專利名稱：半滑舌鰨遺傳性別快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域中的魚類遺傳性別鑒定技術(shù)，具體涉及一種半滑舌鰨遺傳 性別快速鑒定方法。適用于在魚類性別控制和單性育種中應(yīng)用的分子生物學(xué)方法。
技術(shù)背景半滑舌鰨(Cynoglossus semiliaevis)是我國特有的一種名貴經(jīng)濟(jì)海水魚類，屬于近海 溫水性底層魚類，我國沿海均有分布，以黃海、渤海為多。半滑舌鰨由于其味道鮮美，肉質(zhì) 細(xì)嫩，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者歡迎，其市場價(jià)值極高，養(yǎng)殖前景非常廣闊。近兩年來， 半滑舌鰨人工育苗技術(shù)獲得突破，年產(chǎn)半滑舌鰨苗種300 500萬尾，研究表明，半滑舌鰨雌 性個(gè)體和雄性個(gè)體，在生長速率上存在巨大差別，其雌性個(gè)體比雄性個(gè)體生長快3 4倍(中 國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，孟田湘等，1988;中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所， 柳學(xué)周等，2006)。由于雄性個(gè)體生長過慢，降低了半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量，增加了養(yǎng)殖成本， 因而嚴(yán)重影響了半滑舌鰨苗種的推廣及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的形成，由于缺乏鑒定半滑舌鰨遺傳性別的 有效手段，缺乏半滑舌鰨人工雌核發(fā)育和性別控制技術(shù)，難以生產(chǎn)半滑舌鰨全雌或高雌性化 率的苗種，嚴(yán)重影響了半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。有關(guān)魚類性別鑒定方法的研究，目前只是在少數(shù)幾種魚類上進(jìn)行過。加拿大西溫哥華實(shí) 驗(yàn)室的Devlin (1994)找到了大鱗大馬哈魚Y染色體特異的DNA片段；英國的Griffiths等(2000)在三椎棘魚(Gasterosteus aculeatus L.)中找到了兩個(gè)雄性特異的AFLP標(biāo)記， 但是，當(dāng)應(yīng)用于另外兩種棘魚時(shí)，卻不能正確的鑒定其性別。英國的Ezaz等(2004)用AFLP 技術(shù)掃描尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus L.)基因組，找到3個(gè)Y染色體連鎖和一個(gè) X染色體連鎖的AFLP標(biāo)記，然而這些標(biāo)記卻不能鑒別沒有親緣關(guān)系的個(gè)體的性別，表明這些 標(biāo)記和性別決定位點(diǎn)之間發(fā)生了重組。日本的Watanabe等(2005)利用AFLP技術(shù)，應(yīng)用EcoRI 和MseI限制性內(nèi)切酶消化孔雀魚(Poecilia reticulata)的基因組DNA，篩逸了 32組引物 組合，最后找到5個(gè)與性別決定位點(diǎn)相連鎖的標(biāo)記。后來他們又采了 48個(gè)樣品對這幾個(gè)標(biāo)記 進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)性別表型和基因型之間并非完全一致，其中A2-218標(biāo)記在性別表型和基因型 之間的一致性達(dá)到90%,是與性別聯(lián)系比較緊密的1個(gè)標(biāo)記。由于半滑舌鰨雌性個(gè)體生長比雄性個(gè)體快3 4倍，培育全雌半滑舌鰨苗種對于半滑舌鰨 養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展非常重要，因此有關(guān)半滑舌鰨性別特異分子標(biāo)記篩選等方面的研究也引起人 們高度重視。