專利名稱：溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文庫構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文庫構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛存在于世界各地海水和海產(chǎn)品中，是海水養(yǎng)殖動物如魚、蝦、貝類等的主要致病菌，同時也是引起人食物中毒和急性腹瀉的重要病原菌。目前，大多數(shù)學(xué)者對該細(xì)菌的研究主要集中在外膜蛋白及抗溶藻弧菌獨特型單克隆抗體方面，然而，對于溶藻弧菌文庫構(gòu)建，功能基因，毒力因子的研究尚缺乏。
自1976年首例cDNA克隆問世以來，cDNA文庫構(gòu)建方法有了很大進(jìn)步，已成為真核生物分子生物學(xué)的基本手段，但在原核生物卻幾乎止步不前。這是因為細(xì)菌mRNA代謝快速高效，半衰期僅為幾分鐘，3′端poly(A)尾少、短和不穩(wěn)定，使得mRNA的純化和用oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄均存在較大困難，若沿用真核cDNA文庫構(gòu)建方法，即便是克隆成功，cDNA文庫也會存在大量的冗余和重復(fù)的信息，所獲得的多個大小不同克隆可能都來自同一基因不同狀態(tài)的mRNA。目前僅有胡子有等人利用oligo(dT)與poly(A)特異結(jié)合的特性從E.coli中純化出mRNA，用olio(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄，并用限制性顯示PCR技術(shù)(restriction display-PCR)，克隆了100多個基因片段，并對其中40個片段進(jìn)行了測序及分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文庫構(gòu)建方法。
為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是構(gòu)建步驟包括提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄、應(yīng)用RD-PCR技術(shù)擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄得到的雙鏈DNA、分子克隆及ESTs生物信息學(xué)5步方法。
所述構(gòu)建溶藻弧菌cDNA文庫方法如下(1)模板制備①取保存的溶藻弧菌菌株，平板劃線后28℃培養(yǎng)24小時，挑取單菌落轉(zhuǎn)移至100ml液態(tài)TSA培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)8小時，細(xì)菌的培養(yǎng)時間不宜過長，以8-10小時為佳，否者RNA提取效果不好，容易降解。測A600約為0.6；②總RNA的制備使用EZ spin column total RNA lsolation Kit(購于上海生工生物工程公司)試劑盒進(jìn)行，用BIO-TEK酶標(biāo)儀進(jìn)行定量，取2μLRNA進(jìn)行1.5％瓊脂糖電泳檢測，并對提取的總RNA用無RNase的DNase I進(jìn)行消化，以防痕量基因組DNA污染。mRNA的純化用Omega Biotek的E.Z.N.A mRNAEnrichment Kit，按說明書操作；(2)cDNA合成cDNA第一鏈合成按Superscript III(購于Invitragen公司)的說明書進(jìn)行，第二鏈的合成按照以下方法進(jìn)行，具體方法如下加入第一鏈產(chǎn)物2μL，10×大腸桿菌DNA聚合酶緩沖液(10×E.coli DNA polymeraseBuffer)30μL，大腸桿菌DNA聚合酶(E.coli DNA polymerase)12U，10mM dNTP 3μL，大腸桿菌RNA酶抑制劑(E.coli RNase H)120U，大腸桿菌DNA連接酶(E.coli DNA Ligase)100U，無RNA酶水(RNase free H2O)89μL后，輕輕攪拌，16℃，2小時，然后70℃加熱10分鐘，加入T4 DNA聚合酶(T4 DNA polymerase)20U，10mM dNTP 3μL，BSA 2μL，37℃反應(yīng)10分鐘，加入15μL EDTA(0.25mM)終止反應(yīng)。
