專利名稱：：儲備多樣性最大化的功能性人化抗體文庫之構建及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及抗體文庫之構建，該文庫所具有的抗體儲備多樣性(r印ertoirediversity)，超過自然免疫系統(tǒng)和現(xiàn)有的組合技術。該文庫可用于篩選具有令人感興趣的特異性的抗體，由此所構建的抗體被認為是功能性全人化抗體。背景單克隆抗體所具有的確切臨床療效和安全特性，使其成為代表性的專類治療藥物。出現(xiàn)于70年代中期的"雜交瘤技術"突破，為醫(yī)學界帶來了疾病治療特異"魔彈"的希望。不過，直到一系列抗體技術出現(xiàn)，例如嚙齒類抗體嵌合技術(參見美國專利USPNos.4，816，567)和人源化技術(參見美國專利USPNos.5，225，539;5，585，089;5，693，762;5，693，761)、噬菌體展示組合文庫(Clacksonetal.，Nature,352:624-628(1991);Felicietal.，JMol.Biol.，223:301-310(1991);Marklandetal.Gene，109:13-19(1991))、轉基因鼠(huMab/Xenomouse)制備人化抗體技術(參見美國專利USPNos.6，075，181;6，150，584;7，041，870)，以及抗體工業(yè)化制備技術，特異性"魔彈"的希望才變成現(xiàn)實?？笴D20單抗——利妥昔(Rituximab)，開創(chuàng)了治療性抗體時代的先河。迄今，至少有19個治療抗體獲美國食品和藥品管理局(FDA)批準上市，處在不同臨床試驗階段被評價的候選抗體多達數(shù)百個。首先，抗體與對應靶抗原獨一無二的位點結合，通過阻斷靶細胞與配體的相互作用(如ReoPro(abciximab)、Remicade(infliximab)、Humira(adalimumab)單抗等)，或者通過介導免疫效應機制，清除腫瘤細胞(如Rituxan(rituximab、Herc印tin(trasuzumab)、Campath-1(alemtuz咖ab)單抗等)，從而發(fā)揮治療功效。抗體的靶向特異性，也被用以運載化學藥物(如Myetotag(gemtuzumab))或方文身寸同位素(Zevaline(ibritumomab)、Bexxar(tositumomab))，導向抵至耙細胞，而發(fā)揮對腫瘤細胞的毒性清除效應。治療性抗體以其獨有的靶向特異性、經(jīng)證明的臨床療效和安全性，為實現(xiàn)最佳的疾病診斷、治療和其它產業(yè)化應用，開辟了無限發(fā)展空間。碰緣性抗體的重要特征之一是其多樣性，機體能夠針對各種抗原耙點特異性，對應產生獨一無二的抗體。這是通過抗體基因重組和體細胞突變過程才得以實現(xiàn)。小鼠和人類負責編碼免疫球蛋白的三個多基因家族，分別定位于不同的染色體(表l)。表l.免疫球蛋白(Ig)基因的染色體定位3<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>每一個基因家族所包含的編碼序列稱為基因片段。負責編碼輕鏈的3個不同的基因片段是可變區(qū)(V)基因片段(約300bp長)，連接區(qū)(J)基因片段(約50bp長)和恒定區(qū)(C)基因片段(約300bp長)。以上所有的這些基因片段由長度不等的非編碼DNA序列分隔開來。胚系階段如k-和A-輕鏈(也包括重鏈)基因片段都包含一DNA序列，它位于V基因之前，負責編碼一段長19個氨基酸的先導序列。輕鏈V基因片段負責編碼第1-95號氨基酸(含CDR1和CDR2);J基因片段負責編碼第96108號氨基酸(含CDR3)，C基因片段編碼剩余部分的氨基酸(圖1A)。人類k輕鏈大約有100個V基因片段，可與5個J基因片段組合。正是由于如此眾多的V-J基因連接位點才構成了抗體多樣性的遺傳學基礎(圖2)。此外，在抗體的"成熟"過程中，可變區(qū)序列(由V-J基因重組連接而成)所發(fā)生的體細胞突變導致抗體的親和力和特異性進一步強化。大多數(shù)突變事件(缺失、添加和序列替換)主要發(fā)生在CDR3基序中。人類A輕鏈基因家族大約由100個V基因和6個J基因構成(圖1A)。A輕鏈的V-J基因在空間排列上與k鏈略有不同，其余則非常相似。重鏈基因片段的組成與輕鏈相似，只不過重鏈基因包含有多樣性(D)基因片段(約50bp長)，而且每一個C基因片段都有一個或多個稱為膜(M)外顯子的關聯(lián)編碼片段。和輕鏈一樣，每一個重鏈V基因都有一個前導序列。負責編碼重鏈的有4個不同基因片段VH，DH，JH，CH。VH基因片段編碼第1101號氨基酸(含CDR1和CDR2)，DH基因片段編碼第102106號氨基酸(CDR3之前)，JH基因片段編碼第107123號氨基酸，CH基因片段編碼其余氨基酸(圖1B)。人類重鏈基因大約有100個功能性V基因，25-30個功能性D基因，6個功能性J基因。由V-D-J基因重組而構成的重鏈可變區(qū)多樣性與輕鏈類似，只不過由于重鏈DH基因的存在和參與使得發(fā)生在CDR3基序的多樣性數(shù)量遠多于輕鏈(圖2)。抗體多樣性產生于以下幾個層面(a)胚系基因的可變性和V、D、J基因片段的多樣性；(b)輕鏈V-J基因連接的自由組合、重鏈V-D-J基因連接的自由組合、重鏈與輕鏈的組合匹配；(c)由于不精確的DNA重排、以及在D-J基因或V-D-J基因重組過程中隨機插入D-和J-基因之間的核苷，所導致的連接多樣性；(d)體細胞高突變。即使不考慮由體細胞高突變所增加的多樣性，也可以推算出基因重組和連接所產生的多樣性的數(shù)量，如表2所示。表2.抗體多樣性基線計算輕鏈基因片段4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>此外，不同的組合連接也會增加基因的多樣性基線。重鏈和輕鏈基因的組合就可能編碼出43200X1200=5.1X107種可能的免疫球蛋白。因此，不考慮體細胞高突變率的因素，估計人類免疫系統(tǒng)的抗體多樣性為5.IXIO7?？贵w重塑技術治療性抗體在臨床上的成功應用歸因于抗體工程技術的突破，如嵌合技術和人源化技術。憑借這些技術，可以將大多數(shù)的鼠源抗體轉化成為人源化抗體且不顯著改變親本抗體的特異性和與親和力?？贵w嵌合技術(參見例如美國專利4，816，567)采用將鼠抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)移植到人抗體的恒定區(qū)的方法，因此嵌合抗體會含有約1/3鼠源成分序列。理論上，反復注射這種抗體會對人體構成免疫原性。傳統(tǒng)的人源化抗體技術(參見例如美國專利5，225，539，5,585,089,5，693，762，5，693，761)通過將鼠源CDR移植到人源框架以達到降低鼠源成分比例的目的。人源化抗體中鼠源成分可低于10%。CDR移植技術并非完美。首先，CDR本身源自鼠源抗體是主要的免疫原；其次，將CDR直接移植到人源框架通常都會損失抗體的親和力與特異性。雖然這一不足可以補救，即通過鑒別與抗原結合位點相互作用的框架區(qū)關鍵氨基酸殘基，再將鼠源殘基回復突變至人源框架。通常，在CDR移植抗體的人源框架，引入多達7個以上的鼠源殘基，這種狀況并非罕見。傳統(tǒng)CDR移植技術的主要缺陷在于沒有從免疫功能角度去檢測抗體的"人化"程度；也忽視了人源框架中回復突變的鼠源殘基所產生新的T-細胞表位的可能性。(圖3)為了避免在最終的抗體結構中應用鼠源CDR，已經(jīng)開發(fā)了其它技術來產生全人化抗體。劍橋抗體科技(CAT)和Dyax公司從人類的免疫個體外周B淋巴細胞獲得抗體cDNA，設計噬菌體展示庫來鑒別抗體的可變區(qū)序列，即將抗體的可變區(qū)序列與M13噬菌體基因III或VIII結構融合(Clacksonetal.，Nature,352:624-628(1991);Felicietal.，JMol.Biol.，222:301-310(1991);Marklandetal.，Gene，109-13-19(1991)，所有這些文獻通過引用以其整體并入本文)，抗體可變區(qū)以Fab或Fv單鏈形式(scFv)表達在噬菌體外殼。通過幾輪次不同抗原結合條件的加壓篩選，能表達針對特異抗原的Fab或scFv的噬菌體會被篩選分離，其可變區(qū)cDNA序列可以通過標準DNA測序解讀?，F(xiàn)有的抗體工程技術可以將這些特異的Fab序列與所需的同型抗體重新構建出一個完整的抗體，這種方法制備的抗體稱為全人化抗體(包括CDR序列)。為了提高抗體的免疫反應性(抗原親和力與特異性)，可以引入體外成熟步驟，包括不同重鏈輕鏈的組合匹配，CDR3的缺失/添加/突變(模擬V-J，V-D-J基因重組連接)，隨機突變(模擬體細胞突變)。應用該技術發(fā)展的腫瘤壞死因子TNF-a抗體-Adalimumab(商品名Humira)就是一個"全人化"抗體的例子，一個治療性單克隆抗體，最近已獲得美國FDA批準用于治療類風濕性關節(jié)炎(RA)。這項技術的不足在于由于構建抗體的基因序列均源自于人類成熟B細胞，其基因的多樣性有限；而且體外成熟過程中引入的突變可能成為潛在的T-細胞免疫原表位。如此看來，噬菌體展示抗體的"人化"程度仍有待商榷。由Abgenix公司禾口Mederax公司發(fā)展的人化鼠(Abgenix之Xe謹ouse，參見美國專利6，075，181和6，150，584;GenPharm-Medarex之HuMabmouse,參見美國專利7，041，870)，通過基因敲除和轉染技術，將小鼠Ig基因替換為人Ig編碼基因，可能是全人化抗體的最佳途徑。用目標抗原免疫人化鼠，抗體親合力的成熟過程在自然的體內免疫環(huán)境中進行。盡管輕鏈的V-J基因片段和重鏈的V-D-J基因片段是100X的人源基因，但發(fā)生在人化鼠V-J和V-D-J基因連接過程中的突變/缺失/添加以及體細胞突變，仍與人體有明顯差異，也不能排除這些突變將成為新的T細胞免疫原表位的可能性。事實上，類風濕性關節(jié)炎臨床試驗顯示，由HuMab鼠制備的全人抗體HuMax-CD20，免疫原性和輸液反應高于嵌合抗體Rituximab(參見編者按ostergaardetal.2006.FirstClinicalResultofHumax_CD20FullyHumanMonoclonalIgGlantibodyTreatmentinRheumatoidArthritis(RA).EULAR.AbstractP0018)。而且，由于能夠引入鼠體的人Ig微小基因容量有限，抗體的多樣性也不及人體自然免疫系統(tǒng)那么豐富。盡管如此，與其它方法相比，人化鼠產生的抗體仍是人源化程度最高的。除了人化鼠技術，其他人源化技術大多著眼于抗體外觀而非功能，構建外觀相似的人化抗體已經(jīng)成其最主要目標。然而，從免疫系統(tǒng)的角度來說，它會對免疫球蛋白進行檢測、監(jiān)控?？乖蔬f細胞(APC)會將免疫球蛋白內化、酶解成線狀短肽，短肽片段與APC細胞主要組織相容性復合物MHC-II結合。小部分短肽與MHC在細胞表面形成復合物，一經(jīng)由T細胞特異受體所識別，便會觸發(fā)一系列的免疫級聯(lián)反應，包括T細胞激活分化為T輔助細胞、釋放細胞因子介導抗原特性B細胞分化為分泌特異抗體的漿細胞。細胞因子的釋放導致抗原特異的B細胞分化成為抗體特異的漿細胞。