專利名稱：肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽及其體外篩選和鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝癌細胞特異性內(nèi)在化的短肽及其體外篩選和鑒定，屬腫瘤細胞特異性內(nèi)在化短肽的篩選和鑒定的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝癌因其極高的死亡率嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來，隨著對腫瘤生物學(xué)和細胞表面受體研究的深入，導(dǎo)向治療顯示出良好的治療效果，并逐步發(fā)展成為一個重要的腫瘤治療領(lǐng)域。導(dǎo)向治療指利用特異性能作用于腫瘤組織或器官的導(dǎo)向分子作為藥物載體，將藥物導(dǎo)向腫瘤，有效地提高藥物導(dǎo)向的特異性，實現(xiàn)治療的針對性和安全性。目前普遍采用的導(dǎo)向分子主要是單克隆抗體及其片段，近年來由抗體相關(guān)分子構(gòu)建的導(dǎo)向治療藥物取得了巨大的成功。然而由于單抗分子所具有的分子量大、免疫原性高、腫瘤浸潤能力差等缺點，大大阻礙了相關(guān)治療藥物在臨床治療領(lǐng)域的發(fā)展。
針對單抗分子具有上述這些缺點，越來越多的研究者將目光投向小分子的多肽類靶向分子，由于多肽分子具有分子量小的特點，從根本上解決了免疫原性高和腫瘤浸潤能力差的問題，成為目前發(fā)展的熱點。噬菌體展示技術(shù)(phage display technique)是利用基因操作手段，將編碼選定多肽的外源DNA片段與絲狀噬菌體的外殼蛋白基因進行適當(dāng)?shù)闹亟M，使重組后的外源DNA片段隨同噬菌體的外殼蛋白基因一起被轉(zhuǎn)錄和翻譯，使外源DNA編碼的多肽與噬菌體外殼蛋白形成的融合蛋白表達展示在病毒的表面。該外源肽仍能保留其抗原特異性和生物活性，且融合表達不影響噬菌體的繁殖，因此可對該外源多肽進行體外篩選。
傳統(tǒng)的篩選技術(shù)通常直接針對腫瘤細胞特異性蛋白或者腫瘤細胞表面進行篩選，所得到的導(dǎo)向分子也是與腫瘤細胞表面相結(jié)合，雖然解決了局部提高治療藥物濃度的作用，但是并不能有效地提高治療藥物對腫瘤細胞的進入問題，而大部分藥物都需要進入到細胞內(nèi)部以后才能夠最好地發(fā)揮作用。因此對具有內(nèi)在化能力的特異性結(jié)合肽的篩選具有十分重要的意義。
用噬菌體展示庫篩選內(nèi)在化抗體，就是通過噬菌體展示庫與靶細胞相互作用一段時間，啟動內(nèi)在化途徑，通過體外篩選直接篩選出能與細胞表面受體結(jié)合并內(nèi)在化的噬菌體表達短肽。本發(fā)明通過體外篩選技術(shù)篩選到4種與肝癌細胞BEL-7404特異性結(jié)合的噬菌體短肽，并通過有效的方法對噬菌體短肽進行鑒定，鑒定到短肽可以內(nèi)在化。因此，在肝癌的治療和診斷中有著潛在的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是公開4種肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽，其特征在于，所述的短肽的氨基酸結(jié)構(gòu)具有如下序列1.DLNYFTLSSKRE；2.DLNYLTLSSKRE；3.DLNYHARSYKRE；4.NLKLLDSQDWDG。
此類短肽不僅僅具有特異性結(jié)合肝癌細胞的能力，還可以通過相關(guān)受體的介導(dǎo)有效地進入到細胞內(nèi)部，可以大大提高腫瘤治療藥物對肝癌的特異性殺傷作用。
本發(fā)明的另一個目的是推出一種體外篩選肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽的方法。用該法篩選到的內(nèi)在化短肽可將藥物定向運輸?shù)礁伟┘毎?，更好地發(fā)揮藥物的藥理作用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案。通過噬菌體表面展示肽庫與靶細胞的相互作用，啟動內(nèi)在化途徑，體外篩選能與細胞表面受體結(jié)合的內(nèi)在化短肽。