黃海水產(chǎn)研究所周麗青等(2005)觀察到半滑舌鰨雌性個(gè)體存在W性染色體； Chen et al. (2007)首次發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記。但有關(guān)魚類遺傳性別快速鑒定 方法，特別是采用LAMP原理進(jìn)行的魚類遺傳性別快速鑒定方法，目前國內(nèi)外均未見報(bào)道。由于半滑舌鰨苗種生產(chǎn)量大，需要進(jìn)行遺傳性別鑒定的數(shù)量多，因而建立一種能在育苗 場現(xiàn)場使用的半滑舌鰨遺傳性別快速鑒定方法，能在2 3小時(shí)內(nèi)迅速鑒定出半滑舌鰨的遺傳 性別，可以避免對半滑舌鰨單個(gè)個(gè)體進(jìn)行熒光標(biāo)記的麻煩，由于熒光標(biāo)記操作會導(dǎo)致部分魚 死亡，而快速鑒定方法只是采用物理隔離方法將待鑒定魚進(jìn)行短暫隔離，剪取一點(diǎn)鰭條，無 需對待鑒定魚進(jìn)行熒光標(biāo)記，因而不會對魚體造成傷害，可以保證待鑒定魚100%的成活率。因此，遺傳性別快速鑒定方法在半滑舌鰨等魚類性別控制和單性苗種產(chǎn)業(yè)化培育方面將具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。發(fā)明內(nèi)容本申請的發(fā)明目的，是研究能在育苗場現(xiàn)場使用的一種半滑舌鰨遺傳性別快速鑒定方法。 為魚類性別控制和單性育種開辟了新的技術(shù)途徑。 實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下三個(gè)步驟 1 )半滑舌鰨鰭條DNA的快速提??；2) 特異引物的設(shè)計(jì)與合成；3) LAMP (Loop-mediated isothermal amplification,環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)方法建立及遺傳 性別檢測。其中，所述的半滑舌鰨鰭條DNA的快速提取，包括① 剪取半滑舌鰨成魚個(gè)體鰭條，保存于無水乙醇中；② 從步驟①無水乙醇中取出鰭條，另放入新鮮的無水乙醇中，在95。C 10(TC水浴中處理， 去除乙醇，得到處理后的鰭條；③ 向歩驟②處理后的鰭條，加入1M NaOH,在95r 10(TC水浴中處理，得到均一的透 明溶液；④ 向步驟③得到的溶液中，加入1MpH值為8. 0的Tris-HCl和1MHC1，混勻，12000 rpm 離心，取上清液作為半滑舌鰨DNA模板備用。所述的特異引物的設(shè)計(jì)與合成，包括根據(jù)半滑舌鰨雌性特異標(biāo)記序列，設(shè)計(jì)了六條特異引物，共識別該序列的8個(gè)位點(diǎn)，所 用的引物序列如下:CAG-3B3 5-AAGTTAGGCAGTTCGCTGAG-3F3 5-CACCATCATTGTAAAACTAGTCTCG陽3LP1 5國AACAAATATGACACATAATTCTTGGCTTCT-3 LP2 5-CCAGGGCTGGAGAAAGCAG-3這些特異引物在半滑舌鰨雌性特異DNA序列中的位置如下B3 B21 GGCGAAGTTA GGCAGTTCGC TGApTCCAG丁 GCAAACATCA ACGTTCTTAT ATGCCAAC、G CCGCTTCAAT CCGTCAAGCG ACTCAGGTCA CGTTTGTAGT TGCAAGAATA TACGGTTGTC61ACTTTAGAAG CCAAGAATTA TGTGTCATAT TTGTTTTGAC TCCAGGTTCA GTTTACTTAG TGAAAfTTC GGTTCTTAAT ACACAGTATA AACAAAACj"G AGGTCCAAGT CAAATGAATCLP1 Fl Bl121 GACAAACTCA GGGATTTGAA ATGACGAGCA ACATCTTATC GCCTCAAyG CACATGGGTA CTGTTTGAGT CCCTAAACTT TACTGCTCGT TGTAGAATAG CGGAGTTCAC GTGTACCCATLP2181 AAAAGA丁CCT TCCGAGCCAG GGCTGGAGAA AGCAGGCTTC TCAGGTGACA CAGTGGGTTTF2241 GGCCGAGACT AGTTTTACAA TGATGGTGCC ACAAAAAAAG AAAGGGAAAC TCTATGAGTG CCGGCTCTGA TCAAAATGTT ACTACCACGG TGTI I I I I IC TTTCCCTTTG AGATACTCAC301 GACACAGACT GAG A CTGTGTCTGA CTCT其中，引物BIP為圖1序列圖中的B1和B2序列連接而成，引物FIP為序列圖中的F1和 F2序列連接而成。