專利名稱：一種構(gòu)建cDNA文庫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種構(gòu)建cDNA文庫的方法，利用T-載體快速構(gòu)建cDNA文庫是 基因工程技術(shù)中的一種分離鑒定功能基因的方法，屬分子生物學(xué)范疇。
背景技術(shù)：
構(gòu)建cDNA文庫是鑒定未知生物基因組功能基因的一種有效手段，從1975 年Rougeon等人第一次成功構(gòu)建cDNA文庫以來，各種構(gòu)建文庫的方法不斷涌現(xiàn)， 技術(shù)手段也越來越成熟，其主要的技術(shù)手段不外乎包括采用polyd(T)寡聚糖 核苷酸與mRNA的poly (A)互補配對為引物，以mRNA為模板通過RNA反轉(zhuǎn)錄酶 催化合成第一條cDNA鏈。然后通過DNA聚合酶合成第二條cDNA鏈。為了將合 成的cDNA克隆到載體中，通常需要在雙鏈cDNA兩端加上兩個帶有特異酶切位 點的接頭引物，另外為了在酶切接頭引物時不至于將cDNA切斷，往往需要將所 合成的cDNA甲基化。切割完成后連接到載體中，最后進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建。這 些方法都涉及到接頭引物和酶切等復(fù)雜程序，操作太繁瑣，且成功率不是很高， 更不能輕易采用對微量寶貴樣品建庫。雖然最近也有采用噬菌體插入/切除位點 特異性重組系統(tǒng)(即GATEWAYTM系統(tǒng))連接cDNA到載體的報道，但這種重組的效 率是有待提高的，而且用于重組的Clonas^酶非常昂貴，在推廣上有一定難度。 總之，現(xiàn)在還沒有-種既簡單經(jīng)濟(jì)，又快速高效，既不需要大量RNA樣品，又 能高通量、高成功率的構(gòu)建cDNA文庫的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建cDNA文庫的方法，既不需要核酸內(nèi)切酶也不 需要噬菌體插入/切除位點特異性重組系統(tǒng)的構(gòu)建cDNA文庫的高通量、高成功 率的簡單方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的 包括以下步驟
1、
1) 以總RNA或mRNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2為引物，以 Invitrogen公司的Superscript II為反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一條鏈；
2) 以cDNA第一條鏈為模板，以SEQIDNo. l和SEQIDNo. 2為引物，以DNA 聚合酶通過PCR擴(kuò)增合成雙鏈cDNA;
3) 將步驟2)合成的雙鏈cDNA直接通過T4 DNA連接酶連接到T-載體中， 將載體通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌，得到cDNA文庫。
2、 步驟1 ) SEQ ID No. 1為一段寡聚脫氧核苷酸序列，3'末端為GGG，其余 序列為任意一段特異性接頭引物序列。
3、 步驟1 ) SEQ ID No. 2為一段寡聚脫氧核苷酸序列，3'末端為15_30個胸 腺嘧啶脫氧核苷T和VN序列，5'末端為明顯不同于SEQ ID No. 1的任意一段 15-30bp的特異性接頭引物序列。
4、 步驟2)用于合成雙鏈cDNA的DNA聚合酶為具有添加腺嘌呤脫氧核苷A粘 性末端功能的Taq DNA聚合酶。
5、 步驟3)所述的T-載體指兩端都帶有突出胸腺嘧啶脫氧核苷T粘性末端的 載體。
本發(fā)明的核心步驟為使用Taq DNA聚合酶通過PCR合成cDNA的第二條鏈， 利用Taq DNA聚合酶在DNA合成完成后的加尾特性，保證合成的雙鏈cDNA兩個 末端均為A粘性末端，這樣的雙鏈DNA可以在T4-DNA連接酶作用下和帶有兩個 T粘性末端的T-載體連接，之后通過轉(zhuǎn)化完成cDNA文庫的構(gòu)建。
如圖1所示，該發(fā)明的具體實施步驟如下
A.第一條鏈的合成 將以下藥劑加入滅菌過的無菌離心管中
1-3 ul RNA樣品(大約l.Oug總RNA)
lu 1 引物SEQ ID No. 1
lul 引物SEQ ID No. 2
加雙蒸水至5li 1
將離心管里的溶液充分混合并稍微離心使之聚集，然后72。C溫浴2分鐘，然 后放置冰上2min。然后加入以下試劑 2. 0 u 1 5X第一條鏈緩沖液
1. 0 u 1 DTT (20 mM)
1. 0 u 1 dNTP Mix (10 mM )
1.0 ul SuperScriptII反轉(zhuǎn)錄酶 總體積為IO.O ul
將離心管里的溶液充分混合并稍微離心使之聚集，然后42。C溫浴60分鐘。反 應(yīng)完成后，將離心管放在冰上終止反應(yīng)。 B.通過PCR合成cDNA第二條鏈
將以下藥劑加入滅菌過的無菌離心管中
2 yl 第一條cDNA鏈
80 ul H20
10 y 110X PCR緩沖液
2 11 1 50X dNTP Mix
2 u 1 引物SEQ ID No. 1
