專利名稱：Maldi基質(zhì)和maldi方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氣溶膠MALDI質(zhì)譜方法，特定化合物作為氣溶膠MALDI基質(zhì)材料 的應(yīng)用，以及MALDI基質(zhì)組合物在氣相涂覆法中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
作為質(zhì)譜(MS)中的一種軟電離技術(shù)，基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)的引入徹 底改變了大量大分子量化合物的分析，這樣的化合物包括在生物化學(xué)領(lǐng)域中很重要的聚合 物。MALDI是一種使得能夠由大的、非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性化合物產(chǎn)生完整的氣相離子的方 法，該化合物例如是蛋白質(zhì)、肽、寡核苷酸、低聚糖、和合成聚合物，它們的分子量通常在400 至350000Da之間。根據(jù)MALDI MS方法，使用基質(zhì)來保護(hù)不穩(wěn)定的分析物分子免于被激光 束直接破壞。MALDI MS的軟電離技術(shù)通常能夠用來分析生物分子。例如，MALDI MS被用于分析 和分類微生物(的部分)。MALDI MS分析包含兩個步驟。第一步涉及通過將分析物與摩爾過量的基質(zhì)材料混 合以制備樣品。MALDI方法的第二步涉及固體樣品塊狀部分通過強烈的激光短脈沖而發(fā)生 解吸。該基質(zhì)被認(rèn)為起到了三個作用使分析物彼此分離，從激光吸收能量以解吸分析物， 以及促進(jìn)電離。激光引起小部分的基質(zhì)和分析物樣品發(fā)生電離。所得到的氣相離子的分子 質(zhì)量通常是通過在電場中加速經(jīng)電離的分子以及基于它們的質(zhì)量在飛行時間(T0F)檢測 器中分離分子來確定。MALDI-T0F是一種非常靈敏的方法，其能夠用于檢測非常少量的組 分。所采用的基質(zhì)材料通常是小的有機酸。常用的基質(zhì)材料包括3，5- 二甲氧基-4-羥 基肉桂酸(芥子酸)、a-氰基-4-羥基肉桂酸(a-氰基或a-基質(zhì))和2，5_ 二羥基苯甲 酸(DHB)。通常，將該基質(zhì)材料溶解于高純水與另一種有機化合物(通常為乙腈(CAN))的 混合物中。通常還加入一些酸，例如三氟乙酸(TFA)，因為酸能夠抑制鹽雜質(zhì)對分析物的質(zhì) 譜的干擾影響。此外，減小基質(zhì)溶液的PH通常會導(dǎo)致樣品的質(zhì)量提高，例如信號的數(shù)量增 加或信號強度增加。接著，將基質(zhì)溶液與待研究的分析物混合。有機化合物(例如ACN)能夠使樣品中 的疏水性蛋白質(zhì)溶解，而水能夠使親水性蛋白質(zhì)溶解。在傳統(tǒng)的MALDI方法中，將該溶液點 樣到MALDI板上(通常是為此目的設(shè)計的金屬板)。蒸發(fā)溶劑，只留下重結(jié)晶的基質(zhì)，該重 結(jié)晶的基質(zhì)具有遍及基質(zhì)晶體的分析物蛋白?！愣裕跉馊苣zMALDI質(zhì)譜中，發(fā)展應(yīng)遵循樣品處理的以下兩條線路，即在霧 化之前將基質(zhì)與分析物預(yù)混合或?qū)崟r、飛行涂覆氣溶膠顆粒。飛行基質(zhì)涂覆使得能夠?qū)嵤?大氣生物氣溶膠的在線氣溶膠MALDI質(zhì)譜。在實時氣溶膠單個顆粒MALDI的情況下，需要在氣相中用基質(zhì)材料涂覆該氣溶 膠。因此，該基質(zhì)材料應(yīng)該具有足夠的揮發(fā)性。此外，應(yīng)該使足夠量的基質(zhì)材料沉積在氣溶 膠上。在現(xiàn)有技術(shù)中，人們已經(jīng)進(jìn)行了一些嘗試來對氣溶膠實施MALDI分析，尤其是對生物氣溶膠。例如，W0-A-02/052246描述了一種針對氣溶膠的MALDI MS方法，其中氣溶膠通過 蒸發(fā)/凝結(jié)或升華/凝結(jié)而含有MALDI基質(zhì)。根據(jù)這篇文獻(xiàn)，涂覆有MALDI基質(zhì)的干燥氣 溶膠能夠被脈沖激光電離。隨后，能夠用TOF MS來分析該經(jīng)電離的組分。為了分析生物氣溶膠中所包含的微生物，應(yīng)該分析表征細(xì)菌種，或甚至是細(xì)菌菌 株，或甚至是特定發(fā)育形式的蛋白質(zhì)。然而，大多數(shù)這些特征蛋白質(zhì)(例如分子質(zhì)量范圍為 l-20kDa的核糖體蛋白)由細(xì)胞膜保護(hù)，并因此不容易進(jìn)行電離。因此，經(jīng)常需要對生物氣 溶膠進(jìn)行在線處理，以使得使蛋白質(zhì)可進(jìn)行電離，例如通過在電離之前部分降解細(xì)胞膜。通 常，對于傳統(tǒng)的MALDI，這樣的處理包含將酸和MALDI基質(zhì)溶解于水和乙腈中，接著加入微 生物分析物并隨后干燥混合物。酸可部分降解細(xì)胞膜，從而使得特征蛋白質(zhì)可進(jìn)行電離。這 種方法中的重要參數(shù)是基質(zhì)和酸與分析物的比率以及干燥后基質(zhì)的晶體形式。已經(jīng)證明以上的方法很難適用于實時取樣和分析，因為分析物的制備需要多個 步驟并花費大量時間。