專利名稱：使用酵母表面展示載體篩選具有改良的酶活性的脂肪酶的方法和該脂肪酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用酵母表面展示載體篩選具有改良的酶活性的脂肪酶的方法和通過(guò)該方法制備的該突變脂肪酶，更具體地涉及包含1)將脂肪酶基因克隆到表面展示載體中，2)通過(guò)誘變PCR制備步驟1的脂肪酶的突變基因文庫(kù)，3)將步驟2的突變脂肪酶基因文庫(kù)和表面展示載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，和4)測(cè)量在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表面展示的突變脂肪酶的活性并選擇具有進(jìn)化的活性的突變脂肪酶的方法，和通過(guò)該方法制備的突變脂肪酶。
背景技術(shù)：
脂肪酶是羧酸酯水解酶并且廣泛用于食品和表面活性劑工業(yè)以及各種手性化合物的合成。在許多來(lái)源于微生物的脂肪酶中，來(lái)自南極洲假絲酵母(Candida antarctica)的脂肪酶B(此后稱為“CALB”)由317個(gè)氨基酸組成并且形成α/β水解酶的形式。
CALB由于能夠特異地光學(xué)轉(zhuǎn)化仲醇和仲胺(Rotticci等，Chembiochem.，2001，2，766)而在光學(xué)異構(gòu)體的選擇中和聚酯的合成中非常重要(Anderson等，Biocatal.Biotransform.，1998，16，181)，并且可以用于醫(yī)學(xué)供應(yīng)品和農(nóng)業(yè)化學(xué)品的各種生產(chǎn)中。
最近，關(guān)于在單細(xì)胞生物如酵母、細(xì)菌(包括噬菌體)等的細(xì)胞表面表達(dá)外源蛋白的研究已經(jīng)在活躍地進(jìn)行并且用于產(chǎn)生新疫苗、篩選抗原和抗體、將有用的酶固定到細(xì)胞表面上，等等。例如，已經(jīng)使用一種酵母(釀酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)進(jìn)行了細(xì)胞表面上蛋白質(zhì)表達(dá)的研究。通過(guò)利用高等真核細(xì)胞的胞內(nèi)分泌系統(tǒng)，該酵母誘導(dǎo)了在培養(yǎng)基中分泌有用的外源蛋白而不損失其活性，這使得該酵母是作為通過(guò)遺傳重組技術(shù)生產(chǎn)重要外源蛋白的宿主細(xì)胞的有用候選者。一種眾所周知的細(xì)胞壁蛋白--α-凝集素已經(jīng)成為酵母的表面表達(dá)的主要靶標(biāo)(Schreuder等，Yeast.，1993，9，399)。由于α-凝集素或其他細(xì)胞壁蛋白，各種酶如α-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶等可以在細(xì)胞表面上穩(wěn)定地表達(dá)。
此外，根據(jù)最近報(bào)導(dǎo)，通過(guò)在細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)各種酶使得工業(yè)有效的生物催化劑的開(kāi)發(fā)得以實(shí)現(xiàn)(Murai等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1999，51，65)。到今天為止，通過(guò)破碎細(xì)胞、分離所表達(dá)的酶，并將酶固定在載體上或者用滲透溶劑如甲苯處理，已經(jīng)制備了用于生產(chǎn)食品或醫(yī)學(xué)供給品的用于生物轉(zhuǎn)化的微生物來(lái)源的生物催化劑。但是這些方法因?yàn)楦叱杀竞兔傅氖Щ疃哂械蜕a(chǎn)率的問(wèn)題。
最近，已經(jīng)進(jìn)行了使用釀酒酵母的篩選方法的研究，該釀酒酵母適于在細(xì)胞表面表達(dá)靶蛋白。作為一種真核細(xì)胞，酵母具有類似于高等動(dòng)物的蛋白質(zhì)合成過(guò)程，并且具有通過(guò)FACS(熒光激活細(xì)胞分選儀)的細(xì)胞選擇的足夠大小，F(xiàn)ACS可以辨別具有微小差異的細(xì)胞(VanAntwerp和Wittrup.，Biotechnol.Prog.，2000，16，31)。使用酵母表達(dá)系統(tǒng)，可以簡(jiǎn)化基因和文庫(kù)構(gòu)建的操作。而且，可以克服表達(dá)水平的差異。還可能通過(guò)用表面展示系統(tǒng)篩選，選擇最適合表面表達(dá)的酶。用該方法選擇的酶可以極大地增加表面表達(dá)的酶的用途。已經(jīng)多次報(bào)導(dǎo)用FACS篩選展示具有增強(qiáng)的親和力的抗體、抗原或T-細(xì)胞受體的酵母菌株(Schreuder等，Vaccine.，1996，14，383，Kieke等，Protein.Eng.，1997，10，1303，Kieke等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1999，96，5651)，然而還沒(méi)有報(bào)導(dǎo)展示具有提高活性的酶的株系的篩選。到目前為止只報(bào)導(dǎo)了使用來(lái)自假單胞菌變種(Pseudomonas sp)的冰晶核蛋白通過(guò)表面展示系統(tǒng)篩選具有提高的活性的羧甲基纖維素酶的情況(Kim等，Appl. Environ.Microbiol.，2000，66，788)。
本發(fā)明人從工業(yè)酵母多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)分離了新的細(xì)胞壁粘附-介導(dǎo)蛋白并使用其開(kāi)發(fā)了在細(xì)胞表面表達(dá)靶蛋白的新的表面展示系統(tǒng)(PCT/KR00/00819)。多形漢遜酵母是具有強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的工業(yè)有效菌株，其在高溫和有機(jī)溶劑中都具有穩(wěn)定性，生長(zhǎng)快并且可以極好地產(chǎn)生外源重組蛋白。因此，該菌株非常適于生物反應(yīng)系統(tǒng)和諸如脂肪酶的酶的生產(chǎn)。
為了大量產(chǎn)生脂肪酶——一種有用的生物催化劑，本發(fā)明人已經(jīng)使用在細(xì)胞表面表達(dá)靶蛋白的表面表達(dá)系統(tǒng)(PCT/KR00/00819)構(gòu)建了南極洲假絲酵母脂肪酶B突變文庫(kù)，并且已經(jīng)從該文庫(kù)選擇了具有極好脂肪酶活性的突變菌株，并通過(guò)開(kāi)發(fā)從該酵母菌株大量生產(chǎn)突變脂肪酶蛋白的新方法，最終完成了該發(fā)明。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明提供了篩選具有改良的酶活性的突變脂肪酶的方法，該方法包含以下步驟1)將脂肪酶基因克隆到表面展示載體中，2)通過(guò)誘變PCR，使用步驟1的表達(dá)載體中的脂肪酶基因作為模板，制備突變脂肪酶基因文庫(kù)，3)將步驟2的突變脂肪酶基因文庫(kù)和表面展示載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，和4)測(cè)量所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表面中展示的突變脂肪酶的活性并從突變庫(kù)(pool)中選擇具有改良的活性的脂肪酶。
本發(fā)明還提供了通過(guò)本發(fā)明的篩選方法制備的突變脂肪酶蛋白，其中，SEQ.ID.No 14表示的南極洲假絲酵母脂肪酶B的#219亮氨酸和/或#278亮氨酸被其他氨基酸代替。
本發(fā)明還提供了編碼突變的脂肪酶蛋白的基因。
本發(fā)明還提供了含有以上基因的表達(dá)載體。
本發(fā)明還提供了其中導(dǎo)入了上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明還提供了通過(guò)培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)突變脂肪酶蛋白的方法。
本發(fā)明的其他特征將在下文出現(xiàn)。
本發(fā)明涉及篩選具有改良的酶活性的突變脂肪酶的方法，該方法包括下列步驟1)將脂肪酶基因克隆到表面展示載體中；2)通過(guò)誘變PCR，使用步驟1的表面展示載體中的脂肪酶基因作為模板，制備突變脂肪酶基因文庫(kù)；3)將步驟2的突變脂肪酶基因文庫(kù)和表面展示載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中；和4)測(cè)量所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表面中展示的突變脂肪酶的活性并從突變庫(kù)中選擇具有改良的活性的脂肪酶。
本發(fā)明中“表面展示載體”指在細(xì)胞表面上穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的載體。
在本發(fā)明中，SEQ.ID.No 14所表示的并且來(lái)自南極洲假絲酵母的南極洲假絲酵母脂肪酶B優(yōu)選被用于克隆到表面展示載體中。
用于本發(fā)明篩選的表面展示載體是在轉(zhuǎn)化體的表面表達(dá)外源蛋白質(zhì)的載體并且其特征在于包括啟動(dòng)子基因、編碼分泌信號(hào)序列的基因、脂肪酶基因或突變的脂肪酶基因、表面展示介導(dǎo)基因和終止子基因。
優(yōu)選從GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1、GAL10、SED1、MOX、TEF和TPI中選擇啟動(dòng)子基因，從Mfα、PHO6、SUC2、AMY、SED和殺傷毒素(killer toxin)中選擇編碼分泌信號(hào)序列的基因，從SED1、PIR2、TIP1、CWP1、GAS1和WSC1中選擇表面展示介導(dǎo)基因——可以在細(xì)胞表面表達(dá)脂肪酶的一種因子，但是并不總是限于此。
