，重組轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)的表達(dá)，以及其純化。而后，測(cè)量轉(zhuǎn)化蛋白的其它結(jié)合配偶體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，從而確定突變殘基對(duì)分子間相互作用的影響。
除了經(jīng)常使用的，結(jié)合配偶體之間的接觸情況也能夠用結(jié)合配偶體的X-射線結(jié)晶學(xué)來說明。這種技術(shù)高度有效，并能提供原子水平的分辨率，但是需要每一個(gè)結(jié)合配偶體都高度純化，而且還需要形成合適的晶體。
本發(fā)明的親和捕獲串聯(lián)質(zhì)譜設(shè)備提供了改進(jìn)的方法，其所需要的起始材料要少得多，排除了點(diǎn)突變分析、結(jié)晶，并且顯著地降低了純化的要求。
第一步是將結(jié)合配偶體的其中一個(gè)固定在親和捕獲探針上。
每一個(gè)結(jié)合配偶體都能被固定；然而是自由的結(jié)合配偶體，其有關(guān)結(jié)合接觸的結(jié)構(gòu)信息將被獲取。利用受體/配體的相互作用作為該方法的典范，將配體固定在探針上以允許識(shí)別受體參與結(jié)合配體的區(qū)域；將配體固定在探針上也將允許識(shí)別配體參與結(jié)合受體的區(qū)域。當(dāng)配體是蛋白質(zhì)時(shí)——例如蛋白質(zhì)激素、細(xì)胞素或者化學(xué)激活劑(chemokine)——順次使用每一個(gè)結(jié)合配偶體的分離實(shí)驗(yàn)將產(chǎn)生對(duì)分子間接觸的雙邊理解。
探針結(jié)合的配偶體能夠通過共價(jià)的或強(qiáng)非共價(jià)的相互作用而固定。該選擇取決于該即將固定的配偶體上適當(dāng)反應(yīng)基團(tuán)的可獲得性和探針表面的化學(xué)本質(zhì)。適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)性質(zhì)在分析技術(shù)領(lǐng)域中是眾所周知的。
例如，當(dāng)即將固定的結(jié)合配偶體具有自由氨基酸基團(tuán)時(shí)，在固定結(jié)合配偶體的自由氨基酸基團(tuán)與探針表面的碳酰二咪唑之間能夠形成共價(jià)鍵。類似地，也能夠利用固定結(jié)合配偶體的自由氨基酸或硫醇基團(tuán)將該結(jié)合配偶體共價(jià)鍵合到具有環(huán)氧基團(tuán)的探針表面上。強(qiáng)配位鍵或配價(jià)(dative)鍵能夠在固定結(jié)合配偶體的自由巰基基團(tuán)與探針表面上的金或鉑之間形成。
而后，選擇地，探針表面上的殘余反應(yīng)位點(diǎn)會(huì)被封閉以減少對(duì)活化探針的非特異性結(jié)合。
然后，第二(自由)結(jié)合配偶體與親和捕獲芯片相接觸并被允許與第一(固定)結(jié)合配偶體結(jié)合。
如果第二結(jié)合配偶體是已知的并且是可以獲得的，或者，更典型地，是從不均勻混合物，例如懷疑含有第二結(jié)合配偶體的生物樣品中捕獲出來的，第二(自由)結(jié)合配偶體在溶液中能夠是暫時(shí)純凈的。該生物樣品，如在較早前描述過的生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)方法中，可以是生物流體，例如血液、血清、血漿、淋巴、間質(zhì)流體、尿、分泌液，也可以是細(xì)胞溶解物、細(xì)胞分泌物，或者其中部分分餾和純化的組分。
然后，該探針用一種或更多的具有確定的洗脫性質(zhì)的洗脫液沖洗。這些沖洗用于減少與探針非特異結(jié)合的物種的數(shù)量。
然后，將能量吸附分子加入到，典型地是，液相中，并被允許干燥。能量吸收分子的應(yīng)用會(huì)受到影響，其與現(xiàn)在所使用的親和捕獲探針?biāo)艿挠绊懙姆绞较嗤?；?dāng)使用蛋白質(zhì)芯片陣列(Ciphergen生物系統(tǒng)有限公司，F(xiàn)remont，CA，USA)時(shí)，能量吸收分子根據(jù)制造商的使用說明書使用。