而且，發(fā)明人注意到，基質(zhì)蒸發(fā)必需使用的酸性條件以及高溫(> 80°C)對氣相中的蛋白質(zhì)顆粒的MS檢測反應(yīng)有負(fù)面影響。另外，在酸的存在下或在酸性水 溶液的條件下，基質(zhì)材料的降解更快。傳統(tǒng)的MALDI質(zhì)譜裝置具有較高的性能并因此適合用于例如在菌株水平上鑒別 細(xì)菌。然而，在線氣溶膠MALDI MS的性能還不能令人滿意，尤其是分子質(zhì)量范圍為l_20kDa 的蛋白質(zhì)的在線生物氣溶膠MALDI MS的性能不能令人滿意。用適合的MALDI基質(zhì)材料對生物氣溶膠，例如包含微生物和/或蛋白質(zhì)的氣溶膠 實施涂覆使得能夠在線表征包括生物材料的生物氣溶膠。例如W0-A-02/052246中描述的， 能夠通過將基質(zhì)材料從氣相凝結(jié)在氣溶膠上從而用基質(zhì)材料涂覆氣溶膠。然而，該方法不 適合用于大多數(shù)可獲得的基質(zhì)材料，因為它們的揮發(fā)性不夠和/或在大氣壓力下的熱穩(wěn)定 性不夠。此外，一些已知的揮發(fā)性基質(zhì)材料，例如3-硝基芐基醇和吡啶甲酸(picolinic acid)獲得的信號質(zhì)量不能令人滿意。對于適合的MALDI基質(zhì)材料有強烈需要。另外，對于 在氣相中，優(yōu)選在大氣壓下提供具有適合的MALDI基質(zhì)材料涂層的氣溶膠的改進(jìn)方法也有 強烈的需要。而且，向含有氣相微生物的氣溶膠提供足夠量的基質(zhì)材料以產(chǎn)生對特征蛋白 質(zhì)，尤其是那些分子質(zhì)量范圍為l_20kDa的蛋白質(zhì)的高度反應(yīng)，仍然存在挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是滿足對于用于實時/直接的(即不需要事先收集生物氣溶 膠)的氣溶膠MALDI質(zhì)譜(具有令人滿意的信號質(zhì)量)的基質(zhì)材料和制備技術(shù)的需要。本發(fā)明的另一個目的是克服對氣溶膠，尤其是生物氣溶膠實施MALDI質(zhì)譜時遇到 的問題。更具體地，本發(fā)明設(shè)法提供一種用基質(zhì)材料層涂覆MALDI分析物氣溶膠表面的適 合方法。第一方面，本發(fā)明涉及一種用于MALDI MS的基質(zhì)材料，包含化學(xué)式(I)的2_巰 基_4，5- 二烷基雜環(huán)芳烴，或它們的互變異構(gòu)形式，
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其中，X選自S、0或N，并且其中R1和R2獨立地選自氫、甲基、甲氧基、乙氧基、和 丙氧基，或其中R1和R2 —起形成可選地包含一個或多個雜原子的可選取代的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，化學(xué)式(I)的2-巰基-4，5-二烷基雜環(huán)芳烴是非常適合用于氣溶膠 MALDI MS的基質(zhì)材料。2-巰基-4，5-二烷基雜環(huán)芳烴基質(zhì)材料提供了優(yōu)異的信號質(zhì)量。因 此，實施MALDI分析所需要的分析物的量顯著減少。此外，本發(fā)明的基質(zhì)材料的揮發(fā)性明顯 優(yōu)于大多數(shù)傳統(tǒng)的基質(zhì)材料，并因此更加適合用于氣溶膠MALDIMS。R1和R2可以選自氫、甲基、甲氧基、乙氧基、和丙氧基。這些小的側(cè)基確保了基質(zhì) 材料具有所需的揮發(fā)性。烷氧基能夠增強基質(zhì)材料的揮發(fā)性。R1和R2也可以一起形成可 選地包含一個或多個雜原子的一個或多個可選取代的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)(包括稠環(huán))。該一個或 多個芳香環(huán)結(jié)構(gòu)能夠例如包含一個芳香5元、6元、或7元芳環(huán)。優(yōu)選地，R1和R2是相同的，并且更優(yōu)選R1和R2都是甲基。優(yōu)選X為S。用其中R1和R2都是甲基的2-巰基-4，5_ 二烷基噻唑已經(jīng)取得了非常好的結(jié)果?；瘜W(xué)式(I)的2-巰基-4，5-二烷基雜環(huán)芳烴的兩種不同互變異構(gòu)形式是質(zhì)子結(jié)
合于巰基硫原子的形式和質(zhì)子結(jié)合于芳香氮原子的形式。這兩種互變異構(gòu)形式如下所示。 對于實時氣溶膠MALDI MS，應(yīng)該將基質(zhì)材料引入到氣相中以使基質(zhì)材料沉積在 氣溶膠上。優(yōu)選地，在大氣壓下將該基質(zhì)材料沉積在分析物上。盡管能夠?qū)⒒瘜W(xué)式(I)的 2_巰基-4，5-二烷基雜環(huán)芳烴引入到氣相中，但發(fā)明人意識到，由于通過所施加的蒸發(fā)熱 使材料發(fā)生降解，能夠蒸發(fā)的基質(zhì)材料的量是有限的。通常，基質(zhì)材料在約90°C或更高的溫 度下開始發(fā)生降解。對降解的材料進(jìn)行分析表明，化學(xué)式(I)的2-巰基-4，5-二烷基雜環(huán)芳烴的分解 產(chǎn)物包含原來的2-巰基-4，5- 二烷基雜環(huán)芳烴的結(jié)合物(conjugate)，其中兩種分子經(jīng)由 巰基相結(jié)合。