(3)RD-PCR①取寡核苷酸片段SIP(500μg/ml)和SIR(330μg/ml)等體積于一PCR管內(nèi)混勻，在PCR儀上加熱至90℃5分鐘，隨后在30分鐘內(nèi)使其溫度逐漸降低到室，形成的接頭(SIP/SIR)經(jīng)分裝后于-20℃貯存?zhèn)溆?；②逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA2μL(約1μg)，加入Sau3A I 1.5μL，2μL 10×反應(yīng)緩沖液，于20μL總反應(yīng)體積中37℃酶切3小時，然后70℃10分鐘。然后取產(chǎn)物5μL和6μL接頭，用T4連接酶1μL，30μL總反應(yīng)體積，16℃連接3小時即可用于RD-PCR模板。取連接產(chǎn)物1μL，Taq聚合酶1μL(5U)，dNTP mixture 1μL，10×PCR緩沖液(10×PCR Buffer)5μL，配對的選擇引物(如MG和MA，濃度均為10umol/l)各取1μL，50μL總反應(yīng)體系進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件如下94℃變性5分鐘，然后94℃30秒，65℃30秒，72℃1分鐘，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。4種不同選則性引物MA、MG、MT、MC共有十種不同的組合，PCR分成10組進(jìn)行。若酶切加接頭連接產(chǎn)物直接做模板，PCR產(chǎn)物不理想，可先用通用引物擴(kuò)增，再以通用引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物做模板，再進(jìn)行選擇性PCR。
(4)分子克隆及分析①RD-PCR產(chǎn)物使用T載體連接，具體操作參見PMD18-T載體(購于大連寶生物工程有限公司)說明書。經(jīng)快速PCR鑒定，并經(jīng)小量培養(yǎng)陽性菌落后寄往上海英俊生物工程公司進(jìn)行測序；②測序結(jié)果使用BLASTX程序?qū)⑻幚砗蟮腅ST序列在蛋白質(zhì)水平上與NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(non-redundant protein database)進(jìn)行同源性比較。所有參數(shù)設(shè)置均使用默認(rèn)值。序列對齊分值(score)大于80且序列同一性大于35％的搜索結(jié)果認(rèn)為有生物學(xué)意義上的顯著相似性。挑選其中分值最高的蛋白質(zhì)作為相應(yīng)EST最有可能的翻譯產(chǎn)物所述一種構(gòu)建溶藻弧菌cDNA文庫方法，其性質(zhì)要點為(1)首次證明了在溶藻弧菌確實存在poly(A)尾，并應(yīng)用該特性使用oligo(dT)成功進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄；(2)首次報道提取溶藻弧菌總RNA時該細(xì)菌的培養(yǎng)時間不能超過8小時，否者降解現(xiàn)象嚴(yán)重；(3)首次報道溶藻弧菌III型分泌系統(tǒng)易位蛋白(translocation protein intype III secretion)III型分泌途徑分子伴侶EscU(Type III secretory pathway，component EscU)、趨藥性傳感器(putative chemotaxis transducer)、類絲氨酸蛋白酶(Secreted trypsin-like serine protease)四個與溶藻弧菌得力基因有關(guān)的基因片段；
鑒于原核生物細(xì)菌的特殊性質(zhì)，本發(fā)明采用oligo(dT)18為逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA，采用限制性顯示PCR(RD-PCR)技術(shù)從溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)克隆了100多個基因片段，構(gòu)建溶藻弧菌的cDNA文庫，并對其中的53個基因片段進(jìn)行了測序鑒定，通過生物信息學(xué)分析，利用表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)技術(shù)對溶藻弧菌基因進(jìn)行研究，獲得了一些與溶藻弧菌致病性有關(guān)的基因以及功能基因，這對于我們進(jìn)一步深入研究溶藻弧菌致病機(jī)理、制備弧菌工程疫苗、尋求弧菌病害防治新方法方面具有重要意義。
該溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文庫構(gòu)建方法，以溶藻弧菌為材料，用提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄、應(yīng)用RD-PCR技術(shù)擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄得到的雙鏈DNA、分子克隆及ESTs生物信息學(xué)等方法對該菌進(jìn)行研究。此方法具有質(zhì)量高，所篩選的基因片段重復(fù)性低，篩選基因片段效率高，目的性強(qiáng)等特點。