專利名稱：高通量試驗系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用重復(fù)的探針陣列同時進(jìn)行多個生物學(xué)或化學(xué)試驗的組合、裝置和方法。多個區(qū)域各含有一個錨基因分子的陣列，該錨與雙功能接頭分子連接，此接頭分子各含有對至少一種錨有特異性的部分，和對要探測的感興趣的靶分子的特異性部分。可利用所產(chǎn)生的該探針陣列分析能與探針特異性反應(yīng)的一種或多種靶分子的存在。本發(fā)明涉及可憑借分子相互作用性質(zhì)而區(qū)別的多種領(lǐng)域，包括但不限于發(fā)現(xiàn)治療藥物、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、藥物學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)。
背景技術(shù)：
在各種生物學(xué)和化學(xué)試驗中已采用了排列在表面或“芯片”上的多種分子探針。進(jìn)行這些試驗以測定感興趣的靶分子是否與任何探針相互反應(yīng)。使探針在所選的條件下與靶分子接觸后，檢測裝置會確定靶分子是否已與所述探針反應(yīng)。該系統(tǒng)可用于各種篩檢程序以獲得關(guān)於探針或靶分子的信息。例如，可用于篩選能與某感興趣受體結(jié)合的肽或潛在的藥物；可篩選其它樣品中是否存在基因突變，人群中的等位基因變異，或其它許多疾病中的具體病原體或病原株；研究基因表達(dá)，例如鑒定其表達(dá)與具體生理狀態(tài)、發(fā)展階段或疾病狀態(tài)相關(guān)的mRNA。
發(fā)明描述本發(fā)明提供同時進(jìn)行多個生物學(xué)或化學(xué)試驗的組合、裝置和方法，使得能對多個樣品進(jìn)行高通量分析，例如，在一診斷試驗中篩檢多個病人樣品或在一藥物發(fā)現(xiàn)方法中測試多種潛在藥物或治療藥物。提供了一種可用于檢測樣品中一種或多種靶分子的組合。此組合包括一含有多個空間上分離區(qū)域的表面，這些區(qū)域可稱為測試區(qū)和可能是一些孔，其中至少二個區(qū)域基本上相同。每一表面包含至少二個，優(yōu)選至少20個或更多，例如至少約25、50、96、864或1536個等等這種基本上相同的區(qū)域。各測試區(qū)具有一可導(dǎo)入含(或可能含)一個或多個靶分子的樣品的空間，并包含一生物學(xué)或化學(xué)陣列。(“含某靶分子的樣品”或“檢測樣品中的某靶分子”等術(shù)語不意味著排除不含靶分子的樣品或不測定(檢測嘗試)它們。從總體上說，本發(fā)明涉及到檢測樣品中是否含有某靶分子的陣列，而不論它是否能測到或不能測到。)此陣列包括多個各與一雙功能接頭分子連接的“錨”基因，而該接頭分子的第一部分對此錨有特異性，第二部分包含對至少一個靶分子有特異性的探針。將本發(fā)明的組合物與含一個或多個靶分子的樣品接觸，使靶分子任選地與檢測分子反應(yīng)，然后接受檢測裝置的詢問，檢測靶分子與測試區(qū)中探針之間的反應(yīng)，從而產(chǎn)生試驗結(jié)果。
本發(fā)明提供具體用于高通量生物試驗的方法和組合。在具體優(yōu)選實施例中可采用本發(fā)明進(jìn)行高通量篩選來發(fā)現(xiàn)藥物。例如，此高通量試驗可一次在多塊(如100塊)96孔板上進(jìn)行?？捎靡缓写蠹s36對錨和接頭的陣列在一塊板的每個孔中進(jìn)行36種不同的測試。這樣，100塊板，每塊板96個孔，每孔36種測試，就可進(jìn)行總共345000個測試；例如每次可測試9600種不同的候選藥物的36種不同參數(shù)或試驗。高通量試驗為各候選藥物提供了比一次只能測試一種參數(shù)的試驗高得多的信息。例如，可以在一次高通量初步篩選試驗中測定某候選藥物是否有選擇性、特異性和/或無毒性。非高通量方法需要廣泛的后續(xù)試驗來測試每個感興趣藥物的這些參數(shù)。實施例15-17中描述了幾種類型的高通量篩選試驗。同時進(jìn)行各種各樣的試驗和一次做非常多的試驗是本發(fā)明的二個重要優(yōu)點。
在一實施例中，例如采用聚苯乙烯制的帶有供伯氨(如氨基酸或修飾的寡核苷酸)附著的衍生表面的96孔DNA結(jié)合板(Corning Costar)，可將36種不同寡核苷酸集合物點在每塊板的每孔表面作為錨?？蓪⑦@些錨共價結(jié)合于衍生的聚苯乙烯，同樣的36種錨可用于所有的篩選試驗。對于一具體試驗，可用一組所述接頭程序化各孔表面使其對多達(dá)36種不同感興趣的靶分子或試驗類型具有特異性，可將不同的測試樣品加到每塊板96孔的每孔中。同一組錨可多次用于重新程序化各孔表面，用于其它感興趣的靶分子和試驗，或同一組接頭可重新多次應(yīng)用。這種可行性和可重用性提供了本發(fā)明的另一優(yōu)點。本發(fā)明一實施例是一種用于檢測樣品中一個或多個靶分子的組合，在加所述樣品之前，此組合包含a)一含有多個空間上分離區(qū)域的表面，這些區(qū)域至少有二個基本上相同，每區(qū)包含
b)至少8種不同的寡核苷酸錨，每個與c)一雙功能接頭相連接，此接頭的第一部分對該寡核苷酸錨有特異性，其第二部分含有對所述靶分子特異的探針。
本發(fā)明另一實施例是一種用于檢測樣品中一個或多個靶分子的組合，在加所述樣品之前，此組合包含a)一含有多個空間上分離區(qū)域的表面，這些區(qū)域至少有二個基本上相同，每區(qū)包含b)至少8種不同的錨，每個與c)一雙功能接頭相連接，此接頭的第一部分對該錨有特異性，其第二部分含有對所述靶分子特異的探針。
本發(fā)明的另一實施例是檢測至少一種靶分子的方法，此方法包括使可能含有所述靶分子的樣品與對所述靶分子特異并結(jié)合所述靶分子的核酸酶保護(hù)片段接觸。另一實施例是測定RNA表達(dá)模式的方法，此方法包括在有利于RNA靶分子與探針特異性雜交的條件下，培育含至少兩種RNA靶分子的樣品與上述組合，其中該組合的至少一個探針是核酸(如寡核苷酸)，其對于至少一個RNA靶分子有特異性(如選擇性)。另一實施例是一種鑒定能調(diào)節(jié)RNA表達(dá)模式的藥物或狀況的方法，是確定RNA表達(dá)模式的上述方法，此方法還包括將存在所述藥物(或狀況)時產(chǎn)生的RNA表達(dá)模式與在不同條件下產(chǎn)生的RNA表達(dá)模式相比較。
通過實施例，

圖1和2說明本發(fā)明的組合和用它檢測RNA靶分子的方法。圖2顯示的本發(fā)明表面含有15個相同的測試區(qū)；在本發(fā)明的一具體實施例中每一個這些測試區(qū)是微滴板中的一個孔。每一測試區(qū)含有6種不同的錨，表示為號碼1-6。圖1說明了一種這種錨，錨1，在本發(fā)明最優(yōu)選實施例中，它是一種寡核苷酸。附著錨1的是一接頭分子，接頭1，它包括兩個部分第一部分對該錨特異，在此說明中是一種能與該錨特異性雜交的寡核苷酸。第二部分是一種對感興趣的靶分子(此地是靶mRNA1)有特異性的探針，在此說明中是一種能與該靶分子雜交的寡核苷酸。雖然此圖沒有說明，其余五個錨每一個能通過其錨特異性部分與其自身接頭雜交；每個接頭可含有一探針部分，其對例如某RNA特異而不是(或相同于)mRNA1。所述組合物可同時用于測試多達(dá)15個不同樣品中是否存在mRNA1(或同時由陣列中其它五種探針?biāo)禺悳y定的mRNA靶分子)。為進(jìn)行此試驗，將每份樣品(此樣品可能是RNA抽提物)，即15種獨立細(xì)胞系之一，小量加到一個區(qū)域或孔中，在有利于探針和靶分子雜交的條件下培育。為了確定mRNA是否存在于樣品中，采用能識別模式和/或查詢各區(qū)域中特定部位是否存在信號的檢測裝置。如果此細(xì)胞系在其mRNA用一標(biāo)記體內(nèi)標(biāo)記條件下培育，以及如果樣品中存在mRNA，檢測儀將測出位于錨/探針復(fù)合物1所在部位標(biāo)記mRNA發(fā)出的信號?；蛘?，mRNA可在加入?yún)^(qū)域(孔)之前或之后體外直接標(biāo)記?；蛘撸鐖D1所述，mRNA可在與探針雜交前或后，通過與標(biāo)記的“檢測”寡核苷酸(靶特異性報告寡核苷酸，它與一序列而不是此探針?biāo)R別的序列互補(bǔ))一起培育直接標(biāo)記。在所述實例中，可同時分析15個樣品。因為用本發(fā)明可同時分析至少20個或更多個，例如多至1536個或更多的樣品，這是一種非常高通量的試驗系統(tǒng)。
如本文所用，“靶分子”是一種需要測定其存在、活性和/或數(shù)量并對所述探針有親和力的物質(zhì)。靶分子可以是人造的或天然產(chǎn)生的物質(zhì)。它們也可以其未變化狀態(tài)或作為與其它物質(zhì)凝聚物形式使用。靶分子可直接或通過一特異性結(jié)合底物共價或非共價結(jié)合于其結(jié)合伴侶。可用于本發(fā)明的靶分子例子包括但不限于受體(在運載體、脂質(zhì)、細(xì)胞膜上的受體或各種其它受體)；配體；能結(jié)合特異受體的激動劑或拮抗劑；能與特異性抗原決定簇(如病毒、細(xì)胞或其它物質(zhì))反應(yīng)的多克隆抗體、單克隆抗體和抗血清；藥物；核酸或多核苷酸(包括mRNA、tRNA、rRNA、寡核苷酸、DNA、病毒RNA或DNA、ESTs、cDNA、從RNA或DNA衍生的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及它們的突變體、變種或修飾物)；蛋白質(zhì)(包括酶，如負(fù)責(zé)切割神經(jīng)遞質(zhì)的酶、蛋白酶、激酶等)；酶的底物；肽；輔因子；凝結(jié)素；糖；多糖；細(xì)胞(可包括細(xì)胞表面抗原)；細(xì)胞膜；細(xì)胞器等等，以及可能以復(fù)合物、共價交聯(lián)結(jié)合形式存在的其它分子或其它物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語核酸、多核苷酸和多聚核酸可互換使用。靶分子也可稱為反探針。
如本文所用，“探針”是一種物質(zhì)，即一種可被一特定靶分子特異性識別的分子?？赡艿奶结?靶或靶/探針結(jié)合模式包括DNA/DNA，DNA/RNA，PNA(肽核酸)/核酸；酶，其它催化劑，或其它物質(zhì)與底物、小分子或效應(yīng)分子；等等。本發(fā)明所考慮到的探針例子包括但不限于有機(jī)或無機(jī)物或聚合物，包括金屬、塑料、細(xì)胞膜受體的激動劑或拮抗劑，毒素和蛇毒，病毒表位，激素(如類鴉片活性肽、類固醇等)，激素受體，脂質(zhì)(包括磷脂)，肽，酶(如蛋白酶、激酶)，酶底物，輔酶，藥物，凝結(jié)素，糖，核酸(包括寡核苷酸、DNA、RNA、PNA或修飾的或替代的核酸)，寡糖，蛋白質(zhì)，酶，多克隆和單克隆抗體，單鏈抗體或其片段。探針寡核苷酸可以是線性或環(huán)形探針，可憑借不同活性或不同結(jié)合性鑒別磷酸化與非磷酸化蛋白質(zhì)。探針例如凝結(jié)素可鑒別糖基化蛋白質(zhì)。如本文所用，術(shù)語核酸、多核苷酸、多聚核酸和寡核苷酸可互換使用。上述任何物質(zhì)如探針也可作為“靶子”，反之也然。
任何相容性表面都可用于本發(fā)明。該表面(常為固體)可以是各種有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)或它們的組合，只是舉例，包括塑料如聚丙烯或聚苯乙烯；陶瓷；硅；(融合的)二氧化硅。石英或玻璃(它們的厚度顯微鏡載玻片或蓋玻片)；紙，如濾紙；重氮化纖維素；硝酸纖維素濾膜；尼龍膜；或聚丙烯酰胺或其它類型凝膠墊，如氣凝膠制成的氣墊或氣珠為多孔固體，包括用各種常規(guī)方法干燥濕凝膠制成的膜。當(dāng)實施試驗的方法涉及到光學(xué)檢測時，可采用對光線透明的物質(zhì)。此表面可以是與常規(guī)檢測方法相容的任何厚度或不透光。例如，此表面可以是厚底、潔凈板或不透明板。一優(yōu)選實施例中，此表面是多孔塑料表面，即組織培養(yǎng)皿，例如24-，96-，256-，384-，或1536-孔板(一種修飾的板，如Coring Costar DNA Bind Plate)。錨可以直接與表面結(jié)合，或與一種表面如玻璃結(jié)合，再與微滴板塑料“孔”中的第二表面結(jié)合。此表面的形狀不是關(guān)鍵的。它可以是例如平表面，如正方形、長方形、或園形，曲線形表面/或三維表面如珠、顆粒、線串、沉淀、管狀、球形；等等。
此表面含有許多空間上分離的和可尋址或可監(jiān)定的區(qū)域。每個區(qū)域含有一組錨。這些區(qū)域如何相分離，它們的物理特征和它們彼此的相對朝向不重要。一實施例中，諸區(qū)域可通過一抵制液體流通的物理屏障隔開。例如，一優(yōu)選實施例中，諸區(qū)域可以是多孔平皿(組織培養(yǎng)皿)，如24-，96-，256-，284-，864-，或1536-孔板中的孔。或者，一表面如玻璃表面可被蝕刻成具有例如864或1536個分開的窄孔?；蛘?，一表面可以含有不分開的區(qū)域或孔，例如一平面型塑料、玻璃或紙片，各區(qū)域可通過覆蓋一刻劃有分開區(qū)域的結(jié)構(gòu)(如一塑料或玻璃片)而確定。任選的，在各區(qū)域被刻劃出以前，一表面可能已經(jīng)包含一個或多個錨，或結(jié)合了接頭的錨的陣列。在另一實施例中，各區(qū)域中的錨陣列可通過表面上的空白區(qū)(無錨)彼此分開，或通過化學(xué)邊界如蠟或硅膠彼此分開以防止液滴擴(kuò)散。
另一實施例中，這些區(qū)域可以是小管或流體控制通道，如Beattie等，(1995)Clin.Chem.4；700-706，所述設(shè)計用于流通試驗的小管。小管可以是任何大小，如毛細(xì)管或?qū)捒仔」埽豢勺屢后w流通；或可部分或完全裝滿凝膠如瓊脂糖或聚丙烯酰胺，通過這些小管可輸送化合物(用泵通過小管流體)，如電泳；或如Albota等(1998)，Science.281；1653-1656；Cumpston等(1998)，Mat.Res.Soc.Symp.Proc.488；217-225；和/或Cumpston等(1999)，Nature.398；51-54，所述，采用空間裝滿基質(zhì)的通道。在這種充滿基質(zhì)的小管中，流體和/或分子不僅可沿管壁垂直方向流動而且可側(cè)向擴(kuò)散。在一優(yōu)選例中，小管中充滿凝膠或空間填充基質(zhì)，激活凝膠或空間填充基質(zhì)以結(jié)合錨，使不同的錨依次通過小管，讓錨在凝膠中形成陣列(線性陣列)；使接頭、靶分子等繼續(xù)通過。此陣列可以是線性、二維或三維陣列。
可在一根小管中進(jìn)行多個試驗。例如在順序試驗中采用相同或不同樣品，可重復(fù)使用一根小管中的一種錨陣列或錨與接頭結(jié)合的陣列(剝下和重利用或重新程序化)另一實施例中一個試驗采用多根小管，在含有不同陣列的多根小管中分析感興趣的樣品。錨和錨/接頭組合可以是本文所述的任何類型。
表面中或上面的區(qū)域也可通過修飾表面本身來確定。例如一塑料表面可包含通過修飾或衍生的塑料制作的部分，它們可作為加入特殊類型聚合物的位點(如PEG可附著于聚苯乙烯表面，然后用羧基、氨基、雙鍵、醛基等衍生)?；蛘?，一個塑料表面可包含模式結(jié)構(gòu)，如突出端或隆起，它們可作為加入錨的平臺。另一實施例中，這些區(qū)域可以是凝膠墊，如聚丙烯酰胺凝膠墊或氣墊，以所需模式在一表面如玻璃上形成陣列，或夾在兩個表面如玻璃和石英板之間?？蓪㈠^、接頭等固定在墊的表面，或可埋在墊中。凝膠墊表面上的其它各種安排是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟習(xí)的，可按常規(guī)方法制作。測試區(qū)的相對朝向可采納各種形式，包括但不限于平行陣列、正方或長方形或其它方形表面陣列、中間園形或其它表面的放射形陣列、線性陣列等等。
本發(fā)明的空間上相分離的區(qū)域可以有多個拷貝，即至少二個，優(yōu)選至少20個，至少約24、50、96、356、384、864、1536、2025個或更多個基本上相同的空間上相分離(分開)的區(qū)域。增加重復(fù)區(qū)域的數(shù)目可使試驗具有更高的通量。如本文所用，基本上相同的區(qū)域指含有相同的或基本上相同的錨、和/或錨/接頭復(fù)合物的區(qū)域。如本文所用，基本上相同指根據(jù)本發(fā)明，陣列或區(qū)域所起的作用與文中用于分析靶分子的陣列或區(qū)域基本上相同?；旧喜挥绊懝δ埽礄z測靶分子能力的差異是沿線小核苷酸缺陷(刪除/插入/替換)或寡核苷酸缺陷(表面結(jié)合差)等的差異，其在試驗精確度范圍內(nèi)不會明顯影響靶分子測定結(jié)果。
當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白此表面上不是所有區(qū)域都需要基本上彼此相同。例如，如果平行測試二組不同的陣列，將二組陣列包含在一個表面上可能是有益的。例如，可將二組不同的陣列以交替條紋模式安排以促進(jìn)二者之間的比較。另一實施例中，實施者可能希望包括與該表面上其它區(qū)域相鑒別方式檢測出的區(qū)域，從而可作為“注冊區(qū)”。例如，注冊區(qū)可含有顯示不同熒光分子模式、能被掃描檢測儀識別為“起始點”的寡核苷酸或肽，以排列對比表面上的區(qū)域。
不限制測試區(qū)域的大小和物理間隔。典型的區(qū)域面積約1-700mm2，優(yōu)選1-40mm2，間隔約0.5-5mm，常規(guī)選擇取決于涉及的面積。一優(yōu)選實施例中，區(qū)域間隔約5mm。例如，各區(qū)域可包括一長方形格柵，例如有8排6行大約園形的錨附著點，這些點直徑約100微米，間隔500微米；這樣一個區(qū)域覆蓋約20平方厘米面積。還包括較大和較小的區(qū)域面積和間隔。
這些區(qū)域也可進(jìn)一步分成小的區(qū)域，這樣，一區(qū)域內(nèi)的某些或所有的錨可通過小坑或淺凹與相鄰錨物理上分開。例如一個區(qū)域的亞區(qū)數(shù)范圍從約10個到約100個或更多。一實施例中一區(qū)域是1536孔平皿中的一孔，可將其進(jìn)一步分成更小的孔，例如約4至約900小孔，優(yōu)選實施例中約16-36小孔，從而形成孔中孔陣列。見圖4。這種淺凹表面降低了物理放置一個(或一組)錨到各設(shè)計位置(基因座)的抵抗力，使含錨的區(qū)域大小更均勻，從而有利于與探針結(jié)合的靶分子的檢測。
如本文所用，術(shù)語“錨”指任何實體或物質(zhì)，如分子，其能與此表面(如固定于，或共價或非共價結(jié)合于)結(jié)合，或是此表面的一部分(如塑料表面的衍生部分)，其可與一接頭或本文所述其它物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)或結(jié)合。具有接頭分子的錨的此部分可直接與此表面結(jié)合，或錨可含有一中間“臂”部分。此臂可以是任何物質(zhì)，如各種本領(lǐng)域常規(guī)使用的物質(zhì)之一。在一實施例中，此臂是一種線形碳分子，具有約5-20個，優(yōu)選約12個碳原子。另一實施例中，此臂是不與接頭分子發(fā)生特異性反應(yīng)或結(jié)合的核酸(本文所述任何類型的核酸)。
如本文所用，術(shù)語“錨”還指一組基本上相同的錨。見圖7，提供了一含有3個錨(A，B和C)的測試區(qū)，各錨以多個拷貝(一組)存在。各組錨的位置稱為“位點”。如本領(lǐng)域所熟知，一位點中錨的數(shù)量只受到物理性如錨大小的限制。例如約25-200微米直徑的一位點可含有數(shù)百萬錨。
如本文所用，當(dāng)一錨和一接頭通過特定方式的分子連系結(jié)合時，產(chǎn)生了“錨/接頭復(fù)合物”。與接頭的相互反應(yīng)可以是不可逆的，例如通過某種共價鍵；或可逆的，例如通過核酸雜交。
在一優(yōu)選實施例中，此錨是一核酸，可以是任何長度(如寡核苷酸)或類型(如DNA、RNA、PNA、或RNA或DNA分子的PCR產(chǎn)物)。核酸可被修飾或置換(如包含非天然產(chǎn)生的核苷酸，如肌苷，通過各種已知鍵連接，如氨基磺酸鹽、硫酰胺、磷酸硫代硫酸酯、膦酸酯、氨基甲酸酯等；或半合成分子如DNA-鏈霉親合素交聯(lián)物等)。優(yōu)選單鏈核酸。
錨核酸可以是任何長短只要與本發(fā)明相容。例如錨可以是長約8-15個核苷酸的寡核苷酸，優(yōu)選約10、15、20、25或30個核苷酸。另一實施例中，錨可以長約50-300個核苷酸，或更長或更短，優(yōu)選約200-250個核苷酸。例如一錨可含有約150-200個核苷酸的上述“臂”核酸，毗連此臂有一較短的約10、15、20、25或30個核苷酸的序列，設(shè)計其與一接頭分子(“接頭特異性序列”)相互反應(yīng)。此臂可以是任何長度或類型的核酸，可具有在本發(fā)明中有功能的堿基組成。一優(yōu)選實施例中，某區(qū)域一位點各錨或不同位點錨的此種臂基本上相同；因此錨彼此不同主要在于它們的接頭特異性序列。
臂可給于錨好處，改進(jìn)其性能。例如使錨的接頭特異性部分距離此表面更遠(yuǎn)，因而與它們靠近此表面相比，物理限制少，空間位障小。例如這有利于具有靶特異性的多個不同接頭(如約2-10個)與所述位點的錨結(jié)合。如以下更詳細(xì)討論的那樣，一個錨可含有(除臂外)多個串聯(lián)線性形式排列的接頭特異性序列；這使得多個不同類型的錨得以結(jié)合。所述位點的該錨在一“混合位點”上，二個或多個錨各與一具有不同靶特異性的不同接頭結(jié)合。因為含有臂的錨物理上可屈曲，所述位點的錨可容易地與多個不同接頭分子結(jié)合而不受毗鄰錨的物理約束。使多個接頭分子與所述位點的錨結(jié)合的優(yōu)點是，得以在一具體位點上檢出更多數(shù)目的靶分子。一實施例中，結(jié)合于所述位點的多個接頭具有針對同一感興趣靶核酸不同部分(如此核酸內(nèi)不同的寡核苷酸序列)的特異性探針。與用一個探針相比，這得以擴(kuò)大靶分子的檢測。另一實施例中，多個接頭具有針對不同的無關(guān)靶分子的特異性探針，這得以檢測一具體位點內(nèi)多個不同的靶分子。含有臂的錨的另一優(yōu)點是，它們可更容易地容納與大分子如蛋白質(zhì)結(jié)合，和/或與大的靶分子如蛋白質(zhì)、膜或細(xì)胞結(jié)合的接頭。
錨的堿基組成無須受限。錨的任何堿基組分都可接受，只要此錨在本發(fā)明中有功能。例如，某區(qū)域一位點或不同位點上的單鏈錨核酸可含有部分或完全隨機(jī)的序列(如隨機(jī)產(chǎn)生的序列，如對A，G，T和C的相對量無限制)，即寡核苷酸具有相同量的G，C，A和T，但以不同相對順序排列。即該錨，例如在某區(qū)域的不同位點與公式GnCnAmTm不一致，其中n和m是整數(shù)。見實施例1所示錨，它不是隨機(jī)序列的同分異構(gòu)體。本發(fā)明的錨中G和C的量無須大約相同，A和T的相對量也如此。另外G，C，A和T的凈相對量無須受限制。例如，某區(qū)域中錨的堿基組成可以從GC較多(G+C大于50％)到G，C，A和T量相等到AT較多(A+T大于50％)。一實施例中錨以G，C，A和T相對量不受限方式隨機(jī)產(chǎn)生。
含核酸臂和一個或多個接頭特異性部分的錨不可能遵守堿基組成上的特定限制。例如，若位于某位點的錨具有基本上相同的臂，如基本上相同的25-聚或200-聚臂，但各錨具有不同的接頭特異性部分(如25-聚)，即使其接頭特異性部分符合特定要求(如As和Gs數(shù)目大約相同；Ts和Cs數(shù)目大約相同；寡核苷酸遵循公式GnCnAmTm；和/或G+C成分符合特定要求)，這些錨作為整體將不符合那些具體要求。類似地，即使某區(qū)域不同位點錨的接頭特異性部分彼此基本上不同(如各接頭特異性部分序列與該區(qū)域中各其它接頭特異性部分至少約20％或50％，或80％不同)，從該核酸全長考慮，該錨的凈序列相同性可能差別不大。例如各錨含有基本相同的250-聚臂，和25-聚接頭特異性部分(其與該區(qū)域中各其它接頭特異性部分100％不同)，這些錨彼此僅10％不同。
錨也可以是肽或蛋白質(zhì)。例如，它可以是能特異性結(jié)合一接頭(一種抗原或抗體)部分的多克隆或單克隆抗體分子或其片段，或單鏈抗體或其片段；正面講，錨可以是肽，與其結(jié)合的接頭部分可以是抗體等。另一實施例中，錨可以是對特定糖類特異的凝集素(如伴刀豆球蛋白A或生物體如鱟、花生、綠豆、菜豆、麥芽等的凝集素)。另一實施例中，錨可以含有機(jī)分子，如修飾的或衍生的可塑性聚合物，其可在寡核苷酸化學(xué)合成的特定固相階段起作用。此時，衍生的塑料中可分布不同的衍生陣列，在制造過程中整合入組合塑料表面而形成位點。另一實施例中，錨可利用其特異或優(yōu)先結(jié)合于金屬離子如Ni、Zn、Ca、Mg等和特殊蛋白質(zhì)或螯合劑之間。例如，錨可以是聚組氨酸，而接頭的錨特異性部分可以是鎳，其可通過鎳螯合劑與靶特異性探針結(jié)合。或者，螯合劑可以是錨，聚組氨酸是探針相關(guān)部分。或者，錨可含無機(jī)物質(zhì)。例如，它可含金屬如鈣或鎂，接頭的錨特異性部分可以是優(yōu)選的螯合劑，分別是如能與靶特異性探針結(jié)合的EDTA或EGTA。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道廣大范圍的其它類型分子也可作為錨，如能與探針和靶結(jié)合的那些一般類型。
錨也可是一種雜交體結(jié)構(gòu)，如DNA雙鏈體，或含有DNA和蛋白質(zhì)(其以本文所述任何方式特異性相互反應(yīng))的雙鏈體。例如，雙鏈體錨的“堿基部分”(直接與表面接觸的部分)可含有任選的修飾單鏈核酸，優(yōu)選此堿基部分也含有一臂，如上述線性碳原子臂。一實施例中，第二單鏈核酸與此堿基部分結(jié)合(雜交)，形成含有至少部分雙鏈體核酸的錨。例如，該堿基部分可含有一端能結(jié)合表面的線性碳原子臂，另一端能結(jié)合約10-100個核苷酸，優(yōu)選約25個核苷酸的單鏈DNA寡核苷酸；該雙鏈體的第二部分可含有與該堿基部分(如與末端約40個核苷酸)至少一部分互補(bǔ)的序列，后有一任選臂(如約5-15，優(yōu)選約10個核苷酸)，再后有一接頭特異性序列(如長約8-50個核苷酸，優(yōu)選約15、20、25、或30個核苷酸，最優(yōu)選約25個核苷酸)。
錨雙鏈體互補(bǔ)部分和其接頭特異性序列的堿基組成可以不同，以適合于采用本領(lǐng)域常規(guī)最適方法的試驗的需要。例如，可選擇序列，使得接頭在雙鏈體錨本身保持完整的條件下，可從雙鏈體錨中解離下來。此雙鏈體錨的剩余陣列可再使用，若需要，與相同或不同接頭分子雜交?；蛘?，可選擇序列，使錨/接頭雜交體和雙鏈體錨的二互補(bǔ)部分在相同條件下均解離，只留下與表面接觸的堿基部分。一實施例中，某區(qū)域一特定位點或所有位點中的所有或基本上所有的堿基部分相同，或基本上相同。只有當(dāng)雙鏈體錨的互補(bǔ)部分先加回(一種需要知道參與雙鏈體形成的堿基時的方法)時，解離后堿基部分剩余陣列可再使用(如與接頭分子雜交)。不熟悉堿基部分序列的用戶可能或不可能再利用錨操作陣列的能力，提供了利用這種雜交錨的優(yōu)點。防止這種再利用也可預(yù)防因過度使用發(fā)生降解或偶然不穩(wěn)定問題。