一些結(jié)合物通過-c-s-c-鍵相結(jié)合，而其他的結(jié)合物則通過-c-s-s-c-鍵相 不希望受到理論的束縛，發(fā)明人認(rèn)為具有-C-S-C-鍵的結(jié)合物是通過在釋放H2S 的情況下，兩種不同的2-巰基_4，5-二烷基雜環(huán)芳烴分子的巰基的分子間反應(yīng)而形成的。 此外，發(fā)明人認(rèn)為，具有-c-s-s-c-鍵的結(jié)合物是通過在釋放兩個質(zhì)子和兩個電子的情況 下，兩種不同的2-巰基-4，5- 二烷基雜環(huán)芳烴分子的巰基的氧化反應(yīng)而形成的。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可以通過向基質(zhì)溶液中加入醇來至少部分地保護(hù)2-巰基-4，5- 二烷 基雜環(huán)芳烴的巰基。如下所示醇能夠與互變異構(gòu)形式(其中質(zhì)子與芳香氮原子相結(jié)合)的 巰基硫原子的自由電子對形成氫鍵。
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因此，質(zhì)子與芳香氮原子相結(jié)合的互變異構(gòu)形式是優(yōu)選的，并且2-巰基-4，5- 二 烷基雜環(huán)芳烴主要以這種互變異構(gòu)形式存在。另外，2-巰基-4，5- 二烷基雜環(huán)芳烴分子和 醇分子之間的氫鍵的形成能夠增加基質(zhì)材料的可揮發(fā)性。因此，本發(fā)明的另一方面涉及用于實時氣溶膠MALDI MS的基質(zhì)組合物，該基質(zhì)組 合物包含化學(xué)式(I)的2-巰基-4，5-二烷基雜環(huán)芳烴或其互變異構(gòu)形式，以及醇。這種基 質(zhì)組合物對于氣溶膠MALDI MS是尤其有利的，因為能夠容易地將其引入到氣相中，從而將 該基質(zhì)材料沉積在氣溶膠上。優(yōu)選地，醇的分子量相對較低。適合的醇例如是甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、 仲丁醇、異丁醇、和叔丁醇。也可以使用具有多于一個羥基的醇，例如乙二醇、丙烷-1，2_ 二 醇、丙烷-1，3- 二醇、丙三醇、丁烷-1，2- 二醇、丁烷-1，3- 二醇、丁烷-2，3- 二醇、丁烷-1， 2，3-三醇和丁烷-1,2,4-三醇。盡管一般來說多羥基醇(例如二醇和三醇)的揮發(fā)性小于單羥基醇，但它們具有 的優(yōu)勢在于它們具有額外的羥基能夠用于形成氫橋。此外，醇(尤其是乙醇)能夠以足夠的程度降解細(xì)胞膜以使感興趣的蛋白質(zhì)可進(jìn) 行電離。因此，醇的存在同時還起到了用于將特征蛋白質(zhì)從微生物中釋放出來的釋放劑 (release agent)的作用。存在醇的一個重要優(yōu)點是2-巰基-4，5- 二烷基雜環(huán)芳烴基質(zhì)材料不能快速地或 至少快速程度較低地通過所施加的蒸發(fā)/升華熱而發(fā)生降解。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與醇組合時，與 存在低濃度的醇或不含醇的情況下僅保持幾分鐘或幾小時相比，本發(fā)明的基質(zhì)材料甚至在 例如150°C的加熱溫度下也能在明顯增加的時間段內(nèi)保持其活性，例如至少10個月，優(yōu)選 至少12個月。高溫的使用，例如溫度高于100°C，優(yōu)選高于120°C，更優(yōu)選高于150°C也有助于從 微生物釋放特征蛋白，參見例如 Horneffer etal. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004，15(10)， 1444-1454。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，采用鹵代醇是有利的。優(yōu)選的鹵素是氯、甚至更優(yōu)選氟。原則上， 醇中單鹵素取代就已經(jīng)能夠產(chǎn)生有利的效果。在一種優(yōu)選的實施方式中，至少a-碳原子被一個或多個鹵原子取代。這樣的鹵 代醇的適合的實例是三氟乙醇、五氟丙醇、和六氟異丙醇。甚至更優(yōu)選的實施方式是醇被完 全鹵化，即，所有與碳相結(jié)合的氫原子都被鹵原子取代。完全鹵化的醇的實例是三氯甲醇、 三氟甲醇、全氯乙醇、全氟甲醇、全氯丙醇、全氟丙醇、全氯丁醇、和全氟丁醇。鹵素取代基的高吸電子能力使醇分子的羥基負(fù)電性增加。這導(dǎo)致在醇和本發(fā)明的 2_巰基_4，5-二烷基噻唑之間形成較強的氫鍵。因此，質(zhì)子結(jié)合于芳香氮原子的本發(fā)明的 基質(zhì)材料的有利的互變異構(gòu)形式甚至更為優(yōu)選。因此，實時氣溶膠MALDI MS分析的性能得 到了進(jìn)一步改善。