作為用于本發(fā)明中篩選方法的步驟3中的轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，可以選擇酵母如假絲酵母屬(candida)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、Yarrowia和酵母(Saccharomyces)屬、絲狀真菌如曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)和根霉屬(Rhizopus)或者細(xì)菌如埃希氏菌屬(Escherichia)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，但是其不僅僅限于這些。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明人使用了導(dǎo)入轉(zhuǎn)化體(保藏號(hào)KCTC 0824BP、KCTC 0825BP、KCTC 0826BP、KCTC 0827BP和KCTC0828BP)的表面展示載體，這些轉(zhuǎn)化體保藏在Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology的基因儲(chǔ)藏庫(kù)中(韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?000-42939)。
根據(jù)本發(fā)明的篩選方法，實(shí)施PCR以在脂肪酶基因被克隆到表面展示載體中后誘導(dǎo)該基因的突變。用突變基因轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。然后，該突變基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)果，突變脂肪酶位于轉(zhuǎn)化體的表面。從而，通過(guò)測(cè)量在轉(zhuǎn)化體表面表達(dá)的突變脂肪酶的活性，可以容易并快速篩選具有高活性的突變脂肪酶。
本發(fā)明還提供了通過(guò)本發(fā)明的篩選方法制備的突變脂肪酶蛋白，其中，SEQ.ID.No 14表示的南極洲假絲酵母脂肪酶B的#219亮氨酸和/或#278亮氨酸被其他氨基酸代替。
本發(fā)明提供了突變蛋白，其中，SEQ.ID.No 14表示的南極洲假絲酵母脂肪酶B(此后稱為“CALB”)的#219亮氨酸和/或#278亮氨酸被其他氨基酸代替。
本發(fā)明的突變蛋白的疏水氨基酸是SEQ.ID.No 14所表示的CALB的#219氨基酸，該氨基酸優(yōu)選被選自谷氨酰胺、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的親水氨基酸代替，并且更優(yōu)選被谷氨酰胺置換，導(dǎo)致該突變蛋白由SEQ.ID.No 11表示。
此外，SEQ.ID.No 14表示的CALB的#278氨基酸亮氨酸優(yōu)選被選自脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的氨基酸代替，更優(yōu)選被脯氨酸置換，使得其由SEQ.ID.No 9表示。
此外，SEQ.ID.No 14表示的CALB的#219氨基酸亮氨酸優(yōu)選被選自谷氨酰胺、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的親水氨基酸代替，并且同時(shí)，#278氨基酸賴氨酸優(yōu)選被選自脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的氨基酸代替。#219氨基酸和#278氨基酸更優(yōu)選分別被谷氨酰胺或脯氨酸代替，在同一蛋白中，使得其由SEQ.ID.No 10表示。
CALB的#219氨基酸是暴露在表面上的疏水氨基酸。當(dāng)上面的亮氨酸被親水氨基酸代替時(shí)，在水中的穩(wěn)定性增加了，導(dǎo)致突變蛋白的酶活性增加。CALB的#278氨基酸位于CALB的第10個(gè)α-螺旋，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)該螺旋作為脂肪酶活性位點(diǎn)的蓋子(Uppenberg等，Structure.，1994，2，293)。許多疏水氨基酸被包括在第10個(gè)α-螺旋區(qū)內(nèi)。用脯氨酸置換其中的亮氨酸導(dǎo)致螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性增加，產(chǎn)生彎曲結(jié)構(gòu)(改變方向)并通過(guò)改變活性位點(diǎn)的暴露水平增加活性。#278氨基酸亮氨酸位于#223氨基酸天冬氨酸和#188氨基酸谷氨酸附近，賦予活性位點(diǎn)的表面上的電荷。如果#278氨基酸被脯氨酸代替，那么結(jié)構(gòu)改變，其中被疏水性賴氨酸占據(jù)的空間變窄并且活性位點(diǎn)延長(zhǎng)，使得#223和#188帶電氨基酸的更穩(wěn)定的空間并且為水分子得到更大空間。水分子穩(wěn)定了活性位點(diǎn)上的底物并導(dǎo)致活性增加。
使用產(chǎn)生突變脂肪酶蛋白的分泌形式的轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液測(cè)量酶活性。結(jié)果，對(duì)具有SEQ.ID.No 9，No 10和No 11所表示的氨基酸序列的突變蛋白的底物的親和力彼此類似，但是分別比野生型CALB高5倍、10倍和3倍的酶活性(見(jiàn)表3)。
還用在表面表達(dá)本發(fā)明的突變脂肪酶蛋白的轉(zhuǎn)化體的全細(xì)胞級(jí)分測(cè)量了酶活性。結(jié)果，具有SEQ.ID.No 9和No 10所表示的氨基酸序列的突變蛋白顯示出比野生型CALB高5倍的活性(見(jiàn)表1)。
從而，證實(shí)本發(fā)明的突變脂肪酶蛋白具有比野生型脂肪酶蛋白更高的酶活性。
本發(fā)明還提供了編碼突變脂肪酶蛋白的基因。
本發(fā)明的基因優(yōu)選編碼其中選自谷氨酰胺、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的親水氨基酸代替CALB的#219氨基酸的突變蛋白，該基因更優(yōu)選由SEQ.ID.No 8表示。
還優(yōu)選本發(fā)明的基因編碼突變蛋白，其中CALB的#278氨基酸被選自脯氨酸。酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的氨基酸代替，更優(yōu)選該基因被SEQ.ID.No 6表示。
還優(yōu)選本發(fā)明的基因編碼突變蛋白，其中CALB的#219氨基酸被選自谷氨酰胺、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的親水氨基酸代替，并且#278氨基酸被選自脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的氨基酸代替。更優(yōu)選該基因由SEQ.ID.No 7表示。
本發(fā)明還提供了包括所述基因的表達(dá)載體。
本發(fā)明的表達(dá)載體包括編碼本發(fā)明的突變脂肪酶蛋白的基因，并且其被制備用以在細(xì)胞表面上表達(dá)突變脂肪酶蛋白。
表達(dá)本發(fā)明的突變脂肪酶蛋白的載體的特征是具有啟動(dòng)子基因、編碼分泌信號(hào)序列的基因、突變脂肪酶基因、表面展示介導(dǎo)基因和終止子基因。表面展示載體的啟動(dòng)子基因優(yōu)選選自GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1、GALL10、SED1、MOX、TEF和TPI，并且編碼分泌信號(hào)序列的基因優(yōu)選選自MF-α、PHO5、SUC2、AMY、SED和殺傷毒素。表面展示-介導(dǎo)基因是在細(xì)胞表面表達(dá)脂肪酶的因子，并且優(yōu)選選自由SED1、PIR2、TIP1、CWP1、GAS1、和WSC1組成的細(xì)胞壁構(gòu)成基因組成的組。然而，該選擇并不總是限于此。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明人構(gòu)建了含有SEQ.ID.No 6、No7或No 8表示的堿基序列的表達(dá)載體，這些堿基序列是編碼本發(fā)明的突變蛋白的基因。
本發(fā)明還提供了通過(guò)將所述表面展示載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞制備的轉(zhuǎn)化體。
尤其，通過(guò)將包括突變脂肪酶基因的所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可選自酵母如假絲酵母屬(candida)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、Yarrowia和酵母(Saccharomyces)屬、絲狀真菌如曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)和根霉屬(Rhizopus)或者細(xì)菌如埃希氏菌屬(Escherichia)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，但是該選擇不僅僅限于這些。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，酵母被用作宿主細(xì)胞。具體地，多形漢遜酵母DL1-L、多形漢遜酵母A16或釀酒酵母Y2805被用作宿主細(xì)胞以制備轉(zhuǎn)化體。在本發(fā)明中，通過(guò)用含有各自由SEQ.ID.No 6和No 7表示的脂肪酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母DL-1制備轉(zhuǎn)化體，并且轉(zhuǎn)化體被命名為“多形漢遜酵母/pLGK Lip10”和多形漢遜酵母/pLGK Lip14”，它們于2002年7月31日被保藏在Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology的基因儲(chǔ)藏庫(kù)中(保藏號(hào)KCTC 10320BP和KCTC10321BP)。
本發(fā)明還提供了通過(guò)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生突變脂肪酶蛋白的方法。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體優(yōu)選在比通常宿主細(xì)胞培養(yǎng)溫度低2℃-20℃的溫度下培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
