專(zhuān)利名稱(chēng)：具有表面能突變區(qū)以維持陣列上樣品分離的多個(gè)陣列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及諸如多聚核苷酸陣列(例如DNA陣列)的陣列，它們?cè)谠\斷、篩選、基因表達(dá)分析等方面有很好的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在下面的討論以及本申請(qǐng)的全文中，雖然引用了很多參考文獻(xiàn)，但這些引用的文獻(xiàn)都不能構(gòu)成本申請(qǐng)的現(xiàn)有技術(shù)。
已經(jīng)公知多種化學(xué)陣列，例如多聚核苷酸陣列或蛋白質(zhì)陣列(例如DNA或RNA陣列)，它們已經(jīng)被用作諸如診斷或篩選工具。多聚核苷酸陣列包括通常包含不同序列的多聚核苷酸的區(qū)域，這些區(qū)域以預(yù)定的布置(configuration)方式排列在基片上。這些區(qū)域(有時(shí)稱(chēng)為“特征”)位于基片上的各自位置(“地址”)處。當(dāng)陣列受到樣品的作用時(shí)，將表現(xiàn)出可觀察到的結(jié)合圖案(pattern)。當(dāng)對(duì)陣列進(jìn)行閱讀時(shí)，這種結(jié)合圖案可以被檢測(cè)出來(lái)。例如，樣品中的所有多聚核苷酸目標(biāo)(例如DNA)都可以通過(guò)適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物(例如熒光化合物)進(jìn)行標(biāo)記，而陣列上的熒光圖案可以在其受到樣品作用之后精確地觀察到。假定不同序列的多聚核苷酸都按照預(yù)定的布置被正確地沉積，那么所觀察到的結(jié)合圖案將表明樣品中一種或多種多聚核苷酸成分的存在和/或濃度。
生物大分子陣列可以通過(guò)將預(yù)先獲得的生物大分子(例如通過(guò)合成或天然來(lái)源)沉積到基片上或者通過(guò)原位合成方法而制造出來(lái)。沉積所獲得的生物大分子的方法包括將其裝入針或毛細(xì)管中，然后使所述的針或毛細(xì)管與表面接觸，例如US 5,807,522中所述，或者通過(guò)從諸如噴墨頭的脈沖噴頭中噴射出來(lái)而進(jìn)行沉積，例如PCT公開(kāi)文本W(wǎng)O 95/25116和WO98/41531中以及其他地方所述?？梢哉J(rèn)為此類(lèi)沉積方法通過(guò)一個(gè)固定循環(huán)而形成各個(gè)特征(也就是說(shuō)，每一個(gè)特征只有一個(gè)循環(huán)，在此期間，先前獲得的生物大分子被固定到基片上)。在原位制備方法中，通過(guò)脈沖噴頭或其他裝置將很多不同的試劑液滴沉積在給定的目標(biāo)位點(diǎn)上，以便形成最終的特征(從而在陣列的基片上合成出了所述特征的探針)。原位制備方法包括US 5,449,754中描述的合成肽陣列的方法，US 6,180,351和WO98/41531及其所引用的參考文獻(xiàn)中所描述的合成多聚核苷酸的方法，也可以使用脈沖噴頭沉積試劑。制備多聚核苷酸陣列的原位法在多個(gè)不同的有待在此形成特征的地址中的每一個(gè)地址處通常采用相同的傳統(tǒng)重復(fù)工序，所述傳統(tǒng)重復(fù)工序被用于通過(guò)公知的化學(xué)手段由核苷試劑在載體上形成多聚核苷酸特征。在每個(gè)有待形成的特征處，該重復(fù)工序可以被看作是后面的固定循環(huán)中的多個(gè)(a)在第一個(gè)重復(fù)中，將選定的活化的核苷(單體單元)通過(guò)亞磷酸酯鍵偶聯(lián)至官能化支持物上，或者在隨后的重復(fù)中將其偶聯(lián)至結(jié)合在基片上的核苷(也就是核苷修飾的基片)上；(b)可選地，可以將結(jié)合在基片上的核苷的未反應(yīng)羥基封閉起來(lái)(有時(shí)也稱(chēng)為“加帽”)；(c)將步驟(a)的亞磷酸酯鍵氧化以形成磷酸酯鍵；以及(d)將保護(hù)基團(tuán)從在步驟(a)中所偶聯(lián)的最新的結(jié)合在基片上的核苷中除去(去保護(hù))，以便為這些步驟中的下一次循環(huán)產(chǎn)生活性位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)將含有活化劑和亞磷酰胺(phosphoramidite)的液滴沉積到陣列上特定的預(yù)期特征位置上來(lái)進(jìn)行偶聯(lián)。提供最終的去保護(hù)步驟，在該步驟中，通過(guò)在公知的條件下用氫氧化銨和/或甲胺進(jìn)行處理而將含氮堿基和磷酸酯基同時(shí)去保護(hù)。加帽、氧化和去保護(hù)可以通過(guò)用一層合適的試劑對(duì)整塊基片進(jìn)行處理(“浸沒(méi)”)而實(shí)現(xiàn)。官能化的支持物(第一個(gè)循環(huán)中)或去保護(hù)的偶聯(lián)核苷(后續(xù)循環(huán)中)為結(jié)合在基片上的部分(moiety)提供了鏈接基團(tuán)，以便與將要在步驟(a)中進(jìn)行偶聯(lián)的下一個(gè)核苷形成亞磷酸酯鍵。核苷堿基最終的去保護(hù)可以通過(guò)在另一個(gè)浸沒(méi)程序中以公知的方式利用堿性條件例如氫氧化銨而實(shí)現(xiàn)。通常選用一個(gè)脈沖噴頭或其他分配器來(lái)沉積一種單體單元。
下列文獻(xiàn)中詳細(xì)地描述了上述多聚核苷酸合成的化學(xué)機(jī)制，例如，Caruthers，Science 230281-285，1985；Itakura et al.，Ann.Rev.Biochem.53323-356；Hunkapillar et al.，Nature 310105-110，1984；以及”Synthesis ofOligonucleotide Derivatives in Design and Targeted Reaction ofOligonucleotide Derivatives”，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)la.，pages 100 et seq.，US 4,458,066，US 4,500,707，US 5,153,3 19，US 5,869,643，EP 0294196等。亞磷酰胺和亞磷酸三酯法使用得最為廣泛，但是還有一些其他的方法，包括磷酸二酯法、磷酸三酯法以及H-膦酸酯法?；ǔ１还倌芑员闩c所沉積的第一個(gè)單體相結(jié)合。例如，在US 6,258,454和Southem，E.M.，Maskos，U.and Elder，J.K.，Genomics，13，1007-1017，1992中描述了合適的技術(shù)，用于利用此類(lèi)鏈接部分使基片官能化。在陣列的制備中，在任何一個(gè)循環(huán)里，不同的單體和活化劑可以被沉積在基片的不同位置上，從而使得完成后的陣列的不同特征具有不同的所期望的生物大分子序列。在每個(gè)循環(huán)中可能還需要一個(gè)或多個(gè)中間步驟，例如在多聚核苷酸陣列的原位制備中的常規(guī)氧化、加帽和沖洗步驟(同樣地，這些步驟可以在浸沒(méi)程序中進(jìn)行)。
US 6,242,266，US 6,232,072，US 6,180,351以及US 6,171,797中公開(kāi)了通過(guò)沉積先前獲得的生物大分子或原位法而制備生物大分子陣列的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。美國(guó)專(zhuān)利6,319,674和6,444,268中公開(kāi)了特別有用的鏈接組合物及方法。這些專(zhuān)利中也提供了一種裝置，通過(guò)該裝置可以改變基片的表面能，從而在陣列制備過(guò)程中控制沉積液滴的鋪展。
在陣列的制備過(guò)程中，可用的多聚核苷酸的量往往很少，而且非常昂貴。此外，可以用于測(cè)試的樣品量往往也很少。在這些條件下，需要使用特征較小并且緊密分布的陣列。例如，陣列上可以具有數(shù)千個(gè)特征。但是在某些情況下，具有少得多的特征的陣列(例如只有一百個(gè)特征)就足夠了。具有更少特征的多個(gè)陣列可以被容納在同一個(gè)基片上，并和不同的樣品作用。在這種情況下，為了阻止不同樣品的混合，可以在不同陣列之間建立物理阻隔，例如襯墊或其他裝置，以便阻止施加在一個(gè)陣列上的樣品液體與施加在相鄰陣列上的樣品液體進(jìn)行接觸。這可能需要在施加樣品液體之前手動(dòng)組裝這樣一個(gè)襯墊結(jié)構(gòu)，從而提供了產(chǎn)生意外的陣列接觸或者污染(例如來(lái)自使用者接觸列陣的手指)的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致從很昂貴的陣列中無(wú)法獲得有意義的結(jié)果。雖然可以在制備陣列之前將阻隔固定到基片上，但這可能導(dǎo)致對(duì)制備過(guò)程的物理干擾(例如當(dāng)沉積頭需要緊貼基片表面移動(dòng)時(shí))以及處理過(guò)程中可能的阻隔脫離，并且需要額外的制備步驟。