優(yōu)選在15-100°C的溫度范圍內(nèi)根據(jù)醇的類型在可實現(xiàn)飽和蒸氣壓的濃度下應(yīng)用 該醇。然而，也可以使用部分飽和的醇蒸氣。因此，本發(fā)明涉及一種用于分析分析物的實時氣溶膠MALDIMS方法，該方法包括-使氣溶膠分析物與如上文所述的基質(zhì)材料接觸；-電離至少部分的所述分析物；以及-利用MS檢測器(例如飛行時間檢測器)分離經(jīng)電離的組分。在分析物與基質(zhì)材料接觸期間，該基質(zhì)材料能夠沉積在氣溶膠上并形成基質(zhì)涂層。優(yōu)選使分析物與基質(zhì)材料在氣相中接觸。因為在醇的存在下會使能夠升華的本發(fā) 明的基質(zhì)材料的量增加，并且因為醇能夠使基質(zhì)材料的揮發(fā)性增加，因此優(yōu)選在具有醇的 組合物中使用化學(xué)式I的基質(zhì)化合物。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)該方法，氣溶膠分析物具有均勻的、同質(zhì)的基質(zhì)材料層。這是有 利的，因為分析物表面的非同質(zhì)性會對MALDI分析產(chǎn)生不利影響。因此，該方法顯著改善了 氣溶膠上的MALDI譜的信號質(zhì)量。因為需要對特征蛋白質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)分析，這種改進(jìn)對于生 物氣溶膠而言是尤其有利的。至少部分飽和的大氣可以有利地如上文所述用一種或多種醇 至少部分飽和。優(yōu)選地，將作為小液滴的含有乙醇溶液的基質(zhì)引入到裝置的加熱區(qū)中。這 樣做的優(yōu)點是在質(zhì)譜儀中僅有單個液流并且能夠更加精確地控制基質(zhì)的濃度。在線氣溶膠采樣過程中，應(yīng)該優(yōu)選保持蒸氣壓較高，這能夠通過額外蒸發(fā)如醇或 水之類的液體來達(dá)到。在一些情況下，優(yōu)選向經(jīng)涂覆的氣溶膠流中加入揮發(fā)性酸。優(yōu)選使用揮發(fā)性有機 酸(其在室溫至100°c的溫度范圍內(nèi)是揮發(fā)性的)，并且最優(yōu)選三氟乙酸(TFA)。分析物，優(yōu)選分析物中的至少一個顆粒，可包含微生物(包括細(xì)菌、真菌、藻類、原 生動物和病毒)和/或蛋白質(zhì)(包括毒素)或任何其他生物材料，例如淋巴細(xì)胞或細(xì)胞組
幺口優(yōu)選地，通過透射電子顯微鏡測量的該至少一種氣溶膠的平均粒徑為至少 0. lum0優(yōu)選通過透射電子顯微鏡測量的平均粒徑為至多20 ym。因此，該至少一種氣溶膠 顆粒的平均粒徑范圍為0. 3-20 u m,優(yōu)選的范圍為0. 5-15 u m。在一種優(yōu)選的實施方式中，在本發(fā)明的方法之前對該分析物進(jìn)行選擇。一種適合 的選擇方法是，例如W0-A-2002/052246中描述的方法，其結(jié)合于本文作為參考。根據(jù)這種 方法，基于存在特定物質(zhì)如氨基酸當(dāng)其經(jīng)受適當(dāng)波長照射時會誘發(fā)特征熒光的特性，來選 擇生物氣溶膠顆粒。一般而言，無機物質(zhì)和大多數(shù)有機物質(zhì)都不會顯示出這樣的特征。因 此，能夠借助于影響生物氣溶膠顆粒中特定物質(zhì)的熒光的激發(fā)激光來選擇生物氣溶膠顆 粒，之后用檢測器選擇熒光生物氣溶膠顆粒并觸發(fā)第二激光以電離所選擇的生物氣溶膠顆 粒。優(yōu)選地，選擇包含尺寸的選擇。包含細(xì)菌和病毒的氣溶膠顆粒的尺寸通常小于 20umo因為氣溶膠顆粒以給定的速度進(jìn)入質(zhì)譜儀的中央空間中，因此連續(xù)氣溶膠顆粒的尺 寸能夠由氣溶膠顆粒經(jīng)過已知距離的持續(xù)時間來確定。通過將激發(fā)激光束引向彼此距離已 知的兩個連續(xù)的點，能夠由氣溶膠顆粒散射和檢測的光來確定上述持續(xù)時間并由此確定氣 溶膠顆粒的尺寸。這使得能夠在具體的尺寸窗中選擇性地電離生物材料。因此，能夠從不同材料的混合物中確定特定尺寸的生物材料(例如細(xì)菌)。本發(fā)明能夠?qū)ξ⑸?包括細(xì)菌、真菌、藻類、原生動物和病毒)和/或蛋白質(zhì)(包 括毒素)或其他任何生物材料(例如淋巴細(xì)胞或細(xì)胞組織)進(jìn)行分類。能夠根據(jù)它們的光 譜特性來對它們進(jìn)行分類。這樣的分類特異性非常高，并且甚至能夠區(qū)分處于不同發(fā)育期 的微生物。用于對生物材料進(jìn)行分類的方法包含獲得不同的生物材料(例如不同的細(xì)菌、 不同的細(xì)胞、不同的病毒等)的MALDI MS譜，將所獲得的MALDI MS譜與MALDI MS譜文庫 進(jìn)行比較；并基于所述的比較結(jié)果對所述生物材料進(jìn)行分類。已經(jīng)示出了能夠僅基于對一 種顆粒實施的一次測量就能夠進(jìn)行可靠的分類。這在應(yīng)用上述方法分析含有低濃度生物顆 粒的空氣樣品時是尤其有用的。此外，本發(fā)明還能夠監(jiān)控空氣或液體(例如水)的質(zhì)量，尤其是對于顆粒物質(zhì)和微 生物。本發(fā)明的另一方面涉及化學(xué)式(I)的2-巰基-4，5-二烷基雜環(huán)芳烴作為用于氣 溶膠MALDI MS的基質(zhì)材料的應(yīng)用。本發(fā)明的再一方面涉及本文中所限定的基質(zhì)組合物在用于MALDI MS的氣相基質(zhì) 涂覆方法中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明涉及用于分析分析物的MALDI MS方法，該方法包括-使分析物與2-巰基-4，5-二甲基噻唑基質(zhì)材料接觸；-電離至少部分的所述分析物；以及-利用MS檢測器分離經(jīng)電離的組分。