一實施例中，某區(qū)域一給定位點的一組錨基本相同(即只針對一種接頭的“錨特異性部分，或一靶分子的特異性))。見圖7。另一實施例中，一給定位點可存在對多個不同接頭和/或?qū)Χ鄠€不同靶分子有特異性的多個不同的錨，此位點稱為“混合位點“，如含約2-100個不同的錨，例如至少約2個、至少約4個，或至少約10個?；旌衔稽c的好處是它們能在一具體位點上檢測更多數(shù)目的不同靶分子。一實施例中，各個混合位點含有一個與每個或至少幾個位點相同的錨。例如一個以上位點中相同的錨可用于質(zhì)量保證和/或控制信號的標(biāo)準(zhǔn)化。
當(dāng)然，“混合位點“對只有一個信號(無重復(fù))區(qū)的表面也有益處。這種單區(qū)域各位點中的錨可與接頭，或直接與感興趣的靶分子相互反應(yīng)。一測試區(qū)中的錨數(shù)量(即一位點有數(shù)組錨)可至少為2種，優(yōu)選約8-900種(或多或少)，更優(yōu)選約8-300種，最優(yōu)選約30-100(如約64種)。某些優(yōu)選實施例中，一具有96個測試區(qū)(如小孔)的表面有約16、36、45、或100個錨/測試區(qū)，或一具有384個測試區(qū)(如小孔)的表面含有約9、16、或25個錨/測試區(qū)。在一最優(yōu)選實施例中，一測試區(qū)中的各錨具有與陣列中各其它錨不同的特異性。然而，兩個或多個錨可具有相同的特異性，所有的錨可以相同。一實施例中，本發(fā)明的組合含有大量的測試區(qū)(如約864、1536、或更多)，可一次處理大量的測試樣品?？赡芨信d趣的是只測試這些樣品的有限數(shù)目參數(shù)(如約2、4、6或9種)。換言之，因為此組合含有非常大數(shù)量的區(qū)域，每區(qū)域可只含約2-9種錨也許是有益的。
不限制測試區(qū)域中或上的錨(即一位點中的數(shù)組錨)的物理間隔和相對朝向。通常錨之間的距離約0.003-5mm或更少，優(yōu)選約0.03-1mm。包括較大和較小的錨間隔(或面積)。錨可以彼此和對區(qū)域的邊界以任何朝向排列，例如，可以二維朝向，如正方形、長方形、六角形或其它陣列，或園形陣列(錨從中心以放射線或同心園發(fā)射)排列。錨也可以一維線性陣列排列。例如，寡核苷酸可與沿DNA或RNA序列的具體部位雜交形成一超分子陣列，或在流通凝膠中線性排列，或在流通裝置表面或流通裝置內(nèi)的結(jié)構(gòu)表面排列。或者，錨可以“條碼”樣形式排列(見圖6)。例如，錨可沿著彼此平行的線排列，各長線的間隔或?qū)挾瓤捎幸?guī)律的不同以產(chǎn)生一種很象條碼的可識別模式，如第一和第三條線可是其它的二倍粗，也可刪去一些線，等等。也可在最后的區(qū)分一測定區(qū)域的線后安置一額外的空白線，在后續(xù)測定區(qū)中可重復(fù)此條碼模式。
錨模式不需要嚴(yán)格注冊分離的測試孔(測定區(qū))或分離測試滴的位置。術(shù)語“測定位置”用于指測定樣品加入測試表面的位置。(例如，這些位置可由測試樣品的分離液滴位置或多孔板上孔的位置或確定各測試孔的分隔來確定。)錨模式本身(如“條碼”-樣寡核苷酸錨模式)可通過模式識別精確定位各分離的錨，即通過其與其它線的相對位置識別條碼的每條線。因此第一錨不必位于各測試位置的一邊或一角?？磕Ｊ阶R別而非相對于該位置的位置找到該第一錨。只要各試驗位置(例如液滴的面積或孔的面積)所用面積足夠大，明確含有至少一整個錨重復(fù)模式單元，當(dāng)此模式位于測定位置區(qū)域時，各測試點將測定對此(條碼)模式特異的所有靶分子測定位置的樣品。
每測定區(qū)域內(nèi)錨不需要按嚴(yán)格的甚至固定的模式排列。例如，各錨可與一測定區(qū)域中隨機(jī)位置的顆粒、珠等結(jié)合。各錨的位置可采用，例如一可檢測標(biāo)記來確定。例如，可用不同的熒光、發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記各種錨的特異性接頭分子，含有特定的接頭/錨對的顆粒的位置，可通過該接頭發(fā)出信號的性質(zhì)，例如激發(fā)或發(fā)射光譜來鑒定。本領(lǐng)域技術(shù)人員能制備攜帶有各種結(jié)合標(biāo)記，各具有一可鑒別光譜的一系列接頭?；蛘撸芍苯訕?biāo)記錨。例如，各種錨可用具有與其它類型錨不同的熒光標(biāo)記來標(biāo)記。或者，顆粒、珠等在大小或形狀上可彼此不同?？刹捎帽疚乃龅臉?biāo)記和方法。例如，可通過CCD攝影系統(tǒng)用掃描熒光顯微鏡或熒光激活細(xì)胞分揀儀測定熒光。
錨可與接頭分子的一部分—錨特異性部分反應(yīng)或特異性結(jié)合。術(shù)語“相互反應(yīng)”或“結(jié)合”，指兩種物質(zhì)或化合物(如錨和接頭的錨特異性部分，探針和其靶分子，或靶分子和靶特異性報道劑)彼此充分結(jié)合(如附著、結(jié)合、雜交、連接、退火、共價連接或其它結(jié)合)，從而可進(jìn)行所述試驗。術(shù)語“特異性”或“特異地”指兩種成分(如錨和接頭的錨特異性部分，探針和其靶分子，或靶分子和靶特異性報道劑)彼此選擇性結(jié)合，在缺乏保護(hù)技術(shù)時，一般不結(jié)合能結(jié)合目標(biāo)成分的不想要成分。實現(xiàn)特異性相互反應(yīng)所需參數(shù)可用本領(lǐng)域常規(guī)方法確定。
對于核酸，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員可憑經(jīng)驗確定在選擇的嚴(yán)謹(jǐn)條件下，使核酸(如寡核苷酸錨)能與另一核酸(如接頭的錨特異性部分)雜交，同時最大程度降低與其它物質(zhì)或分子(如其它接頭寡核苷酸)非特異性雜交。通常，DNA或錨的其它核酸序列、接頭部分或檢測寡核苷酸將與其結(jié)合伙伴充分互補(bǔ)，使其能在所選的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交，Tm將高于室溫約10-20℃(如約37℃)。通常，寡核苷酸錨可長約8-50個核苷酸，優(yōu)選約15、20、25或30個核苷酸。如本文所用，“高嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”指核酸之間核苷酸互補(bǔ)(相同性)雜交達(dá)到至少95％，優(yōu)選約97-100％的條件。然而，根據(jù)所需目的，可選擇互補(bǔ)性要求較低，如約90％、85％、75％、50％等的雜交條件。雜交反應(yīng)參數(shù)中可以不同的有鹽濃度、緩沖液、PH、溫度、培養(yǎng)時間、變性劑如甲酰胺的量和類型等。(見Sambrook等(1989)，分子克隆實驗手冊(MolecularCloningA Laboratory Manual)第二版，1-3卷；Cold Spring Harbor出版社，紐約；Hames等(1985)，IL出版社；Davis等(1986)，分子生物學(xué)的基礎(chǔ)方法(BasicMethods in Molecular Biology)，Elsevir科學(xué)出版公司，紐約)。例如，可將核酸(如接頭寡核苷酸)加入一測定區(qū)(如多孔板的一孔，一優(yōu)選實例中用96或384孔板或更多孔板)，其體積為約0.1-100微升或更多(一實施例中約1-50微升，最優(yōu)選約40微升)，濃度約0.01-約5微摩(一優(yōu)選實施例中約0.1微摩)，緩沖液為例如，6XSSPE-T(0.9M NaCl，60mM NaH2P04，6mM EDTA，0.05％ Triton X-100)，與結(jié)合伙伴(如表面上的寡核苷酸錨)雜交約10分鐘至至少3小時(一優(yōu)選實施例中至少15分鐘)，溫度約4-37℃(一優(yōu)選實施例中在大約室溫中)?？蛇x擇能進(jìn)行高通量的條件。在本發(fā)明的一實施例中，此反應(yīng)條件可接近生理條件。
可設(shè)計其它類型的物質(zhì)或分子(如多肽、凝集素等)作為錨或接頭部分，確定實現(xiàn)與其結(jié)合伙伴特異性相互反應(yīng)所需的反應(yīng)條件是本領(lǐng)域的常規(guī)工作(如Niemeyer等(1994)，Nucl.Acids Res.22；5530-5539；Fodor等(1996)，美國專利號5,510,270；Pirrung等(1992)，美國專利號5,143,854)。培養(yǎng)參數(shù)有、緩沖液、鹽濃度、PH、溫度、培養(yǎng)時間、是否存在載體和/或試劑、降低非特異性相互反應(yīng)的條件等。例如，在一測定區(qū)(如多孔板的一孔中，一優(yōu)選實施例中，采用96或384孔或更多孔板)中可含有抗體作為錨，可在其中加入抗抗體(即抗原或抗體特異性第二抗體)，其體積為約0.1-100微升或更多(一優(yōu)選實施例中約1-50微升，最優(yōu)選約40微升)，濃度約10皮摩至-約10納摩(一優(yōu)選實施例中約10納摩)，緩沖液為例如，6XSSPE-T、PBS、或生理鹽水，與表面上的錨培育約10分鐘至至少3小時(一優(yōu)選實施例中至少15分鐘)，溫度約4-45℃(一優(yōu)選實施例中約4℃)。對于肽錨優(yōu)選長約5-20個氨基酸。
本發(fā)明某些實施例中，在選擇的反應(yīng)條件下，陣列中的各錨以與陣列中其它錨基本上相同的程度，與接頭的錨特異性部分反應(yīng)。這可保證這些錨特異于基本上均一的接頭和探針陣列。
測定區(qū)中的錨(各位點的錨組)可以是“通用的”，組中的各錨可與各接頭反應(yīng)，各接頭具有針對此類錨的特異性部分，但有不同的“探針”部分；這樣，一個通用錨的陣列可用于程序化或確定不同組探針。錨通用陣列的靈活性可參見圖1和2的說明。圖2描述一含15個測定區(qū)的表面，各區(qū)含有6種不同的錨(此例中為寡核苷酸)組成的陣列。圖1說明這些錨(寡核苷酸)之一，錨1，與接頭1接觸，接頭1含有針對錨1的特異性部分，和針對靶mRNA1的特異性第二部分?；蛘撸蠼宇^1，接頭2含有針對錨1的特異性部分和針對靶mRNA2而非靶mRNA1的特異性第二部分。這樣，錨1可用于對二個或多個不同靶mRNA之一的特異性探測。產(chǎn)生和附著高分辨率寡核苷酸或肽的模型(陣列)，可能是花費多、費時和/或費力的。能用預(yù)先形成的錨陣列來程序化各種各樣的探針陣列是本發(fā)明的一個優(yōu)點。
雖然圖2所述通用錨確定了寡核苷酸探針的模式，但此相同的錨陣列也可用于程序化其它探針陣列，如受體蛋白質(zhì)(見圖3)。對于錨/接頭的類型，已知可能有許多排列，如甚至更復(fù)雜的“夾心”或“積木“式探針層。例如，一實施例中，一組通用錨可與一組接頭結(jié)合(共價或非共價)形成一修飾的“交聯(lián)”錨陣列，詳述見以下。如此，含錨的表面本身就賦予了新的優(yōu)點。
本發(fā)明的一實施例中，錨可反過來與接頭反應(yīng)，這樣一組通用的錨重新用于程序化不同組探針。例如，一寡核苷酸錨可通過加熱使兩種寡核苷酸解離，而與一接頭的寡核苷酸部分分離，然后可再與第二個接頭分子結(jié)合。重新利用制備花費高、費時費力的錨陣列的能力，是本發(fā)明的另一優(yōu)點。
錨不一定需要與接頭相互反應(yīng)。例如，可將錨偶聯(lián)于(直接或間接)一檢測分子，如熒光色素，因而可為測試表面和檢測之間的登記起著在座標(biāo)方格內(nèi)定位一個點的作用?；蛘?，可用已知量的檢測分子標(biāo)記錨，可作為校準(zhǔn)目的的內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)。
術(shù)語“接頭”如本文所用指一種雙功能物質(zhì)，其含有對所選錨或錨亞組有特異性(“錨-特異性”)的第一部分，和含有感興趣的靶分子的特異性探針(“靶特異性”)的第二部分。接頭的此二部分可通過共價或非共價鍵連接，或直接或通過一中間物(如臂)相連。
當(dāng)然，接頭的錨特異性部分的化學(xué)性質(zhì)功能是與錨相互反應(yīng)。例如，如果錨是寡核苷酸，與其反應(yīng)的接頭部分可以是，例如一種能與該寡核苷酸特異結(jié)合的肽，或能在所選的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與其有效和特異性雜交的核酸。此核酸可以是寡核苷酸、DNA、RNA、PNA、PCR產(chǎn)物，或取代的或修飾的核酸(如含有非天然產(chǎn)生的核苷酸如肌苷；通過各種已知的鍵連接，如氨基磺酸鹽、硫酰胺、磷酸硫代硫酸酯、磷酸甲酯、氨基甲酸酯等；或半合成分子如DNA-鏈霉親合素交聯(lián)物等)。優(yōu)選單鏈核酸。接頭的寡核苷酸錨特異性部分長約8-50個，優(yōu)選約15、20、25或30個核苷酸。如果錨是抗體，與其反應(yīng)的接頭部分可以是抗抗體或抗原，或這些分子的能與錨特異性反應(yīng)的較小片段。本領(lǐng)域熟知能與上述其它類型錨特異性反應(yīng)可作為接頭的錨特異性部分的物質(zhì)或分子，并可用常規(guī)方法設(shè)計(見上)。
當(dāng)然，接頭的靶特異性部分的化學(xué)性質(zhì)功能是與要探測的靶分子相互反應(yīng)。例如，如果靶是一具體mRNA，接頭的靶特異性部分可以是，例如一種能在所選雜交條件下與該靶而非干擾性DNA或RNA特異性結(jié)合的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用已知方法，靠經(jīng)驗確定將優(yōu)先與該靶分子雜交，而與非特異性干擾性DNA或RNA(見上)最少雜交的寡核苷酸的特征。通常，用于鑒別靶mRNA與背景中大量過剩的非靶RNA的寡核苷酸長度是約8-50個，優(yōu)選18、20、22或25個核苷酸。用于無高背景竟?fàn)幮园蟹肿由囼灥墓押塑账崽结樋奢^短。用已知方法(如計算機(jī)程序BLAST)，可選擇此寡核苷酸的序列，使它們相互無關(guān)并與已知的基因數(shù)據(jù)庫中的潛在干擾序列不相似?？砂闯Ｒ?guī)用已知的方法(見上)確定使寡核苷酸探針與RNA特異性雜交的雜交條件的選擇。例如，可將從組織或容器中，如多孔微滴板(如96或384孔或更多孔)的孔中培養(yǎng)細(xì)胞提取的靶RNA(即總RNA或mRNA)加入含有寡核苷酸探針陣列(見上)的測定區(qū)中，緩沖液用例如6XSSPE-T或其它，任選地含有能降低非特異性結(jié)合的試劑(如約0.5mg/ml降解的鯡或鮭精DNA，或酵母菌RNA)，并在經(jīng)驗確定的溫度下培養(yǎng)19分鐘到至少18小時(一優(yōu)選實施例中約3小時)，雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性可能與此錨和接頭的錨特異性部分結(jié)合所用嚴(yán)謹(jǐn)性相同或較低。其它類型探針的設(shè)計和應(yīng)用也如上述是本領(lǐng)域的常規(guī)。
一實施例中，某給定位點中所有或基本上所有的與錨結(jié)合的接頭都含有相同(或基本上相同)的針對某一個特定感興趣的靶分子的特異性探針。另一實施例中，某給定位點中與錨結(jié)合的一個或多個接頭含有多個不同的探針，它們是針對多個不同靶分子的。這些探針可位于接頭中分支結(jié)構(gòu)部分，或優(yōu)選可以線性關(guān)系排列，它們可以是同樣的物質(zhì)(如都是核酸或都是肽序列)，或各種物質(zhì)的組合。事實上，每個接頭含多個探針增加了一特定位點可檢測的靶分子數(shù)。一實施例中，給定接頭上的多個探針均對感興趣的特定靶分子有特異性(如對一感興趣mRNA的不同部分有特異性，或?qū)ο鄳?yīng)于該mRNA不同部分的核酸酶保護(hù)片段有特異性)，這得以提高靶分子試驗(如樣品中存在少量靶分子)的靈敏度。接頭上探針的數(shù)目可為約2-50，優(yōu)選約2、4或10個。
當(dāng)然，含有多個不同探針的接頭也有利于只含一個(非重復(fù))測定區(qū)的表面的應(yīng)用。
接頭的錨特異性和靶特異性部分可通過各種共價或非共價鍵連接，連接鍵的性質(zhì)對本發(fā)明不重要。此二部分可直接或通過一中間分子連接。一實施例中，接頭的二部分是寡核苷酸，它們可通過共價鍵如磷酸二酯鍵連接，形成一共線核酸。另一實施例中，錨特異部分是寡核苷酸，而靶特異部分是一受體，例如一受體蛋白質(zhì)，此二部分可通過生物素鏈霉親和素分子的相互反應(yīng)連接，例子見圖3所述。已知這種連接的許多變化(見Niemeyer等(1994)，NAR.22；5530-5539)?；虼硕糠挚芍苯舆B接，例如寡核苷酸可酰胺化再通過酰胺鍵直接連接(如交聯(lián))于肽或蛋白質(zhì)，或通過酰胺鍵或脂鍵連接于一膜成分。形成這種共價或非共價鍵的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)并且不難優(yōu)化。接頭的錨特異性和靶特異性部分也可存在空間臂序列(如核酸)。
兩物質(zhì)結(jié)合后(通過培育兩種核酸、兩種蛋白質(zhì)、一蛋白加一核酸，或其它)形成一復(fù)合物(如錨/接頭復(fù)合物)，可任選項地處理(如洗滌)產(chǎn)生的復(fù)合物去掉未結(jié)合物(如接頭)，所用條件要能保留特異性相互反應(yīng)完全，而去掉非特異性結(jié)合物質(zhì)。例如，在達(dá)到復(fù)合(如錨/接頭復(fù)合)所用條件相同或稍微更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下，洗滌反應(yīng)混合物約1-10次或更多。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白可產(chǎn)生各種類型的錨和接頭夾心物。例如，可使第一組接頭，每個接頭具有錨特異性第一部分和針對第二組接頭之一的特異性第二部分，結(jié)合于一錨陣列(如該錨具有基本上相同的序列)，如此等等。事實上，夾心的這第二層使得第一組錨(如相同的寡核苷酸)轉(zhuǎn)變成具有不同“偶聯(lián)”錨特異性的不同陣列。如需要，不同組的接頭和錨可相互共價或非共價接合。
可用常規(guī)技術(shù)制造本發(fā)明的組合。
可用于本發(fā)明的某些表面不難從供貨商處購得。一優(yōu)選實施例中，此表面是96-、384-或1536-孔微滴板，如Corning Costar銷售的修飾板。或者，含孔表面可進(jìn)一步含有淺凹或“凹痕”，可通過顯微加工鋁或鋼等物質(zhì)制備一個模子，然后將塑料或類似物質(zhì)顯微注入此模子中，形成圖4所述結(jié)構(gòu)來形成這種淺凹或“凹痕”?；蛘?，圖4所示含玻璃、塑料、陶瓷等的結(jié)構(gòu)可從圖5所述的三段材料組裝第一段稱為孔分隔(圖5a)，其將形成樣品孔之間的分隔；第二段稱為亞區(qū)(圖5b)，其形成各測定孔內(nèi)的亞區(qū)或淺凹；第三段稱為底(圖5c)將形成此板的底部，測定孔的下表面?？追指艨梢允?，例如一片材料如硅酮，間隔著一些洞，當(dāng)此三段材料組裝時各洞將形成測定孔的壁。亞小區(qū)可以是一片材料如硅酮，形狀塑造成篩子或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。底可以是一平片材料如玻璃，是用于生化試驗的典型微板下部的形狀。如圖5所示，底的上表面可以是平的，或可以形成淺凹，按亞區(qū)形狀排列以在各樣品孔中提供完全的亞區(qū)或孔?？捎脴?biāo)準(zhǔn)方法，如組裝硅晶片所用的方法組裝這三段材料。
可用常規(guī)技術(shù)，如商品化寡核苷酸合成儀，和/或?qū)⒑铣傻膩喥芜B接在一起來合成錨、接頭或檢測寡核苷酸。太長而不易用此類方法合成的核酸可通過擴(kuò)增方法，如PCR，用常規(guī)程序產(chǎn)生。本發(fā)明一實施例中，可用各種常規(guī)技術(shù)，包括光蝕刻、絲網(wǎng)印刷化學(xué)結(jié)合、噴墨技術(shù)沉積、毛細(xì)管、篩網(wǎng)或液體通道芯片、采用電極陣列的電化學(xué)成模、與釘或刺接觸、或烘烤或UV照射濾器后變性，在測定區(qū)的表面內(nèi)或表面上設(shè)置錨核酸，如寡核苷酸錨(見Rava等(1996)，美國專利號5,545,531；Fodor等(1996)，美國專利號5,510,270；Zanzuchi等(1997)，美國專利號5,643,738；Brennan(1995)，美國專利號5,474,796；PCT WO 92/10092PCTWO 90/15070)。錨可置于測定區(qū)的表面頂部，或當(dāng)采用聚丙烯酰胺凝膠墊時，可包埋在表面內(nèi)，其方式應(yīng)使某些錨突出於表面而能與接頭相互反應(yīng)。一優(yōu)選實施例中，在寡核苷酸錨的5’端產(chǎn)生一游離氨基，將其以經(jīng)驗確定的常規(guī)濃度(如約1微摩)溶于PH8.5，50mM磷酸緩沖液和1mM EDTA中，并用Pixus nanojet分散器(Cartesian Technologies)以約10.4納升液滴加在測定孔表面特定部位上，此表面是新的乾燥DNA結(jié)合板(Corning Costar)。。取決于寡核苷酸結(jié)合和蒸發(fā)量的相對速度，必須控制制備時孔的濕度。另一實施例中，可用常規(guī)方法，如光激活脫保護(hù)生長的寡核苷酸鏈(如與利用位點指導(dǎo)“遮蔽罩”結(jié)合)，或用nanojet分散器模式化分散無活性化合物的納升液滴，在表面上直接合成寡核苷酸錨?？墒顾猩L中的序列脫保護(hù)以接受一個核苷酸，將該核苷酸加入此表面。另一實施例中，用常規(guī)技術(shù)使寡核苷酸錨通過其3’端結(jié)合于此表面。
也可常規(guī)產(chǎn)生肽、蛋白質(zhì)、凝集素、螯合體、塑料和其它類型的錨或接頭分子，可用適合的現(xiàn)有技術(shù)將錨安置在表面內(nèi)或表面上(見Fodor等(1996)，美國專利號5,510,270；Pirrung等(1992)，美國專利號5,143,854；Zanzuchi等(1997)，美國專利號5,643,38；Lowe等，1985美國專利號4,562,157；Niemeyer等(1994)，NAR.22；5530-5539)。
本發(fā)明某些實施例中，以上公開的組合可用于各種篩選程序，和/或獲得關(guān)於探針或靶分子的水平、活性或結(jié)構(gòu)的信息。這些試驗稱為多陣列平板篩選(MAPS)法或試驗，用于此試驗的含錨或錨加探針陣列的表面，稱為MAPS陣列或MAPS板。
可以任何順序組裝反應(yīng)混合物的成分、試驗、或篩選程序。例如，可依次組裝錨、接頭和靶分子；或在有或沒有報道劑時可在溶液中組裝靶和接頭分子，然后與錨接觸。
本發(fā)明一實施例涉及檢測至少一種靶分子的方法，此方法包括a)使可能含有所述靶分子的樣品與一雙功能接頭接觸，該接頭含有特異性針對一寡核苷酸錨的第一部分，和含有針對所述靶分子的特異性探針的第二部分，接觸是在能有效獲得所述靶分子和所述接頭之間第一雜交產(chǎn)物的條件下進(jìn)行b)在能有效獲得所述第一雜交產(chǎn)物和組合之間第二雜交產(chǎn)物的條件下，使所述第一產(chǎn)物與所述組合接觸，其中，所述組合在加入所述第一產(chǎn)物前含有1)含多個空間上相分離區(qū)域的表面，其中至少二個區(qū)域基本相同，各區(qū)域含有2)至少8個不同的寡核苷酸錨c)使所述第一雜交產(chǎn)物或所述第二雜交產(chǎn)物與標(biāo)記的檢測探針接觸，和d)檢測所述檢測探針。
可以高通量方式進(jìn)行以下各種試驗或程序，其中可在每塊板或表面上快速和同時檢測大量樣品(如多達(dá)約864、1036、1536、2025或更多樣品，取決于此組合中測試區(qū)的數(shù)量)。還有，可一次測定多塊板或表面。例如，在尋找藥物的方法中，可將大量的樣品(各含一候選藥物，如一組成性化學(xué)物文庫的成員，如各種小分子、肽、寡核苷酸或其它物質(zhì))加入到上述組合的分離的區(qū)域中，或可加入到生物或生化樣品中，再將它們加入到所述組合的分離區(qū)域中，與區(qū)域中的探針陣列一起培育，對各份樣品進(jìn)行測試。隨著高密度微型板、產(chǎn)生和從密度更高的微型板收集數(shù)據(jù)的DNA點樣的技術(shù)和方法如激光技術(shù)、機(jī)器人技術(shù)、改進(jìn)的分散器、高級檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理軟件最近的進(jìn)展和不斷發(fā)展，本發(fā)明的方法可用于每天篩選和分析數(shù)千或數(shù)萬種化合物。
例如，一實施例中，探針是寡核苷酸，此試驗可能是診斷大量樣品中是否存在基因變異或缺陷(如與疾病膀胱纖維病變有關(guān)的多態(tài)性或特定突變，見Iitia等(1992)，分子和細(xì)胞探針(Molecular and Cellular Probes)。6；505-512)；病原性微生物(如細(xì)菌、病毒、原蟲、它們的宿主是動物，包括人，或植物)、或mRNA轉(zhuǎn)錄模式(用于診斷特定生理狀態(tài)或疾病)的診斷性核酸或多核苷酸篩檢試驗(如結(jié)合或其它試驗)。可利用含EST(包括全長拷貝)部分的核酸探針陣列來評價EST衍生(或其它)細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄模式。核酸探針也可以檢測肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)中能與特定核酸序列特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。
類似地，一實施例中，此探針是抗原結(jié)合分子(如抗體)，此試驗可以篩檢變體蛋白，或蛋白質(zhì)表達(dá)模式以診斷特定生理狀態(tài)或疾病。參見圖40和41，說明了可檢測的分子類型。