本發(fā)明意識(shí)到最好能夠在基片上提供多個(gè)陣列，其可以與不同的液體樣品(或相同樣品的不同部分)作用，同時(shí)提供一種裝置以阻止不同的樣品或樣品部分之間的接觸，該裝置不要求復(fù)雜的處理并且很容易制造。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種陣列單元，其中包括位于基片表面上的多個(gè)化學(xué)陣列(例如生物大分子或其他聚合物陣列)。每個(gè)陣列包括多個(gè)特征，并且每個(gè)陣列都被表面能突變區(qū)所包圍，以維持施加到陣列上的分離的液體樣品之間的分離。基片表面在承載陣列的連續(xù)區(qū)域上是物理上不間斷的。
本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明陣列單元的方法。該方法可以包括向基片表面有待形成特征的位點(diǎn)處沉積含有生物大分子前體的液滴，從而使得前體在所述位點(diǎn)處與表面相結(jié)合。在每一個(gè)所述位點(diǎn)處可以重復(fù)進(jìn)行該操作，使先前已連接的前體與下一步沉積的前體相結(jié)合，直到陣列被制備出來(lái)。在該方法中，在重復(fù)進(jìn)行前述的液滴沉積之后，與陣列間區(qū)域相比，形成陣列的區(qū)域疏水性變得更小。本發(fā)明還提供了一種裝置，可以執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的制備陣列單元的方法，本發(fā)明還提供了一種攜帶計(jì)算機(jī)可讀代碼的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，當(dāng)其被計(jì)算機(jī)執(zhí)行時(shí)，可以執(zhí)行本發(fā)明的制備方法(例如在前述的裝置上)。
本發(fā)明還提供了使用陣列單元的方法，所述陣列單元包括位于基片表面的多個(gè)生物大分子陣列，每個(gè)陣列都包括多個(gè)特征，并且陣列被物理上不間斷的陣列間表面區(qū)域分隔開(kāi)。該方法包括向每一個(gè)陣列上施加分離的液體樣品，從而使得多個(gè)分離的樣品同一時(shí)間存在于基片表面，同時(shí)通過(guò)陣列間區(qū)域保持分離狀態(tài)。例如，該方法可以應(yīng)用于本發(fā)明的陣列，從而使得疏水性更強(qiáng)的陣列間區(qū)域維持了所施加樣品間的分離。
本發(fā)明所提供的使用本發(fā)明陣列單元的另一種方法包括閱讀與陣列單元有關(guān)的代碼，并從所述代碼或與所述代碼相鏈接的文件中獲得有關(guān)應(yīng)施加到陣列上的液體樣品體積的信息。
本發(fā)明的各個(gè)方面可以提供下述或其他有用的益處中的任何一種或多種。例如，可以在基片上提供多個(gè)陣列，可以和不同的液體樣品(或相同樣品的不同部分)作用。同時(shí)，不同樣品或樣品部分之間的接觸可以被抑制，但這并不要求復(fù)雜的處理，而且很容易制造


圖1示出了承載諸如可以通過(guò)本發(fā)明的方法制造的多個(gè)陣列的陣列組件；圖2是圖1中的一部分的放大圖，示出了多個(gè)理想的點(diǎn)或陣列的特征；圖3是圖2中的一部分的放大圖；圖4示出了位于本發(fā)明陣列單元的陣列上的不同體積靜態(tài)(固定)液滴的液滴直徑，其為接觸角的函數(shù)；圖5示出了由表面能突變區(qū)所導(dǎo)致的液體體積對(duì)液體接觸面積的不連續(xù)，而表面能突變區(qū)是由于本發(fā)明單元上陣列的疏水性小于陣列間區(qū)域造成的；圖6示出了本發(fā)明所提供的使用本發(fā)明陣列單元的裝置和方法；圖7示出了本發(fā)明陣列單元的使用；以及圖8示出了本發(fā)明陣列單元的另一種陣列布局。
為了便于理解，在可行的時(shí)候，使用了同樣的標(biāo)號(hào)來(lái)標(biāo)注不同附圖中共有的相同要素。位于相同數(shù)字后面的不同字母指出了一個(gè)大類(lèi)里的不同成員(例如陣列12a、12b、12c可以一般地稱(chēng)為“陣列12”)。附圖不一定是按比例的。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，除非出現(xiàn)了相反的目的，下面的術(shù)語(yǔ)均指所指明的特征?！吧锎蠓肿印笔怯梢环N或多種類(lèi)型的重復(fù)單元所構(gòu)成的聚合物。生物大分子通?？稍谏锵到y(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，具體包括多糖(例如碳水化合物)、肽(使用該術(shù)語(yǔ)時(shí)，包括與/不與多糖相連接的蛋白質(zhì)以及多肽)和多聚核苷酸，以及它們的類(lèi)似物，諸如由下列物質(zhì)構(gòu)成或含有下列物質(zhì)的化合物氨基酸類(lèi)似物或非氨基酸基團(tuán)，或者核苷酸類(lèi)似物或非核苷酸基團(tuán)。這包括其常規(guī)骨架已被替換為非天然或合成骨架的多聚核苷酸，以及其中的一個(gè)或多個(gè)常規(guī)堿基已被替換為能夠參與Watson-Crick型氫鍵作用的基團(tuán)(天然或合成的)的核酸(或合成或天然類(lèi)似物)。多聚核苷酸包括單鏈或多鏈構(gòu)象，其中這些鏈中的一條或多條可以與其他鏈完全配對(duì)或不能完全配對(duì)?！昂塑账帷笔侵负怂岬膩唵卧?，具有磷酸酯基、五碳糖和含氮堿基，以及此類(lèi)亞單元的功能類(lèi)似物(合成或天然)，其中聚合物形式(例如多聚核苷酸)的所述類(lèi)似物可以與天然的多聚核苷酸以序列特異的方式相雜交，其雜交方式與兩種天然多聚核苷酸的雜交方式相類(lèi)似。例如，“生物大分子”包括DNA(包括cDNA)、RNA、寡聚核苷酸和PNA，以及US 5,948,902及其引用文獻(xiàn)(在此以引用的方式將其全部?jī)?nèi)容包括在本文中)中所述的其他多聚核苷酸，不管其來(lái)源如何?！肮丫酆塑账帷币话闶侵搁L(zhǎng)度約為10到100個(gè)核苷酸的核苷酸多聚物，而“多聚核苷酸”包括含有任何數(shù)目核苷酸的核苷酸多聚物?！吧飭误w”是指單個(gè)的單元，可以與相同或其他的生物單體相鏈接以形成生物大分子(例如具有兩個(gè)鏈接基團(tuán)的單個(gè)氨基酸或核苷酸，其中所述連接基團(tuán)中的一個(gè)或兩個(gè)可以具有可除去的保護(hù)基團(tuán))?！吧锎蠓肿忧绑w”是生物大分子的更小單元，可以通過(guò)化學(xué)鍵尾對(duì)尾連接以形成生物大分子。生物單體是一種類(lèi)型的生物大分子前體，但生物大分子前體可以包括相鏈接的兩個(gè)或更多個(gè)的單體單元。流體是指液體(例如，生物大分子或生物大分子前體的溶液)。
“陣列”，除非出現(xiàn)了相反的目的，包括帶有特定化學(xué)部分的可尋址區(qū)域的任何一維、二維或三維布置，其中，所述化學(xué)部分(例如位于不同區(qū)域的具有不同序列的生物大分子，如多聚核苷酸)與該區(qū)域相關(guān)聯(lián)。當(dāng)基片為多孔結(jié)構(gòu)時(shí)，每個(gè)區(qū)域可以向第三維延伸；而當(dāng)基片為非多孔結(jié)構(gòu)時(shí)，則不具有任何實(shí)質(zhì)的第三維的量度(厚度)。陣列是“可尋址的”，因?yàn)樗ǘ鄠€(gè)含有不同部分(例如不同的多聚核苷酸序列)的區(qū)域，從而使得位于陣列上特定的預(yù)定位點(diǎn)處(“地址”)的區(qū)域(陣列的“特征”或“點(diǎn)”)將檢測(cè)到具體的目標(biāo)或一類(lèi)目標(biāo)(雖然特征也有可能意外地檢測(cè)到不對(duì)應(yīng)于該特征的目標(biāo))。陣列特征一般是均一的，并且特征通常被間隔區(qū)所分隔，但不一定非要這樣。對(duì)于陣列而言，“目標(biāo)”是指移動(dòng)相(通常是流體)里的部分，它有待于被位于各個(gè)區(qū)域的與基片相結(jié)合的探針(“目標(biāo)探針”)所檢測(cè)。但是，“目標(biāo)”或“目標(biāo)探針”可以是將被另一個(gè)評(píng)價(jià)的那一個(gè)(因此，任何一個(gè)都可以是含有多聚核苷酸的未知混合物，有待于通過(guò)與另一個(gè)的結(jié)合而被評(píng)估)?！瓣嚵胁季帧被颉瓣嚵刑匦浴笨梢曰Q使用，用于指代陣列的一種或多種物理、化學(xué)或生物的特性，例如陣列內(nèi)部特征的布置以及陣列在基片上的布置，一種或多種特征尺寸，或者在給定的特征位點(diǎn)處某部分的本性或功能(例如化學(xué)的或生物的)的某些指示，或者陣列應(yīng)該如何操作(例如，陣列和樣品作用的條件，或者陣列閱讀說(shuō)明書(shū)，或者在樣品作用后來(lái)自陣列控制特征的預(yù)期信號(hào)或信號(hào)范圍)。對(duì)于多聚核苷酸，“雜交”和“結(jié)合”可以互換使用。陣列上的“控制特征”是指在使用陣列期間檢查陣列或樣品表現(xiàn)的那些特征。例如，控制特征可以是負(fù)控制(在樣品作用后，預(yù)期信號(hào)很少或沒(méi)有)或正控制(在樣品作用后，預(yù)期信號(hào)較高)。