盡管通常已知2-巰基-4，5- 二烷基雜環(huán)芳烴和類似的化合物作為用于MALDI MS 的基質(zhì)材料(例如在 Naxing，X. et al.，1997，J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8 :116-124 禾口 Domin，M. A. et al.，1999, RapidComm. Mass Spectrom. 13 :222_226 中描述的 2-巰基苯并噻 唑及其類似物；以及在Raju，N. P. et al. ,2001, Rapid Comm. Mass Spectrom. 15 1879-1884 中描述的5-乙基-2-巰基噻唑)，但是并沒有披露本文中的特定化合物2-巰基-4，5- 二甲 基噻唑。而且，本領(lǐng)域中已知，基質(zhì)分子的很小改變都會對作為MALDI MS中的基質(zhì)的化合 物的適用范圍產(chǎn)生很大的影響?；旧喜荒茴A(yù)知某一種化合物是否能夠用作基質(zhì)分子以及 能夠用于何種具體應(yīng)用?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如本發(fā)明的實施例中所示，2-巰基-4，5- 二甲基噻 唑是一種非常適合用于檢測諸如微生物中包含的蛋白質(zhì)和碳水化合物之類的生物大分子 的基質(zhì)分子。甚至能夠基于這種特定的基質(zhì)化合物的譜參數(shù)用來對微生物進(jìn)行分類。


圖1 實驗裝置。參見實施例1進(jìn)行說明。圖2 于生理鹽水溶液中過夜保存的蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)細(xì)胞的 實時氣溶膠MALDI T0F MS譜的每日重復(fù)性。圖3 蘇云金芽孢桿菌的芽孢(A)和細(xì)胞⑶的飛行氣溶膠MALDI T0F MS譜。圖4 (A)球芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌，B. globigii)、⑶仙人掌桿菌 (B. cereus)和(C)蘇云金芽孢桿菌芽孢的實時氣溶膠MALDI T0F MS譜。圖5 兩個仙人掌桿菌菌株的飛行氣溶膠MALDI T0F MS譜。圖6 在一種培養(yǎng)基中的個體蘇云金芽孢桿菌營養(yǎng)型細(xì)胞/簇集顆粒(clusteredparticles)的不同指紋(fingerprint)的實施例。圖7 利用標(biāo)準(zhǔn)化的基質(zhì)條件在瓊脂平板上培養(yǎng)的蘇云金芽孢桿菌營養(yǎng)型細(xì)胞的 實時(實時)氣溶膠MALDI與普通(靜態(tài))MALDI相比較的實施例。圖8 利用標(biāo)準(zhǔn)化的基質(zhì)條件在瓊脂平板上培養(yǎng)的草生歐文氏桿菌 (E. herbicola)和大腸桿菌(E. coli)的實時氣溶膠MALDI T0FMS譜。圖9 (A)具有6000_12000Da的特征寬譜帶的AcNPV病毒、以及(B)在 1242-1257-1279Da以及6460和8675Da具有特征信號簇的CpGV病毒的實時氣溶膠MALDI TOF MS 譜；(B-a)和(B_b)放大圖。圖10 水中的霍亂毒素對照(總計600個發(fā)射(或散彈，shots) /顆粒)和含有 選自運河水(canal water)600個發(fā)射/顆粒的發(fā)射的總計12個霍亂毒素的實時氣溶膠 MALDI TOF MS 譜。圖11 J558B淋巴細(xì)胞和Jurkat T淋巴細(xì)胞系的實時氣溶膠MALDI TOF MS譜。
具體實施例方式現(xiàn)在將參照以下的非限制性實施例進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。實施例1-重復(fù)件圖1中示出了用于分析含蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的氣溶膠的 實驗裝置。氣相中的氣溶膠顆粒在進(jìn)入室(1)中進(jìn)入MALDI裝置并且被引至可選地包含液 體(例如醇)的加熱的管(2)并隨后通過包含基質(zhì)材料的管(3)。該管的第一部分被加熱， 而第二部分沒有加熱，以使得基質(zhì)材料在第二部分中沉積并且在氣溶膠上形成涂層。經(jīng)涂 覆的氣溶膠通過干燥器(4)和氣溶膠束發(fā)生器(5)，之后該經(jīng)涂覆的氣溶膠進(jìn)入放射源室 (6)，在那里通過散射光和UV光(7)對它們進(jìn)行檢測。然后通過電離激光⑶對氣溶膠中 所關(guān)注的蛋白質(zhì)實施電離。在T0F管(9)中基于所得到的離子的質(zhì)量對它們進(jìn)行分離，然 后在檢測器(10)上進(jìn)行檢測。用個人計算機(11)來進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和處理。借助于一系列的泵將系統(tǒng)中的壓力從進(jìn)入室(1)、管⑵和管(3)中的約 lOOkPa(大氣壓)減小至放射源室(6)和T0F管(9)中的10_5kPa。通過系統(tǒng)的流量范圍是 600-1000ml/min。