該文庫應(yīng)用了RD-PCR技術(shù)，對欲克隆的基因片段進(jìn)行了擴(kuò)增，由于酶切后片段大小較均一，可以有效地避免PCR對短片的優(yōu)先擴(kuò)增，防止所構(gòu)建的cDNA文庫出現(xiàn)明顯偏向，在這點上優(yōu)于一般PCR介導(dǎo)的cDNA文庫構(gòu)建法。我們通過該方法克隆了100多個片段，并通過對克隆測序片段進(jìn)行EST序列分析，我們比對到有4個與溶藻弧菌毒力相關(guān)的基因序列。構(gòu)建溶藻弧菌cDNA文庫方法以及一些新的生物信息學(xué)分析結(jié)果其性質(zhì)要點是(1)首次證明了在溶藻弧菌確實存在poly(A)尾，并應(yīng)用該特性使用oligo(dT)成功進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄；(2)首次報道提取溶藻弧菌總RNA時該細(xì)菌的培養(yǎng)時間不能超過8小時，否者降解現(xiàn)象嚴(yán)重；(3)首次報道溶藻弧菌III型分泌系統(tǒng)易位蛋白(translocation protein intype III secretion)、III型分泌途徑分子伴侶EscU(Type III secretorypathway，component EscU)、趨藥性傳感器(putative chemotaxistransducer)、類絲氨酸蛋白酶(Secreted trypsin-like serine protease)四個與溶藻弧菌得力基因有關(guān)的基因片段；本發(fā)明對比其他文庫構(gòu)建方法的優(yōu)點在于(1)總結(jié)出提取總RNA時溶藻弧菌培養(yǎng)的最佳時間，為以后研究其他種類的弧菌提供一個時間參考。
(2)驗證了細(xì)菌中確實也存在poly(A)尾，這為在構(gòu)建細(xì)菌cDNA文庫時可以利用poly(A)尾與oligo(dT)特異結(jié)合的特性進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄提供一定的理論基礎(chǔ)。
(3)發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌III型分泌系統(tǒng)、III型分泌途徑分子伴侶EscU、趨藥性傳感器、類絲氨酸蛋白酶基因片段，為更好的研究該細(xì)菌的致病機(jī)理以及找到新藥的靶位點提供新的思路。
具體實施例方式本發(fā)明用下列實施例來進(jìn)一步說明。
實施例1(1)模板制備①取保存的溶藻弧菌菌株，平板劃線后28℃培養(yǎng)24小時，挑取單菌落轉(zhuǎn)移至100ml液態(tài)TSA培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)8小時，細(xì)菌的培養(yǎng)時間不宜過長，以8-10小時為佳，否者RNA提取效果不好，容易降解。測A600約為0.6；②總RNA的制備使用EZ spin column total RNA lsolation Kit(購于上海生工生物工程公司)試劑盒進(jìn)行，用BIO-TEK酶標(biāo)儀進(jìn)行定量，取2μLRNA進(jìn)行1.5％瓊脂糖電泳檢測，并對提取的總RNA用無RNase的DNase I進(jìn)行消化，以防痕量基因組DNA污染。mRNA的純化用Omega Biotek的E.Z.N.A mRNAEnrichment Kit，按說明書操作；(2)cDNA合成cDNA第一鏈合成按Superscript III(購于Invitragen公司)的說明書進(jìn)行，第二鏈的合成按照以下方法進(jìn)行，具體方法如下加入第一鏈產(chǎn)物2μL，10×大腸桿菌DNA聚合酶緩沖液(10×E.coli DNA polymerase Buffer)30μL，大腸桿菌DNA聚合酶(E.coli DNA polymerase)12U，10mM dNTP 3μL，大腸桿菌RNA抑制劑(E.coli RNase H)120U，大腸桿菌DNA連接酶(E.coliDNA Ligase)100U，無RNA酶水(RNase free H2O)89μL后，輕輕攪拌，16℃，2小時，然后70℃加熱10min，加入T4 DNA聚合酶(T4 DNA polymerase)20U，10mM dNTP 3μL，BSA 2μL，37℃反應(yīng)10min，加入15μL EDTA(0.25mM)終止反應(yīng)。
