專利名稱：：一種篩選疾病標(biāo)志物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種篩選疾病標(biāo)志物的方法。
背景技術(shù)：
：疾病的發(fā)生、發(fā)展均導(dǎo)致細(xì)胞中相關(guān)分子的種類和數(shù)量發(fā)生變化，這些與特定疾病密切相關(guān)的分子就是疾病標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)和尋找疾病標(biāo)志物，并從分子水平檢測(cè)和跟蹤這些變化是理解疾病發(fā)生機(jī)理、提高診斷準(zhǔn)確性、提早診斷窗口期、制定合理治療方案以及監(jiān)測(cè)治療效果的一個(gè)非常有效途徑。目前用于尋找疾病標(biāo)志物的方法一般是質(zhì)譜與二維電泳聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)方法。但是該方法在膜蛋白的鑒別方面有很大的局限性，主要因?yàn)槟さ鞍椎娜芙庑圆睢Ｋ械牡鞍字写蠹s有30%是膜蛋白，目前只有不到5%膜蛋白可通過(guò)二維電泳質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒別出來(lái)(Wu，C.C.;Yates，J.R.III.Theapplicationofmassspectrometrytomembraneproteomics.Nat.Biotechnol.2003，21，(3)，262-7)。膜蛋白是在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和與外界物質(zhì)交換中起關(guān)鍵性作用的分子，很多疾病的發(fā)生、發(fā)展都會(huì)引起膜蛋白的變異，導(dǎo)致膜蛋白的種類和數(shù)量發(fā)生變化，而這些變化的膜蛋白就是潛在的疾病標(biāo)志物分子。另外對(duì)于非蛋白類細(xì)胞膜表面的疾病標(biāo)志物分子，上述的蛋白質(zhì)組學(xué)的方法也是無(wú)能為力的。如何有效的發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)志物分子依然是目前分子細(xì)胞生物學(xué)研究的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種篩選疾病標(biāo)志物的方法。本發(fā)明所提供的篩選疾病標(biāo)志物的方法，包括如下步驟(a)用離體的靶疾病細(xì)胞對(duì)核酸文庫(kù)進(jìn)行篩選，得到與靶疾病相關(guān)的核酸適體；所述核酸文庫(kù)為單鏈的隨機(jī)核苷酸序列的文庫(kù)；(b)將所述與靶疾病相關(guān)的核酸適體與所述離體的靶疾病細(xì)胞上的耙分子結(jié)合，得到所述核酸適體和所述靶分子的復(fù)合物，再分離所述復(fù)合物，得到所述耙疾病細(xì)胞上的耙分子，即為耙疾病標(biāo)志物。其中，在所述步驟(a)后、步驟(b)前，還可包括將所述核酸適體標(biāo)記的步驟。這樣得到標(biāo)記的與靶疾病相關(guān)的核酸適體，在步驟(b)中用標(biāo)記的與耙疾病相關(guān)的核酸適體與所述離體的靶疾病細(xì)胞上的靶分子結(jié)合；標(biāo)記利于后續(xù)靶分子的分離與檢測(cè)。所述將核酸適體標(biāo)記具體可以將核酸適體標(biāo)記上信號(hào)分子(如羅丹明B、熒光素)、活性分子(如生物素、氨基、羧基)。所述核酸文庫(kù)具體可為單鏈DNA文庫(kù)、單鏈RNA文庫(kù)、或修飾的單鏈核酸文庫(kù)。所述隨機(jī)核苷酸序列的長(zhǎng)度可為25-60個(gè)堿基，優(yōu)選為52個(gè)堿基。所述核酸文庫(kù)具體可以為如下的文庫(kù)兩端為15-25個(gè)堿基的固定核苷酸序列，中間為25-60個(gè)堿基的隨機(jī)核苷酸序列，如5'-ATACCAGCTTATTCAATT-52-nt-AGATAGTAAGTGCAATCT-3，。其中，兩端固定序列可以用于設(shè)計(jì)引物，以便于擴(kuò)增篩選出的文庫(kù)。所述步驟(a)中篩選的方法包括如下步驟(1)以所述核酸文庫(kù)為起始核酸文庫(kù)；(2)將所述起始核酸文庫(kù)的溶液與所述離體的靶疾病細(xì)胞孵育，得到所述耙疾病細(xì)胞與起始核酸文庫(kù)中部分核酸分子的復(fù)合體，分離復(fù)合體，得到與所述離體的靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫(kù)；(3)將所述與所述離體的靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫(kù)的溶液與離體的非靶疾病細(xì)胞孵育，分離去除與所述離體的非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子，剩余沒(méi)有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子；(4)得到與靶疾病相關(guān)的核酸適體。其中，所述步驟(2)中，在所述得到與所述離體的靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫(kù)后，還可包括如下步驟PCR擴(kuò)增所述與離體的靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫(kù)，并制備成單鏈。