現(xiàn)詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
一種體外篩選肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽的方法，其特征在于一、所需材料
噬菌體表面展示肽庫隨機12肽噬菌體展示文庫(Ph.D.12TMPhage Display PeptideLibrary Kit)購自美國New England Biolabs公司，其中噬菌體的滴度為1.5×1013pfu/ml，多樣性為2.7×109，宿主菌為E.coli ER2738；細胞人肝癌細胞BEL-7404和正常人肝細胞HL-7702購自上海中科院細胞庫；關(guān)鍵試劑枯草桿菌蛋白酶和氯喹購自FLUKA公司；PBS每升溶液中含130mM NaCl，7mM Na2HPO4-12H2O，3mMNaH2PO4，pH 7.5；TBS每升溶液中含50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5；細胞裂解液2％w/v的去氧膽酸鈉，10mMTris-HCl，2mM EDTA，pH 8.0；蛋白酶抑制劑每毫升中含有PMSF 100mM、Aprotinin 15uM、Leupeptin 100μM、Bestatin 100μM、Pepstain A 100μM、E-64 80μM溶解在DMSO中；二、內(nèi)在化短肽的體外篩選，操作步驟第一步 將10μl上述的肽庫加入含100μM氯喹和10％CBS2ml的1640培養(yǎng)基中，室溫孵育1小時；第二步向體外培養(yǎng)至80％聚合度的人肝癌細胞BEL-7404的培養(yǎng)瓶內(nèi)加入2ml含100μM氯喹和10％CBS的1640培養(yǎng)基，37℃孵育30分鐘；第三步將經(jīng)第一步處理的2ml肽庫加入經(jīng)第二步處理的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃孵育2小時；第四步將所述的培養(yǎng)瓶放冰上5分鐘，后續(xù)的操作都在4℃下進行，用2ml含Mg2+和Ca2+的PBS清洗細胞2次，再用2ml PBS清洗細胞6次，每次都是3分鐘，再用TBST清洗細胞1～4次，TBST的配方為TBS中加入0.05％v/vTween-20；
第五步加入含有枯草桿菌蛋白酶3mg/ml的TBS與表面結(jié)合有噬菌體的腫瘤細胞孵育45分鐘，降解與細胞表面結(jié)合的噬菌體，用含有0.1％的乙二胺四乙酸二鈉溶液使細胞重懸，1500rpm離心10分鐘，離心收集得到單細胞懸液，最后加入5ml的含有蛋白酶抑制劑的PBS孵育15分鐘，終止酶的活性；第六步對經(jīng)第五步處理后的溶液進行1500rpm離心，時間為10分鐘，收集細胞，用PBS清洗，重懸于200μl的細胞裂解液中，振蕩離心管，室溫孵育30分鐘，加入50μM的MgCl2到混合物中，中和裂解緩沖液中的EDTA并幫助侵染，回收后的溶液留5μl測滴度，200μl保存，其余的噬菌體侵染大腸桿菌擴增并測滴度；第七步為除去能夠和正常肝細胞結(jié)合的噬菌體，選擇聚合度達到80％的生長狀態(tài)良好的HL-7702，用PBS清洗3次，洗掉未貼壁的細胞，加入第一次篩選的噬菌體肽10μl，內(nèi)含噬菌體約1011個，溫育1小時，吸取上清，所得到的未與正常肝細胞結(jié)合的噬菌體就是所需的肝癌細胞特異性內(nèi)在化噬菌體，放入4℃冰箱保存，測定噬菌體的滴度，至此，第一輪體外篩選完成；整個篩選過程共包括三輪，在第二輪開始時加入第一輪篩選后擴增的噬菌體，而第三輪采用的是第二輪篩選后擴增的噬菌體，第三輪篩選后的噬菌體含有肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽，從第二輪和第三輪篩選后測滴度的平板上各挑選了20個藍斑進行測序并鑒定。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種鑒定肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案。