所述的LAMP反應(yīng)和檢測，包括采用LAMP原理，利用本實(shí)驗(yàn)室篩選到的半滑舌鰨雌性特異標(biāo)記的序列，設(shè)計(jì)特異引物， 在恒溫條件下進(jìn)行30 60 min的核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增出雌性特異的DNA片段；具體是取DNA模版， 99。C變性，快速冰浴，作為LAMP反應(yīng)DNA模板；LAMP反應(yīng)體系為12. 5 25 pl，包含pH值為8. 8的Tris-HC1 20 mM; 10 raM KC1; 10 mM (NH4)2S04; 2 mM MgS04; 0. 5 mM MgCl2; 0. 6 M甜菜堿；0.1%吐溫X-100; 0. 2iiM引物F3; 0. 2uM引物B3;0. 8 u M引物FIP; 0. 8pM引物BIP; 0.4uM引物L(fēng)P1; 0.4uM引物L(fēng)P2; 0. 5 mM dlS'TP， 4單位5st DNA聚 合酶和LAMP反應(yīng)模板，然后置于65'C溫浴1 h ;所述的LAMP產(chǎn)物檢測是指取LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，觀察并記錄 擴(kuò)增出的雌性特異DNA片段，能擴(kuò)增出特異DN'A片段的為遺傳上的雌性個(gè)體，不能擴(kuò)增出DNA 片段的為遺傳上的雄性個(gè)體。本發(fā)明的學(xué)術(shù)思路就是采用LAMP (Loop-mediated isothermal amplification,環(huán)介導(dǎo) 等溫?cái)U(kuò)增)原理[Notomi etal， 2000]，利用本實(shí)驗(yàn)室篩選到的半滑舌鰨雌性特異分子標(biāo)記的序列，設(shè)計(jì)特異引物，在恒溫條件下進(jìn)行短時(shí)間(30 60min)的核酸擴(kuò)增，遺傳上的雌性個(gè) 體產(chǎn)生特異的DNA片段，而遺傳上的雄性個(gè)體則不產(chǎn)生這樣的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明的方法是根據(jù)篩選到的半滑舌鰨雌性特異分子標(biāo)記的序列設(shè)計(jì)6對特異引物， 讓其識別特異DNA片段的8個(gè)位點(diǎn)，然后利用5st DNA聚合酶的鏈置換活性，在恒溫水浴中 進(jìn)行DNA的恒溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增45min后，用EB (Ethidium bromide,溴化乙錠)染色，在紫外 燈下觀察，如果是雌性個(gè)體，就會出現(xiàn)彌散的DNA條帶，而雄性個(gè)體則不會擴(kuò)增出特異DNA 條帶。同時(shí)，我們建立了從半滑舌鰨鰭條中快速提取DNA的方法，可以在2.5 3.5h內(nèi)完成 96個(gè)個(gè)體的遺傳性別檢測。本發(fā)明與已有技術(shù)對比，其特點(diǎn)是本發(fā)明是利用LAMP原理，首先獲得半滑舌鰨雌性特異DNA序列，根據(jù)特異DNA片度的序 列，設(shè)計(jì)特異引物6對，將這些引物與快速提取的DNA模板在Bst DNA聚合酶(Sw DNA Polymerase)的作用下，在恒溫狀態(tài)進(jìn)行快速擴(kuò)增，從雌性個(gè)體中能夠擴(kuò)增出DNA條帶，在 電泳時(shí)形成彌散狀的條帶；而雄性個(gè)體則不產(chǎn)生DNA條帶，從而快速鑒定出遺傳上的雌性和 雄性。