“塑料”是指任何高分子量(例如至少1,000克/摩爾，甚至至少10,000或100,000克/摩爾)的合成有機(jī)聚合物。
當(dāng)“柔性”用于描述基片或基片薄片(web)時(shí)，是指基片可以繞著半徑小于1.25cm的輥?zhàn)訌澱?80度。基片可以在任一方向上這樣重復(fù)彎折和伸直至少100次而不會(huì)產(chǎn)生失效(例如開(kāi)裂)或塑性變形。這種彎折必須在材料的彈性限度之內(nèi)。前述的柔性測(cè)試是在20℃下進(jìn)行的。
“薄片”是指長(zhǎng)大于寬的較長(zhǎng)的連續(xù)基片材料。例如，薄片的長(zhǎng)寬比可以是至少5/1，10/1，50/1，100/1，200/1或500/1，甚至至少1000/1。
當(dāng)一個(gè)項(xiàng)目相對(duì)于另一個(gè)項(xiàng)目被稱(chēng)為“遠(yuǎn)程”時(shí)，是指這兩個(gè)項(xiàng)目至少位于不同的建筑物中，可以至少相隔1英里、10英里或至少100英里。“交流”信息是指將代表該信息的數(shù)據(jù)以電信號(hào)的形式通過(guò)適當(dāng)?shù)耐ㄓ嵭诺?例如私人或公共網(wǎng)絡(luò))進(jìn)行傳送?！稗D(zhuǎn)發(fā)”一個(gè)項(xiàng)目是指將該項(xiàng)目從一個(gè)地點(diǎn)轉(zhuǎn)至另一個(gè)地點(diǎn)，可以通過(guò)物理手段或其他手段(可能的情況下)轉(zhuǎn)移該項(xiàng)目，包括至少對(duì)于數(shù)據(jù)，通過(guò)物理手段將攜帶數(shù)據(jù)的介質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)移或交流數(shù)據(jù)。陣列“組件”可以僅僅是陣列加基片，其中陣列沉積于該基片上，雖然組件也可以是其中包括其他特征的封裝物的形式(例如帶有腔室的外罩)?！扒皇摇笔侵阜忾]的體積(雖然可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)端口訪問(wèn)腔室)。還應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，在本申請(qǐng)的全文中，使用術(shù)語(yǔ)“前”、“后”、“頂”、“上”和“下”時(shí)，僅僅采用了其相對(duì)的意思。提到單數(shù)的項(xiàng)目時(shí)，也包括存在多個(gè)同樣項(xiàng)目的可能性。“可以”是指可選擇的。所詳述的任何方法都可以按照詳述時(shí)所給出的順序加以實(shí)施，或者也可以按照其他邏輯上可行的順序進(jìn)行。
“脈沖噴頭”是指任何可在陣列的形成過(guò)程中分配液滴的器件。脈沖噴頭工作時(shí)，對(duì)臨近出口或噴嘴的液體給予一個(gè)壓力脈沖(例如通過(guò)壓電或熱電元件)，從而使得液滴可以從所述出口或通孔處分配出來(lái)。
例如，與表面相連接的“鏈接層”的厚度可以小于200埃，甚至小于10埃(或厚度小于8、6或4埃)。這樣的層的多聚核苷酸、蛋白質(zhì)、核苷或氨基酸最小結(jié)合親和力可以是104到106單位/μ2。如果需要，可以利用UV或X射線橢圓偏光儀評(píng)估層的厚度。
當(dāng)“物理上不間斷的”用于描述基片表面時(shí)，是指沒(méi)有物理阻隔，所述物理阻隔可以容納液體以阻止其擴(kuò)散出該陣列。物理阻隔的尺寸足夠大以阻止陣列間的液體流動(dòng)，并且與可容納液體的阻隔不同，所述可容納液體的阻隔是由于化學(xué)組成造成的表面能的不連續(xù)所產(chǎn)生的(例如，在疏水區(qū)域和疏水性更小的相臨區(qū)域的界面處)。例如，物理上不間斷的表面可以是沒(méi)有例如包圍陣列的壁之類(lèi)的延伸至基片表面以上超過(guò)10微米(或超過(guò)5、2或1微米)的物理阻隔的表面。表面上的“區(qū)域”是被連接起來(lái)的鄰接的表面部分。區(qū)域內(nèi)部可以有不連續(xù)(例如，陣列間區(qū)域是相互連接在一起的，但是在其內(nèi)部卻有承載特征的區(qū)域，而這些承載特征的區(qū)域并不是陣列間區(qū)域的一部分)?！斑B續(xù)”區(qū)域是不間斷的(也就是說(shuō)，在其外部尺寸之間完全延伸)。因此，承載特征的連續(xù)區(qū)域是承載特征以及特征之間的任何對(duì)象的基片的連續(xù)部分(所以也包括特征間區(qū)域)。當(dāng)承載特征的連續(xù)區(qū)域被稱(chēng)為物理上不間斷的時(shí)候，則這是指在有陣列位于其內(nèi)的表面部分的外部邊界之間沒(méi)有物理阻隔。
與化學(xué)結(jié)構(gòu)式相關(guān)的“基團(tuán)”包括取代和未取代形式的基團(tuán)。取代物可以包括低級(jí)烷基、鹵素或其他基本不會(huì)對(duì)預(yù)期結(jié)果產(chǎn)生干擾的取代物。
“低級(jí)烷基”是含有1到6個(gè)C原子的烷基，可以只具有1、2、3或4個(gè)C原子中的任何一種。
在US 6,444,268中給出了“表面能”的定義。
液體與表面的“接觸角”是指在表面上的液滴邊界與該表面之間所測(cè)量到的銳角。接觸角的測(cè)量是公知的，可以通過(guò)多種儀器實(shí)現(xiàn)，例如可從First Ten Angstroms，Portsmouth，VA，U.S.A.獲得的FTA200。水或水性液體在疏水性更強(qiáng)的表面(表面能更高)上的接觸角比在疏水性更小的表面上的接觸角要大(例如，疏水表面上水滴的接觸角大于50度，甚至大于90度)。陣列的接觸角(有時(shí)稱(chēng)為“平均接觸角”或“有效接觸角”)是指該陣列的特征和特征間區(qū)域的平均接觸角。除非特別說(shuō)明，否則接觸角都是用水測(cè)定的。
“鏈接劑密度”或“加帽劑密度”是指單位面積內(nèi)鏈接分子或加帽分子的數(shù)目。在確定鏈接劑密度時(shí)對(duì)鏈接劑進(jìn)行計(jì)數(shù)，而不管它們是否與探針相連或者自身被加帽。對(duì)于加帽劑密度而言，只有直接與基片表面相連的加帽劑被計(jì)算在內(nèi)。如果具有均一組成的基片表面的不同區(qū)域在相同的條件下受到相同成分的鏈接劑作用時(shí)，那么這些區(qū)域的鏈接劑密度將被認(rèn)為是“相同”的，其中，所述鏈接劑以相同的密度與表面相結(jié)合。
“探針密度”是一種簡(jiǎn)稱(chēng)，是指在一個(gè)特征內(nèi)單位面積上鏈接分子或探針?lè)肿拥臄?shù)目。該術(shù)語(yǔ)可與“特征探針密度”互換使用，并具有同樣的含義。因此，在確定探針密度時(shí)，任何基本上不含探針的特征間區(qū)域都不予考慮。因而，一個(gè)區(qū)域的“探針密度”與特征密度(單位面積內(nèi)的特征數(shù)目)是不一樣的，而且相互獨(dú)立。
本文中的任何方法的步驟都可以按照詳述時(shí)所給出的順序加以實(shí)施，或者也可以按照其他邏輯上可行的順序進(jìn)行。本申請(qǐng)中所引用的全部專(zhuān)利以及其他參考文獻(xiàn)，在此均以引用的方式將其包括在本文中，但是，這些專(zhuān)利或者參考文獻(xiàn)中的任何與本申請(qǐng)相抵觸的內(nèi)容(包括定義)除外(在這種情況下以本申請(qǐng)為準(zhǔn))。