一種鑒定肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽的方法，其特征在于一、所需材料上述的體外篩選得到的噬菌體單克隆，宿主菌為E.coli ER2738；細胞人肝癌細胞BEL-7404、BEL-7402、正常人肝細胞HL-7702、正常人胚腎細胞293購自上海中科院細胞庫；
關(guān)鍵試劑兔抗噬菌體M13抗血清由澳大利亞CSIRO動物健康研究所(Australia Animal Health Laboratory)王林發(fā)研究員惠贈；HRP-兔抗M13抗體購自Sigma公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG購自上海華美公司；枯草桿菌蛋白酶和氯喹購自FLUKA公司；PBST05PBS中加入0.05％v/vTween-20；PBS-S含0.1％的皂角苷的PBS；PBS-SB含1％w/v的BSA的PBS-S；細胞裂解液50mMTris-HCl，150mMNaCl，0.2g/LNaN3，1g/L SDS，5g/L脫氧膽酸鈉；D-Hank’sNaCl 8.00g/L，KCl 0.40g/L，Na2HPO4-12H2O 0.12g/L，KH2PO4 0.06g/L，右旋葡萄糖(D-Glucose)1.00g/L，NaHCO3 0.35g/L；蛋白酶抑制劑每毫升中含有PMSF 100mM、Aprotinin 15μM、Leupeptin 100μM、Bestatin 100μM、Pepstain A 100μM、E-64 80μM溶解在DMSO中；二、肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽的鑒定方法有以下四步，具體操作步驟第一步 細胞ELISA鑒定噬菌體單克隆與細胞的結(jié)合力選擇生長狀態(tài)良好的人肝癌細胞BEL-7404消化下來，記數(shù)后將細胞懸液，濃度調(diào)至5×105cells/ml，分別加入96孔細胞培養(yǎng)板，細胞板每孔加100μl細胞懸液，37℃細胞培養(yǎng)箱中過夜，使細胞貼壁，D-Hanks緩沖液清洗細胞，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1小時，每孔加封阻液100μl，封阻液的配方為PBST05中加入4％的脫脂奶粉，37℃封阻1小時，每孔用PBST05洗板，反復(fù)3次，每孔加噬菌體單克隆1010個，同樣數(shù)量的野生型噬菌體作陰性對照，不加噬菌體克隆做空白對照，4℃溫育2小時，同上洗板，每孔加兔抗噬菌體抗體100μl，兔抗噬菌體M13抗體用所述的封阻液以1∶1000的重量比稀釋，37℃溫育1.5小時；洗板，每孔再加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體100μl，羊抗兔酶標(biāo)抗體用所述的封阻液以以1∶2500的重量比稀釋，37℃溫育1小時，洗板，每孔加OPD底物顯色液，37℃顯色10～15分鐘，每孔加酶終止液2M H2SO450μl，終止顯色，酶標(biāo)儀490nm波長讀數(shù)；第二步競爭ELISA鑒定噬菌體單克隆與細胞的結(jié)合力取一瓶生長狀態(tài)良好的BEL-7404腫瘤細胞，用胰酶消化下來，用PBS清洗幾遍，加入適量的蛋白酶抑制劑后放入冰盒內(nèi)作用1.5小時，使細胞充分裂解，裂解細胞獲得的蛋白直接于4℃進行12000rpm高速離心1.5小時，獲得的上清即為腫瘤細胞膜蛋白溶液，將抽提的膜蛋白以不同的稀釋度1∶2，1∶4，1∶20，1∶50，1∶100，1∶200，4℃過夜包板，取生長狀態(tài)良好的細胞轉(zhuǎn)到96孔板內(nèi)，在有膜蛋白的孔內(nèi)加入噬菌體單克隆，每孔的加入量約為1010個與膜蛋白37℃孵育1小時，取上清加到有細胞的96孔板內(nèi)，方法與第一步的操作完全相同；第三步免疫熒光檢測噬菌體肽的內(nèi)