整個(gè)測定操作可以在2.5 h內(nèi)完成，因而具有快速、特異、準(zhǔn)確、靈敏、簡便以及不 需要大型儀器設(shè)備等特點(diǎn)，可以在養(yǎng)殖公司現(xiàn)場進(jìn)行檢測，為魚類性別控制和單性育種開辟 了新的技術(shù)途徑，除可以在半滑舌鰨養(yǎng)殖場推廣應(yīng)用外，還可以在其它養(yǎng)殖魚類上推廣應(yīng)用。 本發(fā)明的技術(shù)方案，目前在國內(nèi)外未見任何文獻(xiàn)和專利報(bào)道。根據(jù)克隆出的半滑舌鰨雌性特異分子標(biāo)記的序列，設(shè)計(jì)特異引物，建立半滑舌鰨遺傳性 別快速鑒定技術(shù)，這對于生產(chǎn)半滑舌鰨全雌苗種，進(jìn)行全雌苗種養(yǎng)殖，提高半滑舌鰨的養(yǎng)殖 產(chǎn)量，提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，真正將半滑舌鰨開發(fā)為一個(gè)被廣大養(yǎng)殖戶接受的優(yōu)良養(yǎng)殖品種， 推動(dòng)半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及海水魚類養(yǎng)殖品種的更新?lián)Q代，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和重大 的應(yīng)用價(jià)值，推廣后必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。


圖1半滑舌鰨雌性特異DNA片段的核苷酸序列及引物位點(diǎn)的序列圖； 圖2快速提取半滑舌鰨鰭條DNA應(yīng)用于LAMP分析的瓊脂糖凝膠電泳照片； 圖3 LAMP反應(yīng)時(shí)間篩選的瓊脂糖凝膠電泳照片； 圖4 LAMP反應(yīng)特異性檢測的瓊脂糖凝膠電泳照片； 圖5 LAMP方法在半滑舌鰨遺傳性別鑒定上應(yīng)用的照片。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一歩闡述。圖1中顯示，根據(jù)半滑舌鰨雌性特異標(biāo)記序列，設(shè)計(jì)了六條特異引物，在圖1中注明了 該特異序列及其引物的位置。圖1中左側(cè)序號表示序列位置，Bl、 B2、 B3、 LP1、 LP2、 Fl、 F2、 F3分別表示所用的6 條引物所識別的8個(gè)位點(diǎn)，所用的6個(gè)引物序列如下引物FIP:5-GAGCAACATCTTATCGCCTCAAGTTTTTAACCCACTGTGTCACCTGAGA-3引物B3: 5-AAGTTAGGCAGTTCGCTGAG-3引物F3: 5-CACCATCATTGTAAAACTAGTCTCG-3引物L(fēng)P1: 5-AACAAATATGACACATAATTCTTGGCTTCT-3引物L(fēng)P2: 5-CCAGGGCTGGAGAAAGCAG-3其中，引物BIP為圖1中的B1和B2連接而成，引物FIP為圖1中的F1和F2連接而成。 圖2中顯示，快速提取DNA應(yīng)用于LAMP分析的可行性；取3個(gè)個(gè)體的鰭條進(jìn)行DNA的快速提取，其模板DNA應(yīng)用于LAMP分析的可行性如圖2所 示。1 3號泳道為加入快速提取的DNA模板溶液8y L，而4 6號為加入DNA模板溶液1 u L， 7號為普通高鹽法所提取雌性DNA作為對照。結(jié)果說明快速提取的DNA溶液的用量對擴(kuò)增 結(jié)果有明顯影響，當(dāng)用量為luL時(shí)，可以擴(kuò)增出雌性特異DNA片段，如4 6號；而當(dāng)用量 過大時(shí)(如8uU時(shí)，反而擴(kuò)增不出DNA片段，如1 3號。圖3中顯示，LAMP反應(yīng)時(shí)間的確定橫向數(shù)字10-90:代表雌性個(gè)體DNA模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)的時(shí)間，分別為10tnin、 20 min、 30 min、 40 min、 50 rain、 60 min、 70 min、 80 min、 90 min;悉表示雄性個(gè)體，其LAMP反 應(yīng)時(shí)間為60分鐘。