具體地，漢遜酵母優(yōu)選在25℃-35℃培養(yǎng)，酵母菌優(yōu)選在20℃-28℃培養(yǎng)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，據(jù)證實(shí)多形漢遜酵母DL1-L當(dāng)培養(yǎng)在25℃時(shí)可以產(chǎn)生最大量的脂肪酶。多形漢遜酵母A16當(dāng)培養(yǎng)在25℃時(shí)可以產(chǎn)生最大量的脂肪酶，釀酒酵母Y2805當(dāng)培養(yǎng)在20℃時(shí)也是如此(見(jiàn)圖6)。
此外，通過(guò)補(bǔ)料分批培養(yǎng)大量培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體后，據(jù)證實(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)液中的脂肪酶活性極佳(見(jiàn)圖7a)并且還產(chǎn)生800mg/l的CALB蛋白(見(jiàn)圖7b)。
附圖簡(jiǎn)述參考附圖可以最好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的應(yīng)用，其中
圖1是顯示CALB分泌型載體(pGK-Lip*)和CALB表面展示載體(pGK-Lip-CwpF)的示意圖。
pGPDGAPDH啟動(dòng)子，KT殺傷毒素分泌信號(hào)序列，tUK未知的終止子，cHARS36的末端區(qū)，BDHARS36的彎曲DNA結(jié)構(gòu)域，ARSHARS36的自復(fù)制序列，RepHARS36的端粒重復(fù)序列。
圖2是顯示CALB突變體Lip10和Lip14的氨基酸序列與野生型(Lip wt)序列的比較的序列圖。
圖3是顯示CALB突變體的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)與野生型的比較的一組示意圖。
A野生型脂肪酶的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，B突變型脂肪酶的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)。
圖4是顯示突變CALB活性的照片，其在平板培養(yǎng)基上證實(shí)。
泳道1Wt；野生型多形漢遜酵母DL1株系，泳道2Lip-CwpF；含有在表面上展示脂肪酶的載體的株系(pLGK-Lip-CwpF)，泳道3和泳道4Lip10-CwpF和Lip14-CwpF；含有Lip10和Lip14的表面展示載體的株系，泳道5Lip*；含有脂肪酶的分泌型載體的一種株系(pLGK-Lip*)，泳道6和泳道7Lip10和Lip14；含有突變脂肪酶Lip10和Lip14的分泌型載體的株系(pLGK-Lip*)。
圖5是顯示CALB-展示突變株系的培養(yǎng)上清液的SDS-PAGE結(jié)果。
泳道1Lipwt*株系，泳道2Lip10*株系，泳道3Lip14*株系，泳道4和泳道5LP突變株系，泳道6和泳道7LQ突變株系，泳道8和泳道9LPQ突變株系。
圖6a是顯示CALB的脂肪酶活性的圖，該活性根據(jù)多形漢遜酵母DL1株系的培養(yǎng)溫度而變。
圖6b是顯示CALB的脂肪酶活性的圖，該活性根據(jù)多形漢遜酵母A16株系的培養(yǎng)溫度而變。
圖7a是顯示培養(yǎng)釀酒酵母轉(zhuǎn)化體后，用細(xì)胞培養(yǎng)液在OD600測(cè)量的顯示細(xì)胞生長(zhǎng)(◇)，和通過(guò)測(cè)量培養(yǎng)液中脂肪酶活性計(jì)算的CALB(□)生產(chǎn)率的一組圖。
圖7b是顯示釀酒酵母轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)液中產(chǎn)生的CALB蛋白質(zhì)的量的照片，該CALB蛋白質(zhì)的量通過(guò)SDS-PAGE分析。
實(shí)施例下面的實(shí)施例中展示的本發(fā)明的實(shí)際的和當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方案是舉例說(shuō)明的。
然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，考慮到本公開(kāi)內(nèi)容，可以在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)作出修改和改進(jìn)。
實(shí)施例1CALB表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化體的制備本發(fā)明人構(gòu)建了在多形漢遜酵母的表面表達(dá)CALB或者將該蛋白分泌到細(xì)胞外面的載體。
具體地，為了構(gòu)架將CALB分泌到培養(yǎng)基的載體，首先通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)使用SEQ.ID.No 1和No 2表示的引物從南極洲假絲酵母基因組得到CALB基因。使用pfu聚合酶(Stratagene，USA)在94℃3分鐘和15輪94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，并在72℃延伸1分鐘，然后是72℃最后延伸10分鐘，實(shí)施CALB的PCR合成。此后，通過(guò)序列分析鑒定基因。將CALB基因用SapI消化使其平端化并再次用BamHI消化。將該基因插入載體的KpnI和BamHI區(qū)，該載體是一種多形漢遜酵母表達(dá)載體AMIpL1(Agaphonov等.，Yeast，1999，15，541)，其中插入GAPDH啟動(dòng)子(Sohn等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1999，51，800)和殺傷毒素信號(hào)序列(Sor和Fukuhara.，Curr.Genet.，1985，9，147)，通過(guò)該載體制備了本發(fā)明的載體，如圖1中所見(jiàn)，并將其命名為“pGK-Lip*”(圖1)。
為了制備在細(xì)胞表面表達(dá)CALB的載體，通過(guò)PCR使用SEQ.ID.No 1和No 3表示的引物從南極洲假絲酵母基因組得到CALB基因，所得基因用和上面相同的方法消化，然后將其插入AMIpL1載體，導(dǎo)致pGK LipF載體的構(gòu)建。通過(guò)將CwpF(PCT/KR00/00819)-來(lái)自CWP1基因的表面展示介體插入pGK LipF的BamHI和HindIII區(qū)構(gòu)建本發(fā)明的表面展示載體，并將其命名為“pGK-Lip-CwpF”(圖2)。
按照Li/TE方法(Hill等，Nucl.Acids.Res.，1991，19，5971)，用將CALB分泌到細(xì)胞外面的載體(pGK-Lip*)和在細(xì)胞表面表達(dá)CALB的另一載體(pGK-Lip-CwpF)轉(zhuǎn)染多形漢遜酵母DL 1-L株系，然后從基本培養(yǎng)基(0.67％氨基酸缺陷的酵母培養(yǎng)基和2％葡萄糖)選擇轉(zhuǎn)化體。將所得轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到含有1％tributyline的YPD平板培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖)上并通過(guò)測(cè)量菌株周圍環(huán)的大小檢測(cè)轉(zhuǎn)化體的活性。
結(jié)果，通過(guò)轉(zhuǎn)化體周圍活性環(huán)的存在證實(shí)CALB的表達(dá)。
實(shí)施例2通過(guò)體內(nèi)重組構(gòu)建文庫(kù)為了建立CALB突變文庫(kù)，本發(fā)明人使用了體內(nèi)重組，其曾經(jīng)在釀酒酵母中報(bào)導(dǎo)(Abecassis等，Nucleic.Acids.Res.，2000，28，E88)。為了建立CALB文庫(kù)，將該方法針對(duì)多形漢遜酵母進(jìn)行了修改。
體內(nèi)重組方法中，將細(xì)胞用載體片段和在DNA片段的兩端具有與該載體同源性的合成的插入片段一起轉(zhuǎn)染，從而通過(guò)其中的重組產(chǎn)生真正的環(huán)狀載體。體內(nèi)重組是簡(jiǎn)單而有效的方法，不必提前在大腸桿菌中建立文庫(kù)，所以該方面可有效使用特別用于由大腸桿菌致死基因組成的文庫(kù)的建立。
將pGK-Lip-CwpF——在細(xì)胞表面上表達(dá)CALB的一種載體——用EcoRI/PstI消化，導(dǎo)致得到5kb片段。該片段通過(guò)凝膠回收并用作轉(zhuǎn)化的載體片段。使用PCR預(yù)混合試劑盒(Bioneer，韓國(guó))用SEQ.ID.No 4和No5表示的引物(該引物通過(guò)將載體片段和HARS 36區(qū)的的100bp雜交制備)在94℃3分鐘和25輪94℃變性30秒，55℃退火30秒，和72℃延伸1分鐘，然后是72℃最后延伸7分鐘，實(shí)施PCR。此時(shí)，pGK-Lip-CwpF被用作底物。最后，通過(guò)使用Li/TE方法，將100ng所得片段與100ng載體片段一起用于多形漢遜酵母菌株的轉(zhuǎn)化。
隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)化的菌株以測(cè)量含有1％tributyline的YPD平板培養(yǎng)基上脂肪酶的活性，導(dǎo)致證實(shí)所構(gòu)建的文庫(kù)具有一致的活性。
實(shí)施例3CALB突變文庫(kù)的構(gòu)建為了構(gòu)建CALB突變文庫(kù)，本發(fā)明人使用易錯(cuò)PCR和體內(nèi)重組。
具體地，用SEQ.ID.No 4和No 5表示的引物，使用在細(xì)胞表面上表達(dá)CALB的載體pGK-Lip-CwpF作為模板，實(shí)施易錯(cuò)PCR。用PCR隨機(jī)易錯(cuò)試劑盒(Clontec，USA)誘導(dǎo)每1kb 2-5個(gè)錯(cuò)誤。DNA片段在凝膠上以所需要的大小切割后被回收。使用PCR預(yù)混合試劑盒(Bioneer，韓國(guó))用SEQ.ID.No 4和No 5表示的引物，在94℃3分鐘和25輪94℃變性30秒，55℃退火30秒，和72℃延伸1分鐘，然后是72℃最后延伸7分鐘，使用那些片段實(shí)施擴(kuò)增PCR。