然后，非共價(jià)結(jié)合親和捕獲探針的物質(zhì)——如與第一(固定)結(jié)合配偶體特異結(jié)合的第二結(jié)合配偶體、非特異結(jié)合探針表面的分子、非特異結(jié)合第一結(jié)合配偶體的分子——在激光解吸電離質(zhì)譜的第一相中被探測(cè)。
質(zhì)譜儀可以是單級(jí)親和捕獲LDI-MS設(shè)備，比如Ciphergen生物系統(tǒng)有限公司(Fremont，CA，USA)的PBS II。但是，本發(fā)明的親和捕獲串聯(lián)MS提供了更高的質(zhì)量精度和更高的質(zhì)量分辨率，從而是優(yōu)先選擇的。
典型地，第二(自由)結(jié)合配偶體可從較早前的研究中獲知，且它的存在或不存在可以用質(zhì)譜迅速地確定。如果第二(自由)結(jié)合配偶體未知，則每一種結(jié)合到探針上的物質(zhì)可能都要依次被檢測(cè)。如果可檢測(cè)物種的數(shù)量太高，可以用具有不同洗脫性質(zhì)(典型地，嚴(yán)格性遞增)的洗脫劑沖洗該親和捕獲探針，以減少所存在的用于分析的物種的數(shù)量。
一旦第二(“自由”)結(jié)合配偶體與第一(固定)結(jié)合配偶體的結(jié)合被確認(rèn)，第二結(jié)合配偶體便被解離。這典型地伴隨著第二結(jié)合配偶體(在這種情況下，其非共價(jià)地，但特異地與第一結(jié)合配偶體結(jié)合，順次地，第一結(jié)合配偶體被固定在探針表面上)與特殊的內(nèi)在蛋白酶，如胰島素、Glu-C(V8)蛋白酶、內(nèi)在蛋白酶Arg-C(或者是絲氨酸蛋白酶，或者是半胱氨酸蛋白酶Arg-C酶)、Asn-N蛋白酶，或者Lys-C蛋白酶，的接觸。
消化之后，肽被質(zhì)譜探測(cè)。
如果第二結(jié)合配偶體所有的碎片都要識(shí)別的話——例如，用于證實(shí)通過肽質(zhì)量指紋分析對(duì)第二結(jié)合配偶體的識(shí)別——可以施加能量吸附分子并用探針通過激光解吸電離引導(dǎo)肽進(jìn)入質(zhì)譜。出于這種目的，可以使用Ciphergen PBS II單加速級(jí)線性TOF MS；本發(fā)明，能提供更高質(zhì)量精度和質(zhì)量分辨率的串聯(lián)MS是優(yōu)先選擇的，因?yàn)樵龈叩姆直媛屎途冉档土嗽谌魏谓o定的置信度水平上從任何給定數(shù)據(jù)庫查詢中返回的假定“命中”的數(shù)量。
然而更典型地，還是希望能夠分析那些與固定化第一結(jié)合配偶體結(jié)合最緊密的第二結(jié)合配偶體的碎片。在這種情況下，在添加能量吸附分子之前，用一種或者更多的洗脫劑沖洗探針。
在這種情況下，探針插入到本發(fā)明串聯(lián)MS的界面當(dāng)中，而后第二結(jié)合配偶體的碎片(典型的是肽)被探測(cè)。
如果第二(自由)結(jié)合配偶體的識(shí)別已知，則被探測(cè)碎片的質(zhì)量通過將解離酶已知的解離規(guī)則應(yīng)用到第二結(jié)合配偶體的初級(jí)氨基酸序列中，便能夠與所預(yù)測(cè)的質(zhì)量作比較。在這種方法中，每一個(gè)碎片都能夠被識(shí)別出來，這樣便確定出了第二結(jié)合配偶體的結(jié)構(gòu)中導(dǎo)致與第一結(jié)合配偶體結(jié)合的部分的位置。
盡管，理論上可以使用單級(jí)MS設(shè)備，但實(shí)際上還存在不是從第二結(jié)合配偶體中產(chǎn)生的碎片，這使得分析變得混亂。因此通常情況下的最終識(shí)別會(huì)從本發(fā)明設(shè)備的高質(zhì)量分辨率和質(zhì)量精度中受益，且進(jìn)一步會(huì)從MS/MS分析中受益。
如果第二(自由)結(jié)合配偶體未知，則該結(jié)合配偶體能夠用MS/MS分析識(shí)別。
典型地，這種分析采用如下形式，即在MS的第一階段中選擇第一母體肽，將選擇的肽解離，且然后在MS分析的第二階段產(chǎn)生碎片的質(zhì)譜。在氣相中，解離優(yōu)選地通過碰撞誘導(dǎo)解離而實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的親和捕獲串聯(lián)質(zhì)譜儀的優(yōu)選實(shí)施例中，CID在q2中會(huì)受到與大約10-2托的氮?dú)庀嗯鲎驳挠绊憽?br> 而后，利用該碎片譜通過已知的運(yùn)算法則，如Yates et al.，美國(guó)專利號(hào)Nos5,538,897和6,017,693所公開的，及蛋白質(zhì)勘探者M(jìn)S-TAG(http//prospector.ucsf/edu)模塊所使用的，來查詢序列數(shù)據(jù)庫。