在本發(fā)明的陣列單元中，表面能突變區(qū)可以由陣列間表面區(qū)域提供，所述陣列間表面區(qū)域位于承載陣列的區(qū)域之間，并包圍著所述承載陣列的區(qū)域，而且比被包圍區(qū)域邊界的疏水性更強(qiáng)。在一種排列方式中，前述被包圍區(qū)域的邊界是陣列的邊界(也就是說(shuō)，陣列間區(qū)域緊鄰陣列邊界)。在一種結(jié)構(gòu)中，在水侵入到陣列間區(qū)域之前，陣列可以容納的水的體積可達(dá)1mL，通?？蛇_(dá)0.4mL，更為常見(jiàn)的是達(dá)0.1mL。在另一種布局中，陣列特征可以容納的水的體積可達(dá)V，其中V由下式給出V(r,θc)=13π(rcos(π2-θc))13(2-3sin(π2-θc)+sin(π2-θc)3)]]>其中，V(r，θc)是靜止液滴的體積；r是圓形陣列的半徑，或者當(dāng)陣列不是圓形時(shí)，r是與陣列面積相等的圓形的半徑；θc是接觸角，大于20度(或者大于30、40、50或60度)并且可以小于80度(或小于70或65度)?；蛘?，θc可以是大于中間值的接觸角，所述中間值位于上述角度中的任何一個(gè)和下面列出的陣列間區(qū)域的更大角度中的任何一個(gè)之間(例如在80度和90度之間)。
陣列特征的接觸角可以小于20度(或小于15、10或5度)，特征總面積可以占每一個(gè)陣列面積的至少30％(或至少40％、50％、60％或至少80％)。陣列本身的平均接觸角可以大于20度(或者大于30、40、50或60度)并且小于80度(或小于70或65度)，而陣列間區(qū)域的接觸角可以大于80度(甚至大于90、95、100、105、110、115、120或130度)。陣列的形狀可以是“圓的”。在該語(yǔ)境中，“圓的”僅僅意味著不是三角形也不是矩形，并且可以包括橢圓形的陣列。相鄰陣列之間的最小間隔可以是陣列的特征之間的平均距離的至少2倍，或至少是此平均距離的3、4、5或8倍。并且，相鄰陣列之間的最小間隔可以不大于陣列特征之間平均距離的10(或者9或5)倍。
陣列間表面區(qū)域可以包括與基片表面相連接的不同類(lèi)型的分子。每個(gè)陣列特征也可以包括與基片表面相連接的不同類(lèi)型的分子，而只有所述不同類(lèi)型分子的一個(gè)子集可以使生物大分子共價(jià)結(jié)合到特征內(nèi)部表面上。例如，所述不同類(lèi)型的分子可以是US 6,444,268中所述的第一和第二硅烷，此處以引用的方式將該專(zhuān)利包括在本文中，而在這種情況下，所述子集將是第二硅烷(第一硅烷不與陣列單元上的任何生物大分子相結(jié)合)。
在每一個(gè)陣列內(nèi)，陣列不必是均一的(也就是說(shuō)，特征之間間隔相等并且具有相同的尺寸)。例如，每個(gè)陣列可以具有內(nèi)部區(qū)域和包圍內(nèi)部區(qū)域的外部區(qū)域，每個(gè)區(qū)域含有多個(gè)特征，其中，特征所占外部區(qū)域面積的比例要比特征所占內(nèi)部區(qū)域面積的比例更大一些。因而該外部區(qū)域可以提供陣列和陣列內(nèi)部區(qū)域之間的親水/疏水邊界。外部區(qū)域中的陣列可以具有同樣的組成。
如前所述，在本發(fā)明的使用上述陣列的方法中，分離的液體樣品(可以是不同樣品或同一樣品的不同部分)可以被放置在單個(gè)的陣列上，并保持相互之間的分離狀態(tài)。在本發(fā)明的陣列中，疏水性更強(qiáng)的陣列間區(qū)域(相對(duì)于疏水性更小的陣列區(qū)域)可以維持所施加的樣品之間的分離狀態(tài)。因而，雖然人們可以進(jìn)一步在陣列之間提供物理阻隔，但是在本發(fā)明的方法中在陣列之間可以沒(méi)有此類(lèi)物理阻隔，從而避免了可能的處理和污染問(wèn)題。在所述方法中，陣列可以與施加到該陣列上的分離的液體樣品保持接觸至少1小時(shí)、至少5小時(shí)或者至少10小時(shí)。例如，在多聚核苷酸雜交中，在升高的溫度下，樣品可以與陣列保持接觸約12小時(shí)，這對(duì)于多聚核苷酸陣列雜交來(lái)說(shuō)是公知的。
在本發(fā)明的制備陣列單元的方法中，基片表面可以包括與基片表面相結(jié)合的組合物，所述組合物既覆蓋陣列間區(qū)域，也覆蓋形成陣列的區(qū)域，包括特征位點(diǎn)。在沉積含有生物大分子前體的液滴時(shí)，所述組合物中的至少一種成分可以將所述前體結(jié)合在表面上。上述組合物可以包括與基片表面相連接的不同類(lèi)型的分子，而只有所述不同類(lèi)型分子的一個(gè)子集可以將生物大分子共價(jià)結(jié)合到特征內(nèi)部表面上。例如，基片表面可以被US6,444,268中所述的第一和第二硅烷的疏水混合物所完全涂覆，生物大分子特征形成在基片上的不同陣列處。在沉積含有生物大分子前體(例如生物單體)的液滴的第一個(gè)循環(huán)中，前體僅僅通過(guò)第二硅烷被結(jié)合在特征處。在多個(gè)循環(huán)之后，特征位點(diǎn)的疏水性減小，從而使得形成陣列的區(qū)域的疏水性也變得比陣列間區(qū)域更小了。
本發(fā)明的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品可以包括計(jì)算機(jī)可讀的存儲(chǔ)介質(zhì)，其中儲(chǔ)存著計(jì)算機(jī)程序，所述計(jì)算機(jī)程序可以控制裝置來(lái)執(zhí)行此處所描述的方法。例如，用于此處的任何用途的任何計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)可以包括光或磁存儲(chǔ)器(例如固定式或便攜式磁盤(pán)或其他器件)，或者固態(tài)存儲(chǔ)器。
現(xiàn)在參考圖1-圖3，本發(fā)明的陣列組件15可以包括基片，例如該基片的形式可以是有限長(zhǎng)度的剛性基片10(例如透明的非多孔材料，例如玻璃或硅石)，上面承載著一個(gè)或多個(gè)陣列12(例如陣列12a、12b、12c)，這些陣列沿著基片10的平坦的上表面11a分布，并且所有陣列都被同樣的陣列間表面區(qū)域14分隔開(kāi)，而陣列間表面區(qū)域14包圍著陣列12中的每一個(gè)陣列。陣列間表面區(qū)域可以被認(rèn)為剛好延伸超過(guò)圖1中陣列12的最外側(cè)。承載陣列12的連續(xù)區(qū)域包括陣列12以及陣列間區(qū)域14?；?0也可以是柔性的。每個(gè)陣列12都在與陣列在共同的空間延伸的表面11a上占據(jù)了其自身的區(qū)域(因此這些區(qū)域并未延伸至陣列間區(qū)域14內(nèi))?；?0的背面11b并不承載任何陣列12?？梢詫?duì)基片10上的陣列進(jìn)行設(shè)計(jì)，以用于測(cè)試任何類(lèi)型的樣品，可以是測(cè)試樣品；參考樣品；上述樣品的組合；或者多聚核苷酸、蛋白質(zhì)、多糖等的已知混合物(在這種情況下，陣列中可能包含攜帶待評(píng)估的未知序列的特征)。雖然圖1中示出了30個(gè)陣列12，但是應(yīng)當(dāng)理解，在基片10以及使用基片10的實(shí)施方式中，可以使用所期望的任何數(shù)目的陣列12，例如至少5、10、30、50、100個(gè)，或者至少200個(gè)。根據(jù)使用目的，陣列12中的任何一個(gè)或者全部可以是相同的或彼此不同，并且每一個(gè)都含有由多聚核苷酸形式的生物大分子所構(gòu)成的多個(gè)點(diǎn)或特征16。在圖示的實(shí)施例中，陣列12的形狀大致是圓的(但也可能是其他的形狀，例如大致呈橢圓形)。
典型的陣列12可以含有多于5、10、20、30、100甚至至少150個(gè)特征。例如，特征的寬度(對(duì)于圓形的點(diǎn)來(lái)說(shuō)，也就是直徑)可以在10μm到1.0cm范圍內(nèi)。在其他的實(shí)施例中，每個(gè)特征的寬度可以在1.0μm到1.0mm范圍內(nèi)，較為常見(jiàn)的是5.0μm到500μm，更為常見(jiàn)的是10μm到200μm。非圓形特征的面積范圍可以相當(dāng)于具有前述寬度(直徑)范圍的圓形特征的面積范圍。至少一部分或全部特征具有不同的組成(例如，當(dāng)具有相同組成的每個(gè)特征的任何重復(fù)都被排除時(shí)，剩下的特征可以占總特征數(shù)目的至少5％，10％或20％)。