(3)RD-PCR①取寡核苷酸片段SIP(500μg/ml)和SIR(330μg/ml)等體積于一PCR管內(nèi)混勻，在PCR儀上加熱至90℃5分鐘，隨后在30分鐘內(nèi)使其溫度逐漸降低到室，形成的接頭(SIP/SIR)經(jīng)分裝后于-20℃貯存?zhèn)溆茫虎趯⒛孓D(zhuǎn)錄獲得的cDNA2μL(約1μg)，加入Sau3AI 1.5μL，2μL 10×反應(yīng)緩沖液，于20μL總反應(yīng)體積中37℃酶切3小時，然后70℃10分鐘。然后取產(chǎn)物5μL和6μL接頭，用T4連接酶1μL，30μL總反應(yīng)體積，16℃連接3小時即可用于RD-PCR模板。取連接產(chǎn)物1μL，Taq聚合酶1μL(5U)，dNTP mixture 1μL，10×PCR緩沖液(10×PCR Buffer)5μL，配對的選擇引物(如MG和MA，濃度均為10μmol/l)各取1μL，50總反應(yīng)體系進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件如下94℃變性5分鐘，然后94℃30秒，65℃30秒，72℃1分鐘，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。4種不同選則性引物MA、MG、MT、MC共有十種不同的組合，PCR分成10組進(jìn)行。若酶切加接頭連接產(chǎn)物直接做模板，PCR產(chǎn)物不理想，可先用通用引物擴(kuò)增，再以通用引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物做模板，再進(jìn)行選擇性PCR。
(4)分子克隆及分析②RD-PCR產(chǎn)物使用T載體連接，具體操作參見PMD18-T載體(購于大連寶生物工程有限公司)說明書。經(jīng)快速PCR鑒定，并經(jīng)小量培養(yǎng)陽性菌落后寄往上海英俊生物工程公司進(jìn)行測序；③測序結(jié)果使用BLASTX程序?qū)⑻幚砗蟮腅ST序列在蛋白質(zhì)水平上與NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(non-redundant protein database)進(jìn)行同源性比較。所有參數(shù)設(shè)置均使用默認(rèn)值。序列對齊分值(score)大于80且序列同一性大于35％的搜索結(jié)果認(rèn)為有生物學(xué)意義上的顯著相似性。挑選其中分值最高的蛋白質(zhì)作為相應(yīng)EST最有可能的翻譯產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文庫構(gòu)建方法，其特征是構(gòu)建步驟包括提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄、應(yīng)用RD-PCR技術(shù)擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄得到的雙鏈DNA、分子克隆及ESTs生物信息學(xué)5步方法。
2.據(jù)權(quán)力要求1所述的一種新的構(gòu)建溶藻弧菌cDNA文庫方法，其特征是該方法如下(1)模板制備①取保存的溶藻弧菌菌株，平板劃線后28℃培養(yǎng)24小時，挑取單菌落轉(zhuǎn)移至100ml液態(tài)TSA培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)8小時，細(xì)菌的培養(yǎng)時間不宜過長，以8-10小時為佳，否者RNA提取效果不好，容易降解，測A600約為0.6；②總RNA的制備使用EZ spin column total RNA lsolation Kit試劑盒進(jìn)行，用BIO-TEK酶標(biāo)儀進(jìn)行定量，取2μL RNA進(jìn)行1.5％瓊脂糖電泳檢測，并對提取的總RNA用無RNase的DNase I進(jìn)行消化，以防痕量基因組DNA污染，mRNA的純化用Omega Biotek的E.Z.N.A mRNA Enrichment Kit，按說明書操作；(2)cDNA合成cDNA第一鏈合成按Superscript III(購于Invitragen公司)的說明書進(jìn)行，第二鏈的合成按照以下方法進(jìn)行，具體方法如下加入第一鏈產(chǎn)物2μL，10×大腸桿菌DNA聚合酶緩沖液(10×E.coli DNA polymerase Buffer)30μL，大腸桿菌DNA聚合酶(E.coli DNA polymerase)12U，10mM dNTP3μL，大腸桿菌RNA酶抑制劑(E.coli RNase H)120U，大腸桿菌DNA連接酶(E.coli DNA Ligase)100U，無RNA酶水(RNase free H2O)89μL后，輕輕攪拌，16℃，2小時，然后70℃加熱10分鐘，加入T4 DNA聚合酶(T4 DNA polymerase)20U，10mM dNTP 3μL，BSA 2μL，37℃反應(yīng)10分鐘，加入15μL EDTA(0.25mM)終止反應(yīng)；(3)RD-PCR①取寡核苷酸片段SIP(500μg/ml)和SIR(330μg/ml)等體積于一PCR管內(nèi)混勻，在PCR儀上加熱至90℃5分鐘，隨后在30分鐘內(nèi)使其溫度逐漸降低到室，形成的接頭(SIP/SIR)經(jīng)分裝后于-20℃貯存?zhèn)溆?