只有當那些降解的Ig短肽被免疫系統(tǒng)視為"自我"才能逃避免疫監(jiān)視，這樣的抗體才是真正意義的人化抗體。6傳統(tǒng)的CDR移植人源化技術，不能去除重組抗體中關乎抗原特異性和親合力的鼠源CDR序列，而且，大多CDR移植方法中的回復突變可能引入新的T-細胞免疫原表位，從而導致CDR移植抗體成為潛在免疫原。盡管框架重塑技術(framework-patchingorframework-reengineering)可以避免或減輕回復突變帶來的影響，但鼠源CDR所固有的免疫原問題仍有待解決。Gillies認為(參見美國專利PatNo6992174)，如果治療性蛋白序列不含有會被抗原提呈細胞視為"異己"(T表位)的線狀肽段，蛋白將被免疫系統(tǒng)視作"自我"，在用作重復治療時，可切實降低誘發(fā)變態(tài)反應的風險。據(jù)此設計的稱為"肽段線展"(p印tidethreading)程序(計算機模擬肽段結合MHCII分子)，在計算機輔助下鑒別出延伸肽段中那些可能被MHC-II提呈的"異己"序列，然后通過替換其中的一個或二個氨基酸，將其轉化為免疫系統(tǒng)認可為"自我"序列(不會與APC的MHCII結合)。理論上，任何有治療潛力的高免疫原性蛋白(包括鼠抗體)，通過替換序列中個別氨基酸，可轉為非免疫原性蛋白(去免疫原)(AdairF.，2000.Immunogenicity:Thelasthurdleforclinicallysuccessfulther鄰euticantibodies.BioPharm13:42_46;Adairetal.2002.Theimmunogenicityoftherapeuticproteins.BioPharmFebIssue,p30_36)。這項技術需要對序列的必需條件有透徹的認識，哪些序列會被MHC提呈為"免疫原"？哪些會被視為"非免疫原"？此外，還需有設計精巧的肽序列分析程序。如前所述，對于噬菌體展示文庫或其它類似文庫，仍需要加以改進，比如，核糖體展示文庫(參見例如Hanesetal.1998.Ribosomedisplayefficientlyselectsandevolveshighaffinityantibodiesinvitrofromimmunelibraries.PNAS95:14130-14135)，使得對人體無免疫原性、對感興趣的抗原具有特異性的功能人源化抗體的制備，成為可能。本發(fā)明將描述這些文庫構建的改進和必要，并解決上述需要。發(fā)明概述本發(fā)明將提供各種免疫球蛋白序列數(shù)據(jù)庫和對應的DNA文庫。對于每一種免疫球蛋白輕鏈FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4片段、以及對于每一種免疫球蛋白重鏈FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4片段，提供了確切的獨立的數(shù)據(jù)庫和DNA文庫。本領域技術人員將理解，本發(fā)明的一個或多個方面可可滿足某些目的目的，盡管一個或多個其他方面可滿足某些其它目的。在其所有方面，每一個目的可能不等同地適用于本發(fā)明的每一方面。所以，以下目的應被視為有關本發(fā)明任何的一個方面的應用選擇。本發(fā)明第一方面提供了確切的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)序列數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫的具體方式如存儲介質，例如電子、磁性或光學存儲介質、或打印的形式。該數(shù)據(jù)庫包含某單一種屬哺乳動物輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列、或編碼這類氨基酸的序列的核苷酸序列，數(shù)量至少是2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000或10000個。上述輕鏈可變區(qū)任意組合、首尾相連且與自然狀態(tài)的序列排列一致，其中的FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4片段序列可源自哺乳動物V、J基因，也可源于一個或多個數(shù)據(jù)庫、或公開出版文獻，這些數(shù)據(jù)庫或者文獻含有已知的免疫球蛋白、或者哺乳動物免疫球蛋白輕鏈氨基酸序列或核苷序列。在一些實施方式中，數(shù)據(jù)庫不包含某一種屬的已知免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的任何序列，例如數(shù)據(jù)庫不包括眾所周知的哺乳動物輕鏈V基因FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的連接。在優(yōu)選實施方式中，數(shù)據(jù)庫序列來自人。在一些實施方式中，數(shù)據(jù)庫只含有k鏈序列。在其它實施方式中，數(shù)據(jù)庫只有A鏈序列。在還有其他實施方式中，數(shù)據(jù)庫含有來自k鏈和A鏈的序列。在進一步的方面，本發(fā)明提供了DNA文庫，含有編碼前述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)序列數(shù)據(jù)庫中至少2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000或10000個輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的DNA序列。在另一方面，本發(fā)明提供了確切形式的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫的具體方式如存儲介質，例如電子、磁性或光學存儲介質、或打印形式。該數(shù)據(jù)庫包含某單一種屬哺乳動物重鏈可變區(qū)氨基酸序列、或編碼這類氨基酸的核苷酸序列，數(shù)量至少是2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000或10000個。這些重鏈可變區(qū)任意組合、首尾相連且與自然狀態(tài)的序列排列一致，其中的FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4片段序列源自哺乳動物重鏈V、D、J基因，或源于一個或多個數(shù)據(jù)庫、或公開出版文獻，這些數(shù)據(jù)庫或者文獻含有已知的免疫球蛋白、或者哺乳動物免疫球蛋白重鏈氨基酸序列或核苷酸序列。在一些實施方式中，數(shù)據(jù)庫不包含某一種屬的已知免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的任何序列，例如數(shù)據(jù)庫不包括眾所周知的哺乳動物重鏈V基因FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的連接。在優(yōu)選實施方式中，數(shù)據(jù)庫序列來自人。在一些實施方式中，數(shù)據(jù)庫只有Y鏈序列。在其它實施方式中，數(shù)據(jù)庫包含其它類型重鏈的序列(如YpY2，Y3，Y4，P，c^，a2，S，或O。在還有其他實施方式中，數(shù)據(jù)庫含有源自上述重鏈類型的任意可能組合的序列。在進一步的方面，本發(fā)明提供了DNA文庫，含有負責編碼前述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列庫中至少2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000或10000個重鏈可變區(qū)氨基酸序列的DNA序列。在另一方面，本發(fā)明提供了單鏈Fv(scFv)免疫球蛋白序列的數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫包含至少2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000或10000個scFv的氨基酸序列或編碼這類氨基酸的核苷酸序列。每一scFv片段的基本組成是某一哺乳動物輕鏈可變區(qū)通過連接體序列與同一種種屬重鏈可變區(qū)相連。輕鏈可變區(qū)之間任意組合、首尾相連且與自然狀態(tài)的序列排列一致，其中的FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4片段序列可源自哺乳動物V、J基因，也可源于一個或多個數(shù)據(jù)庫、或公開文獻，這些數(shù)據(jù)庫或者文獻含有已知的免疫球蛋白、或者哺乳動物免疫球蛋白輕鏈氨基酸序列或核苷酸序列。重鏈可變區(qū)任意組合、首尾相連且與自然狀態(tài)的序列排列一致，其中的FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4片段序列可源自哺乳動物重鏈V、D、J基因，也可源于一個或多個數(shù)據(jù)庫、或公開出版文獻，這些數(shù)據(jù)庫或者文獻含有已知的免疫球蛋白、或者哺乳動物免疫球蛋白重鏈氨基酸序列或核苷酸序列。在一些實施方式中，數(shù)據(jù)庫內不包含已知免疫球蛋白的輕鏈或重鏈可變區(qū)的任何序列，如數(shù)據(jù)庫內可不包括在所有已知的哺乳動物輕鏈和重鏈V基因內存在的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的連接。在優(yōu)選實施方式中，數(shù)據(jù)庫序列來自人。在一些實施方式中，，數(shù)據(jù)庫scFv序列的輕鏈序列只有k鏈的序列。在其它實施方式中，只有A鏈的序列。在其它實施方式中，均有k和A鏈的序列；在一些實施方式中，scFv數(shù)據(jù)庫的重鏈序列只有Y鏈。在其它實施方式中，由其它序列組成(如Yl，Y2，Y3，Y4，ii，Ql，a2，S，或O。在其它實施方式中，上述重鏈的任意可能組合。在還有另一方面，本發(fā)明提供了能夠表達前述scFv數(shù)據(jù)庫中的至少部分scFv片段的噬菌體展示文庫。本發(fā)明還提供了非天然存在的免疫球蛋白。該免疫球蛋白包含重鏈和輕鏈可變區(qū)序列，分別源自前述重鏈和輕鏈可變區(qū)數(shù)據(jù)庫。該免疫球蛋白亦可是scFv片段，其序列源自前述scFv序列數(shù)據(jù)庫，或是由前述噬菌體展示文庫表達的scFv片段。在還有另一方面，本發(fā)明提供了構建前述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)序列數(shù)據(jù)庫的方法。本發(fā)明進一步的目的是通過增加一種或多種核苷酸序列來增加文庫多樣性的方法，這些核苷酸序列編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。在還有另一方面，本發(fā)明提供了構建前述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列數(shù)據(jù)庫的方法。