另一實施例中，本發(fā)明的組合可用于監(jiān)測生化反應(yīng)，如蛋白質(zhì)、核酸、小分子等的相互反應(yīng)，例如，抗原和抗體、受體(如純化的受體或與細(xì)胞膜結(jié)合的受體)和其配體、激動劑和拮抗劑、酶(如蛋白酶或激酶)和其底物之間的相互反應(yīng)，底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的量增加或減小，及其它等等。這類生化試驗可用于特征分析探針或靶分子的性質(zhì)，或作為篩選試驗的基礎(chǔ)。例如，為篩檢樣品中是否存在特定蛋白酶(如參與血液凝結(jié)的蛋白酶，如蛋白酶Xa和VIIa)，可在含有各感興趣蛋白酶的特異性熒光底物的探針的此組合上測試這些樣品。如某核酸蛋白酶能結(jié)合和切割某底物，而該底物會發(fā)熒光，通常由于兩個能量轉(zhuǎn)移對之間的切斷和分離，可測到信號。在另一實施例中，為篩檢樣品中是否存在特定的激酶(如Sre，酪氨酸激酶，或ZAP70)，可在含有能被感興趣激酶之一選擇性磷酸化的肽的探針組合上測試這些樣品。采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)測定條件，可將樣品與底物陣列在適當(dāng)?shù)木彌_液和必須的協(xié)同因子中培育一段經(jīng)驗確定的時間。(在某些試驗中，如研究感興趣激酶活性調(diào)節(jié)因子的生化試驗中，可調(diào)整各激酶的濃度，使各底物磷酸化的速率相似)。在經(jīng)驗確定的條件下處理各反應(yīng)物去掉激酶和不要的反應(yīng)成分(任選)后，將其與可檢測試劑，如熒光素標(biāo)記的抗磷酰酪氨酸或抗磷酰絲氨酸抗體(如濃度約10nM左右)一起培育，通過檢測產(chǎn)生的信號來檢測磷酸化底物。另一實施例中進(jìn)行結(jié)合試驗。例如，可在相應(yīng)的磷酸化肽的探針陣列上檢測SH2結(jié)構(gòu)域如GRB2 SH2或ZAP70 SH2；或在特定受體的探針陣列上篩檢血清中的免疫缺陷。另外，可在這類陣列模式中進(jìn)行酶聯(lián)試驗。本發(fā)明的組合也可用于檢測活性比野生型酶高或低的突變酶，或篩選各種藥物包括除草劑或殺蟲劑。
當(dāng)然，MAPS試驗可用于定量測定樣品中活性靶分子的量，只要探針不完全被靶分子占據(jù)，即不超過約90％的探針位點被靶分子占據(jù)(或反應(yīng)或雜交)。在這些情況下可定量靶分子，因為靶分子越多與探針結(jié)合越多。另一方面，在90％以上的探針位點被結(jié)合時，更多的靶分子基本上不會提高結(jié)合于探針的靶分子量。上述任何類型的靶分子都可用此方式定量測定。例如，實施例6描述了靶寡核苷酸的定量測定。此外，已顯示，即使存在過量的靶分子(如其量大到使MAPS探針陣列中的探針飽和)，可通過在該結(jié)合混合物中加入已知量的未標(biāo)記靶分子，可轉(zhuǎn)移此反應(yīng)的靈敏度而得以定量檢測如此大量的靶分子。
另一個實施例中，可用本發(fā)明的組合物篩選靶與所述探針相互反應(yīng)的制劑。一制劑可直接或間接與探針，靶分子或靶加探針形成的復(fù)合物反應(yīng)，而調(diào)節(jié)靶/探針相互反應(yīng)。此種調(diào)節(jié)可采取各種方式，包括但不限于提高或降低靶對探針的親和力，提高或降低靶和探針結(jié)合的速度，竟?fàn)幓蚍歉偁幮砸种铺结樑c靶的結(jié)合，提高或降低探針或靶分子的活性，此活性在某些情況上可增強(qiáng)或減弱探針/靶的相互反應(yīng)。這些制劑可以是人造的或天然生成的物質(zhì)。另外，可采用這些制劑的未改變狀態(tài)或與其它物質(zhì)的凝聚物；它們可直接或通過一特異性物質(zhì)共價或非共價結(jié)合于一結(jié)合成員。例如，為了鑒定潛在的“血緩沖劑”，或能與蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)之一的酶反應(yīng)引起血凝的制劑，可測試感興趣蛋白酶的混合物與多種候選制劑的反應(yīng)，然后測定上述活性?？捎糜诒景l(fā)明的制劑的其它例子非常多種多樣，包括除草劑和殺蟲劑。實例16和17描述了選擇性抑制特定激酶的制劑，或選擇性抑制SH2結(jié)構(gòu)域和磷酸化肽之間相互反應(yīng)的抑制劑的高通量試驗。
另一個實施例中，可用本發(fā)明的組合來篩選能調(diào)節(jié)基因表達(dá)模式的制劑。例如，可采用寡核酸陣列來鑒定mRNA種類，一組與特定生理狀態(tài)或發(fā)育階段相關(guān)，或與疾病相關(guān)的基因(相關(guān)基因、RNA、或表達(dá)模式)表達(dá)此種模式的mRNA。術(shù)語”相關(guān)”或”相關(guān)性”指RNA的表達(dá)模式與細(xì)胞的生理狀況相關(guān)，，但不一定所述RNA的表達(dá)負(fù)責(zé)或引起該特定生理狀況。例如，可監(jiān)定到一個小亞組的mRNA被表達(dá)，上調(diào)或下調(diào).在細(xì)胞起著具體疾病狀態(tài)的模型作用時，與未顯示病理表型的的正常細(xì)胞相比，表達(dá)模式的這種改變可作為患病的指征(“指示”基因，RNA，或表達(dá)模式)。術(shù)語”相關(guān)性”和”指示物”可或互換使用。例如，用腫瘤促進(jìn)劑如十四烷佛波醇處理的細(xì)胞可能顯示模擬腫瘤生長早期階段的基因表達(dá)模式。輸在另一種癌癥模型中，當(dāng)用腺病毒感染小鼠胰島瘤細(xì)胞(如細(xì)胞系TGP61)時，其顯示c-Jun和MIP-2表達(dá)提高，而管家基因如GAPDH和L32基本保持不受影響。
在與患病模型的細(xì)胞直接或間接，體內(nèi)或體外(如組織培養(yǎng))接觸后，能調(diào)節(jié)指示物表達(dá)模式的制劑可作為患此病生物(如人或患病動物或植物)的治療制劑或藥物。這些制劑也可通過直接，如在體外(試管)表達(dá)系統(tǒng)接觸此核酸來調(diào)節(jié)表達(dá)模式。如本文所用，”調(diào)節(jié)”指引起參與檢測反應(yīng)的分子量和/或活性提高或降低。可用本發(fā)明的組合來篩選這些制劑。例如，可使一系列細(xì)胞(患病模型的)與一系列制劑接觸(如約10分鐘至48小時或更多)。采用常規(guī)的本領(lǐng)域已知的方法(如商品化試劑盒)，可制備總RNA或mRNA提取物。如果需要擴(kuò)增RNA的量，可采用標(biāo)準(zhǔn)方法如RT-PCR擴(kuò)增(見Innis等編(1996)，PCR擴(kuò)增方法向?qū)?PCR ProtocolsA Guide toMethods in Amplification)。學(xué)院出版社，紐約)。可使此提取物(或它們的擴(kuò)增產(chǎn)物)接觸(或與其共培育)多個基本上相同的含有針對相應(yīng)檢測RNA的探針的陣列，可鑒定那些與該檢測物表達(dá)模式變化有關(guān)的制劑。實施例15描述的高通量試驗可篩選能改變疾病相關(guān)基因表達(dá)的化合物。
類似的，可鑒定能調(diào)節(jié)與特定生理狀態(tài)或發(fā)育階段相關(guān)表達(dá)模式的制劑，這種制劑可以是人造的或天然產(chǎn)生的物質(zhì)，包括環(huán)境因子如參與胚胎發(fā)育或調(diào)節(jié)生理反應(yīng)的物質(zhì)，或農(nóng)業(yè)工商業(yè)中重要的物質(zhì)如除草劑或殺蟲劑。另外，可采用這類制劑的改變狀態(tài)或其與其它物質(zhì)的凝聚物，可使它們直接或通過一特異性結(jié)合物共價或非共價結(jié)合于一結(jié)合成員。
本發(fā)明另一實施例是用于檢測樣品中至少一種靶分子的試劑盒，該試劑盒包含有1)含多個空間上相分離區(qū)域的表面，其中至少二個區(qū)域基本相同，各區(qū)域含至少8個不同的寡核苷酸錨，或本文所述其它類型之一，和2)一容器，該容器含有至少一個雙功能分子，此分子具有針對至少一個所述錨的特異性第一部分，和含有針對至少一個所述靶分子的探針的第二部分。
在一實施例中，提供上述1)的表面和使雙功能接頭分子結(jié)合至少一個所述錨，此雙功能接頭分子具有針對至少一個所述錨的特異性第一部分，和含有針對至少一個所述靶分子的探針的第二部分。此說明書可包括，例如(但不限于)此表面上各錨的描述，表明有多少種錨，它們位于表面何處，和使接頭與錨附著(連接，結(jié)合等)的方法。例如，如果錨是寡核苷酸，此說明書可包括各種錨的序列，根據(jù)此序列，試驗者可設(shè)計出與這些錨特異性反應(yīng)(雜交)的接頭的互補(bǔ)性錨特異性部分。如果錨是肽，此說明書可提供關(guān)於能與這些肽特異性反應(yīng)的抗體信息。此說明書還可包括使錨和接頭結(jié)合的方法，如雜交(或其它結(jié)合類型)的條件，試劑，溫度，培育時間，去掉未結(jié)合分子(如洗滌)的條件和試劑等。另外，該說明書可包括本文所述各類控制接頭的結(jié)構(gòu)和用法，和定量，標(biāo)準(zhǔn)化，”微調(diào)”，或校準(zhǔn)所述組合進(jìn)行試驗的方法。此說明書可包括本申請書所述的任何參數(shù)，條件或?qū)嵤├?，對于這些本領(lǐng)域技術(shù)人員都可按常規(guī)方法進(jìn)行。
如本申請書所述，實施者可使含所述錨陣列的本發(fā)明表面結(jié)合各種類型的接頭，從而使各種各樣的探針陣列程序化。而且，實施者可從本發(fā)明的表面去除某組接頭，并在此表面加上另一組接頭(與第一組相同或不同)，使此表面可重復(fù)利用多次。這種靈活性和重復(fù)就用能力構(gòu)成了本發(fā)明的另一優(yōu)點。
另一實施例中，用本發(fā)明的組合繪制EST(表達(dá)序列標(biāo)記)圖，即MAP試驗可用于確定一種或一組EST是否產(chǎn)生于同一基因的不同部分，和是否是唯一的。圖18，19，20和21說明了這些試驗。在此實施例中，說明一種測定16種EST之一是否”連接”于一共同基因。此試驗(見圖18)第一步是組裝待繪制圖譜的各EST的陣列，含有對應(yīng)其的至少一個寡核苷酸探針，繪制數(shù)目等于(或多于)EST的許多陣列并分布于一表面的分離區(qū)域(如孔)中。在所述實施例中，組合的此表面含有16孔，各孔含16種不同EST特異性寡核苷酸的陣列，編號1-16?！皩?yīng)于”一EST的寡核苷酸(EST特異性)是與該EST充分互補(bǔ)的，在所選擇的條件下，該寡核苷酸將與此EST特異性雜交，但不與其它無關(guān)EST雜交。此種類型的EST相應(yīng)寡核苷酸(在優(yōu)選條件下)可特異性結(jié)合從原先產(chǎn)生此EST的基因合成的cDNA的編碼或非編碼鏈。優(yōu)化設(shè)計寡核苷酸要考慮的因素和雜交參數(shù)以實現(xiàn)特異性雜交在本文中有所討論.。為組裝此陣列，制備接頭分子，其各含有針對通用陣列錨之一的特異性部分，和含有對應(yīng)于待繪制圖譜EST之一的寡核苷酸探針部分；并使這些接頭結(jié)合于本文所述的錨分。.在后續(xù)步驟中，將含有核酸混合物(如mRNA或單鏈或變性cDNA)(其可能性含有與這些寡核苷酸探針之一或多個互補(bǔ)的序列)加入含一探針陣列的各區(qū)(孔)。，然后在經(jīng)驗確定的常規(guī)優(yōu)選條件下培育該混合物，使核酸結(jié)合于互補(bǔ)探針。如果有幾個EST特異性探針與一核酸的不同部分互補(bǔ)，該核酸將結(jié)合于陣列中這些探針?biāo)幉课幻恳晃稽c。
在后續(xù)步驟中，將不同的檢測寡核苷酸(說明性實施例子中為檢測寡核苷酸#1-16)加入各區(qū)域(孔)中(見圖19)。為待繪制圖譜的各EST設(shè)計了檢測寡核苷酸，各EST特異性檢測寡核苷酸對應(yīng)于EST而非探針寡核苷酸的不同(至少部分不重疊)部分，這樣探針和檢測寡核苷酸相互不會干擾?？紤]到，例如圖21所示的EST對應(yīng)于圖18-20的EST1，2和6。圖21表明EST#1和#2二者獲自基因X(它們是”連接”的)，而EST#6獲自一不同的無關(guān)基因。如果將一等分含有mRNA混合物，包括基因X產(chǎn)生的mRNA的樣品與圖18-20所示探針陣列一起培育，在優(yōu)化條件下，基因X的mRNA將與探針1和2的位點雜交但不與探針6的雜交。(當(dāng)然各mRNA必須以超過其可能雜交的探針之和的摩爾量加入)。如果將檢測寡核苷酸1加入?yún)^(qū)域(孔)1，它將與已結(jié)合在該探針陣列位點1和2的XmRNA雜交，但不與位點6雜交。類似的，如果檢測寡核苷酸2加入到另一孔，比如孔#2，它也結(jié)合于位點1和2而非位點6。以這種方式可高通量確定那個EST連接該同一基因各部分的密碼，那個EST是獨特的。對于圖20推測的實施例，同一基因的前3個編碼部分，另一基因的后5個EST編碼部分和其它的EST看來不相連接。本申請書中討論了關(guān)于其它MAPS試驗的雜交條件，任選的洗滌步驟，檢測方法等。為了驗證MAPS試驗獲得的連接資料，可用EST特異性寡核苷酸對作為有義和反義引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，每對連接的EST應(yīng)產(chǎn)生一PCR產(chǎn)物。注意到進(jìn)行這種配對PCR試驗可直接測定連接鏈無須采用連接酶MAPS試驗；然而可能需要許多反應(yīng)物，必須合成各EST引物作為有義和反義鏈。此實施例說明需要180種反應(yīng)物。
一方面，本發(fā)明涉及檢測多個EST中那個與某給定核酸互補(bǔ)的方法，此方法包括a)培育一固定的寡核苷酸探針陣列與測試樣品，此陣列中至少一個探針對應(yīng)于一個所述EST，而測試樣品可能含有所述給定的核酸，以獲得所述寡核苷酸和所述核酸的雜交產(chǎn)物b)培育所述雜交產(chǎn)物與一檢測寡核苷酸，該檢測寡核苷酸對應(yīng)于所述寡核苷酸探針之一所對應(yīng)的EST，但針對該EST的不同部分而非所述寡核苷酸探針，和c)檢測所述陣列中那個寡核苷酸探針被所述檢測寡核苷酸所標(biāo)記其中所述寡核苷酸探針陣列固定于一組合的某區(qū)域上，所述組合含有1)含多個基本上相同的空間上相分離區(qū)域的表面，區(qū)域數(shù)目等于待測EST的區(qū)域，各區(qū)域含2)數(shù)目等于待測EST的許多不同的錨，各錨與3)一雙功能接頭結(jié)合，此雙功能接頭具有針對此錨的特異性第一部分，和含有對應(yīng)于至少一個所述EST的寡核苷酸探針的第二部分。
另一方面，本發(fā)明涉及的上述方法，其中所述EST可與所述核酸互補(bǔ)，各所述EST含有兩個不同的寡核苷酸序列，第一個序列確定了對應(yīng)于所述EST的寡核苷酸探針，第二個序列確定了對應(yīng)于所述EST的檢測寡核苷酸，此方法包括a)使含有所述核酸分子的樣品與一組合中至少一個區(qū)域接觸，其中所述區(qū)域含一寡核苷酸探針陣列，至少一個探針對于一個ESTb)培育所述樣品與所述區(qū)域，從而使所述核酸分子結(jié)合于所述EST對應(yīng)的寡核苷酸探針，該探針與所述核酸某部分互補(bǔ)c)將含有結(jié)合于一個或多個所述EST對應(yīng)寡核苷酸探針的所述核酸分子，與對應(yīng)于一EST的檢測寡核苷酸一起培育，所述陣列寡核苷酸探針之一也對應(yīng)于此EST，從而使檢測寡核苷酸與已結(jié)合于所述給定寡核苷酸探針的核酸分子，或與所述核酸互補(bǔ)的其它寡核苷酸探針結(jié)合d)檢測所述檢測寡核苷酸的存在，從而鑒定所述陣列中那個EST對應(yīng)寡核苷酸探針與此核酸的結(jié)合于所述給定寡核苷酸EST對應(yīng)探針的部分互補(bǔ)，從而鑒定那個EST與所述給定核酸互補(bǔ)，其中所述寡核苷酸探針陣列固定在一組合的一區(qū)域上，所述組合含有1)包含多個空間上相分離區(qū)域的表面，基本上相同的區(qū)域等于待測EST，各區(qū)域含有2)數(shù)目等于待測EST的許多不同的錨，各錨與3)一雙功能接頭結(jié)合，此雙功能接頭具有針對此錨的特異性第一部分，和含有對應(yīng)于至少一個所述EST的寡核苷酸探針的第二部分。
EST繪圖試驗中的組分可以任何順序組裝。例如，可依次組裝錨，接頭和EST；或在存在或缺乏報道劑時可在溶液中裝配接頭和EST，然后加入到錨中。
另一方面，本發(fā)明涉及檢測多個EST中那個與某給定核酸互補(bǔ)的方法，所述方法包括a)將一批雙功能寡核苷酸接頭分子與測試樣品一起培育，該接頭分子各含有一作為探針的對應(yīng)于至少一個所述EST的第一部分，和針對一寡核苷酸錨的特異性第二部分，而此樣品可能含有所述給定的核酸，以獲得所述寡核苷酸探針和所述核酸之間的第一雜交產(chǎn)物b)培育所述第一雜交產(chǎn)物與一固定的寡核苷酸錨陣列，此陣列中各寡核苷酸錨對應(yīng)于至少一個所述接頭分子的錨特異性部分，從而形成含所述錨，所述寡核苷酸探針和所述核酸的第二雜交產(chǎn)物，和c)將所述第一或第二雜交產(chǎn)物與檢測寡核苷酸一起培育，該寡核苷酸對應(yīng)于所述寡核苷酸探針對應(yīng)的EST，但特異性針對此EST的不同部分而不是所述寡核苷酸探針，和d)檢測所述陣列中那個寡核苷酸探針被所述檢測寡核苷酸所標(biāo)記其中所述寡核苷酸錨陣列固定在一組合的一區(qū)域上，所述組合含有1)包含多個空間上相分離區(qū)域的表面，基本上相同的區(qū)域等于待測EST，各區(qū)域含有2)數(shù)目與待測EST相等的不同的錨當(dāng)然，上述繪制EST圖的方法可用于繪制對任何感興趣的核酸的測定序列(如多核苷酸)，例如，可確定對同一基因DNA的二個或多個克隆的DNA片段或cDNA圖。這種方法有助于闡明復(fù)雜的長基因的結(jié)構(gòu)。以類似方法，可確定對同一基因DNA的一個或多個剪接序列或編號序列。這種確定可用于鑒別正常與以不同剪接模式為特征的疾病的診斷試驗。繪圖法的其它許多用途是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道。
另一方面，本發(fā)明涉及檢測多個多核苷酸中那一個與某給定核酸互補(bǔ)。
其中一個或多個所述多核苷酸可能與所述核酸互補(bǔ)和各所述多核苷酸含二個不同寡核苷酸序列，此方法第一步確定對應(yīng)于所述多核苷酸的寡核苷酸探針，第二步確定對應(yīng)于所述多核苷酸的檢測寡核苷酸，這二步包括a)使含所述核酸的分子與所述組合的至少一個區(qū)域接觸，其中所述區(qū)域含寡核苷酸探針陣列，至少一種探針對應(yīng)于各所述多核苷酸。
b)培育所述樣品與所述區(qū)域，使所述核酸分子與所述多核苷酸對應(yīng)的寡核苷酸探針結(jié)合，該探針與所述核酸的一部分互補(bǔ)。
c)培育含有與一個或多個所述多核苷酸對應(yīng)的寡核苷酸探針結(jié)合的所述核酸分子的區(qū)域與一檢測寡核苷酸，該檢測寡核苷酸對應(yīng)于一多核苷酸，而所示陣列的一個寡核苷酸探針對應(yīng)于此多核苷酸，因而使檢測寡核苷酸與已結(jié)合于所述給定的寡核苷酸探針或與所述核酸互補(bǔ)的其它寡核苷酸探針的核酸分子結(jié)合。
d)檢測是否存在所述檢測寡核苷酸，從而鑒定所述陣列中那些多核苷酸相應(yīng)的寡核苷酸探針與某核酸多部分互補(bǔ)，該核酸結(jié)合于所述給定的多多核苷酸相應(yīng)的寡核苷酸探針，從而鑒定出那些多核苷酸與所述給定核酸互補(bǔ)。
其中，所述寡核苷酸探針陣列固定在一組合的一區(qū)域中，所述組合含有1)一表面，該表面含有空間上相分離的、基本上相同的數(shù)目與待測多核苷酸數(shù)目相等的區(qū)域，各區(qū)域含有。
2)與待測多核苷酸數(shù)目相等的許多不同的錨，各錨與。
3)一雙功能接頭結(jié)合，該接頭的第一部分特異性對此錨，第二部分含有對應(yīng)于至少一個所述多核苷酸的寡核苷酸探針。
本發(fā)明另一方面，上述繪制EST或其它多核苷酸圖的方法包括在一步或多步驟之間除去樣品中的未結(jié)合部分。
本發(fā)明另一實施例中，通過逆轉(zhuǎn)錄將感興趣的一個或多個靶RNA(如mRNA或其它類型RNA)轉(zhuǎn)變成cDNA，然后使這些cDNA與一探針陣列雜交。圖8說明了這種試驗。如本文所述制備細(xì)胞或組織的RNA提取物(或純化的mRNA)，然后在RNA樣品中加入逆轉(zhuǎn)錄酶和感興趣RNA的特異性寡核苷酸引物，采用本領(lǐng)域已知的可用常規(guī)確定和優(yōu)化的條件和程序，產(chǎn)生cDNA的第一鏈。術(shù)語“特異性”引物，指與感興趣mRNA充分互補(bǔ)能在選定的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與其結(jié)合并被逆轉(zhuǎn)錄酶識別，但不結(jié)合不需要的核酸的引物(見上述實現(xiàn)特異性雜交的適當(dāng)反應(yīng)條件的討論)。
可用各種核糖核酸酶之一或化學(xué)方法如堿處理去除殘余RNA-RNA提取物中該特異性引物不識別的mRNA，和/或其它類型的污染RNA如tRNA或rRNA，留下單鏈cDNA，然后使其與MAPS探針陣列接觸。此方法中采用逆轉(zhuǎn)錄酶大大減少了對廣泛處理RNA的需要，RNA對核酸酶降解敏感而難以留存。另外，特異性逆轉(zhuǎn)錄酶引物所到的額外特異性給此試驗添加了一層特異性。
任選的可在與探針陣列雜交前擴(kuò)增上述cDNA以提高信號強(qiáng)度。上述逆轉(zhuǎn)錄酶寡核苷酸引物5’端可含有針對RNA聚合酶(如，T7，T3或SP2聚合酶等)引發(fā)位點的特異性序列(可長約22-27個核苷酸)。在圖8所示實施例中，將T7啟動子序列加入逆轉(zhuǎn)錄酶引物中。任選地，可用PCR和適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)一步擴(kuò)增這樣產(chǎn)生的mRNA，或可擴(kuò)增cDNA本身。轉(zhuǎn)錄和PCR的方法是常規(guī)和本領(lǐng)域熟知的。
PCR的靈活性使得可在本發(fā)明的方法中作許多改進(jìn)變化。在一實施例中，用于擴(kuò)增靶分子的一個或二個PCR引物可含有使產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物特異性或非特異性結(jié)合固相載體的化學(xué)修飾。這類化學(xué)修飾包括例如5’酰胺化，從而可結(jié)合于Costar的DNA結(jié)合板表面(如經(jīng)N-氧琥珀酰亞胺脂修飾的表面，或馬來酸酐包被的板如Pierce的Reaci-Bind板，Rockford.IL)。產(chǎn)生含這類化學(xué)修飾寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法。含這類修飾引物的PCR產(chǎn)物可結(jié)合于任何需要的載體，包括固相載體如微滴孔的內(nèi)壁、珠(如磁性或非磁性珠)或上述類型的表面。當(dāng)然，開始PCR反應(yīng)之前PCR引物也可結(jié)合于載體，可用過量的結(jié)合引物不洗滌重復(fù)幾輪PCR，使產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物保持與載體的結(jié)合。擴(kuò)增的靶序列結(jié)合于載體有利于靶分子與含有錨和/或接頭的表面接觸(雜交)之前或其接觸之后洗滌(或純化)靶分子，然后從此表面釋放下來。
另一實施例中，用于擴(kuò)增靶分子的一個或二個PCR引物可含有一個或多個限制性酯切位點，將此限制位點導(dǎo)入兩端之一的毗鄰部位或側(cè)接感興趣的靶序列?？稍赑CR擴(kuò)增的靶分子接觸(雜交)含錨和/或接頭的表面前后在其中加入限制性位點。以此方式導(dǎo)入的限制性位點通過提供側(cè)接靶序列的克隆位點而有利于擴(kuò)增靶分子的克隆。限制性位點也有利于擴(kuò)增序列的純化。例如，在PCR引物中在靶特異性序列和使其結(jié)合于載體的化學(xué)修飾之間可安置一個或多個限制性位點。當(dāng)靶分子經(jīng)PCR擴(kuò)增后，利用該修飾的PCR引物通過此化學(xué)修飾結(jié)合于載體，可洗滌，然后在毗鄰靶序列的限制性位點切斷，從而釋放出洗脫的靶分子。見圖23。
當(dāng)然，上述方法也可利用切割位點而不是限制性酶位點，如可用特異性受體或檢測接頭的特異性序列(其不必存在于靶分子中)。
當(dāng)然，上述引物修飾都可用于任何需要的組合中，可在試驗的任何一階段將其加入擴(kuò)增產(chǎn)物。圖21和22顯示上述幾種引物修飾加入拉增靶分子的方法。
可用在MAPS板上進(jìn)行試驗前用逆轉(zhuǎn)錄酶和/可PCR擴(kuò)增將mRNA靶分子轉(zhuǎn)變成cDNA的上述方法代替標(biāo)準(zhǔn)的MAPS試驗程序來進(jìn)行上述RNA為基礎(chǔ)的任何試驗。
本發(fā)明方法中手所用的核酸，如靶分子檢測或核酸酶保護(hù)片段(本文有描述)的寡核苷酸，可用常規(guī)的各種酶促方法之一，包括PCR和連接酶反應(yīng)來擴(kuò)增。一種擴(kuò)增方法是轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(見Abe等(1993)，J Clin.Microbiol，313274)，也見圖32，36-39和42。
本發(fā)明另一實施例中，使感興趣的一個或多個靶核酸與特異性多核苷酸保護(hù)片段雜交，并進(jìn)行核酸酶保護(hù)程序，并在MAPS板上測定與感興趣靶核酸雜交的那些保護(hù)片段。當(dāng)然，此類“MAPS板”可含有不與接頭結(jié)合的錨(如直接與感興趣的靶分子或核酸酶保護(hù)片段結(jié)合)。用于與任何一方類型探針陣列結(jié)合的核酸酶保護(hù)的優(yōu)點，本領(lǐng)域技術(shù)從中央到地方將會從本說明書和其原始專利申請所需求的權(quán)利中得以理解，如果感興趣的靶分子是RNA，保護(hù)片段是DNA，核酸酶保護(hù)/MAPS試驗(NPA-MAPS)可減少對廣泛RNA的需要。(RNA對污染的核酸酶的降解敏感而難以保存)。用核酸酶可信程序處理新品也得以降低樣品的粘稠度。樣品的核酸酶保護(hù)可使試驗的靈敏度和重現(xiàn)性更高。見圖30說明用核酸酶保護(hù)程序處理樣品的試驗的靈敏度和重現(xiàn)性。本發(fā)明的一個優(yōu)點是當(dāng)靶擴(kuò)增(如PCR)不需要檢測信號時這些試驗的靈敏度足夠高。在NPA-MAPS試驗中，探針陣列中的探針是與感興趣靶核酸標(biāo)準(zhǔn)相同的寡核苷酸，而不是像標(biāo)準(zhǔn)MAPS試驗中與其互補(bǔ)，NPA-MAPS試驗的一個例是見圖9。