結(jié)果說明雌性個(gè)體DNA模板進(jìn)行L細(xì)P反應(yīng)30-90 min，都能擴(kuò)增出雌 性特異DNA片段，其中50 80分鐘的擴(kuò)增產(chǎn)物最多；而雄性個(gè)體，即使LAMP反應(yīng)時(shí)間為60 min，仍無反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)。圖4中顯示，LAMP反應(yīng)特異性分析1 3號為3個(gè)雌性個(gè)休的LAMP結(jié)果，都有DNA擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生；而4 6號為3個(gè)雄性個(gè) 體的LAMP結(jié)果，均沒有DNA擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)；M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果說明雌性個(gè)體都能 擴(kuò)增出DNA產(chǎn)物，而雄性個(gè)體則不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，本發(fā)明方法的特異性好。圖5中顯示，LAMP方法在半滑舌鰨遺傳性別鑒定上的應(yīng)用結(jié)果A圖中，1 11為11個(gè)雄性個(gè)體，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，早表示雌性個(gè)體； B圖中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 15為15個(gè)雌性個(gè)體。結(jié)果表明，在11個(gè)雄性個(gè)體中均沒有擴(kuò)增出DNA片段，而在15個(gè)雌性個(gè)體中都擴(kuò)增出 特異DNA片段，證明該方法可以用于半滑舌鰨遺傳性別的快速鑒定。實(shí)施例下面通過"半滑舌鰨遺傳性別快速鑒定方法"為例，結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi) 容進(jìn)行詳細(xì)闡述本方法包括三個(gè)方面 一、半滑舌鰨DNA的快速提?。欢?、特異引物的設(shè)計(jì)與合成；三、 LAMP方法建立與遺傳性別鑒定。 一、半滑舌鰨非損傷性DNA的快速提取；剪取體長在6-8厘米以上半滑舌鰨魚的鰭條，保存于無水乙醇中。取一小塊鰭條(0. 1-0. 3 腦"，置于無水乙醇中，在95 100。C水浴中處理2 3min，去除乙醇，加入200 uLlMNaOH， 95 100。C水浴中處理5 min，然后加入200 y L 1M Tris-HCl (pH 8.0)和175 u L 1M HC1， 混勻，12000rpm離心2min，取上清液作為DNA模板，用于后面的LAMP反應(yīng)。通過實(shí)驗(yàn)，篩 選到適宜的DNA模板溶液量，結(jié)果表明當(dāng)雌性個(gè)體的DNA模板溶液量為8 y L時(shí)(圖2中，1 3號泳道)，沒有擴(kuò)增出特異DNA產(chǎn)物，而當(dāng)雌性個(gè)體的DNA模板溶液量為1 w L時(shí)，擴(kuò)增出 特異DNA產(chǎn)物(圖2中，4 6號泳道)，與常規(guī)普通高鹽法所提取雌性DNA的效果相當(dāng)(圖2 中，7號泳道)。二、 特異引物的設(shè)計(jì)與合成；根據(jù)半滑舌鰨雌性特異標(biāo)記序列，設(shè)計(jì)了六條特異引物，共識別該序列的8個(gè)位點(diǎn)，所用 的引物序列如下BIP 5-GTCCTAAGTAAACTGAACCTGGAGTCTTTTACATCAACGTTCTTATATGCCAACAG-3FIP 5-GAGCAACATCTTATCGCCTCAAGTTTTTAACCCACTGTGTCACCTGAGA-3B3 5-AAGTTAGGCAGTTCGCTGAG-3F3 5-CACCATCATTGTAAAACTAGTCTCG-3LP1 5-AACAAATATGACACATAATTCTTGGCTTCT-3LP2 5-CCAGGGCTGGAGAAAGCAG-3 半滑舌鰨雌性特異DNA片段及引物位置如圖1所示。