專利名稱：：產(chǎn)氣腸桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新菌種篩選
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說，涉及一種產(chǎn)氣腸桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鐵元素在地殼中的平均含量為5.6%，是地殼中豐度排名第二的金屬。鐵在自然環(huán)境中通常以難溶性Fe(III)氧化物的形式存在，鐵的還原是由特定微生物介導(dǎo)的酶促反應(yīng)，具有鐵還原能力的細(xì)菌是鐵氧化物還原的動(dòng)力。研究表明，鐵還原反應(yīng)不僅影響鐵的生物地球化學(xué)循環(huán)，而且參與多種土壤環(huán)境過程，包括土壤潛育化過程，營(yíng)養(yǎng)元素(如P、K、Ca、Mg等)與微量金屬元素的遷移釋放，有機(jī)污染物的厭氧降解，金屬的還原解毒以及抑制甲烷排放等，具有廣泛的應(yīng)用前景。異化鐵還原(DissimilatoryIronReduction)是指微生物通過呼吸作用將電子轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外的鐵氧化物表面，將Fe(III)還原成Fe(II)的過程。與同化作用不同的是，異化鐵還原過程中的還原產(chǎn)物Fe(II)積聚于細(xì)胞外，不作為細(xì)胞成分進(jìn)入胞內(nèi)。鐵還原細(xì)菌是指能通過氧化電子供體偶聯(lián)還原Fe(ni)，并從中獲得能量的微生物。1987年Lovley首次在淡水沉積物中發(fā)現(xiàn)具有異化鐵還原能力的金屬還原地桿菌(GeWflc化r附Wfl仏Ve^ceraGS15)。目前，已經(jīng)有100多株鐵還原細(xì)菌被分離純化，主要分布于地桿菌屬(GeWfl"^^.).希瓦氏菌屬(5Tewfl"e〃fl脫硫桿菌屬(Z)^M訴to^flcfm'w附取入脫硫弧菌屬(D^^/om/cra^/m取)等幾個(gè)屬。但這些具有鐵還原活性的菌株尚存在以下缺陷1)大多數(shù)菌株只能在嚴(yán)格厭氧環(huán)境中生存，不利于大規(guī)模生產(chǎn)與實(shí)際應(yīng)用；2)菌株的電子供體利用譜較窄，只能利用乙酸、乳酸等小分子量有機(jī)物作為電子供體，不能利用葡萄糖、蔗糖等分子量較大的有機(jī)物，對(duì)實(shí)際應(yīng)用的環(huán)境要求相對(duì)較高。產(chǎn)氣腸桿菌是自然界中普遍存在的菌株，但至今仍未發(fā)現(xiàn)具有鐵還原活性的產(chǎn)氣腸桿菌的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一株具有鐵還原活性、兼性厭氧、電子供體利用譜較廣的產(chǎn)氣腸桿菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述產(chǎn)氣腸桿菌在三價(jià)鐵還原中的應(yīng)用。發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究，從廣東肇慶某地下古森林土壤中分離篩選出了產(chǎn)氣腸桿菌(五w&ra^c^"fleragew^XM02)。于2007年3月12日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCC1969。該菌株為短桿狀，尺寸范圍為1.0~1.7x0.6~0.8pm，菌落顏色為白色或黃色，兼性厭氧，厭氧環(huán)境下其電子供體利用譜較廣，能氧化檸檬酸、丙三醇、葡萄糖、蔗糖等有機(jī)物，同時(shí)還原水鐵礦、針鐵礦、纖鐵礦、赤鐵礦、黃鐵礬等鐵氧化物。一、本發(fā)明菌株從廣東肇慶某地下古森林土壤進(jìn)行分離、純化所得，其分離純化方法如下1)液體分離培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含l.Og葡萄糖、16g檸檬酸鐵、2.5gNaHC03、0.25gNH4Cl、0.678gNaH2P04.2H20、O.lgKCl、維生素溶液10.0mL、微量元素溶液10.0mL;pH5.06.0。其中，維生素溶液是每升水中含2.0mg生物素、2.0mg葉酸、lO.Omg維生素B6、5.0mg硫胺素、5.0mg核黃素、5.0mg煙酸、5.0mg泛酸轉(zhuǎn)、O.lmg維生素B12、5.0mg對(duì)氨基苯甲酸、5.0mg硫辛酸；微量元素溶液是每升水中含1.5g氨三乙酸、3.0gMgS04.7H20、0.5gMnS04.H20、l.OgNaCl、O.lgFeS04.7H20、O.lgCoCl2.6H20、0.1gCaCl2、O.lgZnS04.7H20、O.OlgCuS04.5H20、O.OlgA1K(S04)2.12H20、O.OlgH3B03、O.OlgNa2Mo04.2H20。2)富集:稱取5g古森林土壤樣品接種到100mL液體分離培養(yǎng)基，往培養(yǎng)液中鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)21小時(shí)；鼓氣完畢后將培養(yǎng)物置于厭氧工作站(N2/CO2=80/20)3(TC靜置培養(yǎng)，檢測(cè)Fe(II)的產(chǎn)率同時(shí)觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況。當(dāng)Fe(II)的產(chǎn)量不斷增加時(shí)，培養(yǎng)液的顏色從原先的橙黃色逐漸變暗，最后變成黑色。當(dāng)Fe(II)的產(chǎn)量超過總鐵含量的50%時(shí)，以10%的接種量轉(zhuǎn)接至另一新鮮的液體分離培養(yǎng)基中，如此反復(fù)三次。