在化在預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中每孔加入105個細胞，過夜培養(yǎng)，用D-Hank’s清洗掉未貼壁的細胞，細胞和單克隆都預(yù)先與含100uM氯喹的培養(yǎng)基37℃預(yù)先孵育30分鐘，將噬菌體單克隆加入孔內(nèi)，37℃作用2小時，用冷的PBST05洗三次，每次5分鐘，用含1％BSA和pH2.2的0.1μM甘氨酸-HCL洗2次，每次5分鐘，再用冷的PBST05洗三次，每次5分鐘，細胞用4％的多聚甲醛37℃固定15分鐘，用PBS-S孵育15分鐘，增加細胞的滲透性，用PBS-SB封阻15分鐘，用含0.1％兔抗噬菌體M13 IgG的PBS-SB 37℃孵育1.5小時，PBST清洗4次，與FITC共軛結(jié)合的含羊抗兔抗體IgG的PBS-B以稀釋37℃作用1小時，羊抗兔抗體IgG與PBS-B的重量比為1∶30，PBST清洗4次，用緩沖甘油封片，將玻片倒扣在玻璃板上，熒光顯微鏡檢測；第四步 流式細胞儀定量檢測噬菌體肽的內(nèi)在化待小瓶細胞長滿，加入109個單克隆到培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃作用2小時，同時設(shè)對照加M13，空白，原庫，正常細胞，為阻止進一步內(nèi)吞，培養(yǎng)瓶放冰上5分鐘，倒掉上清，PBST清洗3次，TBST清洗3次，加入含枯草桿菌蛋白酶1.5mg/ml的TBS 1ml，與細胞孵育15分鐘，降解細胞表面結(jié)合的噬菌體，用滴管將細胞吹打下來，得單細胞懸液，轉(zhuǎn)到道夫管內(nèi)，1000rpm離心7分鐘，去上清，PBST清洗2次，加入4％多聚甲醛100μl，37℃固定15分鐘，PBST清洗2次，加含3％BSA和0.1％皂素的PBS，37℃固定30分鐘，PBST清洗2次，加入兔抗噬菌體M13抗體IgG，37℃作用1.5小時，兔抗噬菌體M13抗血清用所述的封阻液以1∶1000的重量比稀釋，PBST清洗2次，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，37℃作用1小時，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體與PBS-B的重量比為1∶30，PBST清洗2次，上流式細胞儀檢測熒光強度。
與背景技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點特異性高，效果好的特點，尤其是多肽所具有的內(nèi)在化能力，對于日后對腫瘤藥物在癌癥部位的有效載運具有十分重要的意義。


圖1BEL-7404對噬菌體隨機12肽庫的篩選和富集。
圖2為了鑒定噬菌體單克隆與肝癌細胞BEL-7404的結(jié)合力強弱，將噬菌體單克隆與肝癌細胞孵育，通過OD值來檢測。實驗結(jié)果如圖2，說明4個單克隆相比M13都與肝癌細胞有很強的結(jié)合力，并且1號克隆相比其他的克隆與肝癌細胞的結(jié)合能力要更強一些。
圖3細胞ELISA鑒定噬菌體單克隆的結(jié)果，為了鑒定噬菌體單克隆與肝癌細胞BEL-7404的結(jié)合力強弱，將噬菌體單克隆與肝癌細胞孵育，通過OD值來檢測。實驗結(jié)果如圖2，說明4個單克隆相比M13都與肝癌細胞有很強的結(jié)合力，并且1號克隆相比其他的克隆與肝癌細胞的結(jié)合能力要更強一些。
圖4圖A、D、G、J分別為4種克隆與肝癌細胞BEL-7404孵育的結(jié)果，而B、E、H、K分別是4種克隆與正常肝細胞HL-7702孵育的結(jié)果C、F是原庫和M13野生型噬菌體與肝癌細胞BEL-7404孵育的結(jié)果；K、L是1號克隆與肝癌細胞BEL-7402和正常人胚腎細胞293孵育的結(jié)果。
圖5共4行，每行的三張圖片分別是4個克隆與肝癌細胞BEL-7404孵育，加入內(nèi)在化抑制劑秋水仙素、蔗糖之后的熒光圖片。
圖6A-F六幅圖片分別是噬菌體與肝癌細胞BEL-7404在不同孵育時間(5分鐘，10分鐘，15分鐘，30分鐘，1小時，2小時)孵育的結(jié)果。