假定的識(shí)別可以進(jìn)一步通過選擇第二母體肽并重復(fù)該方法而被驗(yàn)證，正如為了證實(shí)所有肽均來自于一種可確認(rèn)的母體所需要的那樣。
其后，一旦第二結(jié)合配偶體被識(shí)別出來，正如上面所提及的，分子間相互作用的機(jī)制便能夠被研究了。將裂解酶(或化學(xué)試劑，如CNBr)已知的解離規(guī)則應(yīng)用到剛剛識(shí)別出的第二結(jié)合配偶體的初級(jí)序列上，且將實(shí)驗(yàn)測(cè)量的肽定位到理論消化(theoretical digest)上，由此便識(shí)別出了已經(jīng)結(jié)合在固定化第一結(jié)合配偶體上，且因此在天然分子中也有利于與固定化第一結(jié)合配偶體的結(jié)合的肽。且如上所述，可以通過遞增嚴(yán)格性的洗脫重復(fù)該實(shí)驗(yàn)以識(shí)別那些結(jié)合最緊密的肽。
也可以執(zhí)行其它的微擾以進(jìn)一步闡釋分子間結(jié)合的機(jī)制。
可以改變?cè)诘诙Y(jié)合配偶體裂解之后沖洗探針的洗脫劑的洗脫性質(zhì)，以識(shí)別促成最強(qiáng)相互作用的碎片，或者識(shí)別有利于結(jié)合的pH依賴或鹽依賴的接觸。
這一原理在色譜和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中當(dāng)然是眾所周知的，即隨著洗脫嚴(yán)格性的上升(例如，鹽濃度上升，溫度升高)，那些與固定化第一結(jié)合配偶體結(jié)合較不緊密的碎片將從第一結(jié)合配偶體上洗脫下來。在現(xiàn)有幾何體系中，這種結(jié)合較差的碎片將從探針上洗脫下來，并在隨后的質(zhì)譜分析中丟失掉。因此，能夠執(zhí)行一系列的，其探針或相同對(duì)應(yīng)物的探針以遞增的嚴(yán)格性沖洗的實(shí)驗(yàn)，于是便產(chǎn)生了一系列分級(jí)的第二結(jié)合配偶體碎片的子集。
如上面所提及的，第一(固定)和第二(自由)結(jié)合配偶體可以互換，從而允許洗脫另外一個(gè)結(jié)合配偶體的結(jié)合接觸部位。
更有用的攝動(dòng)(微擾)是去除或改變一個(gè)或兩個(gè)結(jié)合配偶體上的后翻譯改性。例如，如果第一結(jié)合配偶體是糖蛋白，在結(jié)合第二結(jié)合配偶體之前和/或之后，用一種或更多種特異的或非特異的糖蛋白酶處理將有助于闡釋糖殘基對(duì)結(jié)合的貢獻(xiàn)。
類似地，當(dāng)其中一個(gè)結(jié)合配偶體是核酸時(shí)，在結(jié)合了另一個(gè)結(jié)合配偶體之后用核酸酶處理核酸結(jié)合配偶體能夠有助于識(shí)別關(guān)鍵的結(jié)合殘基。
上面所述的表征分子間相互作用的方法代替了先前技術(shù)的多平臺(tái)、高勞動(dòng)強(qiáng)度、低靈敏度的技術(shù)操作，代之以單平臺(tái)、更有效率、高靈敏度的方法。該方法能夠應(yīng)用于多種不同的生物系統(tǒng)和問題之中。
如上面所建議的，本發(fā)明的方法能夠用于抗原決定簇的定位(mapping)——也就是，識(shí)別抗原中有利于結(jié)合抗體、T細(xì)胞受體、或MHC的接觸部位。該方法能夠用于闡釋多蛋白復(fù)合體中生物配體與其受體，轉(zhuǎn)錄因子與核酸，轉(zhuǎn)錄因子與其它轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合的機(jī)制。
盡管上面專門討論討論了蛋白/蛋白相互作用，但本發(fā)明的方法能夠?qū)嵺`地說明外源凝集素與糖蛋白之間，蛋白質(zhì)與核酸之間，及小分子與受體之間的結(jié)合相互作用。