在一NPA-MAPS試驗中，感興趣的靶分子可以是核酸，如基因組DNA，cDNA，病毒DNA或RNA、rRNA、tRNA、mRNA、寡核苷酸、核酸片段、修飾的核酸、合成的核酸等。本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，采用此方法測定組織或細(xì)胞RNA提取物中一種或多種靶的RNA。在所選項嚴(yán)謹(jǐn)條件(見實現(xiàn)特異性雜交的相應(yīng)反應(yīng)條件討論)下使含有感興趣的靶分子的樣品先與過量的一種或多種特異性保護(hù)片段雜交。保護(hù)片段是針對感興趣靶核酸某部分的特異性多核苷酸，可以是RNA、DNA(包括PCR產(chǎn)物)、PNA或修飾的或替代的核酸。“特異性”保護(hù)片段指與結(jié)合伙伴充分互補(bǔ)能在選定的嚴(yán)謹(jǐn)條件下與其結(jié)合但不與其它的核酸結(jié)合的多核苷酸。保護(hù)片段至少長10個核苷酸，宜長50-100個或為全長cDNA。在一優(yōu)選實施例中，此保護(hù)片段是單鏈DNA寡核苷酸?？稍谝浑s交反應(yīng)中包括多達(dá)100個或更多個靶分子的特異性保護(hù)片段。雜交后，用含一種或多種核酸酶的混合物處理樣品以破壞核酸而不破壞已與感興趣的核酸雜交的保護(hù)片段，和任選地在核酸酶保護(hù)程序中(在雙鏈體雜交物中)，靶核酸的已雜交部分將受到保護(hù)不被核酸酶消化。例如，樣品中含有細(xì)胞提取物，不需要的核酸如基因組DNA，tRNA，rRNA和不感興趣的mRNA可在此步驟中基本上受到破壞.可制備各種核酸酶的任何一種，如胰腺RNA酶，綠豆核酸酶，S1核酸酶，RNA酶A，核糖核酸酶T1，外切核酸酶III，外切核酸酶VII，RNA酶CLB，RNA酶PhyM，RNA酶U2等，取決于雜交復(fù)合和樣品中不要的核酸的性質(zhì).RNA酶H可部分用于消化已結(jié)合于DNA保護(hù)片段的剩余RNA.這些酶的反應(yīng)條件是本領(lǐng)域所熟知的可憑經(jīng)驗優(yōu)化.另外也可用堿水解RNA。如需要可起家一步用本領(lǐng)域熟知的方法處理樣品去掉未雜交物質(zhì)，和/或滅活或除去殘存酶(如酚抽提，沉淀，柱滲濾等)。雜交后進(jìn)行核酸酶消化和(任選的)化學(xué)降解稱為核酸酶保護(hù)程序.已報道了各種核酸酶保護(hù)程序(見Lee等(1987)，Meth Enzymol.152，633-648；Zinn等(1983)，Cell.34，865-879)。受核酸酶保護(hù)處理的樣品(任選地)滅活核酸酶后，使樣品與MAPS探針陣列接觸，進(jìn)行MAPS試驗各步驟?？赏ㄟ^與本文所述用于標(biāo)準(zhǔn)MAPS試驗的標(biāo)記靶特異性報道物雜交，或者此保護(hù)片段本身可用一可檢測分子共價或非共價標(biāo)記，來檢測結(jié)合的保護(hù)片段。
如需要，為標(biāo)準(zhǔn)化NPA-MAPS試驗，可包含一個或多個對照.例如，可采用對應(yīng)于預(yù)計以基本衡定數(shù)量存在于一系列樣品的各樣品中的某核酸(組成性產(chǎn)生的mRNA，基因組DNA的一部分，tRNA或rRNA)的一個或多個保護(hù)片段。試驗中，檢測和定量內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化對照，如基因組DNA，以測定存在的不同量核酸(mRNA)能力，是此試驗采用保護(hù)片段的一個優(yōu)點。
因為標(biāo)準(zhǔn)化用的標(biāo)準(zhǔn)品的量可能低于感興趣mRNA的表達(dá)量，可能要調(diào)整該試驗，使對應(yīng)于所表達(dá)基因的信號不超過對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)品的信號。調(diào)整信號水平的方法是本領(lǐng)域常規(guī)為技術(shù)人員所知道。例如，可采用本文所述平衡信號強(qiáng)度(弱化信號，細(xì)調(diào))的任何一種方法(如采用封閉性接頭；標(biāo)記比設(shè)計用于檢測mRNA更高水平的用于檢測標(biāo)準(zhǔn)品的信號部分；置于設(shè)計用于檢測標(biāo)準(zhǔn)品的位點上(此位點含有針對該標(biāo)準(zhǔn)化核酸不同部分或?qū)?yīng)于該核酸不同部分的保護(hù)片段的)多個特異性接頭)?？赏ㄟ^本文所述方法之一，同時或順次檢測標(biāo)準(zhǔn)化用的標(biāo)準(zhǔn)品和感興趣的靶核酸(如mRNA)。圖28和29說明mRNA試驗中采用內(nèi)部DNA標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)品的典型實驗。
在一優(yōu)選實施例中，直接，例如不通過與靶特異性報道物雜交來標(biāo)記此保護(hù)片段。例如，通過配體-抗配體相互反應(yīng)，如鏈霉親和素酶復(fù)合物加入到生物素化保護(hù)寡核苷酸中，使報道物與保護(hù)片段結(jié)合。在另一實施例中，用化學(xué)修飾此保護(hù)片段(如直接交聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)或熒光染料)并用此保護(hù)片段的核酸部分或不用(如經(jīng)酶或化學(xué)處理切除此修飾后)檢測這種化學(xué)修飾。上述任一方法中保護(hù)片段或在與相應(yīng)接頭分子雜交前后標(biāo)記。
為了控制核酸酶保護(hù)程序適當(dāng)?shù)毓ぷ?，即如希望的那樣消化掉未雜交的核酸，可設(shè)計出含有應(yīng)被核酸酶(若保護(hù)程序適當(dāng)?shù)毓ぷ?切除的突出(未雜交)端的一個或多個保護(hù)性片段。該突出端存在是否可通過與一互補(bǔ)的標(biāo)記檢測探針雜交測定，或?qū)⒃摫Ｗo(hù)片段突出端部分用一可檢測分子共價或非共價標(biāo)記?？稍跇悠放c探針陣列接觸之前進(jìn)行這種控制，或作為MAPS試驗本身的一部分。此控制試驗的例子見實施例15所述。當(dāng)然，由于不同的標(biāo)記不難鑒別(如用不同的吸收光譜鑒別熒光)，可在一試驗中包含幾種不同標(biāo)記的寡核苷酸。另外，凝膠電泳分析的標(biāo)準(zhǔn)核酸酶保護(hù)試驗可用于試驗開發(fā)期限間驗證這些保護(hù)性片段是否如預(yù)期的那樣被加工。
核酸酶正確消化的其它控制方法是本領(lǐng)域技術(shù)之一。例如，可在一試驗中包括已知對樣品中的任何核酸酶沒有特異性的核酸酶保護(hù)片段(如植物核酸試驗中)，可包括已知植物中所沒有的動物基因的特異性保護(hù)片段。
測到靶分子后，檢測探針(如HRP標(biāo)記的)信號可能消失(如變性、殺傷、淬滅、受抑制、被封用)，洗滌板去除產(chǎn)生的可能干擾下一步的試劑、藥物或緩沖劑(變性試劑)，然后可用不同的檢測探針(如HRP標(biāo)記的)測定該突出端。可在試驗的不同階段加入具有相同信號產(chǎn)生基因的不同檢測探針后，利用變性的信號，可采用兩種不同的熒光探針和雙色測定而無須變性或阻斷信號。
在本發(fā)明一實施例中，如上所述用一寡核苷酸針來篩選含有一種或多種多形性的核酸。在一優(yōu)選實施例中，此核酸(如DNA、基因組DNA或RNA、mRNA)含有一種或多種SNP，常規(guī)上可用專業(yè)識別程序進(jìn)行此程序。例如篩檢含已知SNP的DNA或此DNA所表達(dá)的mRNA，使“SNP-特異性”保護(hù)片段與含核酸(其可能含該SNP)的樣品雜交?！癝NP-特異性”保護(hù)片段本文指含有SNP的已改變堿基的片段，或如果要分析mRNA則含有此序列的逆互補(bǔ)片段。然后，在適當(dāng)?shù)膽{經(jīng)驗確定的條件下用能在錯配位點(如單堿基錯配)消化未雜交的單鏈核酸和切斷雙鏈(雙鏈體)核酸(如DNA-DNA雜交體，DNA-RNA雜交體等)的一種或多種適合的核酸酶處理樣品。適合的核酸酶包括如S1或RHA酶H。如果樣品中存在含SNP的核酸并與SNP-特異性保護(hù)片段雜交，該保護(hù)片段可從消化程序中完整保存下來并可進(jìn)行MAPS試驗，用對該保護(hù)片段某序列特異性的檢測探針或檢測寡核苷酸檢測。不含SNP的核酸將在該核酸中SNP特異性保護(hù)片段和相應(yīng)的野生型序列之間錯配位點處被切斷。如需要，位于該切斷點遠(yuǎn)端或近端的保護(hù)片段部分可用常規(guī)方法(如熱變性、酶促切割等)去除?？稍O(shè)計一試驗，使該被切分子(或其一部分)不與接頭結(jié)合，或該被切分子即使其一部分與一接頭結(jié)合仍不能被適當(dāng)設(shè)計的檢測探針或檢測寡核苷酸所檢測。實施例29和圖30與31說明本發(fā)明的此試驗可檢測出被表達(dá)的SNP中的一個堿基的錯配。實施例32(圖41)說明一種檢測SNP的試驗，可用于例如檢測基因組DNA中的SNP。
NPA-MAPS試驗可用于測定樣品中靶分子的量。如果加入的保護(hù)片段摩爾量足夠大超過靶分子而驅(qū)使雜交反應(yīng)完成，核酸酶保護(hù)步驟后剩下的保護(hù)片段量將反映出樣品中存在多少靶分子。實施例12和13描述了這種定量反應(yīng)的例子。
本發(fā)明一實施例中，可用一探針陣列測定樣品中不同類型的靶分子，如DNA、RNA、胞內(nèi)蛋白質(zhì)和分泌蛋白的各種組合。這類試驗的例子見圖40和41。
NPA-MAPS試驗可用于實施上述采用標(biāo)準(zhǔn)MAPS試驗的任何方法。
在一優(yōu)選實施例中，用質(zhì)譜儀而不是在MAPS板上測試多核苷酸保護(hù)片段。在最優(yōu)選實施例的雜交或核酸酶消化步驟中，沒有多核苷酸與固相表面結(jié)合(附著)。雜交后，可用核酸酶或化學(xué)處理降解雜交的靶分子，剩余的保護(hù)片段與有多少片段已知靶分子雜交成正比?；蛘呖商幚碓摌悠?，留下靶分子的(單鏈)雜交部分，或雜交靶分子和保護(hù)片段形成的雙鏈體作進(jìn)一步分析。將待分析的樣品用(乙醇沉淀或通過吸附或親和層析等)與其余的雜交和核酸酶混合物相分離、洗脫或溶解，并通過高通量的環(huán)注射注入質(zhì)譜儀。在一優(yōu)選實施例中，將待分析的樣品(如保護(hù)片段)吸附于一表面，并用激光解吸分析，采用本領(lǐng)域熟知的方法。對于最高靈敏度，可采用傅里葉變換質(zhì)譜(FIMS)(或類似的其它先進(jìn)方法)，可測出10-15摩爾或更低的每種保護(hù)片段。
可設(shè)計出測定一份(或多份)樣品的保護(hù)片段為所用質(zhì)譜儀提供獨特的信號。在一實施例中，保護(hù)片段在雜交和核酸酶處理后各具有獨特的分子量，它們的分子量、特征性電離和片段化模式足以衡量它們的濃度。為獲得更高靈敏度或幫助分析復(fù)雜的混合物，可采用設(shè)計的能產(chǎn)生清晰獨特信號的化學(xué)基團(tuán)來修飾(或衍生)這些保護(hù)片段。例如，各保護(hù)片段的衍生可用不同的天然或非天然氨基酸，通過酰胺鍵在寡核苷酸鏈的雜交部分的一個或多個位置與該鏈結(jié)合。采用具有適當(dāng)能量的質(zhì)譜儀，酰胺鍵產(chǎn)生的片段釋放出特征性比例的氨基酸。此類方法中，采用中等大小的化學(xué)基團(tuán)(分子量約80-200)作為質(zhì)譜標(biāo)記是理想的，因為這種大小的分子通常不難檢測。另一實施例中，此化學(xué)修飾是一種含有明確質(zhì)譜信號，如四烷基銨基因(其可產(chǎn)生另一分子如氨基酸分子)的有機(jī)分子。另一實施細(xì)則例中，通過與眾多試劑之一反應(yīng)增強(qiáng)了陽離子或陰離子信號。例如為增強(qiáng)陽離子檢測可使吡喃鹽(如2-4二乙基，6-乙基吡喃四氟硼酸鹽或許多其它化合物)與氨基反應(yīng)形成吡啶鹽可采用許多其它增強(qiáng)劑之一來產(chǎn)生其它陽電荷功能基團(tuán)(見Quirke等(1994)，AnalyticalChemistry 66；1302-1315)。類似地，可使本領(lǐng)域已知的許多試劑之一反應(yīng)形成陰離子增強(qiáng)基團(tuán)。當(dāng)然可在從核酸中切下后或與核酸結(jié)合時檢測到這種化學(xué)修飾。通過區(qū)別性鑒定各保護(hù)片段，可以在一次試驗中測定大量的不同靶分子(如2、6、10、16個或更多的不同靶分子)?？煽焖偃菀椎剡M(jìn)行許多這種試驗，因此可如本文所述，高通量地進(jìn)行一種或一組這類試驗。
不論寡核苷酸是直接通過其質(zhì)量或采用獨特的分子標(biāo)記檢測，可用已知濃度的純品完整特征分析每一待測分子的信號，這得以精確定量分析此信號。對于質(zhì)譜法檢測的任何分子。其強(qiáng)度和圖形不可能精確預(yù)測。分子離子化的傾向、分子片段化時所有化學(xué)鍵的靈敏度、各片段帶多個電荷或單個電荷的程度都太復(fù)雜而不能預(yù)測。然而，對于具有固定能量和樣品處理特征的所述儀器、信號的強(qiáng)度和圖形非常有重復(fù)性。因此，對于各個探針可用純標(biāo)準(zhǔn)品的特征分析其信號和精確定量解釋實驗產(chǎn)生的信號。
一方面，本發(fā)明涉及到檢測一個或多個感興趣的核酸的方法，所述方法包括使含有感興趣的核酸的樣品經(jīng)受一種或多種保護(hù)片段的核酸酶保護(hù)，并用質(zhì)譜法測定雜交后的雙鏈體分子或被保護(hù)的核酸或保護(hù)片段。
用質(zhì)譜分析核酸的方法是本領(lǐng)域熟知的。見Alper等(1998)，Scieuce 279，2044-2045和美國專利5,605,798。
除了上述各種高通量試驗外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道許多其它方法。
采用多重探針試驗的優(yōu)點是能夠在每個探針陣列(將經(jīng)歷與真實實驗探針相同的反應(yīng)條件)中包含許多“對照”探針。例如，該陣列的各區(qū)可含有陽性和/或陰性對照。本文所用術(shù)語“陽性對照探針”，指已知能與靶分子起實質(zhì)反應(yīng)，或與之以已知的定量或定性方式起反應(yīng)的對照探針，故可作為探針/靶分子相互反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。例如，這類探針可控制雜交效率。術(shù)語“陰性對照探針”本文用以指已知不與靶分子起實質(zhì)反應(yīng)的對照探針。這類探針例如可控制雜交的特異性。這兩類對照探針應(yīng)用的例子，考慮為用寡核苷酸探針陣列試驗來篩檢能調(diào)節(jié)某疾病的一組相關(guān)基因表達(dá)的藥物。作為變量如各樣品中裂解細(xì)胞數(shù)，mRNA回收率或雜交效率的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化對照，一個探針陣列可包含的探針針對的有預(yù)計其表達(dá)不會受到所測試藥物調(diào)節(jié)的一個或多個堿基水平，或組成性管家基因(如肌動蛋白，微管蛋白或其它的結(jié)構(gòu)基因)或DNA結(jié)合蛋白(如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子或其它)的特異性探針。另外，為了確定被測藥物是否會導(dǎo)致不良副作用，如細(xì)胞死亡或毒性，探針陣列可含有針對已知受誘導(dǎo)后可引起凋亡(細(xì)胞程序性死亡)過程的基因，或在細(xì)胞創(chuàng)傷(如熱激蛋白)或細(xì)胞中毒(如P450基因)條件下被誘導(dǎo)的基因的特異性探針。
可在一陣列中包含其它對照探針以“精細(xì)調(diào)諧”試驗的靈敏度。例如，考慮一種測試的藥物能調(diào)節(jié)與某具體疾病相關(guān)的mRNA的產(chǎn)生時。如果先前分析已表明，此組基因中一種相關(guān)的mRNA(稱為mRNA-A)產(chǎn)生的量比信號不佳的其它mRNA高，可調(diào)整接頭而“精細(xì)調(diào)諧”此試驗，使信號強(qiáng)度相等?！胺忾]性接頭”含有針對mRNA-A靶分子的錨特異性寡核苷酸序列，但缺乏探針特異性序列，可將其加入以稀釋靶特異性接頭池，從而降低該試驗對此mRNA的靈敏度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可用常規(guī)方法確定封閉性和非封閉性接頭的恰當(dāng)比例。對于某具體靶分子的檢測，用無活性元件稀釋活性元件“精細(xì)調(diào)諧”，也可在該試驗的其它步驟中進(jìn)行。例如，可在檢測水平上用“無活性”的靶特異性報導(dǎo)分子(如用靶特異性相同但無信號傳遞分子(如寡核苷酸序列)或用滅活的或無活性形式的信號傳遞分子)稀釋標(biāo)記的靶特異性報導(dǎo)分子。本文所用的術(shù)語“信號傳遞分子”，指標(biāo)記分子，或任何能發(fā)射可檢測信號，或能產(chǎn)生熒光分子，發(fā)冷光酶或各種本文所述信號的物質(zhì)。在一特別優(yōu)選的實施例中，在含靶分子復(fù)合物與檢測接頭(見實施例23和圖24關(guān)于復(fù)合性夾心型檢測方法章節(jié))接觸步驟中進(jìn)行此“精細(xì)調(diào)諧”?？稍O(shè)計一組檢測接頭來精細(xì)調(diào)諧測試各靶分子的靈敏度。例如，如果已知樣品中某具體靶分子水平很高，可用含靶特異性部分(如寡核苷酸序列)但不含報道試劑特異部分，或含靶特異性部分和報道試劑特異性部分(已預(yù)先結(jié)合于一無活性報道試劑)的“封閉性檢測接頭”(其量憑經(jīng)驗確定)來稀釋針對靶分子的檢測接頭。也即可缺失針對報道試劑的特異性部分或阻止(封閉)其與報道試劑相互反應(yīng)(雜交)。這種精細(xì)調(diào)諧本文有時稱為信號“弱化”。圖28說明進(jìn)行這種信號弱化的實驗。
本發(fā)明試驗所測樣品可能含有上述任何靶分子或其它分子。待測液體樣品體積可相應(yīng)于測試區(qū)域的大小，從約100納升至100微升。一優(yōu)選實施例中，將約1微升液滴加入到1536孔微滴板的各孔中，可采用適合高通量分析的各種方法之一，如移液器、噴墨分散或采用反復(fù)加樣針夾，使樣品與探針陣列接觸。在探針和靶分子發(fā)生有效結(jié)合或其它穩(wěn)定性相互反應(yīng)的條件(鹽濃度、PH、溫度、培育時間等，見上)下培育樣品。這些條件按常規(guī)確定。培育后，用憑經(jīng)驗確定的條件任選處理(如洗滌)樣品以去除未結(jié)合的靶分子，此條件應(yīng)能保留特異性反應(yīng)物完整，但能去除非特異性結(jié)合物質(zhì)。例如，可在實現(xiàn)探針/靶分子結(jié)合所用條件相同或更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下洗滌樣品一至十次。
可用各種方法之一制備含靶RNA(如mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA或總RNA)的樣品。例如，可將從體外細(xì)胞培養(yǎng)物提取到的mRNA接種于表面的諸區(qū)域中，如微滴板的各孔中。任選的，在達(dá)到所需細(xì)胞密度后，用感興趣的制劑，如刺激劑或潛在的治療劑處理這些細(xì)胞，可用各種方法之一，如反復(fù)加樣針夾(獲自Beckman的96或384頭針夾)，通過移液或噴墨分散，將制劑加入細(xì)胞，與細(xì)胞一起培育適當(dāng)時間如15分鐘至48小時(取決于試驗)?？捎帽绢I(lǐng)域已知的常規(guī)方法(通?？少徳噭┖惺?從體外或體內(nèi)來源的組織或細(xì)胞抽取到總RNA，mRNA等。
在一實施例中，在存在或不存在核酸酶保護(hù)片段情況下裂解(或滲透破裂)細(xì)胞，直接利用粗制裂解液(例如在微滴板孔中)而不進(jìn)一步純化去除其它細(xì)胞成分。如果在沒有核酸酶保護(hù)片段時裂解細(xì)胞，可任選地將這些保護(hù)片段依次加入裂解液。
在測定核酸酶保護(hù)片段的優(yōu)選實施例中，使感興趣的細(xì)胞(如微滴板孔表面上的細(xì)胞，組織中的細(xì)胞或整個微生物樣品等)接觸含有表面活性劑或洗滌劑(如SDS約0.01-0.5％ W/V)的水溶液(裂解液)接觸來制備樣品，制劑(如甲酰胺約8-60％V/V)、鹽酸胍(如約0.1-6M)、異硫氰酸胍(如約0.05-8M)或脲素(如約40-46％w/v或約7M)單獨或與一種或多種其它制備組合，可作為離液劑，這些水溶液可加入標(biāo)準(zhǔn)緩沖劑成為緩沖液，在一優(yōu)選實施例中，該緩沖液是約0.5-6XSSC，更優(yōu)選給3XSSC。任選地該水溶液還可含有適當(dāng)濃度的tRNA，如0.1-2.0mg/ml，優(yōu)選約0.5mg/ml。也可將核酸酶保護(hù)片段加入此水溶液，然后將其加入細(xì)胞。各保護(hù)片段的最佳濃度可憑經(jīng)驗用常規(guī)方法確定一優(yōu)選實施例中，各保護(hù)片段的濃度約3-300pM，更佳為約30pM。
細(xì)胞與該水溶液一起培育直至細(xì)胞因滲透而破裂和/或裂解，DNA和/或mRNA從細(xì)胞釋放入水溶液中。將細(xì)胞與該水溶液一起培育憑經(jīng)驗確定的時間(約1-60分鐘)，培養(yǎng)的最適溫度憑經(jīng)驗確定(約37-115℃，優(yōu)選約90-115℃)。
例如，在一實施例中，在約90-115℃，宜約105℃的水溶液中培育細(xì)胞約1-60分鐘，優(yōu)選5-20分鐘，使DNA和RNA以變性形式從細(xì)胞中釋放出來而能結(jié)合保護(hù)片段。若需要例如當(dāng)需要在缺乏RNA時測定DNA，可在培養(yǎng)混合液中加入各種常規(guī)核糖核酸酶之一。選擇適當(dāng)?shù)暮颂呛怂崦负蛢?yōu)化消化條件是常規(guī)工作，技術(shù)人員不難確定。
另一實施例中，將細(xì)胞在90-100℃，優(yōu)選95℃水溶液中培育約5-20分鐘，宜為10分鐘來制備mRNA，任選存在一種或多種保護(hù)片段。此時，mRNA基本上以能結(jié)合保護(hù)片段的變性形式從細(xì)胞中釋放出來，而DNA仍基本上留在細(xì)胞內(nèi)或與細(xì)胞結(jié)合，或因其雙鏈性質(zhì)不能得到，或從細(xì)胞中釋放出來但其形式不能結(jié)合保護(hù)片段(如未變性)。不希望受任何具體機(jī)制的束縛，看來當(dāng)核酸從裂解的/滲透破裂的細(xì)胞中釋放出來時，它已充分變性而能結(jié)合保護(hù)片段形成穩(wěn)定的雙鏈體，從而抵抗內(nèi)源性或外源性試劑或酶和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)(如核酸酶)的降解，并變性或/或滅活。
用上述方法制備好感興趣的核酸后，可稀釋樣品至適當(dāng)體積，使水溶液不能抑制外源加入的蛋白質(zhì)如核酸酶(如S1核酸酶)、聚合酶(如PCR反應(yīng)所需的聚合酶)或結(jié)合性蛋白(如鏈霉親和素)的功能。上述稀釋液的量、水溶液中所用化合物的成份和量可憑經(jīng)驗用常規(guī)方法確定。
對于本發(fā)明的任何方法，可用本領(lǐng)域熟知的和/或本文所述的各種方法之一來標(biāo)記靶分子(如用于檢測核酸酶保護(hù)片段)。例如，可將靶分子直接或間接與能提供檢測信號的化學(xué)基團(tuán)交聯(lián)，如化學(xué)發(fā)光分子或能催化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光分子的酶或熒光分子如熒光素或Cy5，或時間分辨熒光分子如一種整合性鑭素金屬，或放射活性化合物?；蛘甙蟹肿涌稍谄渑c探針反應(yīng)后用一個或多個標(biāo)記的靶特異性報導(dǎo)子(如圖1所示抗體，寡核苷酸或上述與探針和靶結(jié)合的一般類型分子之一)標(biāo)記。
一種熒光分子可能是“高轉(zhuǎn)化磷光體”即一種吸收長波和在長波激發(fā)(紅外)，然后發(fā)射較短波長(如可見光)的熒光劑。因為高轉(zhuǎn)化磷光體吸收的波長比典型的待分析樣品中存在的大多數(shù)潛在干擾物質(zhì)更長，與吸收較低波長的磷相比，高轉(zhuǎn)化磷光體可降低樣品中物質(zhì)所引起的干擾。大多數(shù)高轉(zhuǎn)化磷光體的狹窄發(fā)射光譜也得以同時測定大量的不同高轉(zhuǎn)化磷。本領(lǐng)域熟知和常見的高轉(zhuǎn)化磷光體包括稀土金屬離子，如釔(Yb)、鉺(Tm)和鐠(Pr)，特別是氧硫化物鹽的形式。已描述了多達(dá)80種或以上的獨立的可檢測高轉(zhuǎn)化磷光體(見《生物制劑檢測和鑒定》(BiologicalAgent Detection and Identification)，1999年4月27-30日，DARPA，BiologicalWarfare Defense，Defense Sciences Office)可將這些磷任選地結(jié)合于一表面，如微球或乳膠珠表面。象其它熒光標(biāo)記，可通過向充分靠近的接頭、靶分子或報導(dǎo)子上的標(biāo)記轉(zhuǎn)移能量，檢測高轉(zhuǎn)化磷光體。另外，如本文所述其它信號傳遞分子，可用高轉(zhuǎn)化磷光體測定靶分子的量，并可用于本文所述各種方法，例如測定核酸酶保護(hù)片段。
當(dāng)然，高轉(zhuǎn)化磷光體也可用于檢測以任何其它方式在一表面上分布的靶分子，如直接結(jié)合于表面，直接結(jié)合于表面上不同寡核苷酸陣列或通過雙功能接頭結(jié)合于基本上均勻分布或以所需組織或模式分布在表面上的錨(不同或基本上相同)的靶分子(包括核酸酶保護(hù)片段)?？刹捎萌魏伪砻嫒缌魍ㄏ到y(tǒng)或珠等固體表面。用于本發(fā)明任一試驗的珠可以是任何材料、磁性和/或非磁性材料制成的任何類型的珠，一種試驗所用的珠可以在大小和/或形狀上基本上相同或不同。
也可采用各種更復(fù)雜的夾心型檢測方法。例如，一靶分子可與一雙功能分子雜交，該雙功能分子含有對該靶分子特異的第一部分和可被共同(即相同)報道試劑，如標(biāo)記的多核苷酸、抗體等識別的第二部分。
對于本發(fā)明的任何方法，可采用各種復(fù)雜的夾心型檢測方法來標(biāo)記靶分子。例如可使靶分子與一雙功能(或多功能)分子(檢測接頭)相互反應(yīng)，如雜交，該雙功能分子含有對此靶分子特異的第一部分和對“報道試劑”特異的第二部分。本文所用術(shù)語“對XX特異”指探針和靶分子的相互反應(yīng)。
本文所用術(shù)語“報道試劑”指標(biāo)記的多核苷酸、抗體和本文所述與探針和靶分子相關(guān)的任何通用性分子。檢測接頭的這兩部分可識別(相互反應(yīng)或與其結(jié)合)上述任何方式與探針和靶分子相關(guān)的各自結(jié)合伙伴。檢測接頭也可包含其他序列，如對某靶分子有特異性，但與相應(yīng)錨結(jié)合接頭的靶特異性部分不同(不重疊)的序列。檢測接頭中的序列可起著檢測探針或報道試劑的識別序列作用。一優(yōu)選實施例中檢測接頭是多核苷酸。
可設(shè)計檢測接頭以至可在一試驗中使用所需數(shù)量的常用報道試劑。例如，可設(shè)計一組檢測接頭，各檢測接頭對不同的靶分子是特異的，但含有相同(共同)或有限數(shù)量報道試劑之一的結(jié)合位點。在一試驗中使用有限數(shù)量(如一種)的報道試劑來標(biāo)記各種靶分子的能力，提供了減少成本和降低背景的優(yōu)點。當(dāng)然，可利用檢測接頭/報道試劑的諸種組合來檢測以任何形式分布在表面上的靶分子，例如可用高轉(zhuǎn)化磷光體檢測的上述類型的靶分子排列。