所述步驟(3)中，在所述剩余沒(méi)有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子后，還可包括如下步驟PCR擴(kuò)增所述沒(méi)有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子，并制備成單鏈。所述步驟(a)中篩選的方法中，在所述步驟(3)之后、步驟(4)之前，還可包括至少1次以下操作以所述沒(méi)有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子為起始核酸文庫(kù)，重復(fù)步驟(2)和(3)，每次操作均以前一次操作中得到的沒(méi)有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子為起始核酸文庫(kù)。所述步驟(a)中，在所述得到與靶疾病相關(guān)的核酸適體后、所述將所述核酸適體標(biāo)記前，還可包括對(duì)所述核酸適體進(jìn)行修飾的步驟；所述修飾的方法為對(duì)所述核酸適體進(jìn)行剪切、對(duì)所述核酸適體中的核苷酸單元進(jìn)行替換、對(duì)所述核酸適體中的堿基、核糖或磷酸骨架進(jìn)行修飾。所述步驟(b)中，將所述與靶疾病相關(guān)的核酸適體與所述離體的靶疾病細(xì)胞上的耙分子結(jié)合的方法具體可為將所述與耙疾病相關(guān)的核酸適體與所述靶疾病細(xì)胞的裂解液共同孵育。所述分離所述復(fù)合物的方法具體可以為通過(guò)核酸適體上的標(biāo)記分子將復(fù)合物從所述裂解液中分離，然后將復(fù)合物進(jìn)行凝膠電泳，分離得到靶分子。所述疾病具體可為白血病、淋巴瘤、肝癌等。所述靶疾病細(xì)胞具體可為腫瘤細(xì)胞、被感染細(xì)胞或炎癥細(xì)胞等病變細(xì)胞。所述疾病標(biāo)志物具體可為蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的制備疾病標(biāo)志物的方法既適用于膜蛋白標(biāo)志物的分離又適用于非膜蛋白標(biāo)志物的分離，克服了現(xiàn)有技術(shù)中蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)膜蛋白標(biāo)志物難以分離的缺陷；另外，本發(fā)明方法還可以分離非蛋白類細(xì)胞膜表面的疾病標(biāo)志物分子，如糖類、脂類等。因此本發(fā)明方法在疾病診斷和研究中有廣闊應(yīng)用前景。圖1為與白血病相關(guān)核酸適體的篩選過(guò)程。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中，將白血病相關(guān)的核酸適體(Aptamer，適配體，適配子)分子統(tǒng)一叫作scl，將由其標(biāo)記上羅丹明后的探針統(tǒng)一叫做scl-pro-B，將由其標(biāo)記上生物素后的探針統(tǒng)一叫作scl-pro-bio。實(shí)施例l、制備與白血病相關(guān)的分子探針(一)篩選與白血病相關(guān)的核酸適體1、隨機(jī)核酸文庫(kù)的合成按照文獻(xiàn)(JayasenaSD.Aptamers:anemergingclassofmoleculesthatrivalantibodiesindiagnostics.Oe瓜1999，45:1628-1650)中所述，設(shè)計(jì)合成如下隨機(jī)核酸文庫(kù)5，-ATACCAGCTTATTCAATT-52-nt-AGATAGTAAGTGCAATCT—3'。2、篩選與白血病相關(guān)的核酸適體結(jié)合緩沖液含4.5g/L葡萄糖，5raMMgCl2，lraMCaCl"2.67mMKCl，1.47mM磷酸二氫鉀，137.93mM氯化鈉，8.06mM磷酸氫二鈉，0.1mg/mLtRNA(R8759Sigma，Ribonucleicacid,transferfrombaker'syeast(S.cerevisiae))禾口1mg/mL牛血清白蛋白(Fisher),pH值7.4。CCRF-CEM細(xì)胞(CCL-119)、Ramos細(xì)胞(CRL-1596)均購(gòu)于ATCC(AmericanTypeCulturecollection)。篩選過(guò)程如圖l所示(cellA為靶細(xì)胞，cellB為反篩細(xì)胞，1表示隨機(jī)的DNA文庫(kù)，2表示洗脫步驟，3表示PCR步驟，4表示富集的文庫(kù)，5表示克隆和測(cè)序，6表示進(jìn)入下一輪篩選，7表示流式細(xì)胞分析步驟)，具體如下(1)第1次篩選取4nmo1的核酸文庫(kù)溶于lmL的結(jié)合緩沖液中與1X106個(gè)離體的CCRF-CEM細(xì)胞在冰上孵育30分鐘，離心去除上清液，洗滌，得到結(jié)合有核酸分子的CCRF-CEM細(xì)胞；將結(jié)合有核酸分子的CCRF-CEM細(xì)胞懸浮于300uL結(jié)合緩沖液中，加熱至95°C，離心除去沉淀，得到核酸序列文庫(kù)I;將洗脫的核酸序列文庫(kù)I經(jīng)PCR擴(kuò)增放大(所用的引物序列為熒光素標(biāo)記的ATACCAGCTTATTCAATT(序列l(wèi))、生物素標(biāo)記的AGATTGCACTTACTATCT(序列2))，用鏈親和素包被的瓊脂糖微球(購(gòu)