尤其對(duì)于小分子配體，該方法也能夠應(yīng)用于設(shè)計(jì)已知受體的激動(dòng)劑和對(duì)抗物。
在過去十年里，許多技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來用于組合產(chǎn)生大量的小分子，并具有在各種均勻的和活細(xì)胞測(cè)定中篩選這些分子用于影響一種或更多的生物過程的能力。例如，均勻閃爍鄰近測(cè)定能夠用來篩選與已知受體結(jié)合的組合庫；基于圖象的數(shù)字細(xì)胞測(cè)定能夠用于篩選組合庫中的復(fù)合物用于下游效應(yīng)，如受體的細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，改變細(xì)胞內(nèi)鈣的分布，改變細(xì)胞活動(dòng)性。
但是，一旦這種先導(dǎo)化合物被識(shí)別出來，對(duì)小分子與其受體的相互作用的理解將有助于明智地設(shè)計(jì)具有更好藥物代謝動(dòng)力學(xué)和治療學(xué)指數(shù)的分子。本發(fā)明的技術(shù)非常適合于這種用途。
如果小分子提供的信號(hào)接近于通過能量吸收分子而得出的信號(hào)，那么MS將以單離子監(jiān)視方式執(zhí)行，從而只尋找組合庫組分中已知的物質(zhì)。
舉例1前列腺癌生物標(biāo)記物的識(shí)別傳統(tǒng)地，前列腺癌在發(fā)現(xiàn)血液水平的前列腺特異抗體(PSA)增高之后通過活組織切片檢查而診斷。在正常男性中，PSA存在水平低于1ng/ml。對(duì)于BPH和前列腺癌肉瘤，PSA水平可以提高到4-10ng/ml。Chen et al.J.Urology 1572166-2170(1997)；Qian et al.，Clin.Chem.43352-359(1997)。PSA已知具有胰凝乳蛋白酶活性，能夠裂解酪氨酸和亮氨酸的C末端。Qian et al.，Clin.Chem.43352-359(1997)。
使用蛋白質(zhì)芯片差異顯示技術(shù)來分析從BPH患者及前列腺癌患者獲取的精液漿。圖3顯示了單一BPH和前列腺癌患者精液蛋白的測(cè)驗(yàn)圖。虛擬(virtual)凝膠顯示用于提高樣品之間的可視化比較。前列腺癌減去BPH的蛋白質(zhì)測(cè)驗(yàn)圖的差異位點(diǎn)顯示在凝膠觀測(cè)點(diǎn)的下方。差異位點(diǎn)的陽性顯示信號(hào)暗示蛋白質(zhì)在前列腺癌中被上調(diào)了(upregulated)，而負(fù)峰代表前列腺癌向下的蛋白調(diào)節(jié)。探測(cè)到了多個(gè)獨(dú)特的上調(diào)信號(hào)，這表明可能是前列腺癌的生物標(biāo)記物。
在探針上分離其中一個(gè)該被上調(diào)的蛋白是通過使用混合模式表面和中性pH緩沖液沖洗(見圖4)而實(shí)現(xiàn)。在這種情況下，該蛋白被富集以接近均衡(homogeneity)。然后，該富集的生物標(biāo)記物候選物被用胰島素暴露以原位消化。培育之后，添加飽和的CHCA(基質(zhì))溶液并且隨后用SELDI-TOF分析消化產(chǎn)物。
有多種肽被探測(cè)出來(見圖5)。生成的肽信號(hào)被提交以進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分析，并且進(jìn)行人類semenogellin I的初步識(shí)別。這種識(shí)別有些復(fù)雜，因?yàn)樯飿?biāo)記物具有大約5751Da的分子重量，遠(yuǎn)小于semenogellin I的重量(MW 52,131Da)。
相同的純化蛋白質(zhì)被提交以用于蛋白質(zhì)芯片LDI Qq-TOF MS檢測(cè)(見圖6)。因?yàn)樘幱?751Da的母體離子，超過了目前LDI Qq-TOFMS/MS分析的質(zhì)量限制(3000M/z)，因此使用了二價(jià)離子用于CIDMS/MS排序(見圖7)。CID MS/MS結(jié)果用于執(zhí)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫采掘。26種MS/MS離子中的15種被映射(mapped)回人類精液堿性蛋白(SBP)，semenogellin I的蛋白質(zhì)水解導(dǎo)出碎片，提供了這一候選生物標(biāo)記物的最終識(shí)別。