記錄下利用2-巰基-4，5- 二甲基噻唑作為基質(zhì)材料的含蘇云金芽孢桿菌氣溶膠 的實時MALDI氣溶膠T0F譜。圖2中示出了包括實時樣品制備的在線氣溶膠MALDI T0FMS儀器的重復(fù)性。圖2 中相似的特征峰模式(即MALDI指紋)示出了一致的每日重復(fù)性。通過用蘇云金芽孢桿菌和仙人掌桿菌營養(yǎng)型細(xì)胞和芽孢進(jìn)行的幾次相同的實驗 再現(xiàn)了圖2示出的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)，這表明系統(tǒng)的重復(fù)性和穩(wěn)定性是令人滿意的。實施例2 區(qū)分潛力以與實施例1中描述的類似的方式，但利用幾種桿菌屬物種，例如仙人掌桿菌(兩 個菌株)、蘇云金芽孢桿菌、和球芽孢桿菌獲得的結(jié)果示出了本發(fā)明的區(qū)分潛力。根據(jù)它們 的16SrRNA序列，暗示了可以認(rèn)為仙人掌桿菌和蘇云金芽孢桿菌為密切相關(guān)的物種。基于 16S rDNA核苷酸序列中的堿基對替換和相似性，所測試的細(xì)菌菌株仙人掌桿菌ATCC 14579 中的一個與蘇云金芽孢桿菌具有99. 6%的相似性。用實施例1中描述的基質(zhì)材料實時涂覆來自以上的桿菌屬物種的營養(yǎng)型細(xì)胞和芽孢的氣溶膠，并利用氣溶膠MALDITOF MS進(jìn)行實 時分析。營養(yǎng)型細(xì)胞與芽孢的比較測量了蘇云金芽孢桿菌相同物種的第一芽孢和營養(yǎng)型細(xì)胞。如圖3中所示，獲得 的蘇云金芽孢桿菌的芽孢(A)和營養(yǎng)型細(xì)胞(B)之間不同的MALDI指紋，示出了二者之間 的明顯區(qū)別。密切相關(guān)的物種(closely related species)接著，關(guān)于密切相關(guān)的物種的結(jié)果說明了氣溶膠MALDI T0FMS的區(qū)分潛力，密切相 關(guān)的物種獲自相同生長條件下培養(yǎng)以避免生長依賴性差異的蘇云金芽孢桿菌、仙人掌桿菌 和球芽孢桿菌的芽孢。如在圖4中觀察到的，球芽孢桿菌(A)、仙人掌桿菌(B)、和蘇云金芽 孢桿菌(C)物種示出了能夠用于容易地區(qū)分它們的特征性非常強的譜。在圖5中，在相同生長條件下培養(yǎng)以避免生長依賴性差異的兩個仙人掌桿菌菌株 的結(jié)果示出了區(qū)分潛力。也能夠根據(jù)兩個譜中不同的MALDI形廓將兩個仙人掌桿菌菌株的 芽孢彼此區(qū)分開。結(jié)果表明，通過使用結(jié)合氣溶膠MALDI MS的本發(fā)明，甚至是在菌株水平 上也能夠?qū)⒚芮邢嚓P(guān)的微生物例如蘇云金芽孢桿菌、球芽孢桿菌(B. globigii)、仙人掌桿 菌(包括兩個菌株)彼此區(qū)分開。在一種細(xì)菌培養(yǎng)物內(nèi)在單個顆粒水平上分離通過基于空氣動力學(xué)直徑、熒光或質(zhì)譜指紋來使細(xì)胞或顆粒簇集(clustering)， 在單個細(xì)胞或顆粒水平上的分離是可能的。利用本發(fā)明，在單個發(fā)射(shots)中可獲得足夠的質(zhì)譜信息以用于指紋簇集 (fingerprint clustering)。單個發(fā)射可以是單個細(xì)胞、芽孢、簇集的細(xì)胞、芽孢、蛋白質(zhì)、 肽、生長培養(yǎng)基或其他背景顆粒。圖6示出了蘇云金芽孢桿菌的質(zhì)譜指紋上簇集的6個發(fā)射/顆粒的數(shù)據(jù)。實施例3-氣溶膠MALDI TOF MS與普通MALDI TOF MS的比較對于氣溶膠MALDI TOF MS而言，普通MALDI TOF MS的支持(support)對于建立 微生物數(shù)據(jù)庫是很重要的。盡管兩種技術(shù)之間存在明顯差異_即未知基質(zhì)形態(tài)和飛行中電 離-然而如果在普通MALDI TOF MS和氣溶膠MALDI TOF MS中都使用本發(fā)明的基質(zhì)配方， 則獲得相似的譜。圖7示出了利用兩種技術(shù)記錄的在瓊脂平板上培養(yǎng)一周的蘇云金芽孢桿 菌營養(yǎng)型細(xì)胞獲得的譜的一個實施例。在兩個譜中的4710、4816、7242、7385和8259Da處發(fā)現(xiàn)了相同的峰簇 (peak cluster)。普通MALDI和氣溶膠MALDI T0FMS結(jié)果的良好相似性通過革蘭 氏陰性微生物例如斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)亞種(genomovars)、 大腸桿菌(Escherichiacoli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和草生歐文氏桿菌 (Erwiniaherbicola)以及病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV)禾口蘋果蠹蛾顆粒體病毒(Cydia pomonella granulosis virus)以及MS2噬菌體也得到了證實(數(shù)據(jù)未示出)。實施例4-其他微生物種革蘭氏陰性微生物在已列出的革蘭氏陽性桿菌物種之后，革蘭氏陰性微生物，例如固氮斯氏假單胞菌基因組型(11個物種)、大腸桿菌、霍亂弧菌和草生歐文氏桿菌也給出了可區(qū)分的譜，圖8 中示出了將大腸桿菌與草生歐文氏桿菌相比較的實施例。