本發(fā)明進一步的目的是通過增加一種或多種核苷酸序列來增加文庫多樣性的方法，這些核苷酸序列編碼scFv氨基酸序列。在還有另一方面，本發(fā)明提供了構建前述免疫球蛋白scFv片段數(shù)據(jù)庫的方法。本發(fā)明進一步的目的是通過增加一種或多種核苷酸序列來增加文庫多樣性的方法，這些核苷酸序列編碼輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。在還有另一方面，本發(fā)明提供了構建前述噬菌體展示文庫的方法。在一個實施方式中，，本發(fā)明提供了產生人免疫球蛋白噬菌體展示文庫的方法和如此產生的人免疫球蛋白噬菌體展示文庫，所述方法包含以下步驟制備第一組核苷酸序列，所述序列編碼人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中該第一組的序列包含人輕鏈cDNA片段的序列，用來編碼FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4，其中cDNA片段被隨機選擇和連接，以編碼輕鏈可變區(qū)，按順序包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4;制備第二組核苷酸序列，所述序列編碼人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其中該第二組的序列包含人重鏈cDNA片段的序列，用來編碼FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4，其中cDNA片段被隨機選擇和連接，以編碼重鏈可變區(qū)，按順序包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4;制備第三組核苷酸序列，所述序列編碼免疫球蛋白單鏈Fv，其中該第三組的序列包含第一組的輕鏈序列、連接體、和任意選擇的第二組的重鏈序列，其中連接體將輕鏈和重鏈序列共價連接，所構成的第三組序列編碼免疫球蛋白單鏈Fv;以及將第三組核苷酸序列導入噬菌?？寺≥d體，構建噬菌體展示文庫。如上所述方法，可能優(yōu)選地是，第一組核苷酸序列的人輕鏈cDNA片段僅編碼k鏈?？蛇x地，第一組核苷酸序列的人輕鏈cDNA片段可僅編碼A鏈?？蛇x地，第一組核苷酸序列的人輕鏈cDNA片段可編碼k和A兩輕鏈。同樣，第二組核苷酸序列的人重鏈cDNA片段，可僅編碼Y重鏈，僅編碼YpY2、Y3、Y4、P、c^、a2、S、或e重鏈的序列，或其組合。在人選的優(yōu)選實施方式中，由上述方法所構建的本發(fā)明的噬菌體展示文庫排除了FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的的連接。本發(fā)明進一步的目的還提供了一種抗原結合分子的鑒別方法。該方法包括篩選表達文庫的步驟，這些表達文庫表達免疫球蛋白輕鏈，含有包含在前述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)數(shù)據(jù)庫中的輕鏈可變區(qū)序列、或者包含在前述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)數(shù)據(jù)庫中的重鏈可變區(qū)序列。在一些實施方式中，該方法涉及前述scFv數(shù)據(jù)庫的篩選。篩選過程也涉及測試表達的免疫球蛋白與選擇的抗原的結合。篩選過程的結果是鑒定與選擇的抗原結合的免疫球蛋白。結合閱讀下文專利詳述以及圖例實證，本發(fā)明之目的和特性將變得更清晰明了。不過，對于前述的發(fā)明總結以及下文的詳述，應該理解為本發(fā)明所優(yōu)選的具體應用，而非對發(fā)明和應用選擇的限制。尤其當本發(fā)明結合一系列具體應用實例來描述時，這些實例描述并不是用來對本項發(fā)明進行限制。對于本領域的技術人員而言，正如附帶的權利要求所描述地，只要不脫離本發(fā)明范疇的精髓，就可以有各種各樣的變通應用。同樣，前述本發(fā)明總結和下文的具體應用實例，能更清晰地了解本發(fā)明的各種內容、特性、好處和優(yōu)勢，并容易地為具備抗體設計和文庫構建知識的技術人員所理解。當結合考慮具體實例、數(shù)據(jù)、圖例、以及所引用的參考文獻，就更易理解本發(fā)明的內容、特性、好處和優(yōu)勢。附圖簡述結合閱讀以下圖例說明和本發(fā)明后面的詳述，易于理解本發(fā)明的其它特點和優(yōu)勢。圖1表示人(A)k鏈和A鏈和(B)重鏈的胚系類免疫球蛋白的結構。圖2表示免疫球蛋白(Ig)基因片段(外顯子)和輕和重(A)鏈結構域之間的關系。Ig輕鏈是由2個不連續(xù)的或分隔的外顯子(V和J)和l個完整的外顯子(C)編碼。Ig重鏈，此處為膜式P鏈，是由3個不連續(xù)的或者分隔的外顯子(V、D和J)和6個完整的外顯子(CH卜4外顯子，以及跨膜外顯子(TM)和胞漿外顯子(CY))編碼。鏈內、鏈間的二硫鍵(S-S)、碳水化合物()、以及CDRS(陰影框)的大致位置已作標示。圖3表示經(jīng)典CDR枝接技術實現(xiàn)人源化的過程的圖解。僅顯示重鏈可變區(qū)的CDR枝接。圖4顯示在人免疫系統(tǒng)的監(jiān)視下傳統(tǒng)人源化抗體如何可能是功能上外源的。盡管含有回復突變的鼠源框架殘基(o)的CDR枝接抗體具有看上去人的外觀，但當被抗原呈遞細胞(APC)內化時抗體將經(jīng)蛋白質水解被降解為短肽。隨后這些殘基與MHCII復合物結合而呈遞給T輔助細胞。當含有回復突變鼠源框架殘基的肽作為新的T細胞抗原表位出現(xiàn)時，它經(jīng)由MHCII呈遞并激活T輔助細胞，進而導致針對CDR枝接抗體的級聯(lián)免疫反應。圖5由5個不同V-、J-基因中的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3片段任意組合而產生的儲備多樣性。圖中只說明VL的重組。圖6由5個不同V-、J-基因中的V-J基因重組而產生的系統(tǒng)多樣性。圖中只說明了VL的重組。圖7描述了CA9的輕鏈可變區(qū)核苷酸序列和氨基酸序列?？蛳徊糠譃镃DRs序列。圖8描述了CA9和其他人源序列的VK區(qū)的序列比對。(A)核苷酸序列比對；(B)氨基酸序列比對?？蛳徊糠譃镃DRs序列。圖9描述了PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產物源自連續(xù)的寡核苷酸V區(qū)連接。第1-4道，連續(xù)的寡核苷酸V區(qū)連接的PCR擴增產物對應的孔分別含有12.5、25、50、100pmole固定化的FR4?？梢娂s320bp大小的電泳帶。第5道為bp標記。空白對照孔不含固定化的FR4，沒有電泳帶(未顯示)。圖10描述了用于評價TNF-a功能活性的測定方法(A)，TNF-a可介導L929細胞的細胞毒效應，和證明中和抗體，如CA9嵌合抗體如何能以劑量依賴方式抑制TNF-a介導的L929細胞毒效應。圖11在不同稀釋度比較了scFv-噬菌體和scFv-噬菌體克隆的中和活性，所述scFv-噬菌體含有原始CA9VK和VH序列(對照scFv-噬菌體)，所述scFv-噬菌體克隆含有來自微小多樣性VK文庫的VK序列和來自原始CA9的VH(scFv(VK文庫/VHCA9)噬菌體)。模擬噬菌體不含scFv。發(fā)明詳述本發(fā)明對噬菌體展示文庫(或其它類似文庫，如核糖體展示文庫)領域進行了重大改進，用以構建功能性人化抗體。本發(fā)明特別提供了各種免疫球蛋白序列數(shù)據(jù)庫和其DNA文庫。對于每種免疫球蛋白輕鏈FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4片段、以及對于每種免疫球蛋白重鏈FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4片段，提供獨立的確切形式的數(shù)據(jù)庫和DNA文庫。在實施或嘗試本發(fā)明的具體項目時，雖然有相似或等同的材料方法可供應用，此處仍詳盡描述了本發(fā)明偏好的實施方法、設施、和材料。由于這些因素會根據(jù)常規(guī)實驗的優(yōu)化狀況而作出變通調整，因此，應該理解本發(fā)明不應受限于所描述的某一具體組分、方法和步驟。此外，所使用的專門術語也僅僅是為了描述特定內容或實例具體，并不意味著對本發(fā)明范疇有何限制。本發(fā)明的權利訴求有專門的限制條款。除非另有定義，所用技術和科學術語都有相同含義，且為該領域的普通技術人員所知悉。若有歧義，以本發(fā)明為準。除非專門說明，本發(fā)明用詞"一種"、"一個"，意義為"至少一種、一個"。如上所述，本發(fā)明提供了一種構建噬菌體展示文庫的方法，特別是所構建的人免疫球蛋白文庫，最大程度地擴展了抗體多樣性貯備。眾所周知，噬菌體展示文庫可用于鑒別新穎的抗原結合分子。尤其當文庫初始抗體基因儲備得到擴展、并將潛在的功能片段表達于噬菌體表面，然后通過傳統(tǒng)的文庫篩選方法，迅速將各種特異性抗體分離出來?？贵w展示噬菌體的篩選過程，可應用自動化操作，如AutoPan和CysDisplay技術，高親和力結合分子單次洗脫，將具有潛力的候選分子數(shù)量降低到數(shù)百個或數(shù)千個。然后用AutoScree自動368-孔ELISA，對這些候選分子進行篩選。陽性克隆自動進行驗證、測序、錄入中央數(shù)據(jù)庫。此處所述的"一種免疫球蛋白"，是指由免疫球蛋白基因編碼的一條多肽或幾條多肽構成。典型的免疫球蛋白由兩條重鏈和兩條輕鏈配對而成。重鏈全長分子量約50kD(長約446個氨基酸)，由重鏈可變區(qū)基因(約116個氨基酸)和恒定區(qū)基因編碼。重鏈恒定區(qū)的各種同種型(isotype)，如a、Y(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、S，e和Mu序歹lJ，分別由對應的恒定區(qū)基因編碼。輕鏈全長分子量約25kD(長約214個氨基酸)，由輕鏈可變區(qū)基因(約IIO個氨基酸)和k或者A恒定區(qū)基因編碼。天然免疫球蛋白稱之為抗體，通常是由兩條相同的重鏈和輕鏈配對所形成的四聚體分子?？贵w的抗原結合是由配對輕重鏈的可變區(qū)來共同負責，而抗體的典型效應功能則由恒定區(qū)負責。本發(fā)明所應用的材料和方法，可用于鑒定和分離新穎的、無免疫原性的全人化抗體。本發(fā)明所述的全人化抗體須具備以下特征(1)免疫原性顯著降低、最優(yōu)選完全消除，因此，抗體可用于人體反復注射；(2)對原始抗原的免疫反應性的影響最小，包括抗原結合特異性和親和力(3倍以內)；(3)能夠介導人免疫效應子功能，例如補體固定、補體介導細胞毒性、抗體依賴型細胞毒性，等等。11抗體的免疫原性可進行常規(guī)分析測定，比如，典型的是在靈長類和人體臨床試驗測定。治療性抗體的免疫原性，可以通過所誘發(fā)的特異性T細胞表位鑒定來分析，或者通過測定正血色素紅細胞(NCE)剌激輔助T細胞反應、和/或者誘導遲發(fā)過敏樣反應來分析，可采用Antitope公司(英國劍橋)的EpiScreen技術完成自動測定。本發(fā)明所構建的免疫球蛋白，是新穎的、無免疫原性、功能性全人化抗體，治療性抗體通?？