盡管例如這些初始研究快速顯示了蛋白質(zhì)的生物標(biāo)記物，任何生物標(biāo)記物的完全確認(rèn)都需要分析成打的或者甚至上百的相關(guān)樣品以獲得關(guān)于表達(dá)和發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)上顯著的信息。
所有在此處提到的專利、專利公布和其它公開發(fā)行的參考文獻(xiàn)都特此整體引用以為參考，每一個(gè)都獨(dú)立地而具體地參考引用。通過本文中各種參考文獻(xiàn)的引用，申請(qǐng)人不承認(rèn)任何特別的參考文獻(xiàn)是其發(fā)明的“現(xiàn)有技術(shù)”。
盡管提供了具體的例子，上面的描述是例證性的，但不限于此。先前說明過的實(shí)施例的任何一種或更多的特征能夠以任何方式與本發(fā)明任何其它實(shí)施例的一種或更多的特征相結(jié)合。而且，在審閱說明書時(shí)，本發(fā)明的多種變體對(duì)于那些本技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。因此，本發(fā)明的范圍不應(yīng)當(dāng)根據(jù)上面的描述而確定，而是應(yīng)當(dāng)根據(jù)附加的權(quán)利要求書及其完全的等價(jià)物范圍而確定。
權(quán)利要求
1.一種分析設(shè)備包括激光解吸電離源；親和捕獲探針界面；和串聯(lián)質(zhì)譜儀，其中該親和捕獲探針界面能夠嚙合親和捕獲探針，并將該探針放置在與該激光源有查詢關(guān)系并且同時(shí)與該串聯(lián)質(zhì)譜儀聯(lián)絡(luò)的位置。
2.權(quán)利要求1中的分析設(shè)備，其中該激光解吸電離源包含激光激發(fā)源和激光光路系統(tǒng)，該激光光路系統(tǒng)能夠?qū)⒓ぐl(fā)光子從該激光激發(fā)源傳送到該探針界面。
3.權(quán)利要求2中的分析設(shè)備，其中該激光光路系統(tǒng)從該激光激發(fā)源向每平方毫米查詢探針表面遞送大約20-1000微焦的能量。
4，權(quán)利要求2中的分析設(shè)備，其中該激光激發(fā)源從包含連續(xù)激光器和脈沖激光器的組中選擇。
5，權(quán)利要求2中的分析設(shè)備，其中該激光激發(fā)源從包含氮?dú)饧す馄?、Nd:YAG激光器、鉺:YAG激光器和CO2激光器的組中選擇。
6.權(quán)利要求2中的分析設(shè)備，其中該激光激發(fā)源是脈沖氮?dú)饧す馄鳌?br> 7.權(quán)利要求3中的分析設(shè)備，其中該激光光路系統(tǒng)包括從包含透鏡、反光鏡、棱鏡、衰減器和光束分割器的組中選擇的光學(xué)部件。
8.權(quán)利要求3中的分析設(shè)備，其中該激光光路系統(tǒng)包括具有輸入端和輸出端的光學(xué)纖維，其中該激光激發(fā)源與該光學(xué)纖維輸入端耦連。
9.權(quán)利要求8中的分析設(shè)備，其中該激光光路系統(tǒng)還包括光學(xué)衰減器。
10.權(quán)利要求9中的分析設(shè)備，其中其中該衰減器放置在該激光激發(fā)源和該光學(xué)纖維輸入端之間。
11.權(quán)利要求9中的分析設(shè)備，其中該衰減器是光學(xué)耦合器，該耦合器將該激光激發(fā)源耦合于該光學(xué)纖維輸入端。
12.權(quán)利要求9中的分析設(shè)備，其中該衰減器放置于該光學(xué)纖維輸出端與該探針之間。
13.權(quán)利要求8中的分析設(shè)備，其中該光學(xué)纖維輸出端具有大約200-400μm的最大直徑。
14.權(quán)利要求13中的分析設(shè)備，其中該光學(xué)纖維輸入端具有大約400-1200μm的直徑。
15.權(quán)利要求2中的分析設(shè)備，其中該激光解吸電離源還包括探針觀察光學(xué)器件。
16.權(quán)利要求8中的分析設(shè)備，還包括光學(xué)耦合器，該耦合器將該激光激發(fā)源耦合于該光學(xué)纖維輸入端。