圖中，左側(cè)序號表不序列位置，圖中標(biāo) 有卜-劃線的序列為引物位置，箭頭表示引物擴(kuò)增的方向。引物BIP為B1和B2序列連接而成，引 物FIP為F1和F2序列連接而成。三、 LAMP方法建立與遺傳性別鑒定。1. LAMP反應(yīng)體系的建立與反應(yīng)產(chǎn)物分析取模版DNA溶液IO ul，在99。C變性10 min, 快速冰浴，作為變性模板DNA溶液待用。在12. 5-25ul擴(kuò)增反應(yīng)體系中，包含20 raM Tris-HC1 (pH 8.8), 10 mM KC1， 10 mM (NH4)2S04， 2 mM MgS04， 0. 5 mM MgCU 0. 6 M甜菜堿，0. 1% 吐溫X-IOO， 0. 2yM引物F3， 0. 2uM引物B3， 0. 8yM引物FIP， 0. 8 u M引物BIP， 0. 4uM 引物L(fēng)Pl, 0. 4uM引物L(fēng)P2， 0. 5raMdNTP, 4單位Bst DNA聚合酶和lyl變性模板DNA溶液。 然后置于65'C溫浴lh。 LAMP反應(yīng)產(chǎn)物分析取10iU LAMP產(chǎn)物，經(jīng)l. 0%瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色，在紫外燈下觀察，具有DNA擴(kuò)增條帶的為遺傳上的雌性個(gè)體，沒有擴(kuò)增產(chǎn)物的為遺傳上 的雄性個(gè)體。 2. LAMP反應(yīng)時(shí)間的確定選取實(shí)驗(yàn)室保存并且已知性別的半滑舌鰨DNA，雌雄個(gè)體各一個(gè)，濃度為100ng/yL。將 雌性個(gè)體LAMP反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為10min、 20min、 30min、 40 min、 50rain、 60min、 70min、 80 min、 90 min (圖3)，雄性個(gè)體LAMP反應(yīng)時(shí)間為60分鐘，然后對LAMP產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳檢測，結(jié)果如圖3所示。通過圖3，我們可以發(fā)現(xiàn)，在雌性個(gè)體，LAMP反應(yīng)在30 90 min 時(shí)都可以擴(kuò)增出DNA產(chǎn)物，達(dá)到檢測水平，其中50 80分鐘的擴(kuò)增產(chǎn)物最多，效果最好。而雄 性對照個(gè)休在60 min后仍然沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3中的10 90分別表示LAMP反應(yīng)時(shí)間min， S表示雄性個(gè)體陰性對照。3. LAMP反應(yīng)特異性分析；選取已知生理性別的半滑舌鰨DNA樣品，雄性3個(gè)個(gè)體，雌性3個(gè)個(gè)體，濃度為50-150ng/ yL，對其進(jìn)行LAMP分析，檢測LAMP的特異性，結(jié)果如圖4所示。圖4中3個(gè)雌性個(gè)體都擴(kuò)增出 了預(yù)期產(chǎn)物，而雄性個(gè)體中卻沒有。證明了我們設(shè)計(jì)的引物組合及篩選出的LAMP條件，可以 有效鑒定半滑舌鰨的遺傳性別，其特異性強(qiáng)。4、 LAMP方法在半滑舌鰨遺傳性別鑒定上的應(yīng)用 我們用LAMP方法檢測26個(gè)已知性別的個(gè)體，其中雌性個(gè)體為15個(gè)，都有特異擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，而在ll個(gè)雄性個(gè)體中沒有產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，如圖5所示。