3)純化將第四代反應(yīng)后的培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站(^/CO2=80/20)30。C培養(yǎng)48小時(shí)，挑取單菌落進(jìn)行純化。固體培養(yǎng)基的配方與液體分離培養(yǎng)基相同，只是每升多加了15g瓊脂。二、釆用以下方法來驗(yàn)證本發(fā)明菌株的鐵還原活性，確定其電子供體與電子受體利用譜。1)從保存產(chǎn)氣腸桿菌XM02的斜面接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于3(TC，180轉(zhuǎn)/分鐘搖床活化菌體9小時(shí)，使細(xì)菌數(shù)量達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期；2)在上述液體分離培養(yǎng)基中添加不同電子供體(如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸、乙醇、丙三醇、葡萄糖、蔗糖等)和電子受體(如檸檬酸鐵、水鐵礦、針鐵礦、赤鐵礦、黃鐵礬等)，以10%的接種量接種活化菌液于上述液體分離培養(yǎng)基中，厭氧工作站(N2/CO2=80/20)下3(TC靜置培養(yǎng)；3)每隔一定時(shí)間(約5~10天)取4mL培養(yǎng)液于16mL0.5MHCl溶液(M表示每升水中含HC1的摩爾數(shù))中180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩1.5小時(shí)；把菌體等沉淀濾掉，采用鄰菲羅林法給濾液中的Fe(II)顯色，采用紫外-可見分光光度計(jì)在510nm處測(cè)定Fe(n)的含量，驗(yàn)證菌株的鐵還原活性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究，篩選出了產(chǎn)氣腸桿菌(五MferaZ^"w^ragew"XM02)。此菌株具有鐵還原活性、兼性厭氧、電子供體利用譜較廣?？梢栽诤醚趸騾捬醐h(huán)境下生存，厭氧環(huán)境下其電子供體利用譜較廣，能氧化的電子供體有丙三醇、檸檬酸、葡萄糖、蔗糖等有機(jī)物；可還原的三價(jià)鐵有水鐵礦、針鐵礦、纖鐵礦、赤鐵礦、黃鐵砜等。圖1為flerage"^sXM02的30000倍電子顯微鏡圖片。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1菌株分離1)分離培養(yǎng)基每升分離培養(yǎng)基中含l.Og葡萄糖；16g檸檬酸鐵；2.5gNaHC03;0.25gNH4Cl;0.678gNaH2P04.2H20;O.lgKCl;維生素溶液10.0mL;微量元素溶液10.0mL;pH5.5。其中，維生素溶液是每升水中含2.0mg生物素、2.0mg葉酸、lO.Omg維生素B6、5.0mg硫胺素、5.0mg核黃素、5.0mg煙酸、5.0mg泛酸鈣、O.lmg維生素B12、5.0mg對(duì)氨基苯甲酸、5.0mg硫辛酸；微量元素溶液是每升水中含1.5g氨三乙酸、3.0gMgS04.7H20、0.5gMnS04.H20、l.OgNaCl、O.lgFeS04-7H20、O.lgCoCl2.6H20、O.lgCaCl2、O.lgZnS04.7H20、O.OlgCuS04.5H20、O.OlgA1K(S04)2.12H20、O.OlgH3B03、O.OlgNa2Mo04.2H20。2)富集稱取5g古森林土壤樣品接種到lOOmL上述液體分離培養(yǎng)基；往培養(yǎng)液中鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)1小時(shí)；鼓氣完畢后將培養(yǎng)物置于厭氧工作站(N2/CO2=80/20)3(TC靜置培養(yǎng)。檢測(cè)Fe(II)的產(chǎn)率同時(shí)觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況。當(dāng)Fe(II)的產(chǎn)量不斷增加時(shí)，培養(yǎng)液的顏色從原先的橙黃色逐漸變暗，最后變成黑色。當(dāng)Fe(II)的含量超過總鐵含量的50%時(shí)，以10%的接種量轉(zhuǎn)接至另一新鮮的上述液體分離培養(yǎng)基中，如此反復(fù)三次。3)純化最后，將第四代反應(yīng)后的培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后均勻涂布于上述固體分離培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站(N2/CO2=80/20)30'C培養(yǎng)48小時(shí)，挑取單菌落進(jìn)行純化。實(shí)施例2特性鑒定(1)菌體形態(tài)特性采用常規(guī)的細(xì)菌電子顯微鏡觀察，該菌株為短桿狀，尺寸范圍為1.0~1.7x0.6~0.8^m。(見圖1)(2)菌落形態(tài)特性在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上好氧培養(yǎng)24小時(shí)后，菌落形態(tài)為圓形，邊緣整齊；表面光滑，低凸面；白色，菌落直徑為23mm;在實(shí)施例1所述固體分離培養(yǎng)基平板上厭氧培養(yǎng)48小時(shí)后，菌落形態(tài)為圓形，邊緣整齊；表面光滑，高凸面；黃色，菌落直徑為23mm。(3)生理、生化特性根據(jù)BioLog微生物鑒定儀，分析此菌株在好氧條件下對(duì)96種不同碳源的利用情況，可初步鑒定此菌株為腸道菌。其他生理生化結(jié)果見表l:表1.