17.權(quán)利要求16中的分析設(shè)備，其中該耦合器或該纖維被分叉并從該激光激發(fā)源分離出一部分能量。
18.權(quán)利要求17中的分析設(shè)備，其中該耦合器或該光學(xué)纖維被分叉并允許引導(dǎo)可見光照明解吸點(diǎn)。
19.權(quán)利要求15或18中任何一個(gè)的分析設(shè)備，還包括CCD照相機(jī)，該CCD照相機(jī)被定位以探測(cè)從該探針反射回來的光。
20.權(quán)利要求1中的分析設(shè)備，其中該親和捕獲探針界面包括探針固定器，該探針固定器能夠可逆地嚙合該親和捕獲探針。
21.權(quán)利要求20中的分析設(shè)備，其中該親和捕獲探針界面還包括探針導(dǎo)入口，該探針導(dǎo)入口能夠可逆地嚙合該探針固定器。
22.權(quán)利要求21中的分析設(shè)備，其中該親和捕獲探針界面還包括探針位置調(diào)節(jié)器組件和界面離子收集系統(tǒng)，當(dāng)該探針固定器嚙合于該界面中時(shí)，該探針位置調(diào)節(jié)器能夠接觸該探針固定器，并且相對(duì)于該激光激發(fā)源和該離子收集系統(tǒng)可動(dòng)地定位該探針固定器和該探針。
23.權(quán)利要求22中的分析設(shè)備，其中該調(diào)節(jié)器能夠平移或旋轉(zhuǎn)定位該探針固定器。
24.權(quán)利要求22中的分析設(shè)備，其中該界面還包括真空抽空系統(tǒng)，該系統(tǒng)耦合于該探針導(dǎo)入口。
25.權(quán)利要求24中的分析設(shè)備，其中該真空抽空系統(tǒng)能夠在該探針界面內(nèi)產(chǎn)生低于大氣壓的壓力。
26.權(quán)利要求1中的分析設(shè)備，其中該串聯(lián)質(zhì)譜儀從包含QqTOFMS、離子阱MS、離子阱TOF MS、TOF-TOF MS和傅立葉轉(zhuǎn)換離子回旋加速器共振MS的組中選擇。
27.權(quán)利要求26中的分析設(shè)備，其中該串聯(lián)質(zhì)譜儀是QqTOFMS。
28.權(quán)利要求2中的分析設(shè)備，其中該串聯(lián)質(zhì)譜儀是QqTOF MS，該激光激發(fā)源是脈沖氮?dú)饧す馄鳌?br> 29.權(quán)利要求1中的分析設(shè)備，其中該串聯(lián)質(zhì)譜儀具有20-50ppm的外部標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量精度。
30.權(quán)利要求1中的分析設(shè)備，其中該探針上的激光流量密度大約是最小解吸閾值的2-4倍。
31.權(quán)利要求1中的分析設(shè)備，還包括親和捕獲探針，其中該親和捕獲探針嚙合在該親和捕獲探針界面內(nèi)并放置在與該激光源有查詢關(guān)系的位置且同時(shí)與該串聯(lián)質(zhì)譜儀聯(lián)絡(luò)。
32.權(quán)利要求31中的分析設(shè)備，其中該親和捕獲探針具有至少一個(gè)定位于與該激光源有查詢關(guān)系位置的樣品吸附表面。
33.權(quán)利要求32中的分析設(shè)備，其中該至少一個(gè)樣品吸附表面從包含色譜吸附表面和生物分子親和表面的組中選擇。
34.權(quán)利要求33中的分析設(shè)備，其中該至少一個(gè)樣品吸附表面是色譜吸附表面。
35.權(quán)利要求34中的分析設(shè)備，其中該色譜吸附表面從包含反相、陰離子交換、陽離子交換、固定化金屬親和捕獲，和混合模式表面的組中選擇。
36.權(quán)利要求33中的分析設(shè)備，其中該至少一個(gè)樣品吸附表面是生物分子親和表面。
37.權(quán)利要求36中的分析設(shè)備，其中該生物分子從包含抗體、受體、核酸、外源凝集素、酶、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、Staph蛋白A和Staph蛋白G的組中選擇。
38.權(quán)利要求31中的分析設(shè)備，其中該親和捕獲探針具有多個(gè)放置在與該激光源有查詢關(guān)系位置上的可單獨(dú)尋址的樣品吸附表面。