由此表明本發(fā)明建立的方法可以用于十滑舌鰨遺傳性別的規(guī)模化檢測，可以用于半滑舌 鰨性別控制和全雌苗種生產(chǎn)。圖5A中1 11號為11個(gè)不同雄性個(gè)體的LAMP結(jié)果，M為DNA分子量標(biāo)記，孚表示雌性個(gè)體陽 性對照。圖5B中的1 15號為15個(gè)不同雌性個(gè)體的LAMP結(jié)果，M為DNA分子量標(biāo)記。序列表<110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 <120>半滑舌鰨遺傳性別快速鑒定方法<160〉 1<170〉 Patentln version 3. 1<210〉 1<211〉 314〈212〉 DNA<213> 半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis) <400> 1GGCGMGTTA GGCAGTTCGC TGAGTCCAGT GCAAACATCA ACGTTCTTAT ATGCCAACAG 60ACTTTAGAAG CCAAGAATTA TGTGTCATAT TTGTTTTGAC TCCAGGTTCA GTTTACTTAG 120GACAAACTCA GGGATTTGAA ATGACGAGCA ACATCTTATC GCCTCAAGTG CACATGGGTA 180AAAAGATCCT TCCGAGCCAG GGCTGGAGM AGCAGGCTTC TCAGGTGACA CAGTGGGTTT 240GGCCGAGACT AGTTTTACAA TGATGGTGCC ACAAAAAAAG AAAGGGAAAC TCTATGAGTG 300GACACAGACT GAGA 31權(quán)利要求
1.一種半滑舌鰨遺傳性別快速鑒定方法，其特征是包括以下步驟1)半滑舌鰨DNA的快速提??；2)特異引物的設(shè)計(jì)與合成；3)LAMP方法建立及遺傳性別檢測。
2. 按照權(quán)利要求1所述的半滑舌鰨遺傳性別快速鑒定方法，其特征是所述的半滑舌鰨DNA 的快速提取，包括，① 剪取半滑舌鰨成魚個(gè)體鰭條，保存于無水乙醇中；② 從步驟①無水乙醇中取出鰭條，另放入新鮮的無水乙醇中，在95'C 10(TC水浴中處 理，去除乙醇，得到處理后的鰭條；③ 向步驟②處理后的鰭條，加入1M NaOH，在95'C 1()0'C水浴中處理，得到均一的 透明溶液；④ 向步驟③得到的溶液中，加入1M pH值為8. 0的Tris-HC1和iM HC1，混勻，12000 rpm離心，取上清液作為半滑舌鰨DNA模板備用。
3.按照權(quán)利要求1所述的半滑舌鰨遺傳性別快速鑒定方法，其特征是所述的特異引物 的設(shè)計(jì)與合成，包括，根據(jù)半滑舌鰨雌性特異標(biāo)記序列，設(shè)計(jì)了六條特異引物，共識別該序列的8個(gè)位點(diǎn)， 所用的引物序列如下CAG-3B3 5-AAGTTAGGCAGTTCGCTGAG-3F3 5-CACCATCATTGTAAAACTAGTCTCG-3LP 1 5-AACAAATATGACACATAATTCTTGGCTTCT陽3 LP2 5-CCAGGGCTGGAGAAAGCAG-3這些特異弓I物在半滑舌鰨雌性特異DNA序列中的位置如下:B3 B21GGCGAAGTTA GGCAGTTCGC TGAgTCCAGT GCAAACATCA ACGTTCTTAT ATGCCAAC、G CCGCTTCAAT CCGTCAAGCG ACTCAGGTCA CGTTTGTAGT TGCAAGAATA TACGGTTGTC61 ACTTTAGAAG CCAAGAATTA TGTGTCATA丁 TTGTTTTGAC TCCAGGTTCA GTTTACTTAG TGAAA^CTTC GGTTCTTAAT ACACAGTATA AACAAAACJ"G AGGTCCAAGT CAAATGAATCLP1 Fl Bl121 GACAAACTCA GGGATTTGAA ATGACGAGCA ACATCTTATC GCCTCAACyG CACATGGGTA CTGTTTGAGT