菌株生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注+表示為陽性或可以利用；-表示為陰性或不能利用(4)分子生物學(xué)特性采用SDS-蛋白酶K，氯仿-異戊醇(體積比24:1)抽提，0.6體積異丙醇沉淀的方法提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌16SrDNA通用引物F8和R1542和細(xì)菌gyrB基因通用引物UP-l/UP-2rPCR擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA，在1500bp附近出現(xiàn)明顯的條帶，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行序列測(cè)定，將獲得的DNA序列輸入GenBank，以Blastn程序?qū)?shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明菌株的16SrDNA序列和與GenBank中產(chǎn)氣腸桿菌的多個(gè)菌株具有較高的同源性，其中與產(chǎn)氣腸桿菌的模式菌株(￡"/era^"w的16SrDNA(登錄號(hào)為AF395913)的同源性達(dá)到99%(同一菌種的16SrDNA序列的同源性應(yīng)大于97.7%)。結(jié)合上述的BioLog微生物鑒定結(jié)果、生理生化特性、16SrDNA序列的結(jié)果，該菌株應(yīng)歸屬于產(chǎn)氣腸桿菌(￡>xfera^"eram7gees)，命名為￡>^era^flcfertzeragg"&yXM02。實(shí)施例3鐵還原活性電子供體為檸檬酸，電子受體為水鐵礦培養(yǎng)基(a):在1.0L去離子水中添加2.0g檸檬酸，10.0g水鐵礦，2.5gNaHC03，0.25gNH4Cl，0.678gNaH2P04.2H20，O.lgKCl，lO.OmL維生素溶液，lO.OmL微量元素溶液；其中，維生素溶液與微量元素溶液配方同實(shí)施例l;調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(a)的pH為5.5，于121。C條件下滅菌20分鐘，冷卻后鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)1小時(shí)。從保存產(chǎn)氣腸桿菌XM02的斜面接種菌體于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于3(TC，180轉(zhuǎn)/分鐘搖床活化菌體9小時(shí)，使細(xì)菌數(shù)量達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期，以10呢的接種量接種活化菌液于上述培養(yǎng)基(a)中，3(TC靜置厭氧培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置不加菌的對(duì)照。觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況，每隔5~10天取4mL培養(yǎng)液于16mL0.5MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩爾數(shù))中180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩1.5小時(shí)。采用鄰菲羅林比色法測(cè)定Fe(II)的含量，驗(yàn)證菌株的鐵還原能力。Fe(II)含量變化(單位為mg/L，即表示每升樣品中所含F(xiàn)e(II)的毫克數(shù))見表2:表2.XM02菌株還原水鐵礦產(chǎn)生Fe(II)的濃度變化(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例4鐵還原活性電子供體為檸檬酸，電子受體為針鐵礦培養(yǎng)基(b):在l.OL去離子水中添加2.0g檸檬酸，9.0g針鐵礦，2.5gNaHC03，0.25gNH4C1，0.678gNaH2P04.2H20，O.lgKC1，lO.OmL維生素溶液，lO.OmL微量元素溶液；其中，維生素溶液與微量元素溶液配方同實(shí)施例1;調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(b)的pH為5.5，于12rC條件下滅菌20分鐘，冷卻后鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)1小時(shí)。從保存產(chǎn)氣腸桿菌XM02的斜面接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于30°C，180轉(zhuǎn)/分鐘搖床活化菌體9小時(shí)，使細(xì)菌數(shù)量達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期，以10呢的接種量接種活化菌液于上述培養(yǎng)基(b)中，3(TC靜置厭氧培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況，每隔5~10天取4mL培養(yǎng)液于16mL0.5MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩爾數(shù))中180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩1.5小時(shí)。采用鄰菲羅林法給測(cè)定Fe(II)的含量，并以不加菌的培養(yǎng)液(b)為對(duì)照，驗(yàn)證菌株的鐵還原能力。