39.權(quán)利要求38中的分析設(shè)備，其中每一個(gè)該可單獨(dú)尋址的樣品吸附表面從包含反相色譜吸附表面、陰離子交換色譜吸附表面、陽離子交換色譜吸附表面、固定化金屬親和捕獲色譜吸附表面、混合模式色譜吸附表面、抗體親和表面、受體親和表面、核酸親和表面、外源凝集素親和表面、酶親和表面、生物素親和表面、抗生物素蛋白親和表面、抗生蛋白鏈菌素親和表面、Staph蛋白A親和表面和Staph蛋白G親和表面的組中選擇。
40.權(quán)利要求38中的分析設(shè)備，其中該多個(gè)可單獨(dú)尋址的樣品吸附表面包含至少兩種不同的吸附表面。
41.權(quán)利要求1中的分析設(shè)備，還包括數(shù)字計(jì)算機(jī)，其中該數(shù)字計(jì)算機(jī)與該串聯(lián)質(zhì)譜儀的探測(cè)器連接。
42.權(quán)利要求41中的分析設(shè)備，還包括軟件程序，該軟件程序由該數(shù)字計(jì)算機(jī)執(zhí)行。
43.權(quán)利要求42中的分析設(shè)備，其中該軟件程序本地定位于該計(jì)算機(jī)。
44.權(quán)利要求42中的分析設(shè)備，其中該軟件程序是非本地的但可通信訪問該計(jì)算機(jī)。
45.權(quán)利要求42中的分析設(shè)備，其中該軟件程序能夠控制該激光解吸電離源。
46.權(quán)利要求42中的分析設(shè)備，其中該軟件程序能夠通過該串聯(lián)質(zhì)譜儀控制數(shù)據(jù)采集的至少一個(gè)方面。
47.權(quán)利要求42中的分析設(shè)備，其中該軟件程序能夠在通過該串聯(lián)質(zhì)譜儀獲得的數(shù)據(jù)上執(zhí)行至少一個(gè)分析程序。
48.權(quán)利要求42中的分析設(shè)備，其中該軟件程序能夠控制該激光解吸電離源，能夠通過該串聯(lián)質(zhì)譜儀控制數(shù)據(jù)采集的至少一個(gè)方面，并能夠在通過該串聯(lián)質(zhì)譜儀獲得的數(shù)據(jù)上執(zhí)行至少一個(gè)分析程序。
49.一種用于分析至少一個(gè)檢測(cè)蛋白的方法包括(a)在親和捕獲蛋白質(zhì)芯片上捕獲一個(gè)或多個(gè)測(cè)試蛋白；(b)用蛋白水解試劑在蛋白質(zhì)芯片上產(chǎn)生測(cè)試蛋白的蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物；和(c)用串聯(lián)質(zhì)譜儀分析至少一個(gè)蛋白裂解產(chǎn)物，其中分析包括(i)將蛋白裂解產(chǎn)物從蛋白質(zhì)芯片解吸到氣相中以產(chǎn)生相應(yīng)的母體離子肽，(ii)用第一質(zhì)譜儀選擇母體離子肽用于隨后的碎解，(iii)在氣相中所選擇的碎解條件下碎解該選擇的母體離子肽以產(chǎn)生產(chǎn)物離子碎片和(iv)產(chǎn)生產(chǎn)物離子碎片的質(zhì)譜；由此，該質(zhì)譜提供了對(duì)測(cè)試蛋白的分析。
50.權(quán)利要求49中的方法，還包括(d)通過遞交質(zhì)譜到蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫采掘協(xié)議，為測(cè)試蛋白確定至少一個(gè)蛋白識(shí)別候選物，該蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫采掘協(xié)議根據(jù)該質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的理論質(zhì)譜之間匹配緊密度的測(cè)量而在數(shù)據(jù)庫中為測(cè)試蛋白識(shí)別至少一個(gè)蛋白質(zhì)識(shí)別候選物。
51.權(quán)利要求50中的方法，其中(d)還包括將測(cè)試蛋白的質(zhì)量和測(cè)試蛋白的原始物種遞交給協(xié)議。
52.權(quán)利要求50中的方法，還包括(e)比較識(shí)別候選物與測(cè)試蛋白，這通過(i)產(chǎn)生(b)中蛋白裂解產(chǎn)物的質(zhì)譜，(ii)將蛋白裂解產(chǎn)物的質(zhì)譜遞交給計(jì)算機(jī)協(xié)議，該協(xié)議確定通過使用蛋白水解試劑而產(chǎn)生的預(yù)測(cè)的識(shí)別候選物裂解產(chǎn)物的理論質(zhì)譜與蛋白裂解產(chǎn)物的質(zhì)譜之間的匹配緊密度測(cè)量，由此，該測(cè)量指示了對(duì)應(yīng)于測(cè)試蛋白的蛋白質(zhì)芯片上的蛋白裂解產(chǎn)物。