CCCTAAACTT TACTGCTCGT TGTAGAATAG CGGAGTTCAC GTGTACCCATLP2181 AAAAGATCCT TCCGAGCCAG GGCTGGAGAA AGCAGGCTTC TCAGGTGACA CAG丁GGGTTTF2241 GGCCGAGACT AGTTTTACAA TGATGGTGCC ACAAAAAAAG AAAGGGAAAC TCTATGAGTG CCGgCTCTGA TCAAAATGTT ACTACCACGG TGTI I I I I IC TTTCCCTTTG AGATACTCACF3301 GACACAGACT GAGA CTGTG丁CTGA CTCT其中，引物BIP為序列圖中的B1和B2序列連接而成，引物F1P為序列圖中的F1和F2 序列連接而成。
4.按照權(quán)利要求l所述的半滑舌鰨遺傳性別快速鑒定方法，其特征是所述的LAMP反應(yīng)和檢 測，包括，采用LAMP原理，利用本實(shí)驗(yàn)室篩選到的卞滑舌鰨雌性特異標(biāo)記的序列，設(shè)計(jì)特異引物， 在恒溫條件下進(jìn)行30 60 min的核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增出雌性特異的DNA片段；具體是取DNA模版， 99。C變性，快速冰浴，作為LAMP反應(yīng)模板；LAMP反應(yīng)體系為12. 5 25 jal，包含pH值為8. 8的Tris-HC1 20 mM; 10 mM KC1; 10 mM (NH4)2S04; 2 mM MgS04; 0. 5齒MgCl2; 0.6 M甜菜堿;0.1%吐溫X-100; 0. 2uM引物F3; 0. 2uM引物B3; 0. 8 u M引物FIP; 0.8uM引物BIP; 0. 4yM引物L(fēng)P1; 0. 4uM引物L(fēng)P2; 0. 5 raM dNTP, 4單位Bst DNA聚 合酶和1^1 LAMP反應(yīng)模板，然后置于65'C溫浴1 h ;所述的LAMP產(chǎn)物檢測是指取LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，觀察并記錄 擴(kuò)增出的雌性特異DNA片段，能擴(kuò)增出特異DNA片段的為遺傳上的雌性個(gè)休，不能擴(kuò)增出DNA 片段的為遺傳上的雄性個(gè)體。
全文摘要
本發(fā)明是一種半滑舌鰨遺傳性別快速鑒定方法，包括半滑舌鰨DNA快速提取、LAMP特異引物的設(shè)計(jì)與合成、LAMP反應(yīng)體系的建立、LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測及遺傳性別的鑒定。利用半滑舌鰨雌性特異分子標(biāo)記的序列，設(shè)計(jì)特異引物，在恒溫條件下進(jìn)行短時(shí)間的核酸擴(kuò)增，遺傳上的雌性個(gè)體產(chǎn)生特異的DNA片段，而雄性個(gè)體則不產(chǎn)生這樣的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明首次建立了快速檢測半滑舌鰨遺傳性別的LAMP方法，可在養(yǎng)殖場現(xiàn)場使用，測定操作可在2.5h內(nèi)完成。有先進(jìn)、快速、特異、準(zhǔn)確、靈敏、簡便以及無需大型儀器設(shè)備等特點(diǎn)，為魚類性別檢測和控制開辟了新的技術(shù)途徑，在半滑舌鰨性別控制和單性苗種生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)在其它魚類遺傳性別鑒定和性別控制研究中也具有廣闊應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101240348SQ20081008195
公開日2008年8月13日 申請日期2008年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日
發(fā)明者徐建勇, 陳松林 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所