圖7不同細胞與1號克隆孵育，通過流式細胞檢測熒光強度比較。
圖8不同克隆與肝癌細胞BEL-7404孵育結(jié)果。
具體實施例方式
在以上的發(fā)明內(nèi)容中，已詳細公開了體外篩選和鑒定肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽的方法的具體操作步驟，這部分的內(nèi)容就是實施例。為避免行文重復(fù)，此處就不再贅述。
權(quán)利要求
1.4種肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽，其特征在于，所述的短肽的氨基酸結(jié)構(gòu)具有如下序列1.DLNYFTLSSKRE；2.DLNYLTLSSKRE；3.DLNYHARSYKRE；4.NLKLLDSQDWDG。
2.一種體外篩選肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽的方法，所述的肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽就是權(quán)利要求1所述的肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽，其特征在于一、所需材料噬菌體表面展示肽庫隨機12肽噬菌體展示文庫(Ph.D.12TMPhage Display PeptideLibrary Kit)購自美國New England Biolabs公司，其中噬菌體的滴度為1.5×1013pfu/ml，多樣性為2.7×109，宿主菌為E.coli ER2738；細胞人肝癌細胞BEL-7404和正常人肝細胞HL-7702購自上海中科院細胞庫；關(guān)鍵試劑枯草桿菌蛋白酶和氯喹購自FLUKA公司；PBS每升溶液中含130mM NaCl，7mM Na2HPO4-12H2O，3mMNaH2PO4，pH 7.5；TBS每升溶液中含50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5；細胞裂解液2％w/v的去氧膽酸鈉，10mMTris-HCl，2mM EDTA，pH 8.0；蛋白酶抑制劑每毫升中含有PMSF 100mM、Aprotinin 15uM、Leupeptin 100μM、Bestatin 100μM、Pepstain A 100μM、E-64 80μM溶解在DMSO中；二、內(nèi)在化短肽的體外篩選，操作步驟第一步 將10μl上述的肽庫加入含100μM氯喹和10％CBS2ml的1640培養(yǎng)基中，室溫孵育1小時；第二步 向體外培養(yǎng)至80％聚合度的人肝癌細胞BEL-7404的培養(yǎng)瓶內(nèi)加入2ml含100μM氯喹和10％CBS的1640培養(yǎng)基，37℃孵育30分鐘；第三步 將經(jīng)第一步處理的2ml肽庫加入經(jīng)第二步處理的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃孵育2小時；第四步 將所述的培養(yǎng)瓶放冰上5分鐘，后續(xù)的操作都在4℃下進行，用2ml含Mg2+和Ca2+的PBS清洗細胞2次，再用2ml PBS清洗細胞6次，每次都是3分鐘，再用TBST清洗細胞1～4次，TBST的配方為TBS中加入0.05％v/vTween-20；第五步 加入含有枯草桿菌蛋白酶3mg/ml的TBS與表面結(jié)合有噬菌體的腫瘤細胞孵育45分鐘，降解與細胞表面結(jié)合的噬菌體，用含有0.1％的乙二胺四乙酸二鈉溶液使細胞重懸，1500rpm離心10分鐘，離心收集得到單細胞懸液，最后加入5ml的含有蛋白酶抑制劑的PBS孵育15分鐘，終止酶的活性；第六步 對經(jīng)第五步處理后的溶液進行1500rpm離心，時間為10分鐘，收集細胞，用PBS清洗，重懸于200μl的細胞裂解液中，振蕩離心管，室溫孵育30分鐘，加入50μM的MgCl2到混合物中，中和裂解緩沖液中的EDTA并幫助侵染，回收后的溶液留5μl測滴度，200μl保存，其余的噬菌體侵染大腸桿菌擴增并測滴度；第七步 