53.權(quán)利要求52中的方法，還包括(f)重復(fù)(c)，其中所選擇的母體離子肽與由識(shí)別候選物預(yù)測(cè)的蛋白裂解產(chǎn)物不對(duì)應(yīng)；和(g)對(duì)于(f)中的所選擇的母體離子肽重復(fù)(d)。
54.權(quán)利要求49中的方法，其中測(cè)試蛋白是在第一和第二生物樣品之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
55.權(quán)利要求54中的方法，其中第一和第二生物樣品來源于正常源和病理源。
56.一種探測(cè)分析物的方法，該方法包括將親和捕獲探針嚙合在權(quán)利要求1分析設(shè)備的親和捕獲探針界面中，該親和捕獲探針具有結(jié)合其上的分析物；用該激光源從該探針解吸和電離該分析物或其碎片；且然后通過在該解吸離子上的串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)量探測(cè)該分析物。
57.權(quán)利要求56中的方法，還包括在該解吸和電離步驟之后及該探測(cè)步驟之前，執(zhí)行該解吸離子的碰撞誘導(dǎo)解離的步驟。
58.權(quán)利要求57中的方法，還包括，在解吸和電離步驟之后及執(zhí)行該解吸離子的碰撞誘導(dǎo)解離步驟之前，選擇將要碰撞解離的離子的一個(gè)子集的步驟。
59.權(quán)利要求58中的方法，還包括在該親和捕獲探針界面中嚙合該親和捕獲探針之前，將該分析物吸附到該探針上的步驟。
60.權(quán)利要求59中的方法，還包括在該將該分析物吸附到該探針上之后及將該探針嚙合到該探針界面內(nèi)之前，用能量吸附分子使該探針與該分析物粘著接觸的步驟。
61.一種親和捕獲探針界面，用于嚙合親和捕獲探針和將該探針定位成與激光源有查詢關(guān)系并同時(shí)與串聯(lián)質(zhì)譜儀聯(lián)絡(luò)，包括親和捕獲探針固定器；親和捕獲探針導(dǎo)入口；親和捕獲探針位置調(diào)節(jié)器及組件；真空和氣動(dòng)組件；和界面離子收集系統(tǒng)，其中該親和捕獲探針固定器可通過該導(dǎo)入口嚙合，其中該探針固定器，當(dāng)嚙合在該口中時(shí)，被放置成與該親和調(diào)節(jié)器和組件相接觸，其中該真空和氣動(dòng)組件當(dāng)與該口嚙合時(shí)能夠降低該探針周圍的壓力，并且其中該調(diào)節(jié)器能夠通過該離子收集系統(tǒng)定位該探針固定器以用于離子收集。
62.權(quán)利要求22中的分析設(shè)備，其中該離子收集系統(tǒng)包括靜電離子收集組件、氣動(dòng)離子收集組件和從包含靜電離子引導(dǎo)裝置和RF離子引導(dǎo)裝置的組中選擇的離子引導(dǎo)裝置。
63.權(quán)利要求24中的分析設(shè)備，其中該導(dǎo)入口抽空系統(tǒng)包括真空泵、壓力傳感器、真空兼容管道及連接配件和真空兼容閥。
全文摘要
本發(fā)明提供了分析裝置，其包括親和捕獲探針界面、激光解吸電離源和串聯(lián)質(zhì)譜儀。也提出了一種用于蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)及識(shí)別和利用本發(fā)明的裝置表征分子相互作用的新方法。
文檔編號(hào)H01J49/40GK1502116SQ00819959
公開日2004年6月2日 申請(qǐng)日期2000年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月11日
發(fā)明者史高特·溫伯格, 沃納·安斯, 亞歷山大·拉博達(dá), 維克托·斯派塞, 雷蒙德·G·布賴恩, 肯·史旦丁, 比德·托納托, G 布賴恩, 斯派塞, 史高特 溫伯格, 大 拉博達(dá), 安斯, 托納托, 旦丁 申請(qǐng)人:賽弗根生物系統(tǒng)股份有限公司