每一個(gè)陣列12的面積可以小于400mm2，甚至小于200mm2、100mm2，或小于50mm2或20mm2。在很多實(shí)施例中，特別是當(dāng)基片10為剛性時(shí)，它的形狀可以通常為矩形固體(雖然也可能是其他形狀)，長(zhǎng)度大于4mm小于1m，較為常見(jiàn)的是大于4mm小于600mm，更為常見(jiàn)的是小于400mm；寬度大于4mm小于1m，較為常見(jiàn)的是小于500mm，更為常見(jiàn)的是小于400mm；厚度大于0.01mm小于5.0mm，較為常見(jiàn)的是大于0.1mm小于2mm，更為常見(jiàn)的是大于0.2mm小于1mm。當(dāng)基片10為柔性時(shí)，它可以具有各種長(zhǎng)度，包括至少1m，至少2m，或至少5m(甚至至少10m)。對(duì)于通過(guò)檢測(cè)熒光而進(jìn)行閱讀的陣列而言，基片10可以由當(dāng)用激發(fā)光照射時(shí)可以發(fā)射輕微熒光的材料制成。此外，在這種情況下，如果聚焦激光束在某個(gè)區(qū)域內(nèi)傳播太慢的話，那么基片可以是相對(duì)透明的，以便減少入射照射激光的吸收以及隨后的發(fā)熱。例如，基片10可以透射至少20％或50％(甚至至少70％、90％或95％)的入射到上表面的照射光，這可以通過(guò)此類(lèi)入射光的整體積分光譜或在532nm和633nm處進(jìn)行檢測(cè)而測(cè)定出來(lái)。
當(dāng)陣列12是通過(guò)常規(guī)的原位法形成，或者通過(guò)沉積先前得到的部分(如前所述，沉積先前得到的部分時(shí)，例如通過(guò)使用諸如噴墨頭的脈沖噴頭，在每一個(gè)循環(huán)中沉積一小滴試劑以形成每一個(gè)特征)而形成時(shí)，特征間區(qū)域17通常會(huì)存在，而它們并不承載任何多聚核苷酸。應(yīng)當(dāng)理解，特征間區(qū)域17可以具有各種尺寸和形狀。每一個(gè)特征都承載了預(yù)定的多聚核苷酸(也可能是多聚核苷酸的混合物)。與平常一樣，A、C、G、T代表常規(guī)核苷酸。“Link”(詳見(jiàn)圖3)代表與上表面和第一個(gè)核苷酸共價(jià)結(jié)合的鏈接劑(分子)，“Cap”代表不與核苷酸結(jié)合的分子，下面將對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步的描述。
基片10也可以包括一個(gè)或多個(gè)條形碼356形式的標(biāo)識(shí)符。也可以使用例如其他的光或磁標(biāo)識(shí)符的標(biāo)識(shí)符來(lái)代替條形碼356，它將攜帶下面所討論的信息。由于每個(gè)標(biāo)識(shí)符與每個(gè)陣列12位于同一基片10上，并因此相對(duì)于條形碼356具有固定的位置，通過(guò)所述相對(duì)位置可以識(shí)別每一個(gè)陣列，通過(guò)這種方式，可以使每個(gè)標(biāo)識(shí)符與每個(gè)陣列12聯(lián)系在一起?；€可以具有一個(gè)或多個(gè)基準(zhǔn)標(biāo)識(shí)18，以便在陣列的制備和閱讀過(guò)程中進(jìn)行校準(zhǔn)。
圖2和圖3示出了陣列12a、12b的理想特征16，其中所形成的實(shí)際特征與目標(biāo)(或“目的”)特征是相同的，每個(gè)特征16的形狀、尺寸和組成都是均一的，并且這些特征具有規(guī)則的間隔。當(dāng)通過(guò)液滴沉積法進(jìn)行制備時(shí)，這樣的一個(gè)陣列將要求用于每個(gè)特征的所有試劑液滴都是形狀均一的，并且被精確地沉積在目標(biāo)特征位點(diǎn)上。在實(shí)踐中，由于制造過(guò)程中的系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差，這樣的理想結(jié)果實(shí)際上是很難獲得的。為了便于說(shuō)明，所示出的陣列12a中的特征16以矩形排列方式(也就是說(shuō)，規(guī)則的行和列)進(jìn)行分布，而陣列12b中的特征16則以緊密的六邊形布置方式進(jìn)行分布。在實(shí)踐上，位于同一基片10上的所有陣列12將使用基本相同的布置方式(矩形或緊密六邊形)。
具有相同特征的一個(gè)或多個(gè)陣列可以被重制在表面11a上，其中，重制陣列具有相同或不同的特征探針密度。在該實(shí)施例中，位于同一陣列內(nèi)的所有特征具有相同的特征探針密度，而探針通過(guò)在圖3中被稱(chēng)為“Link”的鏈接劑與表面11a相結(jié)合。在特征12a-12c的每一個(gè)上，也存在加帽劑(“Cap”)。合適的加帽劑可以具體是任何一種US 6,444,268中進(jìn)行了詳細(xì)描述的第一硅烷，而鏈接劑可以是其中的任何一種第二硅烷，溶劑也可以是該專(zhuān)利中所描述的(例如甲苯)。如上所述，此處已經(jīng)以引用的方式將該專(zhuān)利包括在本文中，包括其中所使用的第一硅烷、第二硅烷和溶劑的細(xì)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施例中，如上述專(zhuān)利中所述，第一硅烷具有結(jié)構(gòu)式R1-Si(RLRxRy)，第二硅烷具有結(jié)構(gòu)式(在鏈接到被沉積的生物單體上之前)R2-(L)n-Si(RLRxRy)，從而使得與表面的結(jié)合提供了位于其上的-Si-R1基團(tuán)以及-Si-(L)n-R2基團(tuán)，其中RL部分是離去基團(tuán)，可以相同或不同；Rx和Ry獨(dú)立地是低級(jí)烷基或離去基團(tuán)；R1是在結(jié)合至基片表面后降低其表面能的化學(xué)惰性的部分；n是0或1；L是鏈接基團(tuán)；R2是使其可與分子部分共價(jià)結(jié)合的官能團(tuán)，或者可以被轉(zhuǎn)化為此類(lèi)官能團(tuán)的可修飾基團(tuán)。上述的離去基團(tuán)可以包括鹵素和烷氧基。第一和第二硅烷都通過(guò)其上的活性親水部分與表面相連，所述親水部分選自由羥基、羧基、巰基、氨基及其組合所構(gòu)成的組。在上述專(zhuān)利中，還對(duì)第一和第二硅烷的上述術(shù)語(yǔ)以及其他實(shí)施例進(jìn)行了進(jìn)一步的限定?；?0可以用US 6,444,268中詳述的上述硅烷混合物進(jìn)行處理，以獲得羥基封端的第二硅烷基團(tuán)，核苷酸亞磷酰胺可與該基團(tuán)反應(yīng)，以便通過(guò)第二硅烷(圖3中的連接)與表面相連。這產(chǎn)生了圖1-3中所示出的布置方式，其中，多聚核苷酸(或其他生物大分子)在特征16處通過(guò)鏈接分子與基片表面11a相連?？梢詫?duì)第一和第二硅烷的相對(duì)量進(jìn)行調(diào)節(jié)，以便控制表面能(從而控制疏水程度)，US 6,444,268中也對(duì)此進(jìn)行了詳細(xì)描述。
從圖1中可以看出，基片10上表面11a的連續(xù)區(qū)域在物理上是不間斷的，其中上表面11a包括陣列間表面區(qū)域14和陣列12。因此，陣列12和陣列間表面區(qū)域14本身在物理上也是不間斷的。
由于在每個(gè)特征16上都存在多聚核苷酸(帶有其親水官能團(tuán))，因此每個(gè)特征16的疏水性與陣列間區(qū)域14相比要更小些，并進(jìn)而使得每一個(gè)陣列12的疏水性也比陣列間區(qū)域14更小些。因此，每一個(gè)陣列12都被表面能的不連續(xù)有效地包圍，而表面能的不連續(xù)可以使得施加到陣列12上的分開(kāi)的液體樣品保持分離狀態(tài)。與疏水性更小的區(qū)域相比，疏水性更大的區(qū)域與水性液滴的接觸角更大一些，因此，施加到每一個(gè)陣列12上的液體樣品往往會(huì)被限制在那個(gè)陣列上。這種效應(yīng)可以在陣列單元15上觀察到，如圖5所示。圖5大致描述了在諸如表面11a的表面上接觸角與液滴體積的關(guān)系。隨著陣列12(其疏水性比陣列間區(qū)域14小)上的液滴體積的增加，只要液滴的表面接觸區(qū)域保持在陣列當(dāng)中，那么液滴的平均接觸角就會(huì)大致維持在一個(gè)常量上，約為20到40度(在特征16之間可能有不連續(xù))。但是，當(dāng)液滴繼續(xù)增大，接觸到疏水性更強(qiáng)的陣列間區(qū)域14時(shí)，接觸角開(kāi)始增大(如垂直虛線的附近區(qū)域所示)；當(dāng)液滴的表面接觸區(qū)域進(jìn)入陣列間區(qū)域14時(shí)，接觸角最終再一次穩(wěn)定在某一值上。在圖1-圖3以及圖5所示的情況下，考慮到每個(gè)陣列12上的液滴的平均接觸角，實(shí)際上表面能是不連續(xù)的，因此每個(gè)陣列12附近的平均接觸角也是不連續(xù)的。