2 u 1 引物SEQ ID No. 2
2 1 Taq Polymerase
總體積為IOO Hi
將離心管里的溶液充分混合并稍微離心使之聚集，然后放置到PCR儀里進(jìn) 行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為 95° C1 min
<formula>formula see original document page 6</formula>反應(yīng)完成后，將5u 1 PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定cDNA產(chǎn)物的 合成效果。如果想要獲得大片段的cDNA文庫，可以將全部PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖 凝膠電泳，然后根據(jù)需要將DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收，利用異丙醇和70% 乙醇純化和濃縮后，才進(jìn)行下面的T-載體連接，否則可以直接將雙鏈cDNA用異 丙醇和70%乙醇純化和濃縮之10 u 1總體積，在進(jìn)行T-載體連接。
C. 雙鏈cDNA與T-載體的連接
10 ul 濃縮后的雙鏈cDNA
5 u 1 T-載體
3 u 1 T4 DNA連接酶
2 u ] T4 DNA連接酶緩沖液
混合后在16° C過夜連接。
D. 將連接物與大腸桿菌電激點擊感受態(tài)混合，然后在BioRad MicroPulser 電轉(zhuǎn)儀上進(jìn)行電激轉(zhuǎn)化，獲得cDNA文庫。
該發(fā)明的主要優(yōu)點是(l)RNA使用量少，原則上只需要0.05-L0 ug的 總RNA就可滿足構(gòu)建文庫的要求。(2)操作簡單，因為5'接頭引物在合成cDNA 第一條鏈時利用S叩erScriptII的加尾功能和底物轉(zhuǎn)換巧妙添加上去，而3'端 引物則直接添加在Poly d(T)上，cDNA第二條鏈的合成則通過PCR擴(kuò)增完成。 此外，合成雙鏈cDNA時巧妙利用Taq DNA聚合酶的加尾功能，使PCR產(chǎn)物自動 帶有粘性A末端，可以高通量地與帶有T粘性末端的T-載體直接連接，避免接 頭的酶切過程，所以操作簡單。(3)操作簡潔，合成--次cDNA第-條鏈可以
進(jìn)行5次雙鏈cDNA的PCR擴(kuò)增，保證構(gòu)建文庫的高成功率。(4)應(yīng)用此方法
構(gòu)建文庫幾乎沒有使用任何昂貴試劑，所以費用低廉。


圖l為本發(fā)明的技術(shù)路線圖2為PCR擴(kuò)增得到紅樹的雙鏈cDNA，取5 u 1在1. 2。/。的瓊脂糖凝上進(jìn)行 電泳，最左邊為lkb DNA marker;
圖3為紅樹cDNA文庫單菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果，PCR產(chǎn)物在1. 2%的瓊脂糖凝上 進(jìn)行電泳，最左邊為lkb DNA marker。
具體實施例方式
構(gòu)建紅樹植物紅海欖的cDNA文庫
紅樹植物由于常年生長在海邊，具有很強的耐鹽耐澇能力，其組織內(nèi)的內(nèi) 含物也特別豐富，如多糖和蛋白，大量內(nèi)含物會增加提取紅樹的RNA的難度和 影響提取RNA的質(zhì)量，因此構(gòu)建高質(zhì)量的紅樹的cDNA文庫難度就相對較大，利 用本發(fā)明，我們按照下列步驟構(gòu)建紅樹cDNA文庫。
本發(fā)明對SEQ ID No. 1引物的要求為 一段寡聚脫氧核苷酸序列，3'末端 為GGG，其余序列為任意一段特異性接頭引物序列。本發(fā)明對SEQ ID No. 2引物 的要求為 一段寡聚脫氧核苷酸序列，3'末端為15-30個胸腺嘧啶脫氧核苷T 和VN序列，5，端為明顯不同于SEQ ID No. 1的任意一段15-30bp的特異性接 頭引物序列。本實驗以下面兩個滿足該要求的引物為例構(gòu)建紅樹cDNA文庫。
SEQ ID No. 1: AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG;
V代表:G,或C，或A; N代表A，或C，或G， 或T。 (1)紅樹cDNA第一條鏈的合成
將3ul紅樹RNA樣品(大約1.0ug總RNA)與10uM的引物SEQ ID No. l和引物
SEQ ID No.2各lyl在無菌離心管中混合，然后72"C溫浴2分鐘，然后放置冰上
2min。然后加入以下試劑
2.0 wl 5X第一條鏈緩沖液
1. 0 u 1 DTT (20 mM)
1.0 u 1 譜P Mix (10 mM )
1.0 yl SuperScriptII反轉(zhuǎn)錄酶
將離心管里的溶液充分混合并稍微離心使之聚集，然后42。C空氣溫浴60分 鐘。反應(yīng)時間完成后，將離心管放在冰上終止反應(yīng)。 (2)通過PCR合成cDNA第二條鏈
將以下藥劑加入滅菌過的無菌離心管中 2 ul 紅樹cDNA第一條鏈 80 li 1 H20 10 u 110X PCR緩沖液 2 ti 1 10mM dNTP Mix