；②逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA2μL(約1μg)，加入Sau3A I1.5μL，2μL10×反應(yīng)緩沖液，于20μL總反應(yīng)體積中37℃酶切3小時，然后70℃10分鐘。然后取產(chǎn)物5μL和6μL接頭，用T4連接酶1μL，30μL總反應(yīng)體積，16℃連接3小時即可用于RD-PCR模板。取連接產(chǎn)物1μL，Taq聚合酶1μL(5U)，dNTP mixture 1μL，10×PCR緩沖液(10×PCR Buffer) 5μL，配對的選擇引物(如MG和MA，濃度均為10umol/l)各取1μL，50μL總反應(yīng)體系進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件如下94℃變性5分鐘，然后94℃30秒，65℃30秒，72℃1分鐘，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。4種不同選則性引物MA、MG、MT、MC共有十種不同的組合，PCR分成10組進(jìn)行。若酶切加接頭連接產(chǎn)物直接做模板，PCR產(chǎn)物不理想，可先用通用引物擴(kuò)增，再以通用引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物做模板，再進(jìn)行選擇性PCR；(4)分子克隆及分析①RD-PCR產(chǎn)物使用T載體連接，具體操作參見PMD18-T載體(購于大連寶生物工程有限公司)說明書。經(jīng)快速PCR鑒定，并經(jīng)小量培養(yǎng)陽性菌落后寄往上海英俊生物工程公司進(jìn)行測序；②測序結(jié)果使用BLASTX程序?qū)⑻幚砗蟮腅ST序列在蛋白質(zhì)水平上與NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(non-redundant protein database)進(jìn)行同源性比較。所有參數(shù)設(shè)置均使用默認(rèn)值。序列對齊分值(score)大于80且序列同一性大于35％的搜索結(jié)果認(rèn)為有生物學(xué)意義上的顯著相似性，挑選其中分值最高的蛋白質(zhì)作為相應(yīng)EST最有可能的翻譯產(chǎn)物。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述一種構(gòu)建溶藻弧菌cDNA文庫方法，其特征是其性質(zhì)要點為(1)首次證明了在溶藻弧菌確實存在poly(A)尾，并應(yīng)用該特性使用oligo(dT)成功進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄；(2)首次報道提取溶藻弧菌總RNA時該細(xì)菌的培養(yǎng)時間不能超過8小時，否者將解現(xiàn)象嚴(yán)重；(3)首次報道溶藻弧菌III型分泌系統(tǒng)易位蛋白(translocation protein intype III secretion)III型分泌途徑分子伴侶EscU(Type III secretory pathway，component EscU)、趨藥性傳感器(putative chemotaxis transducer)、類絲氨酸蛋白酶(Secreted trypsin-like serine protease)四個與溶藻弧菌得力基因有關(guān)的基因片段。
全文摘要
一種溶藻弧菌poly(A)化mRNA的cDNA文庫構(gòu)建方法，以溶藻弧菌為材料，用提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄、應(yīng)用RD－PCR技術(shù)擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄得到的雙鏈DNA、分子克隆及ESTs生物信息學(xué)等方法對該菌進(jìn)行研究。此方法具有質(zhì)量高，所篩選的基因片段重復(fù)性低，篩選基因片段效率高，目的性強(qiáng)等特點。該文庫應(yīng)用了RD－PCR技術(shù)，對欲克隆的基因片段進(jìn)行了擴(kuò)增，由于酶切后片段大小較均一，可以有效地避免PCR對短片的優(yōu)先擴(kuò)增，防止所構(gòu)建的cDNA文庫出現(xiàn)明顯偏向，在這點上優(yōu)于一般PCR介導(dǎo)的cDNA文庫構(gòu)建法。該文庫可以作為深入研究溶藻弧菌毒力因子以及致病機(jī)理的基礎(chǔ)；能為研制新型基因工程疫苗提供新的思路。
文檔編號C40B50/06GK101021015SQ20061012434
公開日2007年8月22日 申請日期2006年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日
發(fā)明者吳灶和, 王蓓, 簡紀(jì)常, 魯義善 申請人:廣東海洋大學(xué)