本發(fā)明的陣列單元15可以通過(guò)如下方式制備首先按照US 6,444,268所描述的方法，利用第一和第二硅烷將所有的表面11a官能化。然后，通過(guò)上述的原位制備方法或沉積先前獲得的生物大分子的制備方法形成特征16，從而在表面11a上制備陣列12。這可以通過(guò)下述方式進(jìn)行在有待制備的基片10上每一個(gè)陣列的多個(gè)特征位點(diǎn)上，向基片表面連續(xù)的官能化區(qū)域沉積含有生物大分子或其他化學(xué)探針或探針前體(例如生物單體，如核苷亞磷酰胺)的液滴，從而使得探針或探針前體在特征位點(diǎn)處與鏈接劑相結(jié)合。該步驟可以在一個(gè)或多個(gè)特征處重復(fù)，特別是當(dāng)采用原位法制備生物大分子時(shí)，直到完成陣列12。下述文獻(xiàn)中詳細(xì)地公開(kāi)了這些步驟例如，US 6,242,266，US 6,232,072，US 6,180,351，US 6,171,797，US 6,323,043，Caren等人1999年4月30日提交的序列號(hào)為09/302,898的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)，以及其中引用的文獻(xiàn)。
由于特征的形成，當(dāng)多聚核苷酸在每一個(gè)特征位置延長(zhǎng)時(shí)，與官能化的特征間區(qū)域17相比，每一個(gè)特征16(從而每一個(gè)陣列12)的疏水性變得更小。這是由于正在延長(zhǎng)的多聚核苷酸(雖然也可以使用其他具有親水基團(tuán)的生物大分子，例如肽)上存在親水官能團(tuán)。當(dāng)特征16被足夠緊密地填充在陣列12中時(shí)，雖然特征間區(qū)域17仍然保持著它們的未反應(yīng)的第一和第二硅烷，但是與陣列間區(qū)域14相比，陣列12的整體表面特性將變得疏水性更小。一種評(píng)估獲得此效果所需的特征密度的簡(jiǎn)單方法是，在與預(yù)期的最終陣列相同的官能化表面(例如前述的通過(guò)第一和第二硅烷進(jìn)行官能化的表面11a)上，構(gòu)建若干與預(yù)期的最終陣列組成相同但特征密度不同的測(cè)試陣列。然后檢測(cè)位于測(cè)試陣列上的水性液滴(最好與實(shí)際的陣列以后將要接觸的樣品具有相同的組成)在體積增加時(shí)的表現(xiàn)。如果觀察到了圖5所示的行為，使得只要液滴未達(dá)液體將被擠迫到陣列間區(qū)域的最大體積，被置于測(cè)試陣列上的液滴將往往被限制住，那么該密度就是足夠的。圖5的圖線的中間區(qū)域上升地越快越陡則越好。也可以使用其他設(shè)備，以檢測(cè)液滴在超出陣列12時(shí)移動(dòng)的阻力。
本發(fā)明的陣列單元可以通過(guò)使用下述美國(guó)專(zhuān)利中所描述的裝置中的任何一種進(jìn)行制造6,420,180；6,323,043；6,180,351。按照那些專(zhuān)利中所描述裝置的操作方法，如前面已經(jīng)描述的通過(guò)使用先前已經(jīng)用第一和第二硅烷對(duì)整個(gè)表面11a進(jìn)行了官能化的基片10來(lái)制備陣列單元15。具體地說(shuō)，裝置的處理器通過(guò)原位或沉積方法按照沉積圖案控制陣列的制備，以便在基片10(可以從更大的基片上切出來(lái))上生成陣列12。在每一個(gè)循環(huán)中，在每一個(gè)目標(biāo)特征16處沉積一組試劑液滴，從而使得探針或探針前體通過(guò)鏈接劑與不同的區(qū)域相結(jié)合。在原位制備工藝中，在工藝的每一個(gè)循環(huán)里，在每一個(gè)特征處重復(fù)進(jìn)行單體的沉積。在需要的時(shí)候，處理器也會(huì)將基片送到浸沒(méi)站進(jìn)行循環(huán)中間步驟或者最終步驟，這都按照上述的傳統(tǒng)的原位多聚核苷酸陣列制備工藝進(jìn)行。在操作所述裝置過(guò)程中的任何一點(diǎn)處，處理器可以以US 6,180,351中所述的方式使每個(gè)陣列與諸如條形碼356的標(biāo)識(shí)符相關(guān)聯(lián)。標(biāo)識(shí)符可以攜帶有關(guān)位于基片10上的陣列12的布局信息，也可以攜帶其他信息(例如關(guān)于可以施加到特定的陣列單元15的每一個(gè)陣列12的樣品體積的信息，包括如下的一種或多種推薦的樣品體積，最小體積以及最大體積)。可以施加到每一個(gè)陣列12的典型的最大體積不超過(guò)1000微升，或者不超過(guò)500、200、100、50或10微升。或者，標(biāo)識(shí)符356可以與攜帶任何一種上述信息的文件相鏈接，從而使得可以基于標(biāo)識(shí)符而獲得該文件。該文件及其與標(biāo)識(shí)符的鏈接可以通過(guò)制造裝置的處理器存儲(chǔ)在固定的存儲(chǔ)器中，或者可以被寫(xiě)入便攜式存儲(chǔ)介質(zhì)中，然后將該介質(zhì)放置在與相應(yīng)的陣列組件15相同的包裝中，以便運(yùn)送至遠(yuǎn)程客戶處。US 6,180,351中描述了標(biāo)識(shí)符的其他用途。
應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，在前述的包圍陣列12的表面能突變區(qū)被保證的情況下，陣列單元15可以通過(guò)其他方式制造，例如通過(guò)光刻技術(shù)。
當(dāng)客戶收到陣列單元15時(shí)，可能會(huì)利用手動(dòng)或自動(dòng)裝置，在用戶站將其和樣品作用，所述用戶站位于陣列制造站的遠(yuǎn)程處。圖6示出了一種自動(dòng)裝置。處理器414可以從閱讀器400處接收從陣列單元15讀取的任何代碼(例如條形碼356)。處理器414也可以通過(guò)照相機(jī)404觀察基準(zhǔn)標(biāo)識(shí)18，來(lái)檢驗(yàn)基片單元15相對(duì)于樣品分配單元406的對(duì)準(zhǔn)。樣品分配單元406可以是脈沖噴頭，其結(jié)構(gòu)與頭410相似，并可以是壓電或熱脈沖噴頭，以便將樣品傳送到陣列12(以諸如US 6,221,653所述的方式)?；蛘?，樣品分配單元406可以是自動(dòng)移液系統(tǒng)。X-Y平移平臺(tái)408可以將頭406移動(dòng)到表面11a上的任何位置。處理器414還可以通過(guò)通訊模塊410訪問(wèn)通訊信道180。通訊信道180可以是任何合適的通訊信道，例如LAN、WAN、衛(wèi)星或電話網(wǎng)絡(luò)。
在操作中，陣列單元15被手動(dòng)放置在頭406下方，處理器414利用照相機(jī)404和基準(zhǔn)標(biāo)識(shí)18確定陣列單元15相對(duì)于頭408的位置。閱讀器400讀取代碼(例如條形碼356)，并獲得陣列12的布局以及關(guān)于每一個(gè)陣列12樣品體積的信息(例如下列的任意一種或多種推薦的樣品體積，最小體積或最大體積)。獲取的信息可以來(lái)自所讀取的代碼本身，來(lái)自本地存儲(chǔ)器，而已經(jīng)以與代碼相鏈接的文件的形式將此類(lèi)信息預(yù)先存儲(chǔ)于該本地存儲(chǔ)器中，或者來(lái)自含有鏈接文件的遠(yuǎn)程存儲(chǔ)器(例如位于陣列制造工廠或其他地方)。然后，處理器414利用所獲得的信息控制頭平移平臺(tái)408和頭406，以便將樣品沉積到每一個(gè)陣列12上，其中在每一個(gè)陣列上所沉積的體積是推薦體積，至少是最小體積，或者不超過(guò)最大體積，這取決于所獲得的信息是前述的哪一種。
在用于使用陣列單元15的非自動(dòng)系統(tǒng)中，可以省去照相機(jī)404、頭406和平移平臺(tái)408。作為替代，用戶可以將位于閱讀器400下方的陣列單元15的代碼356進(jìn)行手動(dòng)傳送，處理器會(huì)獲得并在監(jiān)視器410上顯示前述的體積信息。然后，用戶可以將前述待沉積的體積手動(dòng)移取到陣列12上。