蓡为毰R床應用，也可與其它治療手段聯(lián)合應用，用于治療抗體基治療容易治療的疾病。例如，免疫球蛋白可用于過繼性免疫、或者通過補體介導的溶解作用來清除靶細胞和靶抗原，而不會像先前的抗體治療那樣，引發(fā)免疫副作用(如過敏性休克)。可選擇地，本發(fā)明的免疫球蛋白還可用作體外目的，例如作為特異性抗原檢測的診斷工具等。本發(fā)明抗體適合以裸抗體格式用作疾病治療目的，劑量范圍可以是50-400mg/m2，給藥途徑可以是病灶局部、皮下、靜脈、和肌肉注射等。以不同給藥間隔重復治療可望達到理想的臨床效果，如間隔一周、每周一劑共四周。本發(fā)明抗體可聯(lián)合其它治療手段應用，如化療藥物(如CH0P、阿霉素、5-氟脲嘧啶等)、放射治療、放射免疫療法、疫苗、酶、毒素/免疫毒素、或其它抗體等。例如，如果本發(fā)明免疫球蛋白是一個特異于抗腫瘤抗體獨特型的抗體，就可用作疫苗來剌激機體產生抗腫瘤的Ab3抗體反應。醫(yī)藥界所熟知的其它各種藥劑、或藥劑組合，也可與抗體聯(lián)合應用。本發(fā)明抗體還可用作為各種藥物的構成組分?？梢允锹憧贵w，或者與其它組分相偶聯(lián)，如藥物、放射性核素、毒素、細胞因子、可溶因子、激素、酶(如羧酸酯酶、核糖核酸酶)、肽、抗原(如腫瘤疫苗)、DNA、RNA、或者其它具有特異治療功效的分子，抗體作為這些偶聯(lián)分子的特異性靶向載體。此外，本發(fā)明免疫球蛋白或其衍生物，如抗體片段、單鏈Fv，雙抗體等，可用作融合蛋白與其它功能分子融合，如其它發(fā)明的抗體或抗體衍生物(例如雙特異抗體)、毒素、細胞因子、可溶因子、激素、酶、肽等。醫(yī)藥界所熟知的其它各種藥物組合，也可聯(lián)合應用。本發(fā)明的材料和方法可用于篩選抗原特異性的候選抗體。前文述及，本發(fā)明所構建的是新穎的、無免疫原性的、功能性全人化抗體，具有臨床治療和診斷價值。因此，本發(fā)明并不局限于特異性抗原范疇。本發(fā)明適用的靶點抗原的實例包括(但不限于此)，血小板表膜CD417E3糖蛋白1Ib/IIIa受體(關聯(lián)心血管疾病)、腫瘤壞死因子TNF(炎性疾病)、CD52(慢性淋巴細胞白血病)、IL-2a(移植排斥反應)、VEGF(黃斑變性、結直腸癌)、CD3(移植排斥反應)、T細胞VLA受體(多發(fā)性硬化癥)、CDlla(炎性疾病，如銀屑病)、CD20、CD22、CD19、恒定鏈li(非何杰金淋巴瘤、自身免疫疾病)、CD33(急性髓性白血病)、炎性IgE(過敏性哮喘)、呼吸道合胞病毒F蛋白(RSV感染)、ErbB2(乳腺癌)、CEA(結直腸癌、乳腺癌等腫瘤)、Mucin(乳腺癌、胰腺癌)、CD147(肝癌)、P-淀粉樣蛋白(老年癡呆癥)。所構建抗體的抗原結合特性，可通過傳統(tǒng)技術方法來測試，例如，直接或競爭性細胞結合分析(如細胞ELISA、流式細胞分析)、ELISA(抗原包被酶標板，酶標儀比色分析結合抗體)、Biacor測試(如抗體親和力測定)、等等。本發(fā)明抗體的臨床治療或診斷價值，也可通過傳統(tǒng)技術分析確認，例如，誘發(fā)靶細胞的補體介導細胞毒效應(CMC)、或抗體依賴細胞介導性細胞毒(ADCC)、或者阻斷酶和功能蛋白的特異活性(如，白介素抗體對白介素依賴的細胞增殖效應的特異阻斷)。具有高度多樣性的功能人化抗體文庫的構建先前的抗體技術，如CDR移植，已經(jīng)成功地減少了治療抗體的免疫原性。然而，這類抗體的多樣性，仍受制于可用人源框架序列數(shù)量、選擇與親代抗體高度同源的天然單一V基因框架序列(含F(xiàn)R1，F(xiàn)R2和FR3)。本發(fā)明所構建的免疫球蛋白，當被分解成短肽、并呈遞給宿主免疫系統(tǒng)后，將被視為"功能人化"，即，不對人體構成免疫原性。在結構和功能上，免疫球蛋白可變區(qū)分為7個伸展的線狀序列，即FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4。CDR1，CDR2和CDR3序列主要決定抗體特異性和親和力。這些CDRS形成物理間隔以劃分不同F(xiàn)Rs。雖然整個FRs框架平臺對于支撐CDR架構非常重要，F(xiàn)&中的關鍵殘基會與CDRS相互作用，從而影響到抗體親和力和特異性。雖然，天然免疫球蛋白FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2和FR3在遺傳學上是不可分隔的，只能在單一的V基因內編碼(圖2)。通過分子生物學技術處理，可從不同的V基因即人類V基因中分離出編碼FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2和FR3片段的核酸序列。同理，也可以從不同的J基因中分離出編碼免疫球蛋白可變區(qū)CDR3/FR4部分的核酸序列。因此，本發(fā)明的一種表現(xiàn)形式是，提供一個編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的核酸序列數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫包含源自V基因的隨機組合序列，獨立編碼FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2及FR3;源自J基因的隨機組合序列獨立編碼輕鏈可變區(qū)CDR3，F(xiàn)R4。這些序列組合形成核酸集和，每一個核酸集合中包含隨機選擇的片段組合，依次編碼輕鏈可變區(qū)FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4的氨基酸序列。在另一實施方式中，本發(fā)明提供一個能夠編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的核酸序列數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫包含源自V基因的隨機組合序列，獨立編碼FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，和部分CDR3;源自D基因的序列編碼部分CDR3的；源自J基因的序列編碼部分CDR3和FR4。這些序列組合形成核酸集和，每一個核酸集合中包含隨機選擇的片段組合，依次編碼重鏈可變區(qū)FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4的氨基酸序列。本發(fā)明數(shù)據(jù)庫中的序列片段源自哺乳動物V-，D-，J-基因，或是源自哺乳動物免疫球蛋白已知的核酸或氨基酸序列。所有序列最好選擇同一種屬，最佳選擇是人類基因或者人免疫球蛋白序列。對數(shù)據(jù)庫的某些天然核酸進行修飾，可根據(jù)密碼兼并性保留原來編碼，或以完成一些事先設計的突變，比如，突變用以確保免疫球蛋白多肽鏈正確折疊，或者用以維持/提高抗原結合特異性。從不同人免疫球蛋白V-、J-基因的集合體所構建的Ig序列，其重組的抗體蛋白仍可以被人體自身免疫系統(tǒng)視為功能上人化。首先，每一個片段(包括CDR》都是人源的、并且經(jīng)過免疫系統(tǒng)甄別為"沒有免疫原性"，因此沒必要用繁復的"肽段線性拉伸"來檢查是否還存在免疫原性線段，選擇替換氨基酸而降低免疫原性。其次，任意組合不同人抗體V基因的框架區(qū)和CDRs所達成的多樣性，已經(jīng)超越自然重組過程。因此，自由組合人FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4片段所構建的文庫，不僅能表達功能人化抗體，而且，文庫所具有的無窮多樣性(取決于人免疫球蛋白序列儲備量)，可能超過自然多樣性容量。本發(fā)明描述了由可變區(qū)序列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4(圖5)任意組合而構建抗體文庫的方法，其合成的免疫球蛋白是功能上的人化抗體。數(shù)據(jù)庫的多樣性由5種V基因和1種J基因任意組合決定，可通過所處情形的方法計算情形1:系統(tǒng)多樣性包括所有框架區(qū)和CDRS的任意組合135(FR1)X5(CDR1)X5(FR2)X5(CDR2)X5(FR3)X5(CDR3)X1(FR4)=56=15，625情形2:由于框架區(qū)對抗原特異性和親和力沒有太多影響，多樣性計算只考慮CDRS組合5(CDR1)X5(CDR2)X5(CDR3)=53=125因此，采用本發(fā)明由5種V基因和l種J基因產生的系統(tǒng)多樣性范圍是125到15，625(圖5)。天然免疫系統(tǒng)能產生的多樣性只是5(圖6)，前者具有顯著的多樣性優(yōu)勢。前文曾述及，天然免疫系統(tǒng)的多樣性約5.1X107(不考慮體細胞超突變)。鑒于本數(shù)據(jù)庫中FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4，可從100種人重鏈和輕鏈V基因序列任意組合，因此可估計出不同情形多樣性水平情形1:FR和CDR多樣性數(shù)量是1006=1012/每一鏈合計組合1012X1012=1024情形2:重鏈和輕鏈CDRS隨意組合的數(shù)量是2003=2X106/每一鏈合計組合=2X106X2X106=4X1012情形3:相關鏈中CDRS數(shù)量是1003=107每一鏈合計組合=106X106=1012在情形l，多樣性的主要貢獻來自不同的CDRs和FR任意組合。多樣性最高值為1024，由于FR主要構成CDRS的支撐平臺，F(xiàn)R對多樣性的貢獻可能不及CDRS。在情形2，多樣性估算沒有考慮框架區(qū)的貢獻，但可以考慮重鏈和輕鏈對應CDRs的任意組合。例如，重鏈CDR1可用于構建輕鏈數(shù)據(jù)庫中的CDR1，數(shù)據(jù)庫的多樣性可達4X1012;退而次之，比如重鏈CDRs只能用于對應重鏈的對應位置(即重鏈CDR1只能用以構建重鏈數(shù)據(jù)庫中對應位置的CDR1)，多樣性水平仍達到1012。上述任意一種情形，僅僅從IOO種V基因構建的輕、重鏈數(shù)據(jù)庫，其多樣性都遠勝于天然免疫系統(tǒng)(5.1X107)。人類抗體豐富的序列數(shù)據(jù)庫，將為構建輕鏈和重鏈可變區(qū)FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4，提供大量線性序列。理論上，其多樣性至少可匹敵天然免疫系統(tǒng)。事實上，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(Kabat's數(shù)據(jù)庫)，大約有170種重鏈和170種輕鏈(k+入)的可變區(qū)序列。以前述三種情形為例，數(shù)據(jù)庫多樣性在2.4X10"-1.68X10"范圍。通過不斷擴大抗體FR和CDR數(shù)據(jù)庫容量，將能建立具有超高多樣性的功能人化抗體數(shù)據(jù)庫。根據(jù)本發(fā)明，通過隨機組合FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4編碼序列，數(shù)據(jù)庫既可一次構建完成，亦可分步構建。