在一最佳實施例中，可設(shè)計檢測接頭來檢測核酸酶保護(hù)片段，方法是優(yōu)先標(biāo)記核酸酶保護(hù)程序中(如實施例15中所述)已被核酸酶從控制性“突出端”序列切下的保護(hù)片段。此種檢測方法見圖24的圖解說明。在此實施例中，檢測接頭含有的第一部分對靶分子特異，第二部分對共同的控制性突出端序列特異，該控制性突出端序列在一優(yōu)選實施例試驗開始時，存在于幾乎所有的核酸酶保護(hù)片段上。若需要，在核酸酶保護(hù)反應(yīng)時從核酸酶保護(hù)片段切下該控制性突出端序列，檢測接頭的靶特異性部分，將與切下的保護(hù)片段雜交，但檢測接頭的控制性突出端特異部分將不被結(jié)合并保留用于進(jìn)一步雜交。另一方面，如果控制性突出端特異性序列沒從保護(hù)片段切下，例如，由于核酸酶保護(hù)程序的核酸酶消化不完全，檢測接頭的靶特異性部分和控制性突出端特異性部分將與保護(hù)片段雜交，而不能用于進(jìn)一步雜交。在一優(yōu)選實施例中，含有核酸酶保護(hù)片段和結(jié)合的檢測接頭的復(fù)合物在下一步與含有信號分子(如熒光色素、半抗原、酶和任何攜帶有可檢測信號或產(chǎn)生信號部分的其它分子)和對檢測接頭的控制性突出端特異部分有特異性的分子雜交。該報道試劑將優(yōu)先結(jié)合并標(biāo)記那些核酸酶保護(hù)片段中的控制性突出端序列被切下的復(fù)合物(即該復(fù)合物中檢測接頭的控制性突出端特異性部分可用于進(jìn)一步與報道試劑雜交)。
夾心檢測方法的其它許多變化是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。通過這些方法可在有利實現(xiàn)結(jié)合或其它穩(wěn)定性相互反應(yīng)的條件下，將靶分子與靶特異性報道分子一起培育，或?qū)?檢測接頭復(fù)合物與報道試劑一起培育，并進(jìn)行常規(guī)檢測(見上)。例如，可在約15℃至45℃(宜在室溫上下)培育熒光寡核苷酸報道分子(濃度約10nM-1μM或以上，優(yōu)選約30nM以6XSSPE-T或其它緩沖液配制)和結(jié)合的靶分子約15分鐘至2小時或以上(優(yōu)選約30-60分鐘)。培育后，可任選地處理樣品(如洗滌)去除未結(jié)合的靶特異性報道劑，所用的處理條件憑經(jīng)驗確定，應(yīng)能保留特異性反應(yīng)物完整，但去除非特異性結(jié)合物質(zhì)。例如，可在與用于實現(xiàn)靶/報道物結(jié)合的條件相似或比其更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下洗滌樣品1-10次或以上。
用靶特異性報道劑尋靶對初步雜交反應(yīng)可提供另一層特異性，例如，當(dāng)靶特異性報道劑尋靶靶核酸酶序列的不同部位而非探針寡核苷酸時，或探針和報道劑抗體識別靶抗原的不同表位時。另外，用靶特異性報道劑尋靶可能能夠“調(diào)諧”反應(yīng)的靈敏度。例如，若某靶mRNA是低水平表達(dá)的相關(guān)表達(dá)模式的一部分，可通過使結(jié)合的靶與幾個(約2-5個或以上)靶特異寡核苷酸報道劑雜交，每個與該靶mRNA的不同部分特異性雜交，來增強(qiáng)信號水平(信號放大)。
檢測兩種獨立標(biāo)記的能力得以在MAPS試驗中增加控制類型。為具體錨位點(圖7顯示3個典型的錨位點，每個含有多個基本相同的錨(A、B和C))設(shè)計的某些(約10-100％)接頭可具有附著于一端的一個標(biāo)記(如熒光劑)。例如，可將羅丹明或Cy5熒光劑連接在該接頭的5’端。這種修飾后的接頭稱為“對照接頭”。接頭和對照接頭的混合物與錨結(jié)合后，將含有靶分子的樣品與產(chǎn)生的探針陣列一起培育，可利用攜帶了不同熒光劑(如熒光素或另一可檢測標(biāo)記如化學(xué)發(fā)光劑)的靶特異性報道劑(或可用熒光劑或其它可檢測標(biāo)記直接標(biāo)記靶分子)并可確定兩種信號的比例。對照接頭的存在允許校準(zhǔn)測定區(qū)內(nèi)和之間功能性(如能與接頭反應(yīng))錨的數(shù)目(即測定此陣列各位點結(jié)合靶分子的容量，目的是使信號標(biāo)準(zhǔn)化)，作為定量結(jié)合的靶分子的基礎(chǔ)，幫助定位錨位點和/或提供一陽性對照，如當(dāng)樣品缺乏靶分子而致沒有信號時。本發(fā)明一實施例中，也可采用兩種不同的標(biāo)基(如熒光團(tuán))來檢測兩群不同的靶分子，然而，通過空間分辨信號識別靶分子存在的能力得以采用一種標(biāo)記檢測不同的靶分子。
獨立檢測標(biāo)記(如能發(fā)射可鑒別波長的熒光素標(biāo)記，如熒光素、羅丹明或不同的高轉(zhuǎn)化磷)能給本發(fā)明方法添加靈活性。例如，可用其自身的獨特可檢測標(biāo)記直接或間接標(biāo)記兩個或多個靶分子的每一個，除鑒定表面上靶分子的定位或憑借靶分子所定位珠的大小鑒定靶分子外，這得以根據(jù)對標(biāo)記(如發(fā)射顏色)的特異性特征檢測靶分子。本發(fā)明另一實施例中可分別測定某區(qū)域中一個位點的多個靶分子。例如可檢測含一組(基本上相同的)錨的某位點中的兩個或多個(如2.3.4.5.6或以上)靶分子，即可采用一組接頭，各接頭具有對相同錨特異的錨特異性部分和對不同靶分子特異的靶特異性部分。如果采用一組(例如4個)接頭四個接頭均可結(jié)合一位點上錨的成員，則4個不同的靶分子得以在該位點上結(jié)合起來，如果這些靶分子每一個都用一不同的可鑒別標(biāo)記物(直接或間接)標(biāo)記，研究者可確定該位點中存在四個靶分子的每一個。因此，一區(qū)域中的5個錨(一組錨)的陣列可用于上述情況來檢測多達(dá)20個不同的靶分子。圖24和25說明了些種試驗。類似地，在固體表面如珠或流通裝置上一位點內(nèi)均勻分布或以所需方式分布著一種錨時可分別檢測多個，例如84個或更多的靶分子，珠的大小或分散情況等其它方面可用于提供關(guān)于靶分子身份或靶分子組的信息。
具有不同靶特異性的多個接頭(約2-50個或以上)與所述位點中的錨(或是一組基本上相同的錨或一“混合位點”)的結(jié)合，本文有時稱為“混合接頭”，它形成了本發(fā)明其它實施例的基礎(chǔ)，將會為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。例如在所述位點中錨可結(jié)合于對多個不同保護(hù)片段有特異性的接頭混合物，各接頭對應(yīng)于(特異于)感興趣的核酸(如mRNA)的不同部分。一位點存在多個不同的接頭使得能大大提高檢測樣品中低含量感興趣的靶分子(如mRNA)的靈敏度。
可設(shè)計各位點使對應(yīng)于mRNA不同部分的接頭數(shù)目與樣品中mRNA含量成反比(以經(jīng)驗確定方式)。例如，若在初步實驗中發(fā)現(xiàn)樣品中感興趣mRNA的量大大超過第兩種感興趣mRNA，可調(diào)整對應(yīng)于此兩種mRNA不同部分的接頭相對數(shù)目，以使對應(yīng)于各mRNA的信號相對強(qiáng)度基本上相同。即可調(diào)整信號強(qiáng)度使對應(yīng)于第一種mRNA的信號不超過對應(yīng)于第兩種mRNA的信號。以上方式可調(diào)整試驗使其能同時測定樣品中含量大不相同的多種mRNA，平衡對應(yīng)于各mRNA的信號強(qiáng)度。
在本發(fā)明另一實施例中，如上所述的位點可含有多個無關(guān)或不同靶分子或保護(hù)片段的特異性接頭，使得用一個錨陣列可檢測數(shù)目大大增加的靶分子或保護(hù)片段。例如，350個錨陣列的每個點含有10種不同靶分子的特異性接頭，那么此陣列可用于檢測多達(dá)3500種靶分子。實際上這種安排使我們可將能檢測低密度靶分子的陣列轉(zhuǎn)變成能檢測高密度靶分子的陣列。
用本申請中所述的檢測方法可順次或同時檢測一位點中結(jié)合的多個分子(如保護(hù)片段)“檢測接頭”和“報道試劑”的討論見以上關(guān)于復(fù)合性夾心型檢測方法章節(jié)。在一實施例中用第一套檢測系統(tǒng)(如檢測接頭/報道試劑或其特異性檢測探針)檢測所述位點的第一靶分子(如保護(hù)片段)，然后用常規(guī)方法(如提高PH以滅活含有新產(chǎn)生化學(xué)發(fā)生信號的酶的報道試劑)去除或滅活第一套檢測接頭/報道試劑或探針，并用對同一位點第兩種靶分子有特異性的第二套檢測接頭/報道試劑或檢測探針檢測第兩種靶分子，按需要進(jìn)行多輪檢測。在另一實施例中，將第一套檢測接頭/報道試劑或檢測探針加入以上組合物中，但不去除或滅活，然后加入第二套檢測接頭/報道試劑或檢測探針。此例中，通過減去對應(yīng)于第一靶分子的信號量可測出對應(yīng)于第二靶分子的信號量。另一實施例中，將第一和第二套檢測接頭/報道試劑或檢測探針基本上同時加入以上組合物中，用本文所述區(qū)別性檢測標(biāo)記分別檢測。本文所述任一檢測方法中，檢測接頭可含有針對相同或不同報道試劑的特異性部分。例如，若4種靶分子結(jié)合于某所述位點中的諸接頭，4種靶分子各自的特異性檢測接頭可以各含有針對某特異性報道試劑的特異性部分。因而，如上所述用4種不同的報道試劑，當(dāng)含有的4種檢測接頭與諸靶分子雜交后，諸靶分子即可依次或同時檢測出來。其它檢測方法及上述方法的組合本領(lǐng)域技術(shù)人員將會明白。
當(dāng)然“混合接頭”對于含一個(非重復(fù)性)區(qū)域的表面也有其優(yōu)點。
本發(fā)明另一實施例中，感興趣的靶分子的特異性“錨”不與接頭結(jié)合，直接與靶分子結(jié)合。該靶分子進(jìn)而可任選地與檢測接頭或與檢測探針反應(yīng)。
靶分子不論標(biāo)記的或未標(biāo)記的可用本領(lǐng)域各種常規(guī)方法檢測(例如見Fodor等(1996)，美國專利5,605,798；Pirrung等(1997)，美國專利5,143,854；Koster(1997)，美國專利5,605,798；Hollis等(1997)，美國專利5,653,939；Heller(1996)，美國專利5,565,322；Eggers等(1997)，美國專利5,670,322；Lipshutz等(1995)，Biotechniques.19；442-447；Southern(1996)，Trends inGenetics 12；110-115)。檢測方法包括酶法檢測、比色法、SPA放射圖象、質(zhì)譜、電方法、吸光度或冷發(fā)光檢測(包括化學(xué)發(fā)光或電發(fā)光)和采用顯微顆粒作標(biāo)記產(chǎn)生的光散射檢測。另外，可采用電荷偶合裝置(CCD)或熒光顯微鏡(如掃描或共聚焦熒光顯微鏡)或掃描系統(tǒng)CCD陣列或光電倍增管或用陣列為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)(如可測出測定區(qū)每10微米的表面電勢或如果分辨率足夠高可采用表面等離子體共振)或者，一陣列可含有一標(biāo)記(如一對能量轉(zhuǎn)移探針如熒光素和羅丹明之一)，該標(biāo)記可通過能量轉(zhuǎn)移給接頭、靶分子或報道劑上的標(biāo)記(或受修飾)而檢測出。在熒光檢測體系中有熒光強(qiáng)度，熒光(Fp)時間分辨熒光、熒光共振能量轉(zhuǎn)移和均勻性時間釋放熒光(HTRF)等種類。通過模式識別(對于每種特異性標(biāo)記的靶分子通過其相對于其它點或線的位置發(fā)現(xiàn)它的相應(yīng)點或線)，然后標(biāo)記物強(qiáng)度的定量檢測可實現(xiàn)重復(fù)性捧狀密碼樣模式的分析?？沙Ｒ?guī)生產(chǎn)和/或商品化購得用于分析一維或二維陣列的棒狀密碼識別裝置和計算機(jī)軟件(例如見Rava等(1996)，美國專利5,545,531)。
可用于檢測的另一方法是2-光子熒光，包括結(jié)合于陣列表面組分的內(nèi)原性或偶聯(lián)熒光色素產(chǎn)生的熒光，通過緊密結(jié)合于陣列表面，例如緊密并置于基上形成陣列的基質(zhì)，或緊密并置于錯分子或接頭中包含的其它試劑或摻入該結(jié)合的復(fù)合體中而增強(qiáng)。其它熒光方法或利用包括終身熒光、偏振、能量轉(zhuǎn)移等。例如，這類方法允許同時檢測和區(qū)分同一位點內(nèi)的多種靶分子在某些情況下區(qū)別結(jié)合標(biāo)記物和未結(jié)合標(biāo)記物，不需要洗去陣列中未結(jié)合的標(biāo)記物，因而有利于測定此陣列的迅速可逆性或弱相互反應(yīng)。
制備和使用本發(fā)明陣列的方法，包括制備本文所述的表面或區(qū)域合成或純化及附加或裝配例如本文所述錨、接頭、探針和檢測探針等物質(zhì)，以及檢測和分析本文所述被標(biāo)記的物質(zhì)，這是熟知和常規(guī)技術(shù)。除以上引用參數(shù)文獻(xiàn)公開的方法外，可參見Affymax、Affymetrix、Nanogen、Protogene、Spectragen、Millipore和Beckman的專利(本發(fā)明所用的產(chǎn)品可從他們獲得)分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)科學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教課書，包括以上引用的和cozette等(1991)，美國專利5,063,081；Southern(1996)，生物技術(shù)的目前觀點(Current Opinion in Biotechnology)，7；85-88；Chee等(1996)，Science.274；610-614和Foder等(1993)，Nature.364；555-556。
附圖簡述圖1說明寡核苷酸的設(shè)計方案，其中有接頭1含有針對錨1的特異性部分和針對靶分子mRNA1的另一特異性部分，其中標(biāo)記的檢測探針1特異性針對靶mRNA1的某序列，此序列不同于此靶特異性部分的序列。
圖2說明含有15個測定區(qū)的表面，每個測定區(qū)含6種寡核苷酸錨組成的陣列。
圖3說明受體結(jié)合試驗接頭的設(shè)計，其中接頭的錨特異性部分通過生物素鏈霉親和素分子與探針部分(受體蛋白質(zhì))相連，該受體的特異性配體用熒光標(biāo)記分子標(biāo)記。B為生物素，SA為鏈霉親和素，Rec；受體蛋白，配體該受體的天然或合成配體。*結(jié)合于配體的熒光標(biāo)記分子。
圖4說明含有21個測定區(qū)的表面，各區(qū)再細(xì)分為16個亞區(qū)圖5a、5b和5c說明圖4所示表面所組裝成的三片。
圖6為二測定區(qū)，每區(qū)含一線性探針陣列(或錨陣列)形式為棒狀密碼。
圖7圖解說明含3種錨(A、B和C)的一測定區(qū)，每種錨有多個拷貝(“組”)每組錨的位置稱為一“位點”。
圖8說明在MAPS板上測定特異性逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的cDNA陣列。
圖9說明采用核酸酶保護(hù)程序的試驗(NPA-MAPS試驗)。制備細(xì)胞或組織的RNA樣品為細(xì)波形線。在RNA樣品中加入一組多核苷酸保護(hù)片段，繪制成粗黑色和淡色線。保護(hù)片段的黑色section部分代表與特異性RNA靶分子互補(bǔ)并與其雜交的區(qū)段。淡色部分代表突出端部分二與該互補(bǔ)序列毗鄰但不與靶RNA互補(bǔ)序列。過量加入該保護(hù)片段，所有存在的靶分子與保護(hù)片段雜交后，用適當(dāng)?shù)暮怂崦富旌衔锾幚順悠?，并用化學(xué)處理破壞不想要的未雜交RNA和未雜交多核苷酸。例如S1核酸酶可破壞單鏈DNA。因此過量的保護(hù)片段被水解因為是結(jié)合保護(hù)片段的突出端未雜交部分。加入核糖核酸酶(包括核糖核酸酶H)或在堿液中加熱樣品可水解RNA。剩下的是已切下的保護(hù)片段的集合物，其反映了樣品中曾經(jīng)存在過多少各種靶RNA。用MAPS雜交試驗測定剩下的保護(hù)片段。
圖10說明MAPS試驗中的雜交特異性。
圖11說明錨與接頭結(jié)合的動力學(xué)。
圖12說明兩種寡核苷酸靶分子的MAPS試驗。
圖13說明靈敏度轉(zhuǎn)移的定量測定。
圖14說明4種接頭/錨組合的解鏈溫度測定。
圖15說明采用NPA-MAPS的mRNA試驗圖16說明采用NPA-MAPS的稀釋曲線。
圖17說明檢測含磷酸酪氨酸殘基肽的圖18說明繪制EST圖譜試驗的第一步將對應(yīng)于EST的接頭裝配繪制在MAPS板基因錨陣列上。附著在微滴板16孔各孔表面的接頭會有16種不同的寡核苷酸探針排成4×4矩陣，第一位點有與第一EST序列某部分互補(bǔ)的寡核苷酸1。對待測的16種EST也如此。
將從基因產(chǎn)生的cDNA或mRNA獲得的EST加入所有16孔中，在適當(dāng)條件下使之雜交。因此，含16種EST序列之一的cDNA或mRNA將在安置有其互補(bǔ)探針的位點裝配。
圖19說明繪制EST圖試驗的后續(xù)步驟在MAPS板中加入探針寡核苷酸，此板各孔接受對應(yīng)于一種作圖的EST的檢測寡核苷酸。如用熒光成象作為檢測方法，各檢測寡核苷酸與檢測所用分子如熒光素交聯(lián)。各檢測寡核苷酸與一種EST互補(bǔ)，但與EST一特異性探針不同，故與一種EST互補(bǔ)的探針和檢測寡核苷酸二者可同時結(jié)合。洗滌后，按圖中編號各孔加入一檢測寡核苷酸，即將含有與第一種EST互補(bǔ)序列的檢測寡核苷酸加入第一孔，如此等等。
圖20a和b說明繪制圖18和圖19所示EST圖試驗的結(jié)果。檢測寡核苷酸雜交后，用適當(dāng)?shù)膰?yán)謹(jǐn)性條件洗滌，用CCD-熒光攝影儀拍攝滴板的16孔。圖20a顯示程式化后的結(jié)果。預(yù)計各EST-特異性檢測寡核苷酸應(yīng)標(biāo)記受對應(yīng)的EST特異性探針抑制的mRNA或cDNA。例如探針5裝配了該位點中含第五種EST序列的cDNA或mRNA，故第5種檢測寡核苷酸也應(yīng)與同一位點中的cDNA或mRNA雜交。這是這些程式化數(shù)據(jù)與各檢測寡核苷酸標(biāo)記相匹配探針的情況。此外，前三種檢測寡核苷酸標(biāo)記受前三種探針抑制的cDNA或mRNA，顯示這些序列位于同一基因。與此相似，最后5種EST看來是相連的，圖20b提供了從這些數(shù)據(jù)分派的連接。
圖21說明圖18-20所示探針，檢測寡核苷酸和EST#1.2和6的關(guān)系。
圖22說明一高通量試驗。
圖23說明制備擴(kuò)增靶分子的方法。
圖24說明采用檢測接頭和報道試劑的試驗。
圖25說明多重?zé)晒鈩┑挠猛尽?br> 圖26說明一高通量試驗說明THP-1細(xì)胞基因與兩個樣品細(xì)胞的空間安排(選自圖26)。
圖28說明采用信號弱化的試驗。
圖29說明在同一孔，例如基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)化對照的孔中，測定相同樣品的基因組DNA和表達(dá)的RNA試驗。左圖說明單測定DNA，右圖說明同時測定DNA和GAPDH、RNA(在陣列的各角落中測定)。
圖30和31說明測定表達(dá)的SNP。
圖32-35說明試驗的靈敏度和重復(fù)性。
圖36說明本發(fā)明包括的一些試驗構(gòu)型的類型。
圖37說明用PCR擴(kuò)增核酸酶保護(hù)片段。
圖38說明連接酶擴(kuò)增核酸酶保護(hù)片段。
圖39說明核酸酶保護(hù)擴(kuò)增核酸酶保護(hù)片段。
圖40和41描述同時測定同一樣品中的蛋白質(zhì)和mRNA的試驗。
圖42說明用聚合酶擴(kuò)增核酸酶保護(hù)片段，說明用于檢測SNP。
實施例實施例1雜交的特異性(見圖10)用噴墨分配器生產(chǎn)出通用MAPS板，Pixus系統(tǒng)(Cartesian Technologies IncIrvine.CA)在微滴板各孔中形成相同的DNA坐標(biāo)方格。所有寡核苷酸購自Biosource International(Camarillo.CA)對于MAPS板，以如Key所示的模式(圖左側(cè))在每孔中分配7種不同的寡核苷酸錨。各寡核苷酸以含500mM磷酸鈉PH8.5和1mMEDTA的2μM溶液的10納升液滴分配至二點到DNA結(jié)合板(Corning Costar)孔中并使干燥。結(jié)合后，用50mM Tris PH8.1封閉諸孔，然后用含0.1％SDS的5×SSP緩沖液洗去未共價結(jié)合于表面的寡核苷酸。
將熒光標(biāo)記接頭寡核苷酸加入洗滌的板中，使其在含0.1％Triton X-100的6×SSPE中室溫雜交30分鐘。這是接頭結(jié)合的一種優(yōu)選方法，接頭寡核苷酸合成時Cy5衍生化處理，有25對堿基的區(qū)段與特異性錨定寡核苷酸互補(bǔ)。七套錨和接頭的序列如下(均為5’到3’)#1錨*SEQ ID1TCCACGTGAGGACCGGACGGCGTCC
接頭**SEQ ID2GTCGTTTCCATCTTGGAGTCATAGGATACTGAGTGGACGCCGTCCGGTCCTCACGTGGARNA模擬物(小鼠C-juu)SEQ ID3CTATGACTGCAAAGATGGAAACGACGATACTGAGTTGGACCTAACATTCGATCTCATTCA檢測寡核苷酸***SEQ ID4TGAATGAGATCGAATGTTAGGTCCA#2錨*SEQ ID5CACTACGGCTGAGCACGTGCGCTGC接頭**SEQ ID6CTAGGCTGAAGTGTGGCTGGAGTCTGCAGCGCACGTGCTCAGCCGTAGTGRNA模擬物(小鼠MIP-2)SEQ ID7AGACTCCAGCCACACTTCAGCCTAGGATACTGAGTCTGAACAAAGGCAAGGCTAACTGAC檢測寡核苷酸***SEQ ID8GTCAGTTAGCCTTGCCTTTGTTCAG#3錨*SEQ ID9GTCAGTTAGCCTTGCCTTTGTTCAG接頭**SEQ ID10ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGGGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCGRNA模擬物(小鼠GAPDH)SEQ ID11CCTTCATTGACCTCAACTACATGGTGATACTGAGTGGAGAAACCTGCCAAGTATGATGAC檢測寡核苷酸***SEQ ID12GTCATCATACTTGGCAGGTTTCTCC#4錨*SEQ ID13GAACCGCTCGCGTGTTCTACAGCCA接頭**SEQ ID14CTACCGAGCAAACTGGAAATGAAATTGGCTGTAGAACACGCGAGCGGTTCRNA模擬物(小鼠L32蛋白)SEQ ID15ATTTCATTTCCAGTTTGCTCGGTAGGATACTGAGTGAGTCACCAATCCCAACGCCAGGCT
檢測寡核苷酸***SEQ ID16AGCCTGGCGTTGGGATTGGTGACTC#5錨*SEQ ID17CTCGTTCCGCGTCCGTGGCTGCCAG接頭**SEQ ID18CTGGCAGCCACGGACGCGGAACGAG#6錨*SEQ ID19CGGTCGGCATGGTACCACAGTCCGC接頭**SEQ ID20GCGGACTGTGGTACCATGCCGACCG#7錨*SEQ ID21GCGCGCCGCGTTATGCATCTCTTCG接頭**SEQ ID22CGAAGAGATGCATAACGCGGCGCCG*合成的錨通過C12臂以酰胺鍵結(jié)合在5’端。
**合成的接頭通過Cy5結(jié)合在5’端。
**合成的檢測寡核苷酸通過生物素結(jié)合在5’端。
將一接頭或接頭混合物(如圖中所示)成堆加入各孔中(標(biāo)為“all”是將所有7種接頭的混合物回到該孔中)。培育和用5×SSP洗3次后用Tundra攝象機(jī)(IRI，St.Catherines Ontario)攝取圖左部分所示的熒光圖片。可見接頭通過與其互補(bǔ)的錨特異性結(jié)合，自身組裝至該表面。
重復(fù)此過程除了每孔分配8種不同的錨外，并且接頭隨后優(yōu)先與其結(jié)合，在24、96、384、864或1536孔板的每孔中用36，64種等不同的錨重復(fù)整個過程。
實施例2結(jié)合動力學(xué)(見圖11)顯示不同濃度Cy5衍生接頭1號與其固定的互補(bǔ)錨的雜交率。如圖1制備通用MAPS板，除每孔有4個點結(jié)合錨1外。室溫在含0.1％吐溫20的5×SSP中培育，用5×SSP洗孔三次，測定結(jié)合的熒光。用Tundra攝象機(jī)拍攝此板的熒光照片，扣除背景計算出各孔中每個點的綜合熒光強(qiáng)度。以一式二份二個孔每孔中4個點綜合強(qiáng)度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差作圖。
實施例3熒光接頭用一種寡核苷酸錨按照上述方法點在每孔中一個點(上兩排孔)，4個點(中間4排孔)或16個點(下兩排孔)產(chǎn)生通用MAPS板。通過實施例1所述優(yōu)選方法使每孔結(jié)合互補(bǔ)的熒光標(biāo)記接頭。清洗用Tundra拍攝的該板熒光照片后，各點的熒光量報告為有多少功能性接頭已與靶分子雜交。重復(fù)點測到的信號量是高度重復(fù)性的。
實施例4結(jié)合曲線在實施例3所述制備的板中加入不同濃度的靶寡核苷酸，已結(jié)合的接頭含有與該靶分子某部分互補(bǔ)的25聚序列。靶分子溶于含0.05％SDS的5×SSC中總體積為30或100微升。給此板加蓋50℃培育過夜。當(dāng)靶分子與固定的接頭雜交后，用化學(xué)發(fā)光優(yōu)選方法顯影靶分子。加入30nM的含有與該靶分子不同部分(并非與接頭相同部分互補(bǔ))互補(bǔ)的25聚序列生物素化檢測寡核苷酸，可在洗去過量的未結(jié)合靶分子之后30分鐘加入生物素化檢測寡核苷酸，或可與靶分子一起加入雜交過夜。檢測寡核苷酸結(jié)合后用5×SSC洗表面二次，用含0.1％吐溫20和1％PEG(SSPTP)的1×SSP洗一次，加入以SSPTP配的1∶50.000稀釋的250μg/ml辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉親和素(HRPSA購自Pierce.Rockford，I11)室溫5小時。用SSPTP洗各孔4次，用Super Signal Ulfra reagent(Pierce)洗一次，然后培育。5分鐘后用Tundra攝象機(jī)收集發(fā)光照片，例如可積累CCD陣列中的圖象5分鐘，某些孔內(nèi)靶分子濃度低至5×10-13M水平也可顯現(xiàn)。靶濃度約10-10M時信號量通常達(dá)到飽和。重復(fù)點測得的信號量有高度重復(fù)性。
實施例5兩種寡核苷酸試驗(見圖12)顯示采用上述優(yōu)選方案時兩種不同靶寡核苷酸的MAPS雜交試驗結(jié)合曲線用4種不同寡核苷酸錨在每孔中各點4處制備用MAPS板。對于第二和第四號錨，將其互補(bǔ)接頭寡核苷酸自身裝配到所述表面上。以所示濃度每孔40微升加入兩種靶分子，50℃培育過夜，通過結(jié)合各靶分子特異性生物素化檢測寡核苷酸，然后加入HRPSA并化學(xué)發(fā)光攝影顯現(xiàn)各靶分子結(jié)合的量。下圖中測定了顯影強(qiáng)度。采用Tundra Imager包中軟件掃描上圖所示箭頭之間線的顯影強(qiáng)度。最低濃度1.1pM的靶分子，掃描圖象顯示各點有很明確的高斯(gaussian)峰，而最右側(cè)樣品靶濃度為零未見可辨別的背景峰。