不管沉積樣品時(shí)采用的是上述的自動(dòng)技術(shù)還是手動(dòng)技術(shù)，都將分離的液體樣品施加到每一個(gè)陣列12上，其中，在每一個(gè)陣列12上所沉積的樣品體積足以覆蓋該陣列12，同時(shí)不超過(guò)該陣列所能容納的最大體積而不會(huì)延伸進(jìn)入陣列間區(qū)域14。因此，分離的液體樣品將同時(shí)存在于基片表面11a上，而不會(huì)延伸出陣列12并進(jìn)入疏水性更強(qiáng)的陣列間區(qū)域14。如上所述，疏水性更強(qiáng)的陣列間區(qū)域14維持了所施加樣品之間的分離，并通過(guò)抑制樣品移動(dòng)至陣列間區(qū)域14中，來(lái)將它們限制在它們的陣列12的區(qū)域內(nèi)。這種情況在圖7中進(jìn)行了說(shuō)明，其中，由于疏水性更強(qiáng)的陣列間區(qū)域14的作用，所沉積的分離的樣品22a、22b、22c被維持分離狀態(tài)，并被阻止擴(kuò)張至它們相應(yīng)的陣列12a、12b、12c之外。注意接觸角θ1?？梢栽试S樣品22與每一個(gè)陣列12保持接觸至少1小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)或至少10小時(shí)。陣列的平均接觸角和陣列間區(qū)域接觸角的差異可以大于10、20、30、40、60、70或80度。
當(dāng)特征16上的探針以及有待與其結(jié)合的樣品都是待雜交的多聚核苷酸時(shí)，可以使用公知的陣列雜交條件。在雜交過(guò)程中，陣列單元15可以被保持在潮濕環(huán)境(例如體積較小的封閉腔室)中，或者可以向每種樣品中加入諸如保濕劑之類(lèi)的成分，它可以增強(qiáng)水分的保持。保濕劑包括聚乙二醇(例如平均分子量500,1000或更大的聚乙二醇)，甘油三乙酸酯，山梨糖醇，聚葡萄糖，麥芽糖醇，甘油或赤蘚醇，以及促進(jìn)水分保持的其他聚合物(例如親水聚合物)或分子。當(dāng)然，所選出的任何此類(lèi)成分在其他方面都應(yīng)該與雜交溶液和陣列的化學(xué)性質(zhì)相容。也可以在雜交過(guò)程中采用受控的蒸發(fā)以減小樣品的體積(增大濃度)。在那種情況下，人們可能會(huì)希望在起始階段采用過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)木彌_液，因?yàn)殡S著體積的減小，嚴(yán)謹(jǐn)性會(huì)降低。或者，通過(guò)在雜交過(guò)程中添加雜交緩沖液，也可以獲得相反的效果。
注意，與所有陣列的特征都均勻分布在表面11a上只作為一個(gè)陣列時(shí)所需的樣品量相比，無(wú)論如何所需的樣品體積都會(huì)減小。這是因?yàn)椴怀休d特征的很大一部分表面11a(陣列間區(qū)域14)沒(méi)有與樣品接觸。因此，所需的樣品體積可以減小，或者所使用的樣品濃度可以更高以促進(jìn)雜交。而且，承載特征的相對(duì)親水性較強(qiáng)的區(qū)域仍然有助于確保樣品均勻鋪展在陣列12上。
在將樣品作用于陣列足夠長(zhǎng)的時(shí)間之后，可以對(duì)其進(jìn)行沖洗和干燥以便進(jìn)行閱讀。注意，所有的陣列12都可以同時(shí)用同樣的沖洗緩沖液沖洗，因此，與每一個(gè)陣列都位于不同基片上的情況相比，這減少了工藝的差異性，提高了處理能力。
單元15上的所有陣列12都可以通過(guò)任何合適的閱讀裝置同時(shí)閱讀。當(dāng)以公知手段在目標(biāo)中引入了熒光標(biāo)記從而有待檢測(cè)熒光時(shí)，可以使用公知的陣列閱讀器。例如，此類(lèi)閱讀器可以以光柵的方式在每一個(gè)陣列的整個(gè)范圍內(nèi)掃描一種或多種照射激光束以及檢測(cè)到的任何產(chǎn)生的熒光，如US 6,406,849中所述。注意，本發(fā)明的陣列單元可以避免使用任何額外的諸如蠟的疏水材料或者對(duì)襯墊等的需求，而所有這些都可能引入少量的熒光污染物。由于從每個(gè)陣列特征所讀取的熒光信號(hào)很微弱，因此，即使此類(lèi)污染物的濃度很小并且僅在某些位點(diǎn)存在，也有可能?chē)?yán)重影響結(jié)果。
陣列的閱讀結(jié)果可以是經(jīng)過(guò)處理的結(jié)果，例如通過(guò)下述方式獲得拒絕對(duì)某一低于預(yù)定閾值的特征的閱讀，和/或基于從陣列讀取的圖案而形成結(jié)論(例如樣品中是否可能存在一種具體的目標(biāo)序列，或者提供樣品的生物體是否表現(xiàn)出了某種特定的病況或疾病)。閱讀的結(jié)果(已處理或未處理)可以通過(guò)通訊信道180或閱讀器/寫(xiě)入器186以及介質(zhì)190，被轉(zhuǎn)發(fā)(例如通過(guò)通訊)至遠(yuǎn)程位置進(jìn)行接收，以便進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估和/或處理或者使用。如果需要，可以通過(guò)其他手段對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行傳輸以到達(dá)遠(yuǎn)程位置，或根據(jù)需要再輸送到其他位置。
在上述實(shí)施例的一個(gè)變化中，有可能將每個(gè)陣列組件15都包含在適當(dāng)?shù)耐庹种?。此?lèi)外罩可以包括通常被隔片所封閉的封閉的腔室，可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)端口對(duì)其進(jìn)行訪問(wèn)，并且所述外罩承載著基片10。在這種情況下，位于基片10上的所有陣列的標(biāo)識(shí)符可以通過(guò)被施加到所述外罩上而與它們相關(guān)聯(lián)。也應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，可以通過(guò)前面沒(méi)有提及的任何其他方法或裝置來(lái)閱讀陣列，其中，其他的閱讀方法包括其他的光學(xué)技術(shù)(例如檢測(cè)化學(xué)發(fā)光或電發(fā)光標(biāo)記)或電學(xué)技術(shù)(其中對(duì)每個(gè)特征提供了電極，以檢測(cè)該特征處的雜交，其方式如US 6,251,685，US 6,221,583等所公開(kāi)的)。對(duì)于從特征獲得信號(hào)數(shù)據(jù)(特征提取)，其中在此操作中特征及其相應(yīng)的信號(hào)在所讀取的陣列圖像中被識(shí)別，可以按照下述專(zhuān)利中描述的過(guò)程進(jìn)行序列號(hào)為09/589046，09/659415以及10/086839的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)，其標(biāo)題均為“Method And System For Extracting Data From Surface ArrayDeposited Features”。
在圖1-3所示出的實(shí)施例中，被陣列間區(qū)域14包圍的承載陣列12a的每一個(gè)區(qū)域的邊界19(由剛好接觸陣列12a最外側(cè)特征16的最外面邊界的線所定義)提供了表面能突變區(qū)，以維持施加到陣列上的分離的液體樣品之間的分離。但是這并不是必需的。例如，在陣列和這樣的表面能突變區(qū)之間可以有一個(gè)間隙，其中，在該間隙處提供了比陣列12a疏水性更小的其他組分(則表面能突變區(qū)位于該成分和疏水性更強(qiáng)的陣列間區(qū)域14之間)。在另一個(gè)替換實(shí)施例中，陣列不必是均勻布置的。例如，如圖8所示，陣列12a可以包括內(nèi)部區(qū)域20(以21為界)以及包圍著內(nèi)部區(qū)域20的外部區(qū)域22(也以陣列12a的邊界19為界)。外部區(qū)域22也可以具有多個(gè)特征24，這些特征24可以都具有相同或不同的組成(如果它們所含有的組合物比陣列間區(qū)域14的親水性更強(qiáng)的話)。例如，特征24可以是具有相同序列的多聚核苷酸。特征24所占外部區(qū)域面積(限定在界線21和邊界90之間)的比例要比特征16所占內(nèi)部區(qū)域面積(以界線21為界)的比例更大一些。因此，實(shí)際上外部區(qū)域22的親水性可能比內(nèi)部區(qū)域20更大一些。注意，如果外部區(qū)域22被親水性高于陣列間區(qū)域14的組分所連續(xù)填充，那么這將代表一個(gè)實(shí)施例，其中在陣列和表面能突變區(qū)之間有一個(gè)間隙，如前面所述。在這種情況下，陣列12a的邊界在界線21處，19則是表面能突變區(qū)。這樣，在該實(shí)施例中，陣列間區(qū)域14的疏水性要比被包圍區(qū)域的邊界19更強(qiáng)一些。