如果在某一時期內所能采用的FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4序列數(shù)量有限，也能籍此構建出一個初始數(shù)據(jù)庫，以后隨著新序列增添，數(shù)據(jù)庫規(guī)模也會不斷擴增。本發(fā)明還包括一種提升抗體數(shù)據(jù)庫多樣性的方法，依據(jù)前述組合策略，向數(shù)據(jù)庫添加一個或多個編碼輕重鏈可變區(qū)或scFV的核酸序列，從而豐富數(shù)據(jù)庫的序列組合?？梢詮牟煌N族或患者供體來構建人免疫球蛋白數(shù)據(jù)庫。構建類似的數(shù)據(jù)庫，也可經(jīng)由靶抗原(如AIDS)免疫的靈長類動物。本發(fā)明所述的每一個文庫，其所包含的核苷酸序列都可列入數(shù)據(jù)庫，具體保存形式可以是儲存介質或是打印形式，比如電子的、磁性的或光學儲存介質，或是計算機可讀取的任何處儲存介質。本發(fā)明數(shù)據(jù)庫可與計算機聯(lián)機，聯(lián)機內存的指令由程序執(zhí)行。具有基本專業(yè)技能的人員都可應用本發(fā)明之數(shù)據(jù)庫，通過處理器執(zhí)行指令，如腳本、編程、或其它適用元件如可下載Java程序、插件，對數(shù)據(jù)進行分析和處理。可將一組定義數(shù)據(jù)庫功能的指令或程序，以多種方式傳達給處理器，范例包括永久信息(儲存于不可寫介質如只讀存儲器，可借助輸入輸出設備閱讀)，可變信息(儲存于可寫介質如軟盤、硬盤或閃盤，通過傳媒介質、或由普通專業(yè)人員采用的恰當方式傳遞給計算機)。以下提供的實例是對本發(fā)明的說明、而非限制。實例例1人化抗體cDNA文庫的構建從供體扁桃腺或外周血分離出漿細胞和成熟B細胞，還可直接從切除的腫瘤組織中分離浸潤B細胞或漿細胞。首先，實體組織經(jīng)DMEM(Gibco，Rockville，MD)浸浴手工分解，此步和隨后步驟須低溫操作、動作輕柔，盡量減少細胞裂解所致的mRNA污染。組織和血液樣本經(jīng)Ficoll梯度低溫離心純化(Histopaque1083，Sigma，StLouis，M0)，轉速2500r.p.m20分鐘，再經(jīng)由4°CSorvall離心富集漿細胞和淋巴細胞。細胞用10%匿S0懸浮、_80°C保存下備用。細胞用預冷PBS緩沖液洗滌一次，2000r.p.m離心2分鐘收集沉淀細胞。漿細胞染色按1:50比例用DMEM稀釋鼠抗人CD38熒光抗體(Caltag，Burlingame，CA)，4°C染色15分鐘。IgG+B細胞染色鼠抗人IgGFc熒光抗體(Caltag)，細胞經(jīng)PBS洗滌一次，2000r.p.m離心2分鐘后收集，PBS懸浮后經(jīng)FACS分離(MOFLOcellsorter,cytomation，F(xiàn)ortCollins,CO)，F(xiàn)ACS分離的前15%CD38+細胞，實際是純槳細胞(Mervilletal.，JE鄧.Med.，183，227-236(1996))。B細胞分離不需如此嚴格，因為其它細胞不表達膜Ig。有多種方法獲取人免疫球蛋白cDNA中V-基因序列。通常，采用特異于人Y重鏈、k和A輕鏈恒定區(qū)的反義引物來合成cDNA第一鏈。然后用一組包含大多V-基因序列的特異引物或兼并引物，來擴增cDNA的V-基因。V-基因序列擴增可按照標準RT-PCR程序(用幾組套式弓l物)(參見Lietal.，"EffectofVLandVHconsensussequence-specificprimersonthebindingandexpressionofamini—moleculeantibodydirectedtowardshumangastriccancer",ChinMedSciJ.，15:133-139(2000);Coronellaetal.，"AmplificationofIgGVHandVL(Fab)fromsinglehumanplasmacellsandBcells"，NAR28，No20e85(2000);Wangetal.，"HumanimmunoglobulinvariableregiongeneanalysisbysinglecellRT-PCR"，J"ImmunolMethods,20:244:217(2000));或者通過寡聚核苷酸輔助分裂和鏈接法(0NCL)(Schoonbroosdtetal.，"Oligonucleotide-assistedcleavageandligation:anoveldirectionalDNAcloningtechnologytocapturecDNAs，，，Applicationintheconstructionofahumanimmuneantibodyphage-displaylibrary,Nucl.AcidRes.，19:33(9):e81(2005))。有多種不同方法獲取cDNAV-基因序列，以下提供的實例是說明而非限制。逆轉錄短暫離心(30秒)后分別收集上清液和沉淀細胞(漿細胞和/或成熟B細胞)，此步及隨后操作中須保持培養(yǎng)皿低溫。工作區(qū)域和移液管事先滅菌，且與PCR操作區(qū)隔離。培養(yǎng)皿加入5ill預冷RT緩沖液B(含0.1%的Ig印alCA-630(sigma)1ii1，01igo-d(T)16(PerkinElmer，Norwalk，CT)1ii1，DNaseI-處理的酵母tRNA(BoehringerMa皿heim，India卿olis，IN)O.25ii1，5X第一鏈緩沖液1ii1，40U/ii1RNAsin(Promega，Madison，WI)O.5ii1，DEPCH201.5ii1)。RT培養(yǎng)皿65。C加熱1分鐘，冷卻至55°C30秒，45。C30秒，35。C30秒。23°C2分鐘，4°C下置于PTC-100熱循環(huán)儀(MJResearchlnc.，Waltham，MA)。然后反應管中加入5ii1預冷緩沖液C(含1ii1的10mMdNTPmix，1ii1的5X第一鏈緩沖液，1ii1的SuperscriptIIRNaseH-逆轉錄酶(Gibco)，2ill的DEPCH20)，反應體積20ill。RT反應42。C恒溫90分鐘。第一次PCR每一樣本進行3次PCR反應A輕鏈、k輕鏈和y重鏈。96孔培養(yǎng)板中Ready-To-Go反應珠(Pharmacia,Piscataway，NJ)用于隨后所有的PCR反應。每次反應使用20iim的5'引物0.5iil，20iim的3'恒定區(qū)引物0.5yl，水25yl，以及及單個細胞cDNA5ii1。5，引物組如Sblattero和Bradbury所描述(Sblatteroetal.，Immunotechnolog，3:271-278(1998))，為克隆目的而增加末端限制位點。3，恒定區(qū)引物(入恒定區(qū)引物CL2:CGCCG[TCTAGA]ACTATGAACATTCTGTAG(SEQIDNO:1);R恒定區(qū)引物2);IgGl鉸鏈引物CG1Z:GCATCT[ACTAGT]TTTGTCACAAGATTTGGG(SEQIDNO:3))如Burton和Barbas所描述(Burtonetal.，AdvImmunol.，59:191-280(1994))?？寺〔煌琕區(qū)序列的引物如Coronella等所述(2000.NAR.28:E85)，且能用于以下條件入:VL1B，VL3B，VL38B，VL4B，VL7/8B，VL9B，VL11B，VL13B，VL15B各0.5ii1;CL20.5ii1，水20ii1，cDNA5iU。k:VK1B，VK2B，VK9B，VK12B各0.5ii1;CK1Z0.5iil，水22.5ii1，cDNA5ii1。y:VH4B，VH5B，VH6B，VH10B，VH12B，VH14B，VH22B各0.5ii1;CG1Z0.5ii1，水21ii1，cDNA5ii1。第一次PCR反應需要在94t:下進行4分鐘初始加熱，隨后經(jīng)35次循環(huán)94。C下1分鐘(變性)，55t:下2分鐘(退火)，72t:下3分鐘(延長)。最后1分鐘的延長也在72°C下完成?；蛘撸梢赃x擇針對不同種免疫球蛋白IgA，IgM或IgD恒定區(qū)序列的特異引物，分別用以擴增IgA，IgM，IgD的V-片斷序列。第二次PCR第一次PCR反應產物作為第二次套式PCR的模版，每次反應包含5'可變區(qū)引物0.5ii1，3'恒定區(qū)引物0.5iU，水24iU，第一次PCR反應產物lyl，并使用ReachTo-Go反應珠。A套式3'引物(Lnest:GC[TCTAGA]ACTAATGCGTGACCTGGCAGCTGT)(SEQIDNO:4)，k(Knest:GC[TCTAGA]ACTAATGGGTGACTTCGCAGGCGTAGAC)(SEQIDNO:5)禾PIgG重鏈(Hcnest:GG[ACTAGT]GTTGCAGATGTAGGTCTGGGTGC)(SEQIDNO:6)也都用于第二次PCR反應。擴增條件與第一次PCR相同，不同的是退火在60°C進行。序列分析第二次PCR產物(5ill)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。反應產物經(jīng)純化(QiagenQiaquik，Valencia,CA)后直接克隆入TA載體(Invitrogen)，應用TA克隆載體特異引物(PerkinElmerABIPrism染料終止序列)，對克隆cDNA序列進行自動測序析。然后用McVectorDNA軟件將cDNA序列翻譯成氨基酸序列，并與Kabat數(shù)據(jù)庫進行比對，確認氨基酸序列是否源自免疫球蛋白。依據(jù)Kabat分類，所有免疫球蛋白V-基因片段序列分為FRl，16CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4子片斷，編碼子片段的cDNA序列和這些子片段的氨基酸序列都將編入數(shù)據(jù)庫，形成包含框架區(qū)和CDRS子庫的集合體。實施例2含任意組合框架區(qū)和CDRS的人V區(qū)文庫構建如例1所述，含不同重鏈和輕鏈FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4編碼序歹廿的子庫源自Kabat數(shù)據(jù)庫(Kabatetal.，，，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest"(5thedition),USD印tHealthandHumanServices,USGovernmentPringtingOffices(1991))。所有FR和CDR片段均由化學合成的寡核苷酸組合而成。簡言之，某一特定序列的互補DNA寡核苷酸經(jīng)由化學合成。在退火條件下，等同分子濃度的互補寡核苷酸混合形成平端雙鏈DNA。源自數(shù)據(jù)庫的各種框架區(qū)和CDRs的序列片段，可經(jīng)冷凍或凍干保存?zhèn)溆?。當子庫容量達到設定的多樣性數(shù)量時，即可按恰當順序，如FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，順次總裝V-序列數(shù)據(jù)庫。VH和VL基因的組合起始于FR4有義鏈固定。