使用Li/TE方法，將通過(guò)上面的方法所得100ng片段和通過(guò)用EcoRI/PstI消化pGK-Lip-CwpF所得5kb載體片段混合并轉(zhuǎn)染到多形漢遜酵母菌株中。
結(jié)果，得到約1×104個(gè)轉(zhuǎn)化株。
實(shí)施例4CALB突變選擇本發(fā)明人從上面的實(shí)施例3中構(gòu)建的CALB突變文庫(kù)中選擇具有高脂肪酶活性的CALB突變株。
將突變文庫(kù)的約7,000個(gè)菌株接種在含有1％tributylin的YPD平板培養(yǎng)基上并培養(yǎng)24小時(shí)。然后，初步篩選具有大活性圈的23個(gè)菌株。將初步篩選的菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中并在37℃培養(yǎng)16小時(shí)，然后以5,000rpm離心5分鐘以分離細(xì)胞級(jí)分和培養(yǎng)上清液。將細(xì)胞級(jí)分懸浮在50mM tris緩沖液(pH7.5)中，將其洗滌并再次用相同量的相同緩沖液懸浮。
為了測(cè)量脂肪酶活性，將棕櫚酸對(duì)硝基苯酯(此后稱為“pNPP”)用作底物。通過(guò)將10μl 10mM pNPP、40μl乙醇和950μl 50mM tris緩沖液(pH7.5)混合制備反應(yīng)溶液，向其中加入100μl細(xì)胞懸浮液。在25℃反應(yīng)2小時(shí)后，測(cè)量OD450。使用pNPP測(cè)量脂肪酶活性的該方法用于測(cè)量405nm下pNP基團(tuán)的消光水平。通過(guò)脂肪酶，pNP基團(tuán)從pNPP分離(pNP基團(tuán)和棕櫚酸在其中結(jié)合)。在本發(fā)明中，1單位脂肪酶活性被定義為每1分鐘分離1μM pNP基團(tuán)的酶活性。
結(jié)果，最終選擇菌株Lip14、Lip10和Lip23，它們都在全細(xì)胞級(jí)分中表現(xiàn)出極佳的活性。
實(shí)施例5CALB突變體的分析本發(fā)明分析了上面實(shí)施例4中所得三種突變株系的突變基因。
為了回收CALB突變基因，首先純化該突變菌株的基因組，將其用作模板。使用PCR預(yù)混合試劑盒(Bioneer，韓國(guó))用SEQ.ID.No 4和No 5表示的引物在94℃3分鐘和25輪94℃變性30秒，55℃退火30秒，和72℃延伸1分鐘，然后是72℃最后延伸7分鐘，實(shí)施PCR。從凝膠回收DNA片段并分析DNA序列。
結(jié)果，Lip10和Lip14的DNA序列各自由SEQ.ID.No 6和No 7表示，并且它們的相應(yīng)氨基酸序列分別由SEQ.ID.No 9和No 10表示。已證實(shí)Lip10和Lip14的第278位亮氨酸被脯氨酸代替，并且另外Lip14的第219位亮氨酸被谷氨酰胺置換(圖2)。
278位亮氨酸位于CALB的第10個(gè)α-螺旋并且已經(jīng)報(bào)導(dǎo)該區(qū)域?yàn)橹久富钚晕稽c(diǎn)的蓋結(jié)構(gòu)(Uppenberg等，Structure.，1994，2，293)。許多疏水氨基酸出現(xiàn)在該第10個(gè)α-螺旋并且亮氨酸是其中之一。由于該氨基酸被脯氨酸置換，螺旋結(jié)構(gòu)變得更穩(wěn)定并且甚至可形成彎曲結(jié)構(gòu)(方向的改變)，導(dǎo)致通過(guò)改變活性位點(diǎn)的暴露水平而增加活性。278位亮氨酸位于活性位點(diǎn)表面上帶電的188位谷氨酸和223位天冬氨酸附近。當(dāng)該氨基酸被脯氨酸置換時(shí)，278位亮氨酸的疏水末端的空間變窄但是223位天冬氨酸和188位谷氨酸的空間變大，導(dǎo)致活性位點(diǎn)的改變。此外，擴(kuò)大的空間可以有水分子，水分子可通過(guò)使底物穩(wěn)定停留在活性位點(diǎn)而促進(jìn)活性的增加(圖3)。219位亮氨酸是暴露在表面的疏水氨基酸并且被親水氨基酸谷氨酰胺代替。CALB是在其表面具有多數(shù)為疏水氨基酸的酶。蛋白質(zhì)表面上親水氨基酸的暴露導(dǎo)致形狀的改變和增加水中的穩(wěn)定性。對(duì)于Lip23，CALB基因的末端持有中止密碼子，通過(guò)其產(chǎn)生分泌性脂肪酶，表明脂肪酶活性的增加。
實(shí)施例6CALB突變株系活性的測(cè)量本發(fā)明人使用在上面實(shí)施例4中選擇的CALB突變株系測(cè)量脂肪酶的酶活性。
為了構(gòu)建載體以在細(xì)胞表面表達(dá)基因，分離了突變株和野生型CALB-表達(dá)株的基因組，其用作PCR的模板。使用PCR預(yù)混合試劑盒(Bioneer，韓國(guó))用SEQ.ID.No 4和No 5表示的引物在94℃3分鐘和25輪94℃變性30秒，55℃退火30秒，和72℃延伸1分鐘，然后72℃最后延伸7分鐘，實(shí)施PCR。所得DNA片段用EcoRI/ClaI消化并與GAPDH啟動(dòng)子一起插入單拷貝整合載體‘AMIpLD1’(Agaphonov等，Yeast.，1999，15，541)中以制備在細(xì)胞表面表達(dá)基因的載體。所產(chǎn)生的載體被命名為‘pLGK-Lip10-CwpF’和‘pLGK-Lip14-CwpF’。
為了構(gòu)建將基因產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基的載體，分離了突變株和野生型株系的基因組，它們用作PCR的模板。使用PCR預(yù)混合試劑盒(Bioneer，韓國(guó))用SEQ.ID.No1和No 2表示的引物在94℃3分鐘和25輪94℃變性30秒，55℃退火30秒，和72℃延伸1分鐘，然后72℃最后延伸7分鐘，實(shí)施PCR。將所得DNA片段與GAPDH啟動(dòng)子一起插入AMIpLD1的EcoRI/BamHI位點(diǎn)以構(gòu)建載體pLGK-Lip10*和pLGK-Lip14*。
通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)載體中導(dǎo)入野生型和突變的CABL后，通過(guò)Li/TE方法轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母DL1-L株系，并通過(guò)DNA印跡分析證實(shí)向基因組LEU2位點(diǎn)的單拷貝整合。所得轉(zhuǎn)化體接種在含有1％tributyline的平板培養(yǎng)基上，并在37℃溫育24小時(shí)。通過(guò)觀察所產(chǎn)生的活性環(huán)研究活性的改另一方面，在非ApoE ε4攜帶者中，三個(gè)治療組之間沒(méi)有顯著差異。
發(fā)現(xiàn)在ApoE ε4攜帶者中通過(guò)ADAS-Cog等級(jí)量表標(biāo)準(zhǔn)中提高4分測(cè)定的治療響應(yīng)的差異是顯著的(P＝0.00000175)，如表8中所示。
表8.治療響應(yīng)的比較(通過(guò)ApoE ε4等位基因攜帶者和非攜帶者中不同治療組之間ADAS-Cog中提高4分的標(biāo)準(zhǔn)而測(cè)定的)
在ApoE ε4攜帶者中通過(guò)無(wú)惡化標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的測(cè)定發(fā)現(xiàn)治療響應(yīng)的差異非常顯著(P＝0.00000151)，如表9中所示。
表9.治療響應(yīng)的比較(ApoE ε4攜帶者和非攜帶者的不同治療組之間通過(guò)ADAS-Cog中的無(wú)惡化測(cè)定)
非參數(shù)ANOVA模型產(chǎn)生顯著結(jié)果(P＝0.0357)，表明當(dāng)雷司替明日劑量為6mg/天或更高劑量治療時(shí)，與非ApoE ε4等位基因攜帶者相比，ApoE ε4等位基因攜帶者具有對(duì)雷司替明的更好響應(yīng)。來(lái)自非參數(shù)ANOVA模型的結(jié)果在表10中給出。
通過(guò)用純化蛋白，使用pNPP作為底物測(cè)量Km和Kcat來(lái)比較突變蛋白和野生型蛋白。將10μl蛋白質(zhì)溶液加入通過(guò)補(bǔ)加連續(xù)不同濃度的pNPP制備的脂肪酶反應(yīng)溶液。在405nm測(cè)量分離的pNP基團(tuán)的光密度以確定Vi。
應(yīng)用Michales-Menten方程使用Vi計(jì)算每種蛋白質(zhì)的Km值。結(jié)果，Lip10和Lip14的Km值都沒(méi)有增加。另一方面，每種蛋白的Kcat值增加了6.5倍以上，表明Lip10和Lip14的活性增加了而不改變底物親和力(表2)。還讓蛋白質(zhì)在50℃保溫10分鐘后測(cè)量蛋白質(zhì)的剩余活性以檢驗(yàn)熱穩(wěn)定性。結(jié)果，突變蛋白和野生型蛋白在熱穩(wěn)定性中沒(méi)有大的差異。使用(R，S)-乙?；プ鳛榈孜镞€測(cè)量了立體選擇性。結(jié)果，突變蛋白和野生型蛋白在立體選擇性中沒(méi)有大的差異。
因此，證實(shí)每種突變蛋白的酶活性增加6倍而不破壞該蛋白的穩(wěn)定性和特異性。
<表2>
每種突變株的CALB穩(wěn)定性
實(shí)施例8使用定點(diǎn)誘變分析突變特性本發(fā)明人通過(guò)使用定點(diǎn)誘變研究了突變特性以證實(shí)突變蛋白的特征性變化是否由氨基酸的改變導(dǎo)致。
通過(guò)PCR誘導(dǎo)L278P突變(278位亮氨酸被脯氨酸代替，其存在于Lip10和Lip14中)和L219Q突變(219位亮氨酸被谷氨酰胺代替，其僅存在于Lip14中)以在野生型基因中進(jìn)行定點(diǎn)誘變，并分析這些突變的效果。對(duì)于定點(diǎn)誘變，使用pfu聚合酶和野生型CALB基因作為底物，用SEQ.ID.No 15、No 16、No 17和No 18表示的引物作為底物，在94℃3分鐘和15輪94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘和72℃延伸1分鐘，然后是72℃10分鐘的最后延伸，實(shí)施PCR。
為了合成L278P突變基因，通過(guò)PCR，使用SEQ.ID.No 2和No 17表示的引物，用野生型基因作為底物，制備一種基因。還通過(guò)PCR，使用SEQ.ID.No 4和No 18表示的引物合成另一種基因。將兩種合成的DNA片段混合，并將混合物用作PCR底物，并使用SEQ.ID.No 2和No 4表示的引物，導(dǎo)致兩種基因片段的連接。那時(shí)，將5μl每種基因片段和3μl每種引物加入PCR反應(yīng)混合物中，然后使用ExTaq聚合酶(Dakara，日本)，94℃3分鐘和20輪94℃變性30秒，55℃退火30秒，和72℃延伸90秒，然后是72℃最后延伸7分鐘，實(shí)施PCR。通過(guò)上面方法合成的基因用EcoRI/ClaI消化，將該基因插入載體‘pLGK-Lip-CwpF’的相應(yīng)區(qū)域并命名為‘pLGK-LP’。