為除去能夠和正常肝細胞結(jié)合的噬菌體，選擇聚合度達到80％的生長狀態(tài)良好的HL-7702，用PBS清洗3次，洗掉未貼壁的細胞，加入第一次篩選的噬菌體肽10μl，內(nèi)含噬菌體約1011個，溫育1小時，吸取上清，所得到的未與正常肝細胞結(jié)合的噬菌體就是所需的肝癌細胞特異性內(nèi)在化噬菌體，放入4℃冰箱保存，測定噬菌體的滴度，至此，第一輪體外篩選完成；整個篩選過程共包括三輪，在第二輪開始時加入第一輪篩選后擴增的噬菌體，而第三輪采用的是第二輪篩選后擴增的噬菌體，第三輪篩選后的噬菌體含有肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽，從第二輪和第三輪篩選后測滴度的平板上各挑選了20個藍斑進行測序并鑒定。
3.一種鑒定肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽的方法，其特征在于一、所需材料上述的體外篩選得到的噬菌體單克隆，宿主菌為E.coli ER2738；細胞人肝癌細胞BEL-7404、BEL-7402、正常人肝細胞HL-7702、正常人胚腎細胞293購自上海中科院細胞庫；關(guān)鍵試劑兔抗噬菌體M13抗血清由澳大利亞CSIRO動物健康研究所(Australia Animal Health Laboratory)王林發(fā)研究員惠贈；HRP-兔抗M13抗體購自Sigma公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG購自上海華美公司；枯草桿菌蛋白酶和氯喹購自FLUKA公司；PBST05PBS中加入0.05％v/vTween-20；PBS-S含0.1％的皂角苷的PBS；PBS-SB含1％w/v的BSA的PBS-S；細胞裂解液50mMTris-HCl，150mMNaCl，0.2g/LNaN3，1g/LSDS，5g/L脫氧膽酸鈉；D-Hank’sNaCl 8.00g/L，KCl 0.40g/L，Na2HPO4-12H2O 0.12g/L，KH2PO40.06g/L，右旋葡萄糖(D-Glucose)1.00g/L，NaHCO30.35g/L；蛋白酶抑制劑每毫升中含有PMSF 100mM、Aprotinin 15μM、Leupeptin 100μM、Bestatin 100μM、Pepstain A 100μM、E-64 80μM溶解在DMSO中；二、肝癌細胞特異性內(nèi)在化短肽的鑒定方法有以下四步，具體操作步驟第一步 細胞ELISA鑒定噬菌體單克隆與細胞的結(jié)合力選擇生長狀態(tài)良好的人肝癌細胞BEL-7404消化下來，記數(shù)后將細胞懸液，濃度調(diào)至5×105cells/ml，分別加入96孔細胞培養(yǎng)板，細胞板每孔加100μl細胞懸液，37℃細胞培養(yǎng)箱中過夜，使細胞貼壁，D-Hanks緩沖液清洗細胞，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1小時，每孔加封阻液100μl，封阻液的配方為PB ST05中加入4％的脫脂奶粉，37℃封阻1小時，每孔用PBST05洗板，反復(fù)3次，每孔加噬菌體單克隆1010個，同樣數(shù)量的野生型噬菌體作陰性對照，不加噬菌體克隆做空白對照，4℃溫育2小時，同上洗板，每孔加兔抗噬菌體抗體100μl，兔抗噬菌體M13抗體用所述的封阻液以1∶1000的重量比稀釋，37℃溫育1.5小時；洗板，每孔再加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體100μl，羊抗兔酶標(biāo)抗體用所述的封阻液以以1∶2500的重量比稀釋，37℃溫育1小時，洗板，每孔加OPD底物顯色液，37℃顯色10～15分鐘，每孔加酶終止液2M H2SO450μl，終止顯色，酶標(biāo)儀490nm波長讀數(shù)；第二步 