病毒測試了以下的病毒噬菌體MS2和桿狀病毒(baculo viruses)苜蓿銀紋夜蛾核型 多角體病毒(AcNPV)和蘋果蠹蛾顆粒體病毒。噬菌體MS2代表RNA型病毒。桿狀病毒是雙 鏈 DNA(dsDNA)病毒。用氣溶膠MALDI TOF MS和普通MALDI TOF MS獲得了同樣的譜。在MS2的情況 下，檢測13kDa衣殼蛋白的[M+H] + (m/z 13726)和[M+2H]+2 (m/z 6865)離子信號(數(shù)據(jù)未 示出)。特異于其他細(xì)菌種的噬菌體通常具有不同分子量的衣殼蛋白，并由此得到不同的 MALDI信號。桿狀病毒的譜之間的差異是明顯的(參見圖9)。AcNPV病毒(A)的氣溶膠MALDI TOF MS譜含有6000-12000Da的特征寬譜帶，其很可能是大糖蛋白被膜的一部分。CpGV病 毒(B)在1242-1257-1279Da和6460以及8675Da處示出了特征信號簇。實施例5-液體樣品分析在將本發(fā)明直接應(yīng)用于氣溶膠樣品之后，也對液體樣品(例如水、體液和血液)以 50-200 u 1的較小體積進(jìn)行處理。利用Meinhard霧化器將液體霧化，以提供含有濾過空氣 的載氣(運載氣體，carriergas)的氣溶膠。利用本發(fā)明對所產(chǎn)生的氣溶膠進(jìn)行實時涂覆， 并且能夠通過選擇空氣動力學(xué)直徑和/或熒光和/或MALDI TOF MS指紋對單個的顆粒進(jìn) 行分析。運河水(canal water)中的毒素圖10示出了摻至運河水中的霍亂毒素(100g/ml)的結(jié)果。該運河水經(jīng)0. 2 ii m過 濾器過濾以除去微生物顆粒并對60 yl實施霧化并進(jìn)行在線分析?；魜y病毒由1個分子質(zhì)量為24kDa的A亞單元和5個分子質(zhì)量為12kDa的B亞單 元組成。水中對照和摻雜運河水的質(zhì)譜示出了霍亂毒素的B亞單元的特征質(zhì)量。在運河水 的情況下，含有特征霍亂毒素質(zhì)譜的總計12個單個發(fā)射譜(single shot spectrum)足以 表明當(dāng)從運河水的600個發(fā)射/顆粒的背景選擇時存在霍亂毒素。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答(adaptive immuneresponse)的主要 細(xì)胞組分。T細(xì)胞與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫有關(guān)，而B細(xì)胞主要響應(yīng)于體液免疫(涉及抗體)。它 們形成記憶病原體的記憶細(xì)胞，從而能夠在未來發(fā)生感染的情況下更快速地產(chǎn)生抗體。對 Jurkat T淋巴細(xì)胞和J558B淋巴細(xì)胞研究了分析完整B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的潛力。用 16土111^『(1霧化器引入少量約50111。圖11示出了 Jurkat T淋巴細(xì)胞和J558B淋巴細(xì)胞的 氣溶膠 MALDI TOF MS 平均總質(zhì)譜(average summed mass spectra)。 Mrk 以上的實施例示出了由生物來源的材料產(chǎn)生區(qū)別性MS指紋的一般能力。已證明 結(jié)合氣溶膠MALDI TOF MS的本發(fā)明是一種用于容易地將物種區(qū)分至菌株水平的迅速且快 速的工具。 當(dāng)使用本發(fā)明的樣品基質(zhì)條件時，MALDI結(jié)果與普通的MALDI近似相同，這表明 普通MALDI的必要支持對于產(chǎn)生數(shù)據(jù)庫的可用性和這些數(shù)據(jù)庫用于解釋的應(yīng)用。與普通MALDI相比，結(jié)合氣溶膠MALDI TOF MS的本發(fā)明具有明顯優(yōu)勢，即，由于對單個顆粒而非塊 狀材料(批量材料，bulk material)進(jìn)行分析，不會受到天然無機或生物背景的存在的影 響或受其影響較小。
權(quán)利要求
用于分析氣溶膠分析物的MALDI質(zhì)譜方法，包括-使所述氣溶膠分析物與用于MALDI質(zhì)譜的基質(zhì)材料或它們的互變異構(gòu)形式接觸，所述基質(zhì)材料包含化學(xué)式(I)的2-巰基-4，5-二烷基雜環(huán)芳烴其中，X為N、S或O，且其中R1和R2獨立地選自氫、甲基、甲氧基、乙氧基和丙氧基，或其中R1和R2一起形成可選地包含一個或多個雜原子的可選取代的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)；-將至少部分的所述分析物電離；以及-利用質(zhì)譜儀，例如飛行時間質(zhì)譜儀，分離所述經(jīng)電離的組分。FPA00001137535700011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，R1和R2是相同的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，R1和R2是甲基。