實施例6靈敏度遷移(見圖13)可采用MAPS雜交試驗通過使一組寡核苷酸結(jié)合于表面并標(biāo)記它們來測定其濃度。此試驗對于中等或低濃度寡核苷酸工作良好，此例中可鑒別兩種樣品，因為如一樣品含更多寡核苷酸將結(jié)合得更多。另一方面，如果尋靶寡核苷酸濃度對該表面而言已飽和(如高到足以占據(jù)全部結(jié)合位點)那么濃度再高也不可結(jié)合得更多，以至不能測定其含量。然而，可通過加入未標(biāo)記的競爭性配體來遷移靶分子的結(jié)合曲線。
獲得的四種不同靶寡核苷酸結(jié)合數(shù)據(jù)均在3nM濃度時飽和了該表面(達(dá)到最高結(jié)合)。通過向所有孔加入未標(biāo)記的競爭性靶分子，標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合曲線發(fā)生遷移，以至濃度較高時結(jié)合較少，從而提高達(dá)到飽和的水平。例如在靶分子1和3中，但不在2和4中加入競爭性寡核苷酸，只對靶分子1和3遷移了此試驗的靈敏度。用這種方法可在一個試驗孔中檢測更廣泛不同濃度的靶寡核苷酸，如果已預(yù)知寡核苷酸的相對量。
可如上所述確定靶寡核苷酸之一的結(jié)合數(shù)據(jù)。圖13顯示該試驗中加入競爭性寡核苷酸使結(jié)合曲線遷移可用于測定較高濃度的靶分子。
實施例7四種探針的解鏈溫度(見圖14)將隨溫度升高M(jìn)APS試驗測定的4種不同熒光標(biāo)記接頭寡核苷酸與寡核苷酸錨特異性雜交的量繪制成圖。先使4種寡核苷酸以300nM濃度50℃雜交1小時，然后用無探針的SSC洗滌諸孔，如上所述通過熒光法(50℃點)測定結(jié)合量，再55℃培育此表面30分鐘，測定結(jié)合的熒光，如此對所有溫度進(jìn)行測定。
實施例8檢測方法直接比較了兩種檢測方法。在含有4種寡核苷酸錨附著的每孔4個點的MAPS板中每孔加入兩種寡核苷酸，此兩種寡核苷酸均含有共價結(jié)合的Cy5部分或含有生物素基團(tuán)。按綜述所述進(jìn)行表面熒光測定和熒光接頭測定。按MAPS試驗所述利用隨后加入的HRPSA和化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測定。產(chǎn)生的信號數(shù)量級大約相同。然后，含有各孔分開的微滴板的幾何形態(tài)，偶爾產(chǎn)生的液體氣泡或液體的混濁，表面熒光攝像中的反射光都可能干擾數(shù)據(jù)的解釋。
實施例9化學(xué)發(fā)光產(chǎn)品作為MAPS試驗的檢測程序，應(yīng)比較可得到的作為辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光底物的兩種產(chǎn)品。按實施例8準(zhǔn)備MAPS板與生物素化接頭寡核苷酸一起培育，加入堿性磷酸酶偶聯(lián)的鏈霉親和素(A/KPhosSA)或HRPSA洗滌后，諸孔加入CDP-Star(Tropix)和A/KPhosSA或ECL和HRPSA。按制造商提議用SA衍生的酶和底物標(biāo)記，用于Western印跡的標(biāo)記。這兩種(及其它可得到的)底物均可用于評估與MAPS板雜交的寡核苷酸。
實施例100.6mm分辨率準(zhǔn)備每孔含有4種不同的寡核苷酸錨每孔各1個點，節(jié)距(中心之間的距離)0.6mm的MAPS板，測定當(dāng)前MAPS試驗系統(tǒng)的分辨率。如上所述使Cy5衍生接頭或生物素化接頭雜交并檢測和掃描，對于表面熒光測定分辨率較高(節(jié)距可能要減少)對于化學(xué)發(fā)光檢測方法，不能完全分開相鄰的點。也許計算機(jī)去卷積可明確分辨這種相隔的單個峰。
實施例11測定核酸酶保護(hù)在測定核酸酶保護(hù)方案的雜交和核酸酶處理最佳條件的試驗中，采用Ambion(Austin Texas)的試劑盒提供條件，緩沖劑和酶。以三種緩沖液之一制備8個樣品。Hyb Buff1是100％雜交緩沖液(Ambion)；Hyb Buff2是75％雜交緩沖液和25％雜交稀釋液(Ambion)；Hyb Buff3為各50％；合成含60個殘基與測試mRNA互補(bǔ)的70寡核苷酸(Biosource International Camarillo CA)并按Ambion的Psoralen-biotin標(biāo)記法提出的方案用Psoralen熒光素(Schleicher and SchuellKeane，NH)標(biāo)記。簡言之，將保護(hù)片段以TE緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA PH8)稀釋至50μg/ml，取20μl煮沸10分鐘，置冰水中快速冷卻，加入4微升用DMF配的130μg/ml Psoralen一熒光素，用手持長波長UV光源照射樣品90℃45分鐘用飽和丁醇抽提去除游離的Psoralen一熒光素。所用mRNA是GAPDH反義mRNA，用T7啟動子和MaxiScript試劑盒(Ambion)從反義質(zhì)粒(pTR1-GAPPH-小鼠反義控制模板，Ambion)制備。分別合成60聚互補(bǔ)部分作為短保護(hù)片段并類似地標(biāo)記。保護(hù)片段的序列如下全長保護(hù)片段，SEQ ID23CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGCTTGTCTAA短保護(hù)片段，SEQ ID24CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTT混合20nM的保護(hù)片段和60nM的GAPDHmRNA，最終體積10微升，22℃或37℃雜交二小時，雜交后按制造商說明加入200微升核酸酶混合物(Ambion核酸酶保護(hù)試劑盒1∶200核酸酶混合物稀釋液)在相同溫度下再培育30分鐘，加入雜交抑制液(Ambion)停止水解，乙醇沉淀寡核苷酸并洗滌。加入10微升1X凝膠加樣緩沖液(Ambion)，在15％TEB尿素凝膠上分離。使凝膠在流動緩沖液中轉(zhuǎn)動30分鐘。放在塑料板上，用能選擇激發(fā)和發(fā)射光波長的熒光濾板Tundra攝象機(jī)拍照。在CCD陣列上積累圖象2分鐘。最佳條件是37℃在Hyb Buff2中或22℃在Hyb Buff3中培育樣品。這些樣品中沒有殘留可測到的全長保護(hù)片段，但可見數(shù)量明顯的大小與短保護(hù)片段看來相同的全長保護(hù)片段的一部分。
實施例12NPA-MAPSR mRNA試驗(見圖15)采用完整的NPA-MAPS方案，雜交和核酸酶處理條件與實施例11所述相同，測試了10份樣品，均含有相同量的70聚寡核苷酸保護(hù)片段和不同量的GAPDH mRNA。將10微升以50％雜交緩沖液在含0.08mg/ml酵母菌RNA(Ambion)的50％稀釋緩沖液配的雜交樣品加熱至90℃6分鐘，簡單離心后加熱至70℃5分鐘，讓其冷卻至19℃，培育19小時。取各樣品60微升等份作MAPS試驗。樣品加入2微升10NNaoH和2微升0.5MEDTA加熱至90℃15℃分鐘，37℃15分鐘，靜置室溫20分鐘。然后用2微升10MHC1和12微升含2MHEPES PH7.5的20×SSC中和樣品，加入20nM該保護(hù)的特異性生物素化檢測寡核苷酸與1微升10％SDS。混合樣品加熱至80℃5分鐘。向MAPS板二孔中移入各樣的35微升二等份(每份樣品分成二份在MAPS板上一式二份測定)。按標(biāo)準(zhǔn)MAPS方案，采用針對已附著保護(hù)片段的特異性自身裝配的Cy5衍生接頭制備此板。給MAPS板加蓋，50℃培育過夜，如前所述進(jìn)行檢測和發(fā)光測定。最后一個樣品試驗期間不加核酸酶作為對照，以顯示保護(hù)片段單獨如何用MAPS檢測。此圖下部分提供了上排孔的掃描強(qiáng)度(通過圖象分析)樣品中存在的GAPDH mRNA量(各樣品等份加入MAPS板后一式二份孔中的量)列于圖中。
用于MAPS板測定的寡核苷酸如下錨*SEQ ID25CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC接頭**SEQ ID26CTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG保護(hù)片段(與GAPDH的小鼠反義的mRNA互補(bǔ))SEQ ID27CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGCTTGTCTAA檢測寡核苷酸***5’端標(biāo)記為生物素SEQ ID28AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCAT*合成的錨通過C12臂以酰胺鍵結(jié)合在5’端。
**合成的接頭通過Cy5結(jié)合在5’端。
**合成的檢測寡核苷酸通過生物素結(jié)合在5’端。
實施例13稀釋曲線NPA-MAPS(見圖16)以數(shù)量表示實施例12和圖15中所示資料并繪制成稀釋曲線。將每種mRNA濃度一式二份兩孔的所有8個點的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差繪成圖。
Fraction Bound＝Max Bound*1/(1+IC50/L)其中Max Bound是飽和時的最大結(jié)合，F(xiàn)raction Bound是配體濃度時的結(jié)合時，L和IC50是Fraction Bound為Max Bound之一半時的配體濃度。圖中以紅點表示曲線，IC50的最佳擬合值見圖中標(biāo)記為IC50＝4.2。
實施例14小鼠肝臟RNA總提取物中GAPDH mRNA的NPA-MAPS試驗用NPA-MAPS試驗測定了小鼠RNA總提取物中的GAPDH mRNA，并制作稀釋曲線。用Qiagen試劑盒制備小鼠肝臟的總RNA，以含0.5M醋酸鎂的70％EtOH沉淀RNA，并重懸于含0.05％SDS和1-8nM保護(hù)片段的10微升5×SSC中，加入的保護(hù)片段是長70個堿基，其中60個堿基與小鼠GAPDH互補(bǔ)的寡核苷酸，采用與小鼠GAPDH mRNA互補(bǔ)的片段(保護(hù)片段)或用此序列的互補(bǔ)片段作為陰性對照(反義片段)。
加熱含保護(hù)片段的RNA樣品至90℃5分鐘，然后使樣品至70℃并慢慢冷卻至室溫(Promega)，置19℃30分鐘，加入1.6微升10N NaoH和2.7微升0.5M EDTA中止反應(yīng)。加熱樣品至90℃15分鐘，然后37℃15分鐘，以變性破壞RNA，用1.6微升10M HCl中和，在含0.05％SDS并加有200mM HEPES PH7.5r 5×SSC(加入30nM生物素化檢測寡核苷酸)中MAPS板上培育過夜。如上所述洗滌并用SA-HRP顯色。信號量的減少與小鼠RNA量(各樣品含500.170.50.5或0.5μg的小鼠總RNA)的減少相平行。試驗包括的兩個對照品中沒加S1核酸酶。只觀察到互補(bǔ)性保護(hù)片段的信號。
所用寡核苷酸為反義對照(與實施例12相同)錨*SEQ ID25CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC接頭**SEQ ID26CTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG保護(hù)片段(與GAPDH的小鼠反義的mRNA互補(bǔ))SEQ ID27CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGCTTGTCTM檢測寡核苷酸***5’端標(biāo)記為生物素SEQ ID28AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCAT有義GAPDH mRNA樣品錨*SEQ ID25CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC接頭**SEQ ID29ATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG保護(hù)片段(與GAPDH的小鼠反義mRNA互補(bǔ))SEQ ID30AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCATTGCTGACAATCTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGCTTGTCTAA檢測寡核苷酸***SEQ ID31CGAGAAATATGACAACTCACTCAAG*合成的錨通過C12臂以酰胺鍵結(jié)合在5’端。
**合成的接頭通過Cy5結(jié)合在5’端。
**合成的檢測寡核苷酸通過生物素結(jié)合在5’端。
實施例15核酸保護(hù)MAPS試驗與對照提取小鼠肝臟mRNA，按實施例14所述進(jìn)行核酸酶保護(hù)，不同的是GADPH特異性保護(hù)片段含有與小鼠GAPDH互補(bǔ)的60個核苷酸，該片段3’端有15個“突出的”核苷酸與靶分子不互補(bǔ)。雜交和核酸酶消化后，剩下的保護(hù)片段如實施例14所示與MAPS板雜交，例外的是采用兩種不同寡核苷酸檢測片段檢測固定的保護(hù)片段。一個檢測片段與該保護(hù)片段的GAPDH特異性部分互補(bǔ)，另一對照片段與該保護(hù)片段的15個堿基突出部分互補(bǔ)。將各檢測片段加到不同的重復(fù)樣品(即不同孔中)上，兩種檢測片段可用相同的檢測分子標(biāo)記。在本實施例中兩種片段用HRP標(biāo)記。不加核酸酶，可觀察到兩種檢測片段產(chǎn)生的信號。當(dāng)核酸酶消化時，只能測到對應(yīng)于GAPDH序列的信號。GAPDH特異性信號的量比缺乏核酸酶消化時所見的量少，因為加入的保護(hù)片段相對于存在的GAPDH mRNA是過量的。這使得GAPDH mRNA的量被限制于保護(hù)性雜交，這樣形成的雙鏈雜交體量(因此保護(hù)片段的量受到保護(hù)不被核酸酶消化)可反映mRNA的量。當(dāng)反應(yīng)混合物中無mRNA時，加入核酸酶也不可能測到信號。以上發(fā)現(xiàn)證明如希望的那樣該試驗的雜交和消化步驟發(fā)生了。
當(dāng)所述試驗中加入了對應(yīng)于各種靶分子的保護(hù)片段時，各保護(hù)片段可含有相同的15個堿基的突出部分，這得以用一種檢測片段測定所有樣品的殘留突出物。
實施例16篩選能改變疾病狀態(tài)相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄試驗采用人腫瘤衍生的細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)其此正常細(xì)胞以較高水平表達(dá)30種基因(即這30種基因比與正常細(xì)胞相比可表達(dá)更多mRNA，然后表達(dá)更多該基因編碼的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄試驗通過測定每種基因產(chǎn)生多少mRNA而測定有多少基因被使用)。用MAPS板作核酸酶保護(hù)試驗(NPA-MAPS)測定8800種化合物，觀察在存在這些化合物時培養(yǎng)細(xì)胞能否降低30種相關(guān)基因中的某些基因表達(dá)而不影響6種正常(組成型“管家”)基因的表達(dá)。具有此作用的化合物可能用于進(jìn)一步開發(fā)治療這種腫瘤的藥物。在100塊96孔聚苯乙烯板的每一孔中加入1萬-10萬個細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞2天直至細(xì)胞覆蓋各孔表面。每塊板有8孔不加化合物讓細(xì)胞生長，其余88孔加入不同化合物測定其作用。一次用100塊板，可測定或篩選8800種化合物。在存在化合物時培養(yǎng)細(xì)胞24小時，然后收獲細(xì)胞用于試驗。按照制備96孔板樣品中RNA(如按照Qiagen RNeasy96試劑盒)的說明書處理各板中的細(xì)胞。制得RNA后，用NPA-MAPS方法測定36種不同mRNA每一種的量，包括30種相關(guān)基因和6種正?！肮芗摇被颉８骺字屑尤?6種DNA寡核苷酸保護(hù)片段，各對應(yīng)于一種感興趣基因，在選定的嚴(yán)謹(jǐn)條件下使其與它們的靶mRNA序列雜交。然后加入S1核酸酶以破壞過剩的未雜交DNA，并化學(xué)處理樣品破壞RNA。剩下的36種基因每一種的寡核苷酸保護(hù)片段與每份樣品處理細(xì)胞中存在多少mRNA成比例。
通過每孔加入36種不同的接頭寡核苷酸，制備100塊96也板，每塊板每孔中含有多個36種不同寡核苷酸錨組成的陣列。接頭在每孔表面自身裝配將該通用板轉(zhuǎn)變成MAPS板，其含有該36種寡核苷酸保護(hù)片段每一種的特異性探針。各接頭具有針對36種錨之一的特異性部分和針對36種保護(hù)寡核苷酸之一某區(qū)段的特異性部分。將100塊樣品板每孔的寡核苷酸樣品加入100塊MAPS板的對應(yīng)孔中。在選定的嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交后，加入針對各靶分子結(jié)合有化學(xué)發(fā)光酶的檢測寡核苷酸，這樣每孔各特異性點發(fā)出的光與樣品中存在多少mRNA成比例。感興趣的是顯示相關(guān)基因數(shù)量減少但不影響6種管家基因的孔。對這些樣品而言加入細(xì)胞的化合物可能是開發(fā)抗腫瘤藥物的起點。
實施例17誘導(dǎo)型和組成型基因表達(dá)基本上如實施例14所述，制備未感染(對照)或感染腺病毒一小時后(感染的)的小鼠肝臟RNA。每份樣品用60微克肝RNA，一式二份準(zhǔn)備。各試驗孔含三套一式二份位點，對應(yīng)于上述三種基因，各位點含有一寡核苷酸錨，與一接頭結(jié)合，該接頭含有與一保護(hù)片段互補(bǔ)的探針，該保護(hù)片段對應(yīng)于三種基因之一。基本上按圖12所述進(jìn)行核酸酶保護(hù)MAPS試驗，并收集圖象和掃描。顯示收集的原始圖象資料和三種mRNA靶分子之一二孔的強(qiáng)度掃描。掃描線上的數(shù)字是每種情況的綜合強(qiáng)度值和標(biāo)準(zhǔn)并(n＝4)。未預(yù)料到管家基因GAPDH會改變，顯示感染樣品中中等程序增加1-3倍，但無統(tǒng)計學(xué)意義。M1P-2和C-jun的轉(zhuǎn)錄分別提高了4和6倍。這些發(fā)現(xiàn)證明M1-2P和C-jun兩種基因與對照組成型表達(dá)基因GAPDH相比較在對腺病毒感染的反應(yīng)中表達(dá)增加。
實施例18篩選選擇性抑制酪氨酸或絲氨酸激酶的化合物的酶試驗(見圖17)激酶是能使磷酸結(jié)合于蛋白質(zhì)的酶。許多激酶已顯示能刺激正常和腫瘤細(xì)胞的生長。因而可利用能抑制特異性激酶(但不是所有的激酶)的化合物來測試激酶是否參與了致病機(jī)制，如果是，該化合物可作為藥物開發(fā)的起點。例如，五種酪氨酸激酶src、Lck、fyn、Zap70和yes參與了刺激細(xì)胞生長或調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。各激酶的底物已部分得到鑒定如含有一個酪氨酸的短肽。某些激酶的底物特異性有所重疊，因此，不同激酶可能同等磷酸化某些肽，但優(yōu)先磷酸化其它肽。對于該項五種激酶，選出的36種肽底物顯示了特異性譜和特異性重疊。
采用100塊96孔板，每孔含36種通用性寡核苷酸錨。制備36種接頭將該通用性寡核苷酸陣列(只有錨)轉(zhuǎn)變成含肽底物的陣列。合成36種肽底物并將各肽通過酰胺鍵共價結(jié)合于含5’氨基的一寡核苷酸。這些寡核苷酸含有能與錨特異性雜交的序列。將肽/寡核苷酸接頭加和MAPS板的所有孔中使其身安裝在孔表面上。
為了篩選，各孔加入適當(dāng)濃度的五種激酶(盡可能平衡底物磷酸化的速度)和8800種待測化合物之一。測定各化合物直接抑制分離的酶的能力。加入只結(jié)合酪氨酸已磷酸化的肽的標(biāo)記的抗體來檢測備陣列中肽磷酸化的數(shù)量。感興趣的是顯示某些點但不是所有點上磷酸酪氨酸降低的孔。可進(jìn)一步測定這些孔加入的化合物作為所測定的某些激酶的可能選擇性抑制劑。
此試驗方案見圖17的上圖。制備一種嵌合性接頭分子，該分子中與一種錨之一互補(bǔ)的25對堿基寡核苷酸與酪氨酸磷酸激酶的肽底物交聯(lián)。該嵌合型寡核苷酸一肽底物可自身安裝在寡核苷酸錨陣列上。用此激酶磷酸化該嵌合體的肽部分。使進(jìn)行酶促反應(yīng)后用結(jié)合了檢測熒光團(tuán)或酶的抗磷酰酪氨酸或抗磷酰絲氨酸抗體測定此肽磷酸化的量。
此試驗的結(jié)果見下圖，采用同質(zhì)雙功能交聯(lián)接頭DSS(Pierce)將寡核苷酸接頭的5’氨基結(jié)合于合成的含磷?；野彼岬碾牡腘端。此肽序列的單字母為TSEPQpYQPGENL(SEQ ID32)，其中pY代表磷酰酪氨酸。直接用此嵌合體或先置于PH14，60分鐘以部分水解酪氨酸的磷酸基團(tuán)。磷?；虿糠至柞；那逗戏肿釉谒緷舛茸陨戆惭b在MAPS板中互補(bǔ)性錨上1小時。用含0.3％BSA的SSPTP洗滌和封閉諸孔后加入用SSPTP作1∶3000稀釋的偶聯(lián)有HRP的抗磷酰酪氨酸抗體(Upstate Biotechnology的抗體4G10.Lake Placid.NY)1小時，用化學(xué)發(fā)光底物SuperSignal Blaze檢測結(jié)合抗體的量。將顯示的圖象在CCD陣列上積累1分鐘。如預(yù)期那樣，發(fā)現(xiàn)結(jié)合于寡核苷酸一肽的磷酸量有差別。這種差別是測定用不同的可能抑制劑處理時如何活化一系列激酶的試驗的基礎(chǔ)。
實施例19檢測SH2功能域和磷酰肽之間相互反應(yīng)的選擇性抑制劑的結(jié)合試驗SH2功能域作用是某些生長調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的?？縼唵挝?。此功能域能以不完全的特異性結(jié)合含磷酰酪氨酸的蛋白質(zhì)或肽。即某些磷酰酪氨酸肽能特異性結(jié)合一個或幾個SH2蛋白，而其它能廣泛結(jié)合多種SH2蛋白。
用于此試驗的接頭是共價結(jié)合于寡核苷酸的磷酸化肽。選擇肽的能結(jié)合一組SH2蛋白的部分，此種接頭可將通用MAPS板轉(zhuǎn)變成含有該組SH2蛋白的特異性配體的板。制備含有這些配體的100塊96孔MAPS板。分離這些蛋白質(zhì)并用例如Cy5熒光分子標(biāo)記。
為了篩選SH2功能域/磷酸肽相互反應(yīng)的抑制劑在100塊96孔MAPS板的每孔中加入該組標(biāo)記的SH2蛋白，并且每孔中加入不同的待測化合物。檢測每種化合物單獨對SH2蛋白與其磷酰肽相互作用的影響。此試驗是測定結(jié)合的SH2蛋白與結(jié)合于各表面的肽接頭相結(jié)合時產(chǎn)生的熒光。對于顯示某些點而不是所有點的熒光減少的孔，可進(jìn)一步測試此孔中所加的化合物，是否可作為SH2停靠的推定選擇性抑制劑。
實施例20高通量篩選(見圖22)用高通量MAPS板顯示了對一次實驗96孔的信號檢測，測定了80孔中16份重復(fù)樣品與同一寡核苷酸的雜交。如圖所示，1280個雜交試驗的重現(xiàn)性很高。最左和最右柜作為標(biāo)準(zhǔn)化該寡核苷酸不同濃度時所產(chǎn)生信號的對照。
以相似方式，每孔可檢測16種不同的寡核苷酸并在此板的80個不同孔中重復(fù)此測定，當(dāng)然每孔可測定更高數(shù)目的不同寡核苷酸或其它探針(如100種核苷酸探針)，多塊板可同時測定(如100塊96孔微滴板)可對每份樣品進(jìn)行大量測定(如在后一情況時，約100種不同試驗)可同時測定大量樣品(如在后一情況時，約96×100或9600個不同樣品)提供了非常高的處理量。
實施例21 制備擴(kuò)增的靶分子(見圖23)通過在引物寡核苷酸的5’端引入一化學(xué)修飾，使PCR引物(引物1)結(jié)合于一固相載體(如珠或反應(yīng)管)。此引物從5’-3’含有該化學(xué)修飾，限制性酶切位點和與感興趣的靶分子(如感興趣mRNA的cDNA拷貝)互補(bǔ)的序列。作為PCR引物，采用結(jié)合的引物1加引物2(從5’-3’含有針對檢測寡核苷酸的特異性序列和與靶分子而不是引物1的不同部分互補(bǔ)的序列)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增靶DNA，PCR擴(kuò)增后洗滌擴(kuò)增的靶DNA去除過量的反應(yīng)物質(zhì)，并用對引物1上限制性位點有特異性的限制性酶切割使靶DNA從固相載體上釋放下來。擴(kuò)增的引物也釋放入液相中?？刹捎眉訜岷?或化學(xué)方法滅活限制性酶并使雙鏈DNA產(chǎn)物變性。然后可使釋放的單鏈DNA靶分子接觸含有錨和/或接頭的表面，并可用與引物2的特異性檢測序列互補(bǔ)的檢測寡核苷酸檢測此靶分子。
實施例22 制備擴(kuò)增的靶分子通過在引物寡核苷酸的5’端引入一化學(xué)修飾，使PCR引物(引物1)結(jié)合于一固相載體(如珠或反應(yīng)管)。此引物從5’-3’含有該化學(xué)修飾，可被蛋白酶切斷的肽序列和與感興趣的靶分子(如感興趣mRNA的cDNA拷貝)互補(bǔ)的序列。除了肽，任何其它可被特異性切斷的元件也可使用。如實施例21所述，PCR擴(kuò)增后，變性和(任選)洗滌仍結(jié)合于固相載體的PCR產(chǎn)物，使其成為結(jié)合于載體上的單鏈分子。可切斷此洗滌的結(jié)合分子并釋放(如用適當(dāng)?shù)牡鞍酌柑幚?下來，與含有錨和/或接頭的表面接觸?；蛘?，使擴(kuò)增的靶分子鏈釋放，變性后，與含有錨和/或接頭的表面接觸。或者只擴(kuò)增靶分子的一條鏈與接頭接觸(如雜交)，這樣消除了與擴(kuò)增靶分子的反向鏈競爭雜交，從而降低了本底?？稍O(shè)計出對擴(kuò)增靶分子兩條鏈之一或二者具有特異性的接頭。
實施例23采用檢測接頭和報道試劑的試驗(見圖24)對含有感興趣mRNA的樣品進(jìn)行核酸酶保護(hù)程序，用作保護(hù)片段的寡核苷酸含有靶特異部分和與該mRNA不互補(bǔ)的控制性突出端部分。核酸酶消化后，如需要可切下該控制性突出部分，見此圖右側(cè)說明，使產(chǎn)生的核酸酶保護(hù)片段與檢測接頭雜交，此接頭含有靶特異部分和控制性突出端特異部分，此圖左側(cè)所示的試驗中，檢測接頭的控制性突出端部分與保護(hù)片段剩余的控制性突出端序列雜交。在該試驗以后的步驟中，一報道試劑(其含有能與該檢測接頭控制性突出端特異部分反應(yīng)的部分)與此復(fù)合物相互反應(yīng)。此圖左側(cè)所示試驗中，此報道試劑與仍有的能進(jìn)行雜交的檢測接頭控制性突出端特異部分雜交。依靠此報道試劑產(chǎn)生的信號可檢測到此復(fù)合物。相反，此圖右側(cè)所示試驗中，該報道試劑不能結(jié)合此復(fù)合物，因為基沒有可雜交的互補(bǔ)序列，因此沒有該復(fù)合物的相關(guān)信號。