競爭ELISA鑒定噬菌體單克隆與細胞的結(jié)合力取一瓶生長狀態(tài)良好的BEL-7404腫瘤細胞，用胰酶消化下來，用PBS清洗幾遍，加入適量的蛋白酶抑制劑后放入冰盒內(nèi)作用1.5小時，使細胞充分裂解，裂解細胞獲得的蛋白直接于4℃進行12000rpm高速離心1.5小時，獲得的上清即為腫瘤細胞膜蛋白溶液，將抽提的膜蛋白以不同的稀釋度1∶2，1∶4，1∶20，1∶50，1∶100，1∶200，4℃過夜包板，取生長狀態(tài)良好的細胞轉(zhuǎn)到96孔板內(nèi)，在有膜蛋白的孔內(nèi)加入噬菌體單克隆，每孔的加入量約為1010個與膜蛋白37℃孵育1小時，取上清加到有細胞的96孔板內(nèi)，方法與第一步的操作完全相同；第三步 免疫熒光檢測噬菌體肽的內(nèi)在化在預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中每孔加入105個細胞，過夜培養(yǎng)，用D-Hank’s清洗掉未貼壁的細胞，細胞和單克隆都預(yù)先與含100uM氯喹的培養(yǎng)基37℃預(yù)先孵育30分鐘，將噬菌體單克隆加入孔內(nèi)，37℃作用2小時，用冷的PBST05洗三次，每次5分鐘，用含1％BSA和pH2.2的0.1μM甘氨酸-HCL洗2次，每次5分鐘，再用冷的PBST05洗三次，每次5分鐘，細胞用4％的多聚甲醛37℃固定15分鐘，用PBS-S孵育15分鐘，增加細胞的滲透性，用PBS-SB封阻15分鐘，用含0.1％兔抗噬菌體M13 IgG的PBS-SB 37℃孵育1.5小時，PBST清洗4次，與FITC共軛結(jié)合的含羊抗兔抗體IgG的PBS-B以稀釋37℃作用1小時，羊抗兔抗體IgG與PBS-B的重量比為1∶30，PBST清洗4次，用緩沖甘油封片，將玻片倒扣在玻璃板上，熒光顯微鏡檢測；第四步流式細胞儀定量檢測噬菌體肽的內(nèi)在化待小瓶細胞長滿，加入109個單克隆到培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃作用2小時，同時設(shè)對照加M13，空白，原庫，正常細胞，為阻止進一步內(nèi)吞，培養(yǎng)瓶放冰上5分鐘，倒掉上清，PBST清洗3次，TBST清洗3次，加入含枯草桿菌蛋白酶1.5mg/ml的TBS 1ml，與細胞孵育15分鐘，降解細胞表面結(jié)合的噬菌體，用滴管將細胞吹打下來，得單細胞懸液，轉(zhuǎn)到道夫管內(nèi)，1000rpm離心7分鐘，去上清，PBST清洗2次，加入4％多聚甲醛100μl，37℃固定15分鐘，PBST清洗2次，加含3％BSA和0.1％皂素的PBS，37℃固定30分鐘，PBST清洗2次，加入兔抗噬菌體M 13抗體IgG，37℃作用1.5小時，兔抗噬菌體M 13抗血清用所述的封阻液以1∶1000的重量比稀釋，PBST清洗2次，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，37℃作用1小時，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體與PBS-B的重量比為1∶30，PBST清洗2次，上流式細胞儀檢測熒光強度。
全文摘要
本發(fā)明涉及肝癌細胞特異性內(nèi)在化的短肽以及其體外篩選和鑒定，屬腫瘤細胞特異性內(nèi)在化短肽的篩選和鑒定的技術(shù)領(lǐng)域。以肝癌細胞BEL－7404作為篩選靶細胞，對噬菌體展示隨機12肽庫進行親和淘選。經(jīng)3輪淘選，隨機挑選20個噬菌斑進行了擴增和測序，推導(dǎo)隨機多肽的氨基酸序列。經(jīng)細胞ELISA、免疫熒光、流式細胞術(shù)等方法進一步鑒定噬菌體克隆與肝癌細胞的結(jié)合力以及內(nèi)在化的效果。通過對陽性克隆的測序和序列比較分析，得到4種不同的序列，都有良好的與肝癌細胞的結(jié)合力；篩選到的單克隆可內(nèi)在化進入細胞。通過對噬菌體隨機肽庫的篩選，得到可與肝癌細胞BEL－7404結(jié)合和可內(nèi)在化的噬菌體短肽，為肝癌的治療提供進一步的理論基礎(chǔ)。
文檔編號C40B30/06GK101033251SQ200610148050
公開日2007年9月12日 申請日期2006年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月27日
發(fā)明者錢旻, 杜冰, 李晶, 汪磊 申請人:華東師范大學(xué)