為了合成SEQ.ID.No 8所表示的L219Q突變基因，通過(guò)PCR，用SEQ.ID.No 2和No 15表示的引物，使用野生型基因作為底物，制備一種基因。通過(guò)PCR，使用SEQ.ID.No 4和No 16表示的引物，還合成了另一種基因。將兩種合成的DNA片段混合，并將混合物用作PCR的底物，使用SEQ.ID.No 2和No 4表示的引物，導(dǎo)致兩種基因片段的連接。那時(shí)，將5μl每種基因片段和3μl每種引物加入PCR反應(yīng)混合物中，然后使用ExTaq聚合酶(Dakara，日本)，94℃3分鐘和20輪94℃變性30秒，55℃退火30秒，和72℃延伸90秒，然后是72℃最后延伸7分鐘，實(shí)施PCR。通過(guò)上面方法合成的基因用EcoRI/ClaI消化，將該基因插入載體‘pLGK-Lip-CwpF’的相應(yīng)區(qū)域并命名為‘pLGK-LQ’。
為了得到包括L278P突變和L219Q突變的基因，用SEQ.ID.No 2、No 15、No 4和No 16表示的引物，使用pLGK-LP基因作為底物實(shí)施PCR，<p>表10.非參數(shù)ANOVA模型的結(jié)果(研究結(jié)束時(shí)自ADAS-Cog分值基線變化的平均值)
如可以從表10看到的，≥6mg劑量組中ε4等位基因攜帶者的ADAS-Cog得分減少(-1.74)。而對(duì)于非ε4攜帶者，自基線的變化是最小的(0.39)。在更低劑量組或安慰劑組中沒(méi)有見(jiàn)到基因型的影響，指出基因型影響依賴于雷司替明的劑量。
如在表11中所見(jiàn)的，基因型已確定和基因型未確定的群體之間人口統(tǒng)計(jì)信息之間沒(méi)有顯著差異。不同治療中ApoE ε4基因型和它們的分布頻率在表12中給出。
表11.基因型已確定和基因型未確定群體的人口統(tǒng)計(jì)信息
不同治療組中基因型已確定和基因型未確定個(gè)體的分布
結(jié)果，來(lái)自25℃下生長(zhǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液顯示出脂肪酶的最高活性和生長(zhǎng)。同時(shí)，在37℃培養(yǎng)導(dǎo)致隨著時(shí)間的流逝活性的快速降低(圖6a)。
那似乎是凋亡期間細(xì)胞分泌的蛋白酶的作用。用已知較少受蛋白酶影響的多形漢遜酵母A16株系(CBS4732衍生株系)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)和上面的相同的方法用pLGK-Lip14*轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母A16株。所得轉(zhuǎn)化體在YPD培養(yǎng)基中溫育，使得最初OD600為1，然后在25℃、30℃和37℃培養(yǎng)?；厥张囵B(yǎng)上清液以測(cè)量活性。
結(jié)果，證實(shí)多形漢遜酵母A16株的脂肪酶活性與多形漢遜酵母DL-1株的相比幾乎沒(méi)有改變但是在低溫培養(yǎng)時(shí)表達(dá)多得多的脂肪酶(圖6b)。25℃培養(yǎng)30小時(shí)導(dǎo)致脂肪酶的最高活性，產(chǎn)生480AU酶。
實(shí)施例10釀酒酵母中CALB表達(dá)為了優(yōu)化酶的生產(chǎn)，在釀酒酵母中表達(dá)突變CALB。
通過(guò)PCR使用SEQ.ID.No 2和No 12表示的引物合成Lip14基因，然后將其通過(guò)與NdeI和SEQ.ID.No 13表示的α-淀粉酶分泌信號(hào)序列融合連接到載體“YEGα HIR525”的EcoRI/BamHI位點(diǎn)(Choi等，Appl.Microbial.biotechnol.，1994，42，587)。使用Li/TE方法用所得載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母Y2805(MATα pep4∷HIS3 prb-1.6R canl his3-20 ura3-52)株。使用SC-URA(0.67％缺少氨基酸的酵母培養(yǎng)基，2％葡萄糖和除了尿嘧啶的各種其他氨基酸)培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)化體。所選的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)于含有1％tributyline的YPDG(1％酵母提取物、2％蛋白胨、0.5％葡萄糖和1.5％半乳糖)上以測(cè)量脂肪酶活性。
結(jié)果，在平板上觀察到活性圈。所證實(shí)的菌株接種于YPDG液體培養(yǎng)基中并被誘導(dǎo)在30℃表達(dá)24小時(shí)，并測(cè)量酶活性。
為了研究釀酒酵母在培養(yǎng)過(guò)程中是否同等地受到溫度的影響，將釀酒酵母分別培養(yǎng)于20℃和30℃并回收培養(yǎng)上清液以測(cè)量活性。
結(jié)果，當(dāng)其在20℃表達(dá)(720AU)時(shí)，該活性為在30℃表達(dá)的活性的10倍。
實(shí)施例11使用發(fā)酵罐大量產(chǎn)生改良的CALB的優(yōu)化為了使用釀酒酵母大量產(chǎn)生改良的CALB，51發(fā)酵罐被用于補(bǔ)料分批培養(yǎng)以優(yōu)化CALB的產(chǎn)生。YPD培養(yǎng)基(1％酵母提取物、4％蛋白胨和2％葡萄糖)被用作初級(jí)原代培養(yǎng)基。還額外以6-18ml/小時(shí)的間隔提供YG培養(yǎng)基(20％酵母提取物和40％半乳糖)以誘導(dǎo)CALB蛋白的表達(dá)。如上所述，重組CALB生產(chǎn)株(KCTC 10321BP)在比最優(yōu)培養(yǎng)溫度低的多的溫度下表現(xiàn)出最佳生產(chǎn)率。這樣，在培養(yǎng)的早期將培養(yǎng)溫度設(shè)為30℃以容許細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期。此后，將培養(yǎng)溫度降低到20-23℃以使蛋白質(zhì)生產(chǎn)率最佳。那時(shí)，向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑半乳糖。培養(yǎng)后，通過(guò)用細(xì)胞培養(yǎng)基測(cè)量OD600以研究細(xì)胞生長(zhǎng)，之后測(cè)量脂肪酶活性。通過(guò)使用培養(yǎng)基進(jìn)行SDS-PAGE定量補(bǔ)料-分批培養(yǎng)產(chǎn)生的CALB蛋白。
結(jié)果，如在圖7a中所示，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)直到OD600達(dá)到300，并且改進(jìn)的CALB的最大產(chǎn)量為18,000AU。每小時(shí)回收并通過(guò)SDS-PAGE分析培養(yǎng)上清液。結(jié)果在圖7b中顯示。改進(jìn)的CALB的產(chǎn)量為800mg/l。
工業(yè)適用性如此前所解釋的，本發(fā)明的突變脂肪酶的篩選方法促進(jìn)了產(chǎn)生具有改良的酶活性的突變脂肪酶的轉(zhuǎn)化株的制備。從所述轉(zhuǎn)化株制備的突變脂肪酶可被固定在細(xì)胞表面上并且是可再現(xiàn)的，因此大量生產(chǎn)是可能的。從而，可以篩選具有改良的酶活性的酶的本發(fā)明方法可以有效用于各種領(lǐng)域，如食品和洗滌劑工業(yè)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解前面的描述中公開(kāi)的概念和具體實(shí)施方案可以容易地用作改進(jìn)和設(shè)計(jì)其他實(shí)施方案的基礎(chǔ)以實(shí)施本發(fā)明的相同目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解這些等價(jià)實(shí)施方案不背離在后附權(quán)利要求中闡明的本發(fā)明的精神和范圍。
生物材料國(guó)際保藏和存活證明(譯文)
生物材料國(guó)際保藏和存活證明(譯文)
序列表<110>韓國(guó)生命工學(xué)研究院<120>使用酵母表面展示載體篩選具有改良的酶活性的脂肪酶的方法和該脂肪酶<130>3fpo-07-05<150>KR 2002-55575<151>2002 09 13<160>18<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CALB引物1<400>1ggctcttcag ccactccttt ggtgaag 27<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CALB引物2
<400>2gcggatcctc agggggtgac gat 23<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CALB引物3<400>3gcggatccgg gggtgacgat gccggag 27<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GPD-易錯(cuò)引物<400>4gcagagctaa ccaataagg 19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T-0引物<400>5tgcagttgaa cacaaccac 19<210>6<211>1023<212>DNA<213>南極洲假絲酵母<220>