Fe(II)含量變化(單位為mg/L，即表示每升樣品中所含F(xiàn)e(II)的毫克數(shù))見表3:表3.XM02菌株還原針鐵礦產(chǎn)生Fe(II)的濃度變化(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例5鐵還原活性電子供體為丙三醇，電子受體為水鐵礦培養(yǎng)基(c):在1.0L去離子水中添加0.92g丙三醇，10.0g水鐵礦，2.5gNaHC03，0.25gNH4Cl，0.678gNaH2P04.2H20，O.lgKC1，lO.OmL維生素溶液，lO.OmL微量元素溶液；其中，維生素溶液與微量元素溶液配方同實(shí)施例l;調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(c)的pH為5.5，于12rC條件下滅菌20分鐘，冷卻后鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)1小時(shí)。從保存產(chǎn)氣腸桿菌XM02的斜面接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于30°C，180轉(zhuǎn)/分鐘搖床活化菌體9小時(shí)，使細(xì)菌數(shù)量達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期，以10呢的接種量接種活化菌液于上述培養(yǎng)基(c)中，3(TC靜置厭氧培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況，每隔5~10天取4mL培養(yǎng)液于16mL0.5MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩爾數(shù))中180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩1.5小時(shí)。采用鄰菲羅林法測(cè)定Fe(II)的含量，并以不加菌的培養(yǎng)液(c)為對(duì)照，驗(yàn)證菌株的鐵還原能力。Fe(II)含量變化(單位為mg/L，即表示每升樣品中所含F(xiàn)e(II)的毫克數(shù))見表4:表4.XM02菌株還原水鐵礦產(chǎn)生Fe(II)的濃度變化(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例6鐵還原活性電子供體為蔗糖，電子受體為水鐵礦培養(yǎng)基(d):在1.0L去離子水中添加3.42g蔗糖，10.0g水鐵礦，2.5gNaHC03，0.25gNH4C1，0.678gNaH2P04.2H20，O.lgKCl，10.0mL維生素溶液，lO.OmL微量元素溶液；其中，維生素溶液與微量元素溶液配方同實(shí)施例1;調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(d)的pH為5.5，于12rC條件下滅菌20分鐘，冷卻后鼓充高純混合氣體(N2/CO2=80/20)1小時(shí)。從保存產(chǎn)氣腸桿菌XM02的斜面接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于30°C，180轉(zhuǎn)/分鐘搖床活化菌體9小時(shí)，使細(xì)菌數(shù)量達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期，以10呢的接種量接種活化菌液于上述培養(yǎng)基(d)中，3(TC靜置厭氧培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況，每隔5~10天取4mL培養(yǎng)液于16mL0.5MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩爾數(shù))中180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩1.5小時(shí)。采用鄰菲羅林法測(cè)定Fe(II)的含量，并以不加菌的培養(yǎng)液(d)為對(duì)照，驗(yàn)證菌株的鐵還原能力。Fe(II)含量變化(單位為mg/L，即表示每升樣品中所含F(xiàn)e(II)的毫克數(shù))見表5:表5.XM02菌株還原水鐵礦產(chǎn)生Fe(II)的濃度變化(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1.一種產(chǎn)氣腸桿菌，其特征在于其為短桿狀，于2007年3月12日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCC1969。2.權(quán)利要求1所述產(chǎn)氣腸桿菌在三價(jià)鐵還原中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種產(chǎn)氣腸桿菌及其應(yīng)用。發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究，篩選出了產(chǎn)氣腸桿菌(EnterobacteraerogenesXM02)。此菌株具有鐵還原活性、兼性厭氧、電子供體利用譜較廣?？梢栽诤醚趸騾捬醐h(huán)境下生存，厭氧環(huán)境下其電子供體利用譜較廣，能氧化的電子供體有丙三醇、檸檬酸、葡萄糖、蔗糖等有機(jī)物；可還原的三價(jià)鐵有水鐵礦、針鐵礦、纖鐵礦、赤鐵礦、黃鐵礬等。文檔編號(hào)C22B3/00GK101096645SQ200710028390公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年6月1日優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日發(fā)明者周順桂,李曉敏,李芳柏,雷發(fā)懋申請(qǐng)人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所