多聚核苷酸組分或其他部分將沉積于其上的基片表面可以是多孔的或非多孔的，可以是平滑的或基本呈平面狀?；梢允且环N材料或者具有多層結(jié)構(gòu)。當(dāng)希望陣列具有某種圖案時(shí)，除了圖1中陣列12的有規(guī)則行列結(jié)構(gòu)以外，還可以構(gòu)建出各種幾何形狀。例如，陣列12可以被布置為布滿基片表面的一系列曲線的行(例如一系列同心圓狀或半圓狀的點(diǎn))等等。相似地，位于陣列12內(nèi)的特征16的圖案可以與圖2中特征的有規(guī)則的行列狀不同，可以包括例如一系列曲線的行(例如一系列同心圓或半圓形)等等。類(lèi)似地，在陣列12中的特征16的圖案可以不同于圖2中的特征的若干規(guī)則的行或列，特征16的圖案可以包括例如一系列的曲線的行(例如，例如一系列同心圓或半圓形的點(diǎn))等等。雖然可以采用各種特征布置方式，但應(yīng)該向用戶提供某些能夠確認(rèn)特征的至少某些特性(例如下列的任何一種或多種特征的組分、位點(diǎn)、尺寸、以在與不同樣品結(jié)合圖案的變化的顯著性的形式給出的表現(xiàn)特性等)的方式(例如通過(guò)陣列標(biāo)識(shí)符)?？梢愿鶕?jù)制造、處理和使用方面的考慮對(duì)陣列的布置方式進(jìn)行選擇。本方法和裝置可以與前述的類(lèi)似的方式，用于制造和使用表面上具有其他生物大分子、聚合物或其他部分的陣列，其方式與前面所述的相同。相應(yīng)地，當(dāng)提到聚合物、生物大分子或多聚核苷酸等時(shí)，往往可以替換為“化學(xué)部分”。
當(dāng)然可以對(duì)上述具體實(shí)施例進(jìn)行各種進(jìn)一步的修改。因此，本發(fā)明并不限于前面詳細(xì)描述的具體實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.一種陣列單元，包括承載著多個(gè)生物大分子陣列的基片表面，每個(gè)陣列中都包括多個(gè)特征，并且每個(gè)陣列都被表面能突變區(qū)所包圍，以維持施加到所述陣列上的分離的液體樣品之間的分離，并且其中所述基片表面在承載所述陣列的連續(xù)區(qū)域上是物理上不間斷的。
2.如權(quán)利要求1所述的陣列單元，其中，所述的表面能突變區(qū)由陣列間表面區(qū)域提供，所述陣列間表面區(qū)域位于承載陣列的區(qū)域之間，并包圍著所述承載陣列的區(qū)域，而且比被包圍區(qū)域邊界的疏水性更強(qiáng)。
3.如權(quán)利要求2所述的陣列單元，其中，所述被包圍區(qū)域的邊界是所述陣列的邊界。
4.如權(quán)利要求2所述的陣列單元，其中，所述的生物大分子包括多聚核苷酸或肽。
5.如權(quán)利要求4所述的陣列單元，其中，所述陣列間表面區(qū)域比所述陣列特征的疏水性更強(qiáng)。
6.如權(quán)利要求5所述的陣列單元，其中，在水侵入到所述陣列間區(qū)域之前，所述陣列可以容納的水的體積可達(dá)V，其中V由下式給出V(r,θc)=13π(rcos(π2-θc))13(2-3sin(π2-θc)+sin(π2-θc)3)]]>其中，V(r，θc)是靜止液滴的體積；r是圓形陣列的半徑，或者當(dāng)陣列不是圓形時(shí)，r是與所述陣列面積相等的圓形的半徑；θc是大于20度的接觸角。
7.如權(quán)利要求5所述的陣列單元，其中，所述陣列特征的接觸角小于20度，并且特征總面積占每一個(gè)陣列面積的至少30％。
8.如權(quán)利要求4所述的陣列單元，其中，所述的陣列是圓形的。
9.如權(quán)利要求4所述的陣列單元，其中，所述相鄰陣列之間的最小間隔至少為所述陣列特征之間平均距離的二倍。
10.如權(quán)利要求5所述的陣列單元，其中，所述相鄰陣列之間的最小間隔不大于所述陣列特征之間平均距離的十倍。
11.如權(quán)利要求4所述的陣列單元，其中，所述的每一個(gè)陣列包括50到1000個(gè)特征。
12.如權(quán)利要求4所述的陣列單元，其中，所述的陣列間表面區(qū)域包括與所述基片表面相連接的不同類(lèi)型的分子。
13.如權(quán)利要求12所述的陣列單元，其中，所述陣列的每一個(gè)特征也包括與所述基片表面相連接的不同類(lèi)型的分子，其中只有所述不同類(lèi)型分子的一個(gè)子集可以將生物大分子共價(jià)結(jié)合到所述特征內(nèi)部表面上。
14.如權(quán)利要求4所述的陣列單元，其中，每個(gè)陣列包括內(nèi)部區(qū)域和包圍所述內(nèi)部區(qū)域的外部區(qū)域，每個(gè)區(qū)域含有多個(gè)特征，特征所占據(jù)的所述外部區(qū)域面積的比例要比特征所占據(jù)的所述內(nèi)部區(qū)域面積的比例更大。
15.如權(quán)利要求14所述的陣列單元，其中，每個(gè)陣列的所述外部區(qū)域包括至少八個(gè)特征。
16.一種使用權(quán)利要求4所述陣列的方法，包括下列步驟向每一個(gè)陣列上施加分離的液體樣品，從而使得多個(gè)分離的樣品同一時(shí)間存在于所述基片表面，同時(shí)疏水性更強(qiáng)的陣列間區(qū)域維持了所施加樣品間的分離。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，陣列之間沒(méi)有物理阻隔。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述陣列特征中包含多聚核苷酸或肽，并且每一個(gè)樣品中包含多聚核苷酸或肽。
19.一種制備權(quán)利要求4所述陣列的方法，包括下列步驟(a)將含有生物大分子前體的液滴沉積到所述基片表面上有待形成特征的位點(diǎn)處，從而使得所述前體在所述位點(diǎn)處與所述表面相結(jié)合；(b)在每一個(gè)所述位點(diǎn)處重復(fù)進(jìn)行(a)步驟，使先前已結(jié)合的前體與隨后被沉積的前體相結(jié)合，直到所述陣列被制備出來(lái)；其中，在重復(fù)進(jìn)行(a)步驟之后，與所述陣列間區(qū)域相比，所述形成陣列的區(qū)域疏水性變得更小。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述基片表面包括與所述基片表面相結(jié)合的組合物，所述組合物既覆蓋所述陣列間區(qū)域，也覆蓋包括所述特征位點(diǎn)的所述形成陣列的區(qū)域；在步驟(a)中，所述組合物中的至少一種成分將所述生物大分子前體結(jié)合到所述表面上。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述組合物包括與所述基片表面相結(jié)合的不同類(lèi)型的分子，但是只有所述不同類(lèi)型分子的一個(gè)子集將生物大分子共價(jià)結(jié)合到所述特征內(nèi)部的所述表面上。
22.一種使用包含位于基片表面上的多個(gè)生物大分子陣列的陣列單元的方法，每個(gè)陣列都包含多個(gè)特征，并且所述陣列被陣列間表面區(qū)域分隔開(kāi)，其中，所述基片表面在承載陣列的連續(xù)區(qū)域上是物理上不間斷的，所述方法包括下列步驟向每一個(gè)陣列施加分離的液體樣品，從而使得多個(gè)分離的樣品同一時(shí)間存在于所述基片表面，同時(shí)通過(guò)所述陣列間區(qū)域保持分離。
23.一種使用權(quán)利要求4所述的陣列單元的方法，所述方法包括下列步驟閱讀與所述陣列單元相關(guān)聯(lián)的代碼，并從所述代碼或與所述代碼相鏈接的文件中獲得有關(guān)應(yīng)施加到所述陣列上的液體樣品體積的信息。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述液體樣品是水性樣品，其中包括保濕劑以保持水分。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種陣列單元，其包括承載著多個(gè)化學(xué)陣列的基片表面，每個(gè)陣列包括多個(gè)特征，并且每個(gè)陣列都被表面能突變區(qū)所包圍，以維持被施加到陣列上的分離的液體樣品之間的分離，其中基片表面在承載陣列的連續(xù)區(qū)域上是物理上不間斷的。本發(fā)明還提供了陣列的制備和使用方法。
文檔編號(hào)C40B40/02GK1521275SQ20041000048
公開(kāi)日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2004年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月31日
發(fā)明者埃里克·M·勒普魯, 埃里克 M 勒普魯, P 卡倫, 邁克爾·P·卡倫, J 佩克, 比爾·J·佩克 申請(qǐng)人:安捷倫科技有限公司