<221>信號(hào)肽<222>(-51)..(-1)<223>分泌信號(hào)<400>6atgaatatat tttacatatt tttgtttttg ctgtcattcg ttcaaggtac cgccactccc9ttggtgaagc gtctgccttc cggttcggac cctgcctttt cgcagcccaa gtcggtgctc 69gatgcgggtc tgacctgcca gggtgcttcg ccatcctcgg tctccaaacc catccttctc 129gtccccggaa ccggcaccac aggtccacag tcgttcgact cgaactggat ccccctctct 189gcgcagctgg gttacacacc ctgctggatc tcacccccgc cgttcatgct caacgacacc 249caggtcaaca cggagtacat ggtcaacgcc atcaccacgc tctacgctgg ttcgggcaac 309aacaagcttc ccgtgctcac ctggtcccag ggtggtctgg ttgcacagtg gggtctgacc 369ttcttcccca gtatcaggtc caaggtcgat cgacttatgg cctttgcgcc cgactacaag 429ggcaccgtcc tcgccggccc tctcgatgca ctcgcggtta gtgcaccctc cgtatggcag 489
caaaccaccg gttcggcact cactaccgca ctccgaaacg caggtggtct gacccagatc 549gtgcccacca ccaacctcta ctcggcgacc gacgagatcg ttcagcctca ggtgtccaac 609tcgccactcg actcatccta cctcttcaac gggaagaacg tccaggcaca ggctgtgtgt 669gggccgctgt tcgtcatcga ccatgcaggc tcgctcacct cgcagttctc ctacgtcgtc 729ggtcgatccg ccctgcgctc caccacgggc caggctcgta gtgcagacta tggcattacc 789gactgcaacc ctcttcccgc caatgatctg actcccgagc aaaaggtcgc cgcggctgcg 849ctcccggcgc cggcggctgc agccatcgtg gcgggtccaa agcagaactg cgagcccgac 909ctcatgccct acgcccgccc ctttgcagta ggcaaaagga cctgctccgg catcgtcacc 969ccc 972<210>7<211>1023<212>DNA<213>南極洲假絲酵母<220>
<22>信號(hào)肽<222>(-51)..(-1)<223>分泌信號(hào)<400>7atgaatatat tttacatatt tttgtttttg ctgtcattcg ttcaaggtac cgccactcct 9ttggtgaagc gtctgccttc cggttcggac cctgcctttt cgcagcccaa gtcggtgctc 69gatgcgggtc tgacctgcca aggtgcttcg ccatcctcgg tctccaaacc catccttctc129
gtccccggaa ccggcaccac aggtccacag tcgttcgact cgaactggat ccccctctct 189gcgcagctgg gttacacacc ctgctggatc tcacccccgc cgttcatgct caacgacacc 249caggtcaaca cggagtacat ggtcaacgcc atcaccacgc tctacgctgg ttcgggcaac 309aacaagcttc ccgtgctcac ctggtcccag ggtggtctgg ttgcacagtg gggtctgacc 369ttcttcccca gtatcaggtc caaggtcgat cgacttatgg cctttgcgcc cgactacaag 429ggcaccgtcc tcgccggccc tctcgatgca ctcgcggtta gtgcaccctc cgtatggcag 489caaaccaccg gttcggcact cactaccgca ctccgaaacg caggtggtct gacccagatc 549gtgcccacca ccaacctcta ctcggcgacc gacgagatcg ttcagcctca ggtgtccaac 609tcgccactcg actcatccta ccttttcaac ggaaagaacg tccaggcaca ggctgtgtgt 669gggccgcagt tcgtcatcga ccatgcaggc tcgctcacct cgcagttctc ctacgtcgtc 729ggtcgatccg ccctgcgctc caccacgggc caggctcgta gtgcggacta tggcattacg 789gactgcaacc ctcttcccgc caatgatctg actcccgagc aaaaggtcgc cgcggctgcg 849ctcccggcgc cggcggctgc agccatcgtg gcgggtccaa agcagaactg cgagcccgac 909ctcatgccct acgcccgccc ctttgcagta ggcaaaagga cctgctccgg catcgtcacc 969ccc972<210>8<211>1023<212>DNA<213>南極洲假絲酵母<220>
<221>信號(hào)肽<222>(-51)..(-1)<223>分泌信號(hào)<400>8atgaatatat tttacatatt tttgtttttg ctgtcattcg ttcaaggtac cgccactcct 9ttggtgaagc gtctgccttc cggttcggac cctgcctttt cgcagcccaa gtcggtgctc 69gatgcgggtc tgacctgcca gggtgcttcg ccatcctcgg tctccaaacc catccttctc129gtccccggaa ccggcaccac aggtccacag tcgttcgact cgaactggat ccccctctct189gcgcagctgg gttacacacc ctgctggatc tcacccccgc cgttcatgct caacgacacc249caggtcaaca cggagtacat ggtcaacgcc atcaccacgc tctacgctgg ttcgggcaac309aacaagcttc ccgtgctcac ctggtcccag ggtggtctgg ttgcacagtg gggtctgacc369ttcttcccca gtatcaggtc caaggtcgat cgacttatgg cctttgcgcc cgactacaag429ggcaccgtcc tcgccggccc tctcgatgca ctcgcggtta gtgcaccctc cgtatggcag489caaaccaccg gttcggcact cactaccgca ctccgaaacg caggtggtct gacccagatc549gtgcccacca ccaacctcta ctcggcgacc gacgagatcg ttcagcctca ggtgtccaac609tcgccactcg actcatccta cctcttcaac ggaaagaacg tccaggcaca ggctgtgtgt669gggccgcagt tcgtcatcga ccatgcaggc tcgctcacct cgcagttctc ctacgtcgtc729ggtcgatccg ccctgcgctc caccacgggc caggctcgta gtgcagacta tggcattacg789gactgcaacc ctcttcccgc caatgatctg actcccgagc aaaaggtcgc cgcggctgcg849ctcctggcgc cggcggctgc agccatcgtg gcgggtccaa agcagaactg cgagcccgac909
ctcatgccct acgcccgccc ctttgcagta ggcaaaagga cctgctccgg catcgtcacc 969ccc972<210>9<211>341<212>PRT<213>南極洲假絲酵母<220>
<221>信號(hào)<222>(-24)..(-8)<223>分泌信號(hào)<400>9Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly-24 -20 -15 -10Thr Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala-5 1 6Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly11 16 21Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr26 31 36Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser41 46 51 56Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met61 66 71Leu Asn Asp Thr Gln Val ABn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr
76 81 86Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp91 96 101Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser106 111 116Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys121 126 131 136Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro141 146 151Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg156 161 166Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser171 176 181Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp186 191 196Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys201 206 211 216Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe221 226 231Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala236 241 246Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro A1a Asn251 256 261Asp Leu Thr pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro266 271 276
Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp281 286 291 296Leu Met pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser301 306 311Gly Ile Val Thr Pro316<210>10<211>341<212>PRT<213>南極洲假絲酵母<220>
<221>信號(hào)<222>(-24)..(-8)<223>分泌信號(hào)<400>10Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly-24 -20 -15 -10Thr Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala-5 1 6Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly11 16 21Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr26 31 36Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser41 46 51 56
Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met61 66 71Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr76 81 86Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp91 96 101Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser106 111 116Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys121 126 131 136Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro141 146 151Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg156 161 166Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser171 176 181Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Aspl86 191 196Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys201 206 211 216Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe221 226 231Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala236 241 246
Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn251 256 261Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro266 271 276Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp281 286 291 296Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser301 306 311Gly Ile Val Thr Pro316<210>11<211>341<212>PRT<213>南極洲假絲酵母<220>
<221>信號(hào)<222>(-24)..(-1)<223>分泌信號(hào)<400>11Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly-24 -20 -15 -10Thr Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala-5 1 6Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly11 16 21
Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr26 31 36Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser41 46 51 56Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met61 66 71Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr76 81 86Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp91 96 101Ser G1n Gly G1y Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser106 111 116Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys121 126 131 136Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro141 146 151Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg156 161 166Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser171 176 181Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp186 191 196Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys201 206 211 216Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe
221 226 231Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala236 241 246Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn pro Leu Pro Ala Asn251 256 261Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro266 271 276Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp281 286 291 296Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser301 306 311Gly Ile Val Thr Pro316<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CALB引物4<400>12ctcatatgct accttccggt tcggac 26<210>13<211>21<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>a-淀粉酶分泌信號(hào)<400>13Met Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala1 5 10 15Ala Pro Ala Leu Ala20<210>14<211>317<212>PRT<213>南極洲假絲酵母<400>14Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu1 5 10 15Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys20 25 30Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe35 40 45Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys50 55 60Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr65 70 75 80Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn85 90 95
Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln100 105 110Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu115 120 125Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu130 135 140Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly145 150 155 160Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile165 170 175Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro180 185 190Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys195 200 205Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His210 215 220Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala225 230 235 240Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr245 250 255Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val260 265 270Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly275 280 285
Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe290 295 300Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro305 310 315<210>15<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>LQ53引物<400>15gctgtgtgtg ggccgcagtt cgtcatcg 28<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>LQ35引物<400>16gcatggtcga tgacgaactg cggcccacac 30<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>LP53引物<400>17gtcgccgcgg ctgcgctccc ggcgccggcg 30<210>18<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>LP35引物<400>18ctgcagccgc cggcgccggg agcgcagcc 29
權(quán)利要求
1.篩選具有改良的酶活性的突變脂肪酶的方法，該方法包括下列步驟1)將脂肪酶基因克隆到表面展示載體中；2)通過(guò)誘變PCR，使用步驟1的表面展示載體中的脂肪酶基因作為模板，制備突變脂肪酶基因文庫(kù)；3)將步驟2的突變脂肪酶基因文庫(kù)和表面展示載體片段轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中；和4)測(cè)量所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表面中展示的突變脂肪酶的活性并選擇顯示進(jìn)化的活性的脂肪酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟1的脂肪酶基因是由SEQ.ID.NO 14表示的南極洲假絲酵母脂肪酶B。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表面展示載體含有啟動(dòng)子基因、編碼分泌信號(hào)序列的基因、脂肪酶基因或突變的脂肪酶基因、表面展示介導(dǎo)基因和終止子基因。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述啟動(dòng)子基因選自由GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1、GAL10、SED1、MOX、TEF和TPI組成的組。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述編碼分泌信號(hào)序列的基因選自由MFα、PHO5、SUC2、AMY、SED和殺傷毒素組成的組。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述表面展示介導(dǎo)基因選自由SED1、PIR2、TIP1、CWP1、GAS1和WSC1組成的組。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟2的突變脂肪酶基因是編碼一種突變蛋白的基因，該突變蛋白中，南極洲假絲酵母脂肪酶B的#219亮氨酸和/或#278亮氨酸被其他氨基酸代替。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟3的宿主細(xì)胞選自酵母如假絲酵母屬、德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、裂殖酵母屬、Yarrowia和酵母屬、絲狀真菌如曲霉屬、青霉屬和根霉屬或者細(xì)菌如埃希氏菌屬和芽孢桿菌屬。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是選自由假絲酵母屬、德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、裂殖酵母屬、Yarrowia和酵母屬組成的組的酵母細(xì)胞。
10.通過(guò)權(quán)利要求1的方法選擇的突變脂肪酶蛋白，其中SEQ.ID.No14表示的南極洲假絲酵母脂肪酶B的#219亮氨酸和/或#278亮氨酸被其他氨基酸代替。
11.如權(quán)利要求10所述的突變脂肪酶蛋白，其中#219亮氨酸被選自谷氨酰胺、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的親水氨基酸代替。
12.如權(quán)利要求11所述的突變脂肪酶蛋白，其中#219亮氨酸被谷氨酰胺代替，并且其氨基酸序列由SEQ.ID.NO 11表示。
13.如權(quán)利要求10所述的突變脂肪酶蛋白，其中#278亮氨酸被選自脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的氨基酸代替。
14.如權(quán)利要求13所述的突變脂肪酶蛋白，其中#278亮氨酸被脯氨酸代替，并且其氨基酸序列由SEQ.ID.No 9表示。
15.如權(quán)利要求10所述的突變脂肪酶蛋白，其中#219亮氨酸被谷氨酰胺代替，#278亮氨酸被脯氨酸代替，并且其氨基酸序列由SEQ.ID.No 10表示。
16.編碼權(quán)利要求10的突變脂肪酶蛋白的基因。
17.權(quán)利要求16所述的基因，其中該基因具有編碼權(quán)利要求11的突變脂肪酶蛋白的、由SEQ.ID.No 8表示的堿基序列。
18.權(quán)利要求16所述的基因，其中該基因具有編碼權(quán)利要求13的突變脂肪酶蛋白的、由SEQ.ID.No 6表示的堿基序列。
19.權(quán)利要求16所述的基因，其中該基因具有編碼權(quán)利要求15的突變脂肪酶蛋白的、由SEQ.ID.No 7表示的堿基序列。
20.含有權(quán)利要求16的基因的表達(dá)載體。
21.如權(quán)利要求20所述的表達(dá)載體，其中所述載體由啟動(dòng)子基因、分泌信號(hào)序列基因、權(quán)利要求17的基因、終止子基因和/或表面展示-介導(dǎo)基因組成。
22.如權(quán)利要求20所述的表達(dá)載體，其中所述載體由啟動(dòng)子基因、分泌信號(hào)序列基因、權(quán)利要求18的基因、終止子基因和/或表面展示-介導(dǎo)基因組成。
23.如權(quán)利要求20所述的表達(dá)載體，其中所述載體由啟動(dòng)子基因、分泌信號(hào)序列基因、權(quán)利要求19的基因、終止子基因和/或表面展示-介導(dǎo)基因組成。
24.如權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)子基因選自由GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1、GAL10、SED1、MOX、TEF和TPI組成的組。
25.如權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述分泌信號(hào)序列基因選自由MFα、PHO5、SUC2、AMY、SED和殺傷毒素組成的組。
26.如權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中所述表面展示-介導(dǎo)基因選自由SED1、PIR2、TIP1、CWP1、GAS1和WSC1組成的組。
27.其中導(dǎo)入權(quán)利要求20的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。
28.如權(quán)利要求27所述的轉(zhuǎn)化體，其中導(dǎo)入權(quán)利要求22的表達(dá)載體(保藏號(hào)KCTC 10320BP)。
29.如權(quán)利要求27所述的轉(zhuǎn)化體，其中導(dǎo)入權(quán)利要求23的表達(dá)載體(保藏號(hào)KCTC 10321BP)。
30.通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)權(quán)利要求10的突變脂肪酶蛋白的方法。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中培養(yǎng)溫度比宿主細(xì)胞培養(yǎng)的適宜溫度低2℃至20℃。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中當(dāng)轉(zhuǎn)化體是漢遜酵母時(shí)，培養(yǎng)溫度為25℃至35℃。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其中當(dāng)轉(zhuǎn)化體是酵母菌時(shí)，培養(yǎng)溫度為20℃至28℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用酵母表面展示載體篩選具有改良的酶活性的脂肪酶的方法和通過(guò)該方法制備的該突變脂肪酶，更具體地涉及包含1)將脂肪酶基因克隆到表面展示載體中，2)通過(guò)誘變PCR制備步驟1的脂肪酶的突變基因文庫(kù)，3)將步驟2的突變脂肪酶基因文庫(kù)和表面展示載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，和4)測(cè)量在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表面展示的突變脂肪酶的活性并選擇如此制備的突變脂肪酶的方法。本發(fā)明的方法可篩選具有改良的酶活性的脂肪酶。因此，其可有效用于各種領(lǐng)域，如食品和洗滌劑工業(yè)。
文檔編號(hào)C40B40/02GK1681942SQ03821734
公開(kāi)日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月13日
發(fā)明者崔毅星, 孫廷薰, 金素影 申請(qǐng)人:韓國(guó)生命工學(xué)研究院