2 u 1 引物SEQ ID No. 1
2 1 引物SEQ ID No. 2
2 ti 1 TaKaRa LD Taq Polymerase
將離心管里的溶液充分混合并稍微離心使之聚集，然后放置到PCR儀 (Perkin Elme，GeneAmp 9600)里進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為
95°C1 min95。C20 sec68。C6 min
16°C---
25循環(huán)
反應(yīng)完成后吸5u 1 PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，如圖2所示，大部分的 cDNA集中在750—3000bp之間，表明cDNA具有較好的完整性。將余下的95 y 1
雙鏈cDNA用異丙醇和70V酒精沉淀，然后將沉淀的c咖A溶于10 u 1水。
(3) 雙鏈cDNA與T-載體的連接
10 ul 濃縮后的雙鏈cDNA 5 u 1 pMD-20 T-載體(TaKaRa)
3 ti 1 T4 DNA連接酶(Fermentas)
2 u 1 T4 DNA連接酶緩沖液
混合后在16° C過夜連接。
(4) 大腸桿菌轉(zhuǎn)化
20 ul連接物和200 wl電擊感受態(tài)大腸桿菌混合，然后進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化， 取1 1^1在含氨芐霉素,X-gal和IPTG的LB平板培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布篩選，通過 藍(lán)白斑可以確定正確的轉(zhuǎn)化菌斑，經(jīng)計算，每1 w g總RNA可以獲得10H的轉(zhuǎn)化 菌斑。最后利用菌落PCR來檢測cDNA文庫，如圖3所示，大部分cDNA的長度 在500-2000bp之間，證明所構(gòu)建的文庫質(zhì)量很好。
權(quán)利要求
1、一種構(gòu)建cDNA文庫的方法，包括以下步驟1)以總RNA或mRNA為模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2為引物，以Invitrogen公司的SuperScript II為反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一條鏈；2)以cDNA第一條鏈為模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2為引物，以DNA聚合酶通過PCR擴(kuò)增合成雙鏈cDNA；3)將步驟2)合成的雙鏈cDNA直接通過T4 DNA連接酶連接到T-載體中，將載體通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌，得到cDNA文庫。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟l ) SEQ ID No. 1為一段寡 聚脫氧核苷酸序列，3'末端為GGG，其余序列為任意一段特異性接頭引物序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟l ) SEQ ID No. 2為一段寡 聚脫氧核苷酸序列，3'末端為15-30個胸腺嘧啶脫氧核苷T和VN序列，5'端 為明顯不同于SEQ ID No. 1的任意一段15-30bp的特異性接頭引物序列。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在丁步驟2)用于合成雙鏈cDNA的 DNA聚合酶為具有添加腺嘌呤脫氧核苷A粘性末端功能的Taq DNA聚合酶。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟3)所述的T-載體指兩端 都帶有突出胸腺嘧啶脫氧核苷T粘性末端的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種構(gòu)建cDNA文庫的方法，其特點是簡單快速而且不需要核酸內(nèi)切酶。該方法的主要步驟包括(1)以總RNA(或者mRNA)為模板，利用這對引物通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。(2)利用這對引物通過Taq DNA合成酶催化的PCR合成cDNA第二條鏈。(3)將步驟(2)得到的PCR產(chǎn)物通過DNA連接酶直接與T-載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，得到cDNA文庫。本發(fā)明的方法構(gòu)建cDNA文庫成本極低，RNA模板需要量很少，而且適用于任何來源生物樣品RNA。
文檔編號C40B50/06GK101377021SQ20081016857
公開日2009年3月4日 申請日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者徐遠(yuǎn)峰, 翟金玲, 惜 黃 申請人:海南大學(xué)