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，X是S。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述基質(zhì)材料還包含醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述醇選自由甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、 仲丁醇、異丁醇和叔丁醇組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述醇是多羥基醇，例如二醇或三醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項所述的方法，其中，所述醇是鹵化的醇，例如氯化或氟化 的醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一項所述的方法，其中，所述醇的至少一個a-碳原子被至少 一個鹵原子取代。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一項所述的方法，其中，所述醇是完全鹵化的醇。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中，所述接觸在氣相中發(fā)生，其中所述 氣相由醇至少部分飽和。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其中，用透射電子顯微鏡測量的所述至 少一種氣溶膠的平均粒徑為至少0. 1 ii m，優(yōu)選0. 3-20 u m,更優(yōu)選0. 5-15 u m。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，其中，所述分析物包含生物材料，優(yōu)選微 生物和/或蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其中，在使所述分析物與所述基質(zhì)材料 接觸之前對所述分析物的粒徑進(jìn)行選擇。
15.用于對生物材料進(jìn)行分類的方法，包括-利用權(quán)利要求1-14中任一項所述的方法獲得不同生物材料的MALDI質(zhì)譜；-將獲得的所述MALDI MS譜與MALDI MS譜文庫進(jìn)行比較；以及 -基于所述比較結(jié)果對所述生物材料進(jìn)行分類。
16.用于分析分析物的MALDI質(zhì)譜方法，包括-使所述分析物與包含2-巰基-4，5- 二甲基噻唑的基質(zhì)材料接觸；-將至少部分的所述分析物電離；以及-利用飛行時間檢測器分離所述經(jīng)電離的組分。
17.2-巰基-4，5- 二甲基噻唑作為MALDI質(zhì)譜的基質(zhì)材料的應(yīng)用。
18.包含化學(xué)式(I)的2-巰基-4，5-二烷基雜環(huán)芳烴或它們的互變異構(gòu)形式的基質(zhì)組 合物在MALDI質(zhì)譜的氣相基質(zhì)涂覆方法中的應(yīng)用，其中，X為N、S或0，且其中R1和R2獨立地選自氫、甲基、甲氧基、乙氧基、和丙氧基，或 其中R1和R2 —起形成可選地包含一個或多個雜原子的可選取代的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其中，所述基質(zhì)組合物還包含醇，優(yōu)選鹵化的醇。
全文摘要
用于大氣氣溶膠的實時氣溶膠質(zhì)譜的基質(zhì)以及實時氣溶膠MALDI MS方法。本發(fā)明涉及一種用于MALDI質(zhì)譜的基質(zhì)材料；用于MALDI質(zhì)譜，尤其是氣溶膠MALDI質(zhì)譜的基質(zhì)組合物；MALDI質(zhì)譜方法，尤其是氣溶膠MALDI質(zhì)譜方法；特定化合物作為MALDI基質(zhì)材料的應(yīng)用；以及MALDI基質(zhì)組合物在氣相涂覆法中的應(yīng)用。本發(fā)明的基質(zhì)材料包含化學(xué)式(I)的2-巰基-4，5-二烷基噻唑或它們的互變異構(gòu)形式，其中，X選自S、O或N，且其中R1和R2獨立地選自氫、甲基、甲氧基、乙氧基、和丙氧基，或其中R1和R2一起形成可選地包含一個或多個雜原子的可選取代的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)?；|(zhì)組合物優(yōu)選包括基質(zhì)材料和醇。醇可以是鹵化的。MALDI MS方法包含使分析物與基質(zhì)材料或基質(zhì)組合物接觸；將至少部分的分析物電離；以及利用質(zhì)譜儀例如TOF-MS分離經(jīng)電離的組分。優(yōu)選地，在氣相中使生物氣溶膠與基質(zhì)材料接觸。
文檔編號H01J49/04GK101855556SQ200880115972
公開日2010年10月6日 申請日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月13日
發(fā)明者卡拉·伊麗莎白·安娜·瑪麗亞·德根哈特-朗格萊恩, 查爾斯·伊麗莎·金茨, 阿簡·勞倫斯·維吉克胡吉斯 申請人:荷蘭應(yīng)用科學(xué)研究會(Tno)