本發(fā)明的許多試驗中，報道試劑可與檢測接頭中的任何序列反應(yīng)，不限于針對控制性突出端的特異性序列。
實施例24多重?zé)晒鈭F(tuán)(見圖25)
圖25顯示含有五個位點A-E的某區(qū)域，各位點含有基本上相同錨的A-E的不同組。與位點A處錨雜交的有4種不同類型的接頭，各含有對錨A的特異部分。然而，各錨含有針對靶1、2、3或4的不同的靶特異部分。因此，當(dāng)靶分子與錨/接頭復(fù)合物雜交后，靶分子1、2、3或4就可能定位于位點A上。類似的，四種不同的接頭可與位點B雜交，每接頭含針對錨B的特異部分，但其靶特異部分是針對靶分子5、6、7或8的以相似方式，靶分子9-12可與位點C結(jié)合，靶分子13-16與位點D，靶分子17-20與位點E結(jié)合。如用不同的獨立的可檢測熒光團(tuán)，如高轉(zhuǎn)化磷直接或間接標(biāo)記每種靶分子就可分別檢測5個位點上的所有20種靶分子。
實施例25高通量方式的試驗此實施例中，采用本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄試驗以為高通量篩選作準(zhǔn)備的方式，檢測和定量基因表達(dá)模式的變化，自動化進(jìn)行該試驗的所有步驟。不具體敘述常規(guī)洗滌步驟，所有反應(yīng)按本領(lǐng)域所知和/或本文所述常規(guī)程序進(jìn)行。
在96孔V形底微滴孔板上培養(yǎng)，THP-1單核細(xì)胞，每孔5萬或15萬個細(xì)胞，細(xì)胞不處理或用佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸(PMA)分化48小時，然后用脂多糖(LPS)激活4小時。處理后以異硫氰酸胍裂解細(xì)胞，凍存直至需要時用結(jié)合生物素聚dT的鏈霉親和素順磁顆粒獲得mRNA?；蛘哂萌N試劑(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)抽提獲得總RNA。對含有mRNA或總RNA的樣品進(jìn)行核酸酶保護(hù)程序，采用13種60聚單鏈寡核苷酸的混合物作為DNA保護(hù)片段，這些單鏈寡核苷酸各自從5’-3’含有針對感興趣的13種靶分子(GAPDH。IL-1 TNF-α，組織蛋白酶G、COX-2、周期蛋白-2、波形蛋白、LD78-β、HMG-17、骨橋蛋白、血小板球蛋白、血管緊張素或肌動蛋白)之一的特異性25聚體、-10聚臂、針對共同寡核苷酸檢測探針的特異性25聚體和15聚共同控制性突出端序列。mRNA就此轉(zhuǎn)變成此試驗所測出的“對應(yīng)的DNA保護(hù)片段”的化學(xué)計量，對照實驗中這些對應(yīng)的DNA保護(hù)片段與針對控制性突出端序列的特異性探針一起培育，顯示基本上只有針對感興趣mRNA分子的特異性序列存在于該對應(yīng)的保護(hù)片段中，如所預(yù)計的那樣，如果發(fā)現(xiàn)核酸酶消化時。
按本發(fā)明方法準(zhǔn)備好表面，96孔DNA結(jié)合板的每孔中置有一16種不同25聚寡核苷酸錨的陣列。采用14種不同的錨，一種錨用于此陣列四個角中的3個，采用13種不同的錨，各自位于此陣列的其余位置。然后使該錨以確定的正交模式與60聚寡核苷酸接頭雜交，每個接頭從5’-3’含對應(yīng)于13種感興趣的靶分子之一的25聚體、-10聚體臂和針對錨之一的特異性25聚體。這樣，此多種重復(fù)的16點陣列的各點在陣列中的確定位置(位點)定位了十三種靶特異性接頭之一。見圖18此正交陣列說明。對應(yīng)于GAPDH(一種組成性表達(dá)的管家基因，用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化對照)的接頭位于各陣列中的三個位點。對照實驗表明，此實驗所用的接頭以及保護(hù)片段和檢測寡核苷酸顯示了所需的特異性。
使上述含有制備的對應(yīng)保護(hù)片段混合物的樣品與此錨/接頭陣列雜交。采用未處理或經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)物產(chǎn)生的樣品。然后，通過與標(biāo)記的檢測寡核苷酸雜交檢測各位點是否存在雜交的保護(hù)片段和數(shù)量。為了標(biāo)準(zhǔn)化各位點的信號量，用適當(dāng)量的本文所述阻斷性寡聚物稀釋檢測寡核苷酸。加工各位點的信號量并按對照GAPDH的信號標(biāo)準(zhǔn)化。8份重復(fù)樣品以及三次不同日期的獨立實驗制備的樣品所獲數(shù)據(jù)有再現(xiàn)性。下表顯示一次實驗中13種轉(zhuǎn)錄物相對豐度的小結(jié)。
相對密度(105細(xì)胞/孔)
實施例26多重陣列板數(shù)據(jù)定量的計算機(jī)算法一種優(yōu)選的算法能找到MAPS板所有點的位置并自動計算出各數(shù)據(jù)點信號幅度的最佳擬合估計值。優(yōu)選用計算機(jī)程序執(zhí)行此算法。
1-選擇小部分圖像數(shù)據(jù)40×40盒，含該圖像各像素(圖像單元)的強(qiáng)度值，此圖像包括被查的第一孔。
2-用16種未知物確定計算各像素位置預(yù)期強(qiáng)度的函數(shù)，這些未知物是13個不同微陣列點每一點的幅度(即DNA陣列各位置真實信號有多亮)。對于每孔中4×4(＝16)點有13個點如此，因為16個點中的某些是同一靶分子的重復(fù)點。
X偏移和Y偏移確定此具體孔中4×4點陣列的確切位置。
此孔中圖象的背景強(qiáng)度。
各像素位置的此函數(shù)計算出該像素和各點之間的距離，通過點幅度乘以所述距離的脈沖反應(yīng)函數(shù)，增加了各點對該像素觀察強(qiáng)度的貢獻(xiàn)。對于所用圖像，通過高斯和相應(yīng)(常量)半徑的Lorentzian之和確定該脈沖反應(yīng)函數(shù)。
3-通過快速猜測諸參數(shù)值開始對當(dāng)前的孔進(jìn)行擬合。為此計算此圖像預(yù)計有點子的16個區(qū)域的平均圖像強(qiáng)度。減去這16個平均值的偏移，用一常數(shù)換算此差異。憑經(jīng)驗確定此偏移和換算常數(shù)。重安排結(jié)果以使16點與13個幅度匹配。背景和偏移采用任何小號碼。
4-通過曲線擬合優(yōu)化擬合的值(對16種未知物)。具體采用帶線性化擬合函數(shù)的Marquadt程序的線性最小平方算法，擬合16種未知物為40×40＝1600等式(當(dāng)然不是所有等式都是線性獨立的)。
5-利用X、Y偏移為當(dāng)前孔擬合以提高的精確性估計何處坐標(biāo)方格，將會用是微板的下一孔。預(yù)計相對于下一毗鄰孔(通過圖像系統(tǒng)60放大系數(shù)變換為像素號碼的距離)為9厘米偏移。因為孔間距離相對于此板尺寸較小，利用位置的局部估計是最準(zhǔn)確的。
6-隨著位置估計的改進(jìn)確定下一孔圖像的較小，移至30×30像素塊。這使得擬合更快。
回到第二步并對每孔重復(fù)。
實施例27 高通量篩選(見圖26和27)圖26說明了采用檢測接頭和一個報道試劑作為試驗的原始圖像數(shù)據(jù)，該試驗測定了96份不同的細(xì)胞樣品中13種天然mRNA的表達(dá)。96孔板每孔含105個未處理(左半圖)THP-1細(xì)胞或用PMA和LPS誘導(dǎo)成為單核細(xì)胞(右半圖)。
表達(dá)模式變化一致，誘導(dǎo)了IL-1、TNF、COX-2、波形蛋白、LD78、骨橋蛋白和β-血小板球蛋白。關(guān)閉了組織蛋白酶G，周期蛋白-6，HMG-17和血管緊張素，GAPDH和肌動蛋白不變。
圖27提供THP-1細(xì)胞基因的空間安排，和兩個樣品孔的資料(選自圖26)。
此實驗用的寡核苷酸列于下表。對于某此靶分子，用一含有25個與保護(hù)片段互補(bǔ)堿基，但不含報道試劑互補(bǔ)序列的不完全檢測接頭寡核苷酸稀釋檢測接頭，降低了信號的強(qiáng)度。這些不完全寡核苷酸稱為“弱化因子”。
表1提供了上述原始數(shù)據(jù)的數(shù)量限定，此篩選試驗的高通量進(jìn)行。在96孔板中培養(yǎng)和處理細(xì)胞，平均每孔105個細(xì)胞，這是微孔板常規(guī)操作的細(xì)胞數(shù)，以高通量形式測定了細(xì)胞小樣品的13種基因表達(dá)模式。如表1小結(jié)，試驗獲得的結(jié)果證實和擴(kuò)展了文獻(xiàn)所報道的。此試驗可檢測到每個細(xì)胞低于一個拷貝的基因表達(dá)。參考文獻(xiàn)反映了各種相關(guān)細(xì)胞類型如U-937細(xì)胞的積累觀察資料。我們測定的背景信號很低，對照與誘導(dǎo)條件結(jié)合之間差異明顯。采用檢測接頭，只用一種報道試劑就能降低試驗背景，這是由于含HRP的報道試劑總濃度低得多。
表1相對豐度(每個細(xì)胞的RNA分子+)MAPS96-16格式、105細(xì)胞/孔
+估計值，假設(shè)GAPDH為30/細(xì)胞 *％CV(Std Dev/Mean as a％)(n＝48)，**nd未測。
實施例27中所用的寡核苷酸和檢測接頭及各探針是固定的探針CACCTCCAAACAGTGAAGGAGAGCA(偶聯(lián)于HRP)(SEQ ID33)靶#1；IDMI7851GAPDH9572-513)錨長度＝25CGCCGGTCGAGGCGTTGTGGGAGCGC(SEQ ID34)靶長度＝60TGAGAAGTATGACAACAGCCTCAAGATCATCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTT(SEQID35)接頭長度＝60ATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG(SEQID36)保護(hù)片段長度＝75AAGCAGTTGGTGGTGCAGGAGGCATTGCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCTCAGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID37)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACGTAGTTGAGAAGTATGACAACAGCCTCAAG(SEQID38)弱化因子長度＝25TGAGAAGTATGACAACAGCCTCAAG(SEQ ID39)靶#2；IDMI5840 ILI-β(4392-4333)錨長度＝25TCCACGTGAGGACCGGACGGCGTCC(SEQ ID40)靶長度＝60CGACACATGGGATAACGAGGCTTATGTGCACGATGCACCTGTACGATCACTGAACTGCAC(SEQID41)接頭長度＝60CACCTGTACGATCACTGAACTGCACGATACTGAGTGGACGCCGTCCGGTCCTCACGTGGA(SEQID42)保護(hù)片段長度＝75GTGCAGTTCAGTGATCGTACAGGTGCATCGTGCACATAAGCCTCGTTATCCCATGTGTCGGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID43)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCGACACATGGGATAACGAGGCTTAT(SEQID44)弱化因子長度＝25CGACACATGGGATAACGAGGCTTAT(SEQ ID45)靶#3；IDMI0988 TNF(780-721)錨長度＝25CACTACGGCTGAGCACGTGCGCTGC(SEQ ID46)靶長度＝60CGGAACCCAAGCTTAGAACTTTAAGCAACAAGACCACCACTTCGAAACCTGGGATTCAGG(SEQID47)接頭長度＝60ACCACTTCGAAACCTGGGATTCAGGGATACTGAGTGCAGCGCACGTGCTCAGCCGTAGTG(SEQID48)保護(hù)片段長度＝75CCTGAATCCCAGGTTTCGAAGTGGTGGTCTTGTTGCTTAAAGTTCTAAGCTTGGGTTCCGGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID49)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCGGAACCCAAGCTTAGAACTTTAAG(SEQID50)弱化因子長度＝25CGGAACCCAAGCTTAGAACTTTAAG(SEQ ID51)靶#4；IDMI7851 GAPDH(572-513)(與靶#1相同)
靶#5；IDMI6117組織蛋白-G(373-314)錨長度＝25GAACCGCTCGCGTGTTCTACAGCCA(SEQ ID52)靶長度＝60GCGGACCATCCAGAATGACATCATGTTATTGCAGCTGAGCAGAAGAGTCAGACGGAATCG(SEQID53)接頭長度＝60TGAGCAGAAGAGTCAGACGGAATCGGATACTGAGTTGGCTGTAGAACACGCGAGCGGTTC(SEQID54)保護(hù)片段長度＝75CGATTCCGTCTGACTCTTCTGCTCAGCTGCAATAACATGATGTCATTCTGGATGGTCCGCGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID55)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGCGGACCATCCCAGAATGACATCATG(SEQID56)弱化因子長度＝25GCGGACCATCCAGAATGACATCATG(SEQ ID57)靶#6 IDM90100 COX-2(240-181)錨長度＝25CTCGTTCCGCGTCCGTGGCTGCCAG(SEQ ID58)靶長度＝60CCGAGGTGTATGTATGAGTGTGGGATTTGACCAGTATAAGTGCGATTGTACCCGGACAGG(SEQID59)接頭長度＝60ATAAGTGCGATTGTACCCGGACAGGGATACTGAGTCTGGCAGCCACGGACGCGGAACGAG(SEQID60)保護(hù)片段長度＝75CCTGTCCGGGTACAATCGCACTTATACTGGTCAAATCCCACACTCATACATACACCTCGGGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID61)檢測接頭長度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCCGAGGTGTATGTATGAGTGTGGGA(SEQID62)弱化因子長度＝25CCGAGGTGTATGTATGAGTGTGGGA(SEQ ID63)靶#7；IDM74091周期蛋白(932-873)錨長度＝25CGGTCGGCATGGTACCACAGTCCGC(SEQ ID64)靶長度＝60CACCTCCAAACAGTGAAGGAGAGCAGGGTCCAAATGGAAGTCAGAACTCTAGCTACAGCC(SEQID65)接頭長度＝60GGAAGTCAGAACTCTAGCTACAGCCGATACTGAGTGCGGACTGTGGTACCATGCCGACCG(SEQID66)保護(hù)片段長度＝75GGCTGTAGCTAGAGTTCTGACTTCCATTTGGACCCTGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID67)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCACCTCCAAACAGTGAAGGAGAGCA(SEQID68)弱化因子長度＝25CACCTCCAAACAGTGAAGGAGAGCA(SEQ ID69)靶#8 IDMI4144波形蛋白(1338-1279)錨長度＝25GCGCGCCGCGTTATGCATCTCTTCG(SEQ ID70)靶長度＝60GTGGATGCCCTTAAAGGAACCAATGAGTCCCTGGAACGCCAGATGCGTGAAATGGAAGAG(SEQID71)接頭長度＝60ACGCCAGATACGTGAAATGGAAGAGGATACTGAGTCGAAGAGATGCATAACGCGGCGCGC(SEQID72)保護(hù)片段長度＝75CTCTTCCATTTCACGCATCTGGCGTTCCAGGGACTCATTGGTTCCTTTAAGGGCATCCACGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID73)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGTGGATGCCCTTAAAGGAACCAATG(SEQID74)弱化因子長度＝25GTGGATGCCCTTAAAGGAACCAATG(SEQ ID75)靶#9；IDD90145 LD78-b(2049-1990)錨長度＝25GTTAGCATACGTGTCACCACACCGG(SEQ ID76)靶長度＝60CACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTG(SEQID77)接頭長度＝60ACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGGATACTGAGTCCGGTGTGGTGACACGTATGCTAAC(SEQID78)保護(hù)片段長度＝75CACTGGCTGCTCGTCTCAAAGTAGTCAGCTATGAAATTCTGTGGAATCTGTCGGGAGGTGGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID79)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCACCTCCCGACAGATTCCACAGAAT(SEQID80)弱化因子長度＝25CACCTCCCGACAGATTCCACAGAAT(SEQ ID81)靶#10；IDX13546 HMG-17 M12623-mRNA(191-132)錨長度＝25CGTCAGTCCGTCGGCCAGCTCTTCC(SEQ ID82)
靶長度＝60CAAAGGTGAAGGACGAACCACAGAGAAGATCCGCGAGGTTGTCTGCTAAACCTGCTCCTC(SEQID83)接頭長度＝60AGGTTGTCTGCTAAACCTGCTCCTCGATACTGAGTGGAAGAGCTGGCCGACGGACTGACG(SEQID84)保護(hù)片段長度＝75GAGGAGCAGGTTTAGCAGACAACCTCGCGGATCTTCTCTGTGGTTCGTCCTTCACCTTTGGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID85)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCAAAGGTGAAGGACGAACCACAGAG(SEQID86)弱化因子長度＝25CAAAGGTGAAGGACGAACCACAGAG(SEQ ID87)靶#11；IDX13694骨橋蛋白(783-724)錨長度＝25ATCCAGTTAACCACATGCTAGTACC(SEQ ID88)靶長度＝60CCGTGGGAAGGACAGTTATGAAACGAGTCAGCTGGATGACCAGAGTGCTGAAACCCACAG(SEQID89)接頭長度＝60ATGACCAGAGTGCTGAAACCCACAGGATACTGAGTGGTACTAGCATGTGGTTAACTGGAT(SEQID90)保護(hù)片段長度＝75CTGTGGGTTTCAGCACTCTGGTCATCCAGCTGACTCGTTTCATAACTGTCCTTCCCACGGGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID91)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCCGTGGGAAGGACAGTTATGAAACG(SEQID92)弱化因子長度＝25
CCGTGGGAAGGACAGTTATGAAACG(SEQ ID93)靶#12；IDMI7017b血小板球蛋白(142-83)錨長度＝25TTAGCGTTGGCCGAGGTTCATAGCC(SEQ ID94)靶長度＝60GTGTAAACATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCTCTCTTGGCAGCCTTCCTGATTTCTGCAG(SEQID95)接頭長度＝60TTGGCAGCCTTCCTGATTTCTGCAGGATACTGAGTGGCTATGAACCTCGGCCAACGCTAA(SEQID96)保護(hù)片段長度＝75CTGCAGAAATCAGGAAGGCTGCCAAGAGAGCCACGGCCAGCTTGGAAGTCATGTTTACACGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID97)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGTGTAAACATGACTTCCAAGCTGGC(SEQID98)弱化因子長度＝25GTGTAAACATGACTTCCAAGCTGGC(SEQ ID99)靶#13；ID；MI7851 GAPDH9572-513)(與靶#1相同)靶#14；IDK02215 血管緊張肽(805-746)錨長度＝25CATTACGAGTGCATTCGCATCAAGG(SEQ ID100)靶長度＝60CACGCTCTCTGGACTTCACAGAACTGGATGTTGCTGCTGAGAAGATTGACAGGTTCATGC(SEQID101)接頭長度＝60GCTGAGAAGATTGACAGGTTCATGCGATACTGAGTCCTTGATGCGAATGCACTCGTAATG(SEQID102)
保護(hù)片段長度＝75GCATGAACCTGTCAATCTTCTCAGCAGCAACATCCAGTTCTGTGAAGTCCAGAGAGCGTGGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID103)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCACGCTCTCTGGACTTCACAGAACT(SEQID104)弱化因子長度＝25CACGCTCTCTGGACTTCACAGAACT(SEQ ID105)靶#15；IDMI0277肌動蛋白(2627-2568)錨長度＝25ATCATGTAAGTCTTCGGTCGGTGGC(SEQ ID106)靶長度＝60GAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATCATGAAGTGTGACGTGGACATC(SEQID107)接頭長度＝60CATCATGAAGTGTGACGTGGACATCGATACTGAGTGCCACCGACCGAAGACTTACATGAT(SEQID108)保護(hù)片段長度＝75GATGTCCACGTCACACTTCATGATGGACTTGAAGGTAGTTTCGTGGATGCCACAGGACTCGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID109)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTA(SEQID110)弱化因子長度＝25GAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTA(SEQ ID111)靶#16；(此點不用)實施例28同時檢測DNA和RNA(見圖29)在96孔V形底微滴板中培養(yǎng)THP-1人單核細(xì)胞，3萬-15萬細(xì)胞/每孔。對照細(xì)胞不用PMA分化或不用LPS激活，因為某些基因(如IL-2、COX-2、LD78、骨橋蛋白和血小板球蛋白)的RNA這些細(xì)胞中不存在，因而試驗只測DNA，而GAPDH的DNA和RNA二者都存在可予以測定。在水(裂解)溶液中加熱細(xì)胞至105℃，裂解中加入感興趣的靶分子的特異性核酸酶保護(hù)片段。溫度升高裂解物釋放出測定形式的DNA和RNA。為測定DNA加入的核酸酶保護(hù)片段為針對IL-1、COX-2、LD78、骨橋蛋白和血小板球蛋白的保護(hù)片段。為同時測定DNA和RNA，加入上述核酸酶保護(hù)片段以及針對GAPDH的特異性保護(hù)片段，如本文所述進(jìn)行核酸酶保護(hù)反應(yīng)。
基本上按實施例27所述形成陣列和進(jìn)行保護(hù)片段的雜交。通過一系列檢測接頭的雜交檢測DNA和DNA+RNA。進(jìn)行系列雜交是為了平衡RNA和DNA靶分子產(chǎn)生的信號(見F)。當(dāng)然，系列雜交不是該試驗同時檢測DNA和RNA靶分子所要求。第一輪中加入IL-2、COX-2、LD78、骨橋蛋白和血小板球蛋白的檢測接頭。第二輪加入GAPDH的檢測接頭。進(jìn)行系列雜交以拍攝DNA信號，此信號比RNA信號弱得多，因為每份樣品的拷貝低得多，延長雜交時間以積累較高的信號強(qiáng)度。
圖29提供了測定結(jié)果。左圖說明只檢測基因組DNA時，待測的IL-2、COX-2、LD78、骨橋蛋白和血小板球蛋白的基因組序列均可在相應(yīng)位點測到數(shù)量幾乎相同。表1為所測定的基因組DNA，顯示在對照細(xì)胞中沒有測到這些基因的DNA。右圖為測定的DNA和RNA，但收集的圖像暴光時間短得多，因而DNA信號較左圖弱得多，表明同時檢測DNA和RNA時，對照基因組序列可作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化參比品檢測，基因GAPDH表達(dá)水平比對照高得多。通過測定對照信號和表達(dá)的GAPDHmRNA的相對量，可計算出每個細(xì)胞表達(dá)的mRNA量。
實施例29檢測表達(dá)的SNP(見圖30和31)圖90說明了檢測表達(dá)的SNP的一種試驗。其中，設(shè)計的核酸酶保護(hù)片段，當(dāng)加入適當(dāng)?shù)拿?如RNA酶H)時，含SNP的RNA的該區(qū)域雜交，如果該核酸酶保護(hù)片段與堿基錯配的RNA(此處為SNP)雜交，此酶將切割此核酸酶保護(hù)片段。此實施例中產(chǎn)生的切割片段不能與此陣列雜交(由于所用的雜交條件如溫度的影響)。另一實施例中可發(fā)生與此陣列雜交但檢測接頭不能結(jié)合切割的保護(hù)片段(由于所用的雜交條件如溫度影響)或切割的片段不能同時與此陣列和檢測接頭雜交時發(fā)生切割。