編碼FR4的寡核苷酸固定語凝膠墊或凝膠芯片。簡言之，用親和硅烷(LKB)處理玻板，然后在玻板表面聚合形成20ym后聚丙烯酰胺凝膠(8%丙烯酰胺/0.28%雙丙烯酰胺)層。劃線機從膠板X-Y方向切割膠條，筑成40X40iim(間隔80iim)或100X100ym(間隔200ym)的芯片陣列。聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)水合肼處理，凝膠胺基被肼基置換而活化，施用疏水硅烷(LKB)處理膠條間的玻璃空隙。固定用的寡脫氧核苷酸由3'端的3-甲基尿苷合成，經(jīng)^104氧化激活產生二醛基，而將凝膠的肼基交聯(lián)起來?；罨墓押塑账崛芤航?jīng)one-pinrobot轉移至微芯片，降溫凝結芯片表面水。用礦物油(Nujolmineraloil,Schering-Plough)覆蓋完全膨脹的凝膠芯片，置于20°C48小時以固定寡核苷酸，然后用乙醇和蒸餾水洗去礦物油。微芯片干燥備用，4t:可保存1年。示例參見Yershovetal.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，4913—4918。將預先合成的FR4有義鏈固定在固體支持物上(Khrapkoetal.，F(xiàn)EBSLett.，256:118-122(1989);Khrapkoetal.，DNASeq.，1:375-388(1991);Lamtureetal.，NAR，22:2121-2125(1994);Ghuetal.，NAR，22:5456-5465(1994))?；蛘撸苯釉诠腆w支持物表面合成FR4有義鏈(Southernetal.，Genomics,13:1008-1017(1992);Fodoretal.，Science,251:767-773(1991);Peaseetal.，PNAS，91:5022-5026(1994))。對固定的序列進行原位退火和連接。將lpmol的FR4有義鏈寡核苷酸固定在凝膠芯片(100fmol/0.1X0.1X0.002mm芯片)。在10ill雜交緩沖液中進行退火，雜交緩沖液含1PM反義FR4(未磷酸化)。反義寡核苷酸溶液保存于9(TC，取1滴lOiU的熱雜交溶液放在芯片上，加蓋片室溫溫育5分鐘。37t:下蒸餾水洗滌10分鐘，洗去未退火的寡核苷酸。在與對應的有義鏈(未磷酸化)合成DNA雙鏈(表達其余框架區(qū)和CDRs)之前，所有反義寡核苷酸(除FR4之外)須進行5'末端磷酸化。10y1反應混和物在37t:下磷酸化60分鐘，反應混合物含1XPN激酶緩沖液(EpicentreTechnologies,USA)，500pmolATP，0.5U的T4多聚核苷激酶(EpicentreTechnologies,USA)。這將確保平端定向連接是以正確次序、在正確片斷上進行(有義鏈的磷酸化5'末端才能與固定的序列連接)。連接反應是在相似條件下進行。簡言之，將4微升CDR3連接混合物置于芯片上，連接混合物含有0.5倍稀釋的4pmo1平端-退火CDR3雙鏈DNA和1U的T4DNA連接酶(BoehringerMannheim,USA)，以及稀釋1倍的連接緩沖液(RapideDNALigationkit,BoehringerMa皿heim，USA)。連接反應是在100%濕度、室溫條件下進行12小時。洗去連接的CDR3DNA。依照雙鏈FR3，CDR2，F(xiàn)R2，CDR1和FR1順序，連接-洗滌循環(huán)反復進行。也可經(jīng)由定向粘性末端克隆，依序完成連接。圖7說明了一種可能的方案。同樣，除FR4之外，所有FR和CDR片段的反義鏈都要磷酸化，以確保定向連接。然而，帶有突出粘性末端的雙鏈DNAs被引入，F(xiàn)R4的5'突出粘性末端的帶有3個交錯的核苷酸(圖7)。對于雙鏈CDR3，磷酸化的反義鏈在CDR之外擁有3個外凸的5'突出粘性末端，5'突出粘性末端攜帶有簡并核苷酸(A/T/G/C)(A/T/G/C)(A/T/G/C)(用XXX表示)；反義鏈還有3個外凸的3'突出粘性末端，帶有源自CDR的界定序列(用000表示)。FR4有義鏈的5'突出粘性末端的界定序列，將選擇CDR3的簡并5'突出粘性末端的恰當序列進行退火，然后連接。此外，CDR3雙鏈DNA的不兼容上游懸突結構和不對稱磷酸化(只在反義鏈)，將確保粘性末端的定向連接。CDR3帶有的簡并序列不能退火，也不能與FR4的突出粘性末端序列連接，所以將被洗除。對于FR3的連接，未磷酸化的有義鏈在FR3序列之外具有3個外凸的3'突出粘性末端，突出粘性末端帶有簡并核苷酸；有義鏈還有3個外凸的5'突出粘性末端，帶有界定的FR3序列。應用相似的替換策略，連接就能有效地定向進行(圖7)。—個通用的粘性末端序列，是在所有FR1片段的上游位置摻入，在所有FR4片段下游位置摻入，這樣有利于隨后的連接序列連接、亞克隆進入最終表達系統(tǒng)。例如，在VH-linker-VL排列結構中，SfiI在FR1通用粘性末端序列的上游位置摻入，NotI在FR4通用粘性末端序列的下游位置摻入，以便于克隆進入噬菌粒載體如pCANTAB5E。這些序列組合進入以scFv或Fab為形式的噬菌體展示文庫(Caietal.，PNAS，93:6280-6285(1996);Barbasetal.，PNAS，95:10164-10168(1992))?；蛘撸M合進入篩選用核糖體展示系統(tǒng)(Hanesetal.，PNAS，95:14130-14135(1998);Schaffitzeletal.，IImmunolMethods,231:119-135(1999))?！獋€通用的引物序列，可在所有FR1上游位置隨意摻入，而在所有FR4下游位置隨意摻入，這樣有利于后面的連接序列進行連接、亞克隆進入最終的表達系統(tǒng)。例如，在VH-linker-VL排列結構中，SfiI位點帶有5'-GAATTCGGCCCAGCCGGCC-3'(SEQIDNO:7)序列，在所有VHFR1的上游位置摻入，部分連接序列(5'-GGCACCACGGTCACCGTC-3')(SEQIDNO:8)在所有VHFR4下游位置摻入(圖8)。同理，部分連接序列(5'-GCTCACTCAGTCTCCA-3')(SEQIDNO:9)在所有VLFR1上游位置摻入，Notl(含5'-GCGGCCGCAGGTGCGCCG-3'序列)(SEQIDN0:10)在所有VLFR4下游位置摻入。引物A(5'-GAATTCGGCCCAGCCGGCC-3，)(SEQIDNO:11)和引物B(5'-GACGGTGACCGTGGTGCC-3，)(SEQIDNO:12)用于PCR擴增所有的組合VH序列；引物C(5'-GCTCACTCAGTCTCCA-3')(SEQIDNO:13)和引物D(5'-CGGCGCACCTGCGGCCGC-3')(SEQIDNO:14)用于PCR擴增所有的組合VL序列(圖8)。采用標準的重疊PCR連接擴增的VH與VL序列。對VH_1inker-VL的PCR產物在SfiI和NotI位點進行限制性酶解，以備隨后的亞克隆進入噬菌粒載體pCANTAB5E。也可應用其它噬菌粒載體。VH和VL序列摻入噬菌體展示庫，如scFv(或Fab)展示庫(Caietal.，PNAS，93:6280-6285(1996);Barbasetal.，PNAS，95:10164-10168(1992))。另一種方式是，VH和VL序列摻入篩選用的核糖體展示系統(tǒng)(Hanesetal.，PNAS，95:14130-14135(1998);Schaffitzeletal.，IImmunolMethods,231:119-135(1999))。實施例3噬菌體展示庫的構建應用重疊PCR，以及VH和VL上下游通用粘性末端的特異引物，將源自不同F(xiàn)R和CDR片段(見例2)的可變區(qū)VH和VL序列連接起來，形成編碼抗體單鏈可變區(qū)片段(scFv)的DNA序列。通過一序列為(GGGGS)3(SEQIDNO:15)的連接肽(其它連接序列和長度亦可)，將VH和VL序列連接起來。參見圖8。PCR反應容積50iil，含1XPCR緩沖液(Invitrogen)，1.5mM的MgCl2(Invitrogen)，0.2mM的d證(Promega)，0.04U/ii1的鉬Taq聚合酶(Invitrogen)，各50ng合成Ig基因VH或VK，0.2iiM引物。經(jīng)過94°C3分鐘的預變性后，在Mastercycler⑧PCR儀(帶有25孔鋁板，Eppendorf)內進行25次延長循環(huán)，每個循環(huán)包括94。C變性40秒，50°C退火40秒，72°C延長40秒，及隨后的72°C再延長10分鐘。每一連接體-連接的VH與VL的5illPCR產物，用作重疊PCR的模板。重疊PCR反應混和物容積50ii1，含1XPCR緩沖液(Invitrogen)，2.5mM的MgCl2(Invitrogen)，0.2mM的dNTP(Invitrogen)，0.04U/ii1的鉬Taq聚合酶(Invitrogen),5ill的第一步PCR反應產物(VH和VK)，0.2yM的側翼引物。混合物在94"C下預變性3分鐘，接著在Mastercycler⑧PCR儀(帶有25孔鋁板，E卯endorf)內進行25次延長循環(huán)。每個循環(huán)包括94t:變性60秒，5(TC退火60秒，72。C延長60秒。在72。C延長溫育10分鐘之后，PCR產物(編碼一個scFv的DNA)在4。C下保存?zhèn)溆?。?jīng)過重疊PCR之后，用QIAquickPCRPurificationKit(Qiangen)純化單鏈可變區(qū)片段(scFv)。純化PCR產物經(jīng)由SfiI酶解，50iU酶切溶液含1XNE緩沖液2(NewEnglandBiolabs)，補充0.01%BSA，5U的SfiI限制內切酶，lug純化scFvDNA。反應混合物37。C溫育過夜，酶解產物經(jīng)QIAquickNucleotideRemovalKit(Qiagen)純化回收，然后經(jīng)由Notl酶解，50iU的反應溶液含1XNE緩沖液3(NewEnglandBiolab)，補充0.01%BSA(lXNEB-BSA，NewEnglandBiolabs)，5U的NotI限制內切酶，以及經(jīng)Sfi1-7水解后純化的scFv的DNA。反應混合物37。C溫育過夜，SfiI/NotI水解后的scFvDNA經(jīng)由凝膠純化(QIAquickGelExtractionKit;Qiagen)，以備隨后亞克隆。噬菌粒載體pCANTAB5E經(jīng)SfiI和NotI雙解線化，將酶解scFv片段亞克隆至載體相應位點。然后在1XT4連接緩沖液(Invitrogen)中進行連接，載體與插入分子比例為1:3，DNA總濃度<100ng。由連接的DNA構建成scFv序列庫(scFv-pCANTAB5E)，電穿孔法將其導入大腸桿菌TGI(Stratagene)。簡言之，將2ii1scFv-pCANTAB5E與20ii1感受細胞TGI混合，置于無菌電穿孔管(0.l-cm-g即，BioRad)。樣品經(jīng)l次脈沖電擊(2000V,25yF，200'Q)后，加入S0C培養(yǎng)基1ml以懸浮細胞，然后將細胞移至無菌14-mlFalcon聚丙烯圓底離心管(BDBiosciences)，37t:搖床(250rpm)溫育1小時。合并全部轉化培養(yǎng)，系列稀釋(1X，10—、，10—2X和10—3X)后涂布于SOBAG平板(SOBAG培養(yǎng)基，含1.5%Bacto-arga(BDBioscience)禾P100iig/ml氨節(jié)青霉素(Sigma),3(TC溫育過夜，測算轉化效率(文庫容量)剩余培養(yǎng)4。C離心(4000rpm)5分鐘，用10mlS0BG培養(yǎng)液(含100yg/ml氨芐青19霉素，5mMMgCl2)懸浮沉淀細胞，冰育15分鐘，偶爾輕搖。分光光度計600nm吸光值測算細胞數(shù)量(108細胞/ml的0D6。。值為0.4)。懸浮細胞中加入M13K07援救噬菌體，感染復數(shù)比3:1，M13K07噬菌體感染37。C靜置溫育30分鐘，然后搖床(200rpm)溫育30分鐘。感染培養(yǎng)液4。C離心(4000rpm)10分鐘，沉淀細胞以10ml2X-YT培養(yǎng)液懸浮，培養(yǎng)液含100yg/ml氨芐青霉素和50yg/ml卡那霉素。懸浮細胞經(jīng)系列稀釋(1X，10—、，10—2X和10—3X)后涂布SOBAG-K平板(SOBG培養(yǎng)基，含0.5%Bacto-arga，100yg/ml氨芐青霉素，50yg/ml卡那霉素)，37"溫育過夜(>20小時)，測算噬菌體援救率。剩余懸浮細胞用2X-YT培養(yǎng)液(含100iig/ml氨芐青霉素和50iig/ml卡那霉素)補足至50ml，37t:搖床(250rpm)溫育過夜，用于重組scFv-噬菌體制備。實施例4抗原特異性噬菌體展示文庫的篩選從例3獲取的過夜培養(yǎng)物置冰上溫育15分鐘，4t:離心(6000rpm)10分鐘。將含重組scFv-噬菌體的上清移至預冷的50ml離心管，每25ml上清中加入5mlPEG/NaCl溶液(20%聚乙二醇8000(Sigma)，2.5MNaCl(Sigma))，冰育1.5小時，4。C離心(10，OOOrpm)30分鐘，收集重組噬菌體沉淀，用2ml2X-YT培養(yǎng)液(含1%BSA)懸浮噬菌體。為確定scFv-噬菌體效價，取2iil懸浮噬菌體用200ii12X-YT培養(yǎng)液連續(xù)稀釋(10—2X，10—4X，10—6X，10—8X和10—1QX)。從每一滴度稀釋液中取出2iil，加入200ia對數(shù)生長期大腸桿菌TGl，37t:溫育30分鐘(不需搖振)，以備scFv-噬菌體感染。對數(shù)期TGI的制備將100ii1TGI接種入10ml2X-YT培養(yǎng)液(含5mMMgCl2)，培養(yǎng)過夜。接種經(jīng)37t:搖床(250rpm)溫育，直至0De。。吸光值達到0.4-0.5。細菌培養(yǎng)液用冰預冷20分鐘備用。重組噬菌體感染后，將100ii1感染TG1細胞涂布SOBAG板(SOBG培養(yǎng)基，含1.5%Bacto-arga和100yg/ml氨芐青霉素)，30。C溫育過夜。剩余重組噬菌體濃集物中加入2倍容積的scFv-噬菌體封閉緩沖液(含1XPBS，0.2%TrionX-100(Sigma)，0.01%NaN3(Riedel-deHaen)，0.1%BSA(Sigma)，10%脫脂奶(Nestle))，室溫下預封閉30分鐘。24孔培養(yǎng)板(Corning)預先包被特異抗原，每孔加入0.5ml封閉液稀釋的重組噬菌體。亦可將501含有特異抗原的PBS包被于PVC微量滴定板上，室溫下濕盒溫育2小時，用PBS洗去游離抗原。示例參見HarlowEAndLaneD.1988.In:Antibodies:ALobroatoryMan皿al.p.564.CSHLPress。提前1天準備篩選用的預封閉培養(yǎng)板，將特異抗原溶于包被緩沖液pH9.6(15mMNa2C03(Sigma)，35mMNaHC03(Sigma))，抗原終濃度10iig/ml，每孔井加入lml抗原溶液。4t:輕微搖振溫育過夜，孔井用3ml硼酸緩沖液pH8.0(26mM的Na2B407，lOOmM的H3B03，0.1%BSA，100mM的NaCl，3mM的KCl，O.5%吐溫_20)洗滌3次，再用2.5ml相同緩沖液37t:下封閉2小時，篩選前用3ml硼酸緩沖液洗滌3次。篩選是在室溫下輕微搖振溫育2小時。去除游離scFv-噬菌體之后，以1XPBS用力震蕩洗滌培養(yǎng)板孔井5次，每次30秒，再用2.5mlPBS(含O.1%Tween-20，USB)洗滌10次。洗滌完畢，用100ill0.1Mglycine-HCl緩沖液(pH2.2)將板孔上結合的scFv-噬菌體洗脫下來，并即用lOiillMTris-HCl緩沖液(pH8.0)中和。合并洗脫的scFv-噬菌體，用于再感染50ml對數(shù)期TGI(含2%葡萄糖和5mMMgCl2)。再感染條件37t:下靜止溫育30分鐘，然后搖振(200rpm)溫育30分鐘。將100ii1再感染TG1培養(yǎng)物作系列稀釋(1X，10—1X，10—2X和10—3X)，涂布SOBAG板，30。C溫育過夜，測算文庫效價。剩余再感染培養(yǎng)液中加入終濃度5X109pfu/ml的M13K07輔助噬菌體(含100yg/ml氨芐青霉素)，進行噬菌體援救。超感染在37t:靜止溫育30分鐘，，然后搖振(200rpm)溫育30分鐘。援救培養(yǎng)冰育10分鐘，4t:離心(4000rpm)10分鐘，將援救細胞沉淀懸浮于50ml2X-YT培養(yǎng)液中(含100yg/ml氨芐青霉素，50yg/ml卡那霉素)。將100yl援救培養(yǎng)物作系列稀釋(1X，10—丄X，10—2X和10—)，涂布S0BAG-K板，37。C溫育過夜(>20小時)，測算第二輪篩選文庫的效價。剩余的援救培養(yǎng)液在37t:下?lián)u床(250rpm)溫育過夜，產生的重組噬菌體以備下一輪篩選。篩選過程重復2次，每次篩選都使用IO倍系列稀釋的包板抗原。二輪篩選之后，用50ml對數(shù)期TGl(含2X葡萄糖，5mMMgCl2)的再感染第2輪洗脫物?；旌衔镏?7t:靜止溫育和搖振(200rpm)溫育，將100iU再感染培養(yǎng)物作系列稀釋(IX，10—^，10—2X和10—3X)，涂布SOBAG板，測算效價。剩余的再感染培養(yǎng)液經(jīng)4"離心(4000rpm)10分鐘，收集沉淀細胞并懸浮于8ml2X-YT培養(yǎng)液(含20%葡萄糖)，分瓶于-7(TC儲存。應用噬菌體-ELISA法，對每一單克隆的重組噬菌體的抗原特異性進行分析，以第2輪篩選的單克隆TG1接種lml2X-YT培養(yǎng)液(含2%葡萄糖，5mM的MgCl2，100yg/ml氨芐青霉素)，37t:搖振(250rpm)溫育4_5小時，按100iU培養(yǎng)液制備甘油菌，-7(TC儲存。剩余培養(yǎng)液中加入2X108pfu/mlM13K07輔助噬菌體，援救培養(yǎng)置于37"靜止溫育和200rpm搖振溫育來輔助感染。培養(yǎng)液經(jīng)4t:離心(4000rpm)10分鐘后，沉淀細胞懸浮于2.5ml2X-YT培養(yǎng)液(含100yg/ml氨芐青霉素和50yg/ml卡那霉素)，培養(yǎng)液置于37°C搖振(250rpm)溫育過夜以制備重組噬菌體，4"C離心(4000rpm)15分鐘。收集含上清液的scFv-噬菌體，4"C儲存，用于噬菌體-ELISA檢測。用96孔ELISA板進行噬菌體-ELISA檢測，板孔用50y1抗原溶液包被(pH9.6碳酸緩沖液，含50iig抗原)。4t:溫育過夜，所孔用200ii1的硼酸鹽緩沖液(pH8.0)洗滌3次，再用硼酸鹽緩沖液于37t:下封閉1小時。封閉之后，用200iU的硼酸鹽緩沖液洗滌3次，孔井中加入lOOiU含scFv-噬菌體上清，37t:溫育1小時。溫育后用200ii1的硼酸鹽緩沖液(pH8.0)洗滌板孔5次，加入100y1經(jīng)硼酸緩沖液稀釋5000倍的酶標抗體(HRP/anti-M13mouseAb，Amersham)，37。C溫育1小時，200ii1硼酸鹽緩沖液洗滌3次，然后加入100iU鄰苯二胺(OPD，Sigma)底物溶液顯色。底物溶液配制將10mgOPD溶于10ml擰檬酸-磷酸緩沖液(24mM擰檬酸(sigma)，51mMNa2HP04(sigma)，pH5.0)，加入8ii130%H202。室溫顯色1小時后，加入100yl40%H2S04(sigma)終止顯色。呈色強度用Sunrise酶標儀(Tecan)測定。將0D450nm值大于1.5倍均值的樣本視為潛力噬菌體而篩選出來，用對照抗原(BSA)和核苷酸序列，進一步對候選噬菌體進行噬菌體-ELISA測試分析。實施例5從陽性噬菌體庫到功能化抗體的先導轉化對抗原特異性scFv-噬菌體進行DNA測序。用特異引物在恰當?shù)目寺∥稽c摻入，21將scFv-噬菌體VH和VL進行PCR擴增，然后將VH和VL亞克隆至對應的階段載體。制備2個質粒載體以用于功能人化抗體基因的構建和表達，質粒pEY1包含一個人IgG啟動子和增強子、包括部分前置內含子的人染色體CY1片段、以及一個鳥嘌呤_次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(gpt)基因；質粒pEK與pEYl相似，不同在于pEK包含人染色體CK片段和潮霉素基因。為表達功能人化抗體，用電穿孔法將重鏈和輕鏈質粒轉染Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞，選擇潮霉素表達細胞。通過ELISA檢測，選擇具有最大抗體表達量的克隆。測定純化抗體對特異性抗原(或者表達表面特異抗原的細胞)的結合力。實施例6在有限序列內構建一個抗TNF-a含任意組合框架區(qū)和CDRS的人輕鏈V區(qū)文庫為闡述本發(fā)明的概念，以抗TNF-a抗體CA9的輕鏈V_基因文庫的構建來說明。圖7列出抗TNF-a抗體CA9的輕鏈可變區(qū)(VK)的氨基酸及核酸序列。序列同源性檢索(sequencehomologysearch:IgBlastagainstKabatsystem:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)找到兩個與CA9的VK序列相似度高達65.4-66.4%的人輕鏈VK序列(圖8)，分別為CAG27043(Immunoglobulinkappalightchainvariableregion[Homosapiens])與ABA26038(Immunoglobulinlightchainvariableregion[Homosapiens])。以上被篩選過的人FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4序列(圖8)可通過隨機組合的方式，按FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的排列順序，制備一個小型的抗體文庫。這樣的隨機組合，理論上可得出36(729)種不同序列。重組的單鏈序列可與原來的CA9重鏈可變區(qū)序列配對，制備一個scFv噬菌體展示文庫。篩選后，強親和力并特異于TNF-a抗原的scFv噬菌體會被擴增，其輕鏈V區(qū)序列會被測序。