圖31說明按本文常規(guī)方法進(jìn)行此類試驗的結(jié)果，用野生型肌動蛋白作為內(nèi)部對照，含有經(jīng)基因工程產(chǎn)生的SNP的GAPDH的保護(hù)片段，與對應(yīng)于野生型GAPDH的保護(hù)片段。圖31說明含野生型GAPDH和野生型肌動蛋白(左側(cè)和放大的左圖)或含SNPGAPDH和野生型肌動蛋白(右側(cè)和放大的右圖)的多個樣品的測定結(jié)果，放大的中圖說明該陣列設(shè)計。
實施例30高通量篩選(見圖32-35)基本上按實施例28所述進(jìn)行轉(zhuǎn)錄試驗，不同的是寡核苷酸錨放置在放射性照射過的板上而非DNA結(jié)合板上。采用實施例27所述相同的寡核苷酸錨，但改變陣列中的某些靶分子，只有一種錨測定GAPDH，并加入微管蛋白、肌動蛋白和LDH。測定的其它靶分子是IL-1、TNF-α、組織蛋白酶G、COX-2、G-CSF、GM-CSF、GST-Pil、HMG-17、b-血小板球蛋白、TIMP-1、MMP-9。圖32說明此陣列、接頭和核酸酶保護(hù)片段序列見下，每孔采用大約3萬個細(xì)胞(在PMA和LDH處理受處理細(xì)胞時未對細(xì)胞的不斷增殖作調(diào)整)。
序列靶#1GAPDH(與實施例27靶#1相同)靶#2IL-1b(與實施例27靶#2相同)靶#3 TNF-α(與實施例27靶#3相同)靶#4 微管蛋白質(zhì)(AF141347)靶#15；IDMI0277肌動蛋白(2627-2568)錨長度＝25TAAGCGTCTCTAGGAAGGGACGTGG(SEQ ID112)靶長度＝60GACGTGGTTCCCAAAGATGTCAATGCTGCCATTGCCACCATCAAGACCAAGCGTACCATC(SEQID113)接頭長度＝60CACCATCAAGACCAAGCGTACCATCGATACTGAGTCCACGTCCCTTCCTAGAGACGCTTA(SEQID114)保護(hù)片段長度＝75GATGGTACGCTTGGTCTTGATGGTGGCAATGGCAGCATTGACATCTTTGGGAACCACGTCGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID115)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGACGTGGTTCCCAAAGATGTCAATG(SEQID116)
弱化因子長度＝25GACGTGGTTCCCAAAGATGTCAATG(SEQ ID117)靶#5 組織蛋白酶G(與實施例27的靶#5相同)靶#6 Cox-2(與實施例27的靶#6相同)靶#7；G-CSF(E01219)錨長度＝25CGGTCGGCATGGTACCACAGTCCGC(SEQ ID118)靶長度＝60GAGGGAGCAGCCAGGAGGAATCATGTCAGGCCTGTGTGTGAAAGGAAGCTCCACTGTCAC(SEQID119)接頭長度＝60GTGTGAAAGGAAGCTCCACTGTCACGATACTGAGTGCGGACTGTGGTACCATGCCGACCG(SEQID120)保護(hù)片段長度＝75GTGACAGTGGAGCTTCCTTTCACACACAGGCCTGACATGATTCCTCCTCTCTGCTCCCTCGCTTGTCTAAAGTCTG(SEQ ID121)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGAGGGAGCAGACAGGAGGAATCATG(SEQID122)弱化因子長度＝25GAGGGAGCAGACAGGAGGAATCATG(SEQ ID123)靶#8；GM-CSF(E02975)錨長度＝25GCGCGCCGCGTTATGCATCTCTTCG(SEQ ID124)靶長度＝60CACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACC(SEQID125)接頭長度＝60TTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCGATACTGAGTCGAAGAGATGCATAACGCGGCGCGC(SEQID126)保護(hù)片段長度＝75GGTGATAATCTGGGTTGCACAGGAAGTTTCCGGGGTTGGAGGGCAGTGCTGCTTGTAGTGGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID127)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAA(SEQID128)弱化因子長度＝25CACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAA(SEQ ID129)靶#9；GST-PI1 X06547錨長度＝25GTTAGCATACGTGTCACCACACCGG(SEQ ID130)靶長度＝60CAGGGAGGCAAGACCTTCATTGTGGGAGACCAGATCTCCTTCGCTGACTACAACCTGCGT(SEQID131)接頭長度＝60CTCCTTCGCTGACTACAACCTGCTGGATACTGAGTCCGGTGTGGTGACACGTATGCTAAC(SEQID132)保護(hù)片段長度＝75CAGCAGGTTGTAGTCAGCGAAGGAGATCTGGTCTCCCACAATGAAGGTCTTGCCTCCCTGGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID133)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCAGGGAGGCAAGACCTTCATTGTGG(SEQID134)弱化因子長度＝25CAGGGAGGCAAGACCTTCATTGTGG(SEQ ID135)靶#10 HMG-17(與實施例27的靶#10相同)靶#11；親環(huán)蛋白 X52851
錨長度＝25ATCCAGTTAACCACATGCTAGTACC(SEQ ID136)靶長度＝60GGGTTTATGTGTCAGGGTGGTGACTTCACACGCCATAATGGCACTGGTGGCAAGTCCATC(SEQID137)接頭長度＝60TAATGGCACTGGTGGCAAGTCCATCGATACTGAGTGGTACTAGCATGTGGTTAACTGGAT(SEQID138)保護(hù)片段長度＝75GATGGACTTGCCACCAGTGCCATTATGGCGTGTGAAGTCACCACCCTGACACATAAACCCGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID139)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGGGTTTATGTGTCAGGGTGGTGACT(SEQID140)弱化因子長度＝25GGGTTTATGTGTCAGGGTGGTGACT(SEQ ID141)靶#12 血小板球蛋白-b(與實施例27的靶#12相同)靶#13；LDH X02152錨長度＝25TCTCGGTCTGGAACGCCCGGCAACT(SEQ ID142)靶長度＝60GGTGGTTGAGAGTGCTTATGAGGTGATCAAACTCAAAGGCTACACATCCTGGGCTATTGG(SEQID143)接頭長度＝60AAGGCTACACATCCTGGGCTATTGGGATACTGAGTAGTTGCCGGGCCTTCCAGACCGAGA(SEQID144)保護(hù)片段長度＝75CCAATAGCCCAGGATGTGTAGCCTTTGAGTTTGATCACCTCATAAGCACTCTCAACCACCGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID145)
檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGGTGGTTGAGAGTGCTTATGAGGTG(SEQID146)弱化因子長度＝25GGTGGTTGAGAGTGCTTATGAGGTG(SEQ ID147)靶#14；TIMP-1 X03124錨長度＝25CATTACGAGTGCATTCGCATCAAGG(SEQ ID148)靶長度＝60CACCAAGACCTACACTGTTGGCTGTGAGGAATGCACAGTGTTTCCCTGTTTATCCATCCC(SEQID149)接頭長度＝60CAGTGTTTCCCTGTTTATCCATCCCGATACTGAGTCCTTGATGCGAATGCACTCGTAATG(SEQID150)保護(hù)片段長度＝75GGGATGGATAAACAGGGAAACACTGTGCATTCCTCACAGCCAACAGTGTAGGTCTTGGTGGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID151)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCACCAAGACCTACACTGTTGGCTGT(SEQID152)弱化因子長度＝25CACCAAGACCTACACTGTTGGCTGT(SEQ ID153)靶#15；MMP-9 J05070錨長度＝25ATCATGTAAGTCTTCGGTCGGTGGC(SEQ ID154)靶長度＝60GCAACGTGAACATCTTCGACGCCATCGCGGAGATTGGGAACCAGCTGTATTTGTTCAAGG(SEQID155)接頭長度＝60
GGGAACCAGCTGTATTTGTTCAAGGGATACTGAGTGCCACCGACCGAAGACTTACATGAT(SEQID156)保護(hù)片段長度＝75CCTTGAACAAATACAGCTGGTTCCCAATCTCGCGATGGCGTCGAAGATGTTCACGTTGCGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID157)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGCAACGTGAACATCTTCGACGCCAT(SEQID158)弱化因子長度＝25GCAACGTGAACATCTTCGACGCCAT(SEQ ID159)靶#16；肌動蛋白 X10277錨長度＝25CTGAGTCCTCCGGTGCCTACGTGGC(SEQ ID160)靶長度＝60GAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATCATGAAGTGTGACGTGGACATC(SEQID161)接頭長度＝60CATCATGAAGTGTGACGTGGACATCGATACTGAGTGCCACGTAGGCACCGGAGGACTCAG(SEQID162)保護(hù)片段長度＝75GATGTCCACGTCACACTTCATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGATGCCACAGGACTCGCTTGTCTAAGTCTG(SEQ ID163)檢測接頭長度＝60TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTA(SEQID164)弱化因子長度＝25GAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTA(SEQ ID165)圖33顯示該試驗的再現(xiàn)性很高，當(dāng)分析3萬個細(xì)胞時，CV的范圍約3-13％。
圖34顯示該試驗的靈敏度很高。當(dāng)測試的樣品所含細(xì)胞少至1000個時仍可測到GAPDH的靶mRNA。
圖35基本上采用實施例25的方案和實施例27的陣列和靶分子進(jìn)行，顯示即使樣品所含細(xì)胞不到1000個也能測出許多靶mRNA，當(dāng)RNA得自不到1萬個細(xì)胞時可測到低濃度表達(dá)的所有靶分子。
實施例31任選的寡核苷酸試劑(見圖36)圖36顯示可用于本發(fā)明方法的幾種寡核苷酸試劑。此圖說明試驗方案是使寡核苷酸錨通過其5’或3’(反向)端結(jié)合于一表面。此寡核苷酸錨有兩個識別部分，彼此毗鄰(縮短)或被核酸臂隔開，每部分有5個核苷酸。
實施例32核酸酶保護(hù)片段擴(kuò)增方法(見圖37-39和42)圖37說明用PCR擴(kuò)增核酸酶保護(hù)片段。
圖38說明用連接酶擴(kuò)增核酸酶保護(hù)片段。通過選擇a’作為α堿基序列，位于連接的a’之外的25個堿基結(jié)合于此陣列，可選擇雜交條件只讓a’分子的連接的25個堿基序列結(jié)合。利用a’和a接頭結(jié)合區(qū)各部分中修飾的核苷酸可促進(jìn)辨別，如果熱解離循環(huán)破壞了連接酶，可在每次循環(huán)時再加入。
圖39說明通過核酸酶保護(hù)使核酸酶保護(hù)片段得到擴(kuò)增，與該(核酸酶保護(hù)片段6)互補(bǔ)的(DNAa)鏈可含有修飾的堿基。其可在(DNAa)的溫度下雜交，或在(DNAa)加入前可破壞(DNAa)。同樣，(DNAa)的(接頭a)可含有修飾的核苷酸。允許在低于(核酸酶保護(hù)片段6)的溫度下雜交，即使(接頭a)/(DNAa)雜交體是25個堿基。(DNAa)/(核酸酶保護(hù)片段6)是50個堿基的雜交體，尤其當(dāng)從經(jīng)驗上考慮到溶液中的DNA鏈?zhǔn)窍〉?，可通過高度濃縮，基本上無限制性高度濃縮(接頭A)。流通裝置可用含有捕俘陣列的板來替換。線性陣列可用2-D或3-D陣列替換。
圖42說明用聚合酶擴(kuò)增核酸酶保護(hù)片段。核酸酶保護(hù)反應(yīng)完成后核酸酶保護(hù)片段從RNA上解離下來，加入含有RNA聚合酶(如T7聚合酶)雙鏈啟動子的一引物(a’)和核酸酶保護(hù)片段模板延伸(如逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)延伸以復(fù)制RNA或DNA或復(fù)制DNA的Tag聚合酶)將利用其作為模板形成雙鏈DNA復(fù)合物，帶有靠近該核酸酶保護(hù)片段序列未端的雙鏈啟動子區(qū)域。加入連接酶將使該啟動子的第二鏈連接于核酸酶保護(hù)片段鏈，除非第一堿基是錯配的SNP。因此在核酸酶保護(hù)反應(yīng)期間，S1剪去了未受保護(hù)的堿基。由于此堿基被跳過，連接酶不會將啟動子與核酸酶保護(hù)片段連接。用連接酶時，b鏈被轉(zhuǎn)變?yōu)檠由斓腷”鏈，摻入聚合酶啟動子中，可用聚合酶擴(kuò)增并在加入RT引物b’后繼續(xù)擴(kuò)增。用啟動子/核酸酶保護(hù)片段延伸端結(jié)合此陣列或檢測接頭或檢測探針。為檢測SNP，安排此雜交使SNP位點大約處在用于與該陣列(檢測接頭或檢測探針等)雜交的序列的中部。延伸核酸酶保護(hù)探針的陣列(檢測接頭或檢測探針)，雜交區(qū)不必包括此未端的所有堿基(該延伸的核酸酶保護(hù)探針未端的某些堿基可能突出在接頭中無互補(bǔ)性雜交序列)。變化中沒有描述采用聚合酶(如T7)之前不需要連接，因此通過選擇能將SNP定位在與a’雜交序列中部序列，進(jìn)行SNP檢測。采用本文所述的SNP檢測方案。不需要延伸a’鏈，但RNA聚合酶可能利用與單鏈核酸酶保護(hù)片段(刪去所示的RT延伸或改變所述的Tag聚合酶延伸步驟)雜交的啟動子來產(chǎn)生RNA。
從以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可能不難確定本發(fā)明的基本特征。在不背離本發(fā)明的思路和范圍下，可對本發(fā)明作修改以將其用于不同情況。
不必進(jìn)一步詳盡闡述，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員通過以上描述，能以最充分程序應(yīng)用本發(fā)明。因此以上優(yōu)選的具體實施例應(yīng)解釋為只是說明性的，并不以任何方式限制本發(fā)明的其余內(nèi)容。
以上所引用和圖中引用的所有專利申請、專利和出版物的全部公開內(nèi)容都納入本文參考文獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種檢測至少一種靶核酸分子的方法，其特征在于，所述方法包括a)使可能含有所述靶分子的樣品與對所述靶分子特異并結(jié)合所述靶分子的核酸酶保護(hù)片段接觸，然后使該樣品暴露于核酸酶的作用下以有效消化殘存的單鏈核酸，然后使所得樣品接觸包括多個小管的組合，這些小管在其內(nèi)部含有以線性陣列排布的至少兩種不同的錨位點，所述小管至少有兩個基本上相同，各位點的錨與雙功能接頭結(jié)合，此雙功能接頭包含對錨特異的第一部分，和含有對所述核酸酶保護(hù)片段之一特異的探針的第二部分，在所述核酸酶保護(hù)片段能有效結(jié)合所述組合的條件下進(jìn)行此試驗，和b)檢測所述結(jié)合的保護(hù)片段。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述小管是毛細(xì)管，所述錨結(jié)合于所述毛細(xì)管表面。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述小管是毛細(xì)管，所述錨結(jié)合于所述毛細(xì)管中的一種物質(zhì)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述物質(zhì)是瓊脂糖或聚丙稀酰胺。
5.一種檢測至少一種靶核酸分子的方法，其特征在于，所述方法包括a)使可能含有所述靶分子的樣品與對所述靶分子特異并結(jié)合所述靶分子的核酸酶保護(hù)片段接觸，然后使該樣品暴露于核酸酶的作用下以有效消化殘存的單鏈核酸，然后使所得樣品接觸一組合，[在加入所述樣品前]該組合含有i)含多個空間上相分離區(qū)域的表面，其中至少二個區(qū)域基本相同，各區(qū)域含有ii)至少二個不同的錨位點，各位點上的錨各與iii)一雙功能接頭結(jié)合，此雙功能接頭包含對錨特異的第一部分，和含有對所述核酸酶保護(hù)片段之一特異的探針的第二部分，在所述核酸酶保護(hù)片段能有效結(jié)合所述組合的條件下進(jìn)行此試驗，其中位于區(qū)域第一位點的兩個或多個錨與具有不同靶特異性的不同的雙功能接頭結(jié)合，和b)檢測所述結(jié)合的保護(hù)片段。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述第一位點上的至少二個不同的雙功能接頭對核酸酶保護(hù)片段特異，所述核酸酶保護(hù)片段對感興趣的相同第一核酸的不同部分特異。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括使結(jié)合的保護(hù)片段與特異性檢測接頭和/或檢測探針雜交，從而產(chǎn)生對應(yīng)于各所述核酸的信號。
8.一種檢測樣品中含有SNP的核酸的方法，其特征在于，所述方法包括a)在SNP特異性保護(hù)片段能與待檢核酸有效雜交的條件下培育樣品和所述保護(hù)片段，b)用一種或多種核酸酶處理所述樣品，所述核酸酶可有效地基本上消化所有多核苷酸但不消化已與感興趣的核酸雜交的保護(hù)片段和所述核酸已雜交的部分，并切除錯配位點上的核酸雙鏈體，c)基本上除去所有的多核苷酸而不除去所述雜交的保護(hù)片段的至少一部分和，任選地已雜交的核酸，從而提供含有SNP特異性保護(hù)片段或其部分作為靶分子的樣品，d)使含有所述靶分子的樣品與一組合接觸，在加入所述樣品前此組合含有i)含多個空間上相分離區(qū)域的表面，其中至少二個區(qū)域基本相同，各區(qū)域含有ii)至少二個不同的寡核苷酸錨，各與iii)一雙功能接頭結(jié)合，此雙功能接頭包含對該寡核苷酸錨特異的第一部分，和含有對所述靶分子特異的探針的第二部分，在所述靶分子能有效結(jié)合所述組合的條件下進(jìn)行此試驗。
9.一種檢測至少兩種靶核酸分子的方法，其中第一靶分子是一種感興趣的mRNA，第二靶分子是預(yù)計以基本恒定的量存在于樣品中的一種核酸，其特征在于，所述方法包括a)使可能含有所述靶分子的樣品與對所述靶分子特異并結(jié)合所述靶分子的核酸酶保護(hù)片段接觸，然后使該樣品暴露于核酸酶的作用下以有效消化殘存的單鏈核酸，然后使含有所述核酸酶保護(hù)片段的樣品接觸一組合，此組合含有i)含多個空間上相分離區(qū)域的表面，其中至少二個區(qū)域基本相同，各區(qū)域含有ii)至少二個不同的錨位點，各位點上的錨各與iii)一雙功能接頭結(jié)合，此雙功能接頭具有對該錨特異的第一部分，和含有對所述核酸酶保護(hù)片段之一特異的探針的第二部分，在所述核酸酶保護(hù)片段能有效結(jié)合所述組合的條件下進(jìn)行此試驗，其中所述mRNA的特異性第一核酸酶保護(hù)片段和樣品中預(yù)計以基本上恒定量存在的所述核酸的第二核酸酶保護(hù)片段結(jié)合于所述組合同一區(qū)域中不同位點，和b)檢測所述結(jié)合的核酸酶保護(hù)片段。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，一種或多種所述接頭含有對不同靶分子特異的多個探針。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，一種或多種所述接頭含有對不同靶分子特異的多個探針。
12.一種檢測至少一種靶核酸分子的方法，其特征在于，所述方法包括a)使可能含有所述靶分子的樣品與對所述靶分子特異并結(jié)合所述靶分子的核酸酶保護(hù)片段接觸，然后使該樣品暴露于核酸酶的作用下以有效消化殘存的單鏈核酸，然后使所得樣品接觸一組合，此組合含有i)多個相分離的區(qū)域，其中至少二個區(qū)域基本上相同，各區(qū)域含有ii)至少二個不同的錨位點，各位點上的錨各與iii)一雙功能接頭結(jié)合，此雙功能接頭含有對該錨的特異的第一部分，和含有對所述核酸酶保護(hù)片段之一特異的探針的第二部分，在所述核酸酶保護(hù)片段能有效結(jié)合所述組合的條件下進(jìn)行此試驗，其中所述區(qū)域是小管，所述錨位點在2在所述管中以線性陣列排布，和b)檢測所述結(jié)合的保護(hù)片段。
13.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述物質(zhì)是線性通道的空間填充基質(zhì)。
14.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述樣品是通過在含10-30％甲酰胺和75-110pM一種或多種核酸酶保護(hù)片段的水溶液中培育感興趣的細(xì)胞制備的。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述水溶液還含有0.5-2×SSC和1-2μgtRNA，并在90-115℃進(jìn)行培育。
16.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，至少一個所述區(qū)域的至少一個位點含有多個不同的錨，每個錨對不同的雙功能接頭特異。
17.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，該組合的各區(qū)域含有ii)至少二個不同的寡核苷酸錨，各與iii)一雙功能接頭結(jié)合，此雙功能接頭具有對該寡核苷酸錨特異的第一部分，和對第二雙功能接頭特異的第二部分，和iv)一個第二雙功能接頭，此接頭具有對第一雙功能接頭特異的第一部分，和含有對所述靶分子特異的探針的第二部分。
18.一種檢測至少一種靶核酸分子的方法，其特征在于，所述方法包括使可能含有所述靶分子的樣品與對所述靶分子特異并結(jié)合所述靶分子的核酸酶保護(hù)片段接觸，使該樣品暴露于核酸酶的作用下以有效消化殘存的單鏈核酸，并使所得樣品接觸一組合，此組合在加入所述樣品前含有i)多個相分離的區(qū)域，其中至少二個區(qū)域基本上相同，各區(qū)域含有ii)至少二個不同的寡核苷酸錨位點，各錨與iii)一雙功能接頭結(jié)合，此雙功能接頭具有對該寡核苷酸錨特異的第一部分，和含有對所述核酸酶保護(hù)片段特異的探針的第二部分，在所述核酸酶保護(hù)片段能有效結(jié)合所述組合的條件下進(jìn)行此試驗，其中至少一個所述區(qū)域的至少一個位點是一“混合位點”，含有約2-4種不同的錨，每個錨對不同的雙功能接頭具有特異性，其中位于所述混合位點的兩個或多個所述不同的錨各與約2-4種具有不同靶特異性的不同的雙功能接頭結(jié)合，使所述結(jié)合的保護(hù)片段與特異性檢測接頭雜交，這些接頭中至少一個是“封閉”檢測接頭，并且其中至少一個所述檢測接頭對與所述約2-4種不同的雙功能接頭的第一個結(jié)合的第一保護(hù)片段有特異性，用含有能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號的酶的特異性報道試劑檢測所述檢測接頭，調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的PH中止所述信號，使所述結(jié)合的保護(hù)片段與特異性檢測接頭雜交，這些接頭中至少一個是“封閉”檢測接頭，并且其中至少一個所述檢測接頭對與所述約2-4種不同的雙功能接頭的第二個結(jié)合的第二保護(hù)片段有特異性，以及用含有能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號的酶的特異性報道試劑檢測所述檢測接頭。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于同時進(jìn)行多重高通量生物學(xué)和化學(xué)試驗的，采用重復(fù)性探針陣列的組分，裝置和方法。本發(fā)明的組合包括一表面，此表面含有多個測定區(qū)，其中至少兩個，在一優(yōu)選例中至少20個測定區(qū)是基本相同的，各測定區(qū)包括一通用的錨陣列，陣列中的錨與雙功能接頭分子結(jié)合，每個接頭包括對至少一種錨特異的部分，和對感興趣的靶分子特異的探針部分，所產(chǎn)生的探針陣列可用于分析能與探針特異性反應(yīng)的一種或多種靶分子的存在或活性。優(yōu)選實施例中，使待測樣品先經(jīng)歷核酸酶保護(hù)步驟，然后再與本發(fā)明的組合接觸。
文檔編號C40B70/00GK1620513SQ02816770
公開日2005年5月25日 申請日期2002年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月26日
發(fā)明者R·M·克里斯, S·費爾德 申請人:高產(chǎn)基因組股份有限公司