化學合成編碼不同F(xiàn)R與CDR的互補寡核苷酸(Invitrogen)應有如下特性(1)在編碼FR4段的有義鏈的5'末端胺化(amine-modified)，方便固定在DNA-BIND板上)；(2)FR3除外，所有編碼FR及CDR段的有義及反義鏈只來自一個合成循環(huán)內產生的寡核苷酸；(3)編碼不同CDR段分別在反義鏈5'突出粘性末端帶有四個簡并核苷(degeneratenucleotides)[(A/T/G/C)(A/T/G/C)(A/T/G/C)(A/T/G/C)]，及3，突出粘性末端帶有五個預設的序列；(4)編碼FR1與FR2的有義鏈均在3'突出粘性末端帶有五個簡并核苷(degeneratenucleotides)[(A/T/G/C)(A/T/G/C)(A/T/G/C)(A/T/G/C)(A/T/G/C)]，及5，突出粘性末端帶有四個預設的序列；(5)編碼FR3的有義及反義鏈會分開兩個半段合成；N-FR3代表N-端的半段，C-FR3代表C-端的半段；(6)C-FR3段的有義鏈在3'突出粘性末端帶有五個簡并核苷(degenerate皿cleotides)[(A/T/G/C)(A/T/G/C)(A/T/G/C)(A/T/G/C)(A/T/G/C)]，N-FR3段的有義鏈在5'突出粘性末端帶有四個預設的序列。混合等滲濃度的FR4有義與反義鏈，94。C加熱10分鐘，室溫下退火。雙鏈FR4DNA用01igoBindingBuffer(OPB)(50mMNa2P04，pH8.5，lmMEDTA)稀釋。10Q1稀釋過的FR4段以12.5，25，50與100pmo1/孔的濃度加到DNA-BINDTt^R(Costar)。DNA-BIND板的聚苯乙烯表面共價連接了一層可與如伯胺等的親核分子發(fā)生作用的N-氧琥珀酰亞胺酯(NOS)基團(Costar)。特異偶聯(lián)在DNA-BINDTM表面的DNA并不容易洗掉。在4。C及加濕的培養(yǎng)箱溫育過夜后，用無菌的DPBS(pH7.4)把沒有偶聯(lián)的寡核苷酸洗掉，DNA-BINDTM內余下活性基團用稀釋于0PD內3%牛血清白蛋白(BSA)封鎖。再用無菌的DPBS(pH7.4)清洗。所有反義FR與CDR寡核苷酸的5'末端均用T4多核苷酸激酶(T4poly皿cleotidekinase)磷酸化[251雜交緩沖液內包含1X前反應緩沖液(forwardreactionbuffer)(Invitrogen)，lmMATP(Invitrogen)，10單位T4多核苷酸激酶(Invitrogen)，2M反義寡核苷酸]。磷酸化在37"C進行，溫育超過50小時后，再在65"C溫育20分鐘終止反應。混合等滲濃度的有義鏈與相應的磷酸化反義鏈FR(FR4除外)與CDR寡核苷酸，保存94°C10分鐘。室溫下退火形成雙鏈CDR3，N-FR3，C-FR3，CDR2，F(xiàn)R2，CDR1與FR1。FR3合成在25微升的體積內加入等滲濃度的N-FR3及C-FR3，IX連接緩沖液(Invitrogen)與1UT4DNA連接酶(Invitrogen)。連接反應在4。C下溫育過夜，再在65°C下終止反應。連接反應在25微升的體積內進行；反應混合物包含4pMCDR3雙鏈DNA，1XT4DNA連接緩沖液(Invitrogen)與1UT4DNA連接酶(Invitrogen)。在4t:及加濕的培養(yǎng)箱溫育8小時或過夜。用無菌的DPBS(pH7.4)把沒有連接上的CDR3DNA洗掉。雙鏈FR3，CDR2，F(xiàn)R2，CDR1與FR1會以方向性粘性末端克隆的方法連續(xù)順序反復循環(huán)連接_洗滌完成。在反義FR4的5'端及有義FR43'端加入了一個NotI限制性酶位點。連接_洗滌后，在50微升的體積內，力B入lXNEBuffer3(NewEnglandBioLabs)，IXBSA(NewEnglandBioLabs)與10UNotl酶(NewEnglandBioLabs)。在37。C及加濕的培養(yǎng)箱溫育過夜。反應混合物轉置于0.5毫升微量離心管后溫育65°C20分鐘去終止反應?！獋€通用的粘性末端序列，是在FR1片段的上游位置摻入(DL-R引物AGCTCGACATCCAGCTGACTCAGTCTCCAG)及在FR4片段下游位置摻入(DL-F弓|物TGAGCGGCCGCTTTGATCTCCA)。PCR反應容積50ii1，含1XPCR緩沖液(Invitrogen)，1.5mMMgCl2(Invitrogen)，0.2mMd證(Promega)，0.04U/ml鉬Taq聚合酶(Invitrogen),與51Notl-酶解物?；旌衔镱A變性3分鐘，接著在Mastercycler⑧PCR儀(帶有25孔鋁版，Eppendorf)內進行30次延長循環(huán)。每個循環(huán)包括94。C變性45秒，6(TC退火45秒，及72°C延長45秒。最后在72t:延長溫育10分鐘。PCR后，15iU的PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳UV照明分析。在一個試合成實驗，用如圖9的序列排列，按照上術程序合成連接一輕鏈V序列。簡言之，帶有胺基的雙鏈FR4被固定在DNA-BIND板表面，再順序地將CDR3，F(xiàn)R3(連接N-FR3與C-FR3而成)，CDR2，F(xiàn)R2，CDR1，與FR1連接。連接后的成品通過Notl酶切釋放，再以通用的側翼引物組合(DL-R與DL-F引物)PCR放大。圖9展示了合成后PCR產物的凝膠電泳分析，說明FR與CDR片段順序連接可以得出完整的V區(qū)序列。實施例7特異TNF-a并帶有CA9VH序列及在有限FR及CDR序列下隨機組合合成輕鏈的scFv噬菌體鑒別及特性檢測例6描述的合成人VK序列與CA9VH序列結合成的scFv噬菌體文庫經(jīng)過三次遞增壓力篩選循環(huán)，找出對TNF-a高親和力的scFv噬菌體，如例四所術。TNF_a能誘導L929(鼠纖維肉瘤)細胞毒凋亡(圖10A)。CA9的嵌合抗體可以中和TNF-a誘導的L929細胞毒效應(圖IOB)。相同的檢測方法可以應用到評估scFv噬菌體對TNF-a誘導的細胞毒效應的中和能力。通過三次不同遞增壓力篩選循環(huán)，克隆出一個scFv噬菌體。經(jīng)過放大的scFv噬菌體以TNF-a誘導的細胞毒法來評估其中和能力。如圖十一所示，相關的噬菌體以劑量依賴的方式中和TNF-a誘導的L929細胞毒效應，其中和能力比包含原來鼠CA9的VK與VH序列的對照噬菌體更高。產業(yè)應用本發(fā)明提供的免疫球蛋白序列數(shù)據(jù)庫和對應DNA文庫，包含隨機組合的重鏈和輕鏈可變區(qū)FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4序列，用于構建功能性人化抗體文庫。文庫具有超越天然免疫系統(tǒng)的多樣性儲備。應用本發(fā)明的人免疫球蛋白噬菌體展示文庫，用來表達新穎的、無免疫原性的、全人化抗體，和用來篩選抗原靶點特異性的抗體。本文所提及的所有專利和公開出版物，都作為參考文獻引述。對于這些發(fā)明的引述，不應被解讀為承認本項發(fā)明披露晚于這些引述的發(fā)明。在描述本發(fā)明的細節(jié)和具體體現(xiàn)時，應該明白前文所述為實例性和解釋性描述，用以說明本發(fā)明和其優(yōu)選的具體實施方式。本領域技術人員通過常規(guī)實驗，就能輕易找到本發(fā)明的各種變通和調整用途，但并不脫離本發(fā)明的精髓和范疇。在權利要求部分中，明顯體現(xiàn)了本發(fā)明的優(yōu)勢和特性，權利要求的范圍，是由合理的對等值判定，本領域技術人員對此易于理解。因此，本發(fā)明并不受前文描述的限制，而是受權利要求和其對等值來限定。權利要求用于構建人免疫球蛋白噬菌體展示文庫的方法，所述方法包括以下步驟制備第一組核苷酸序列，所述序列編碼人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中所述第一組的序列包括人輕鏈cDNA片段的序列，負責編碼FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4，其中所述片段經(jīng)隨機選擇并連接，用以編碼輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)按順序包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR；制備第二組核苷酸序列，所述序列編碼人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其中所述第二組的序列包括人重鏈cDNA片段的序列，負責編碼FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4，其中所述片段經(jīng)隨機選擇并連接，用以編碼重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)按順序包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR；制備第三組核苷酸序列，所述序列編碼免疫球蛋白單鏈Fv，其中所述第三組的序列包括所述第一組的輕鏈序列、連接體、和所述第二組的隨機選擇的重鏈序列，其中所述連接體將所述輕鏈序列和所述重鏈序列共價連接，構成第三組序列，用以編碼免疫球蛋白單鏈Fv；以及將所述第三組核苷酸序列導入噬菌?？寺≥d體，構建噬菌體展示文庫。2.權利要求l所述的方法，其中所述第一組核苷酸序列的所述人輕鏈cDNA片段僅編碼k鏈。3.權利要求l所述的方法，其中所述第一組核苷酸序列的所述人輕鏈cDNA片段僅編碼入鏈。4.權利要求1所述的方法，其中所述第一組核苷酸序列的所述人輕鏈cDNA片段編碼k禾P人鏈。5.權利要求1所述的方法，其中所述噬菌體展示文庫排除FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3組合。6.權利要求l所述的方法，其中所述第二組核苷酸序列的所述人重鏈cDNA片段僅編碼Y鏈。7.權利要求1所述的方法，其中所述第二組核苷酸序列的所述人重鏈cDNA片段編碼YpY2、Y3、Y4、ii、c^、c[2、S、或e重鏈。8.用于鑒定對感興趣的靶抗原具有結合特異性的抗原結合分子的方法，所述方法包括如下步驟(a)以權利要求1中所述人免疫球蛋白噬菌體展示文庫，篩選對所述靶抗原具有結合特異性的免疫球蛋白；(b)表達所述免疫球蛋白，并(c)測試所述表達的免疫球蛋白對所述靶抗原的結合。9.人免疫球蛋白噬菌體展示文庫，其通過權利要求1所述的方法構建。全文摘要本申請?zhí)峁┝艘环N免疫球蛋白文庫。文庫是由免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變區(qū)FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列經(jīng)任意組合而構成。文庫所擁有的多樣性組合儲備，超過自然免疫系統(tǒng)，可用來表達新穎免疫球蛋白。文庫可用于篩選具有感興趣的靶標特異性的抗體。應用該文庫所構建的抗體，是沒有免疫原性的全人源化抗體。文檔編號C40B40/08GK101720368SQ200880015319公開日2010年6月2日申請日期2008年3月10日優(yōu)先權日2007年3月9日發(fā)明者梁瑞安,鄺志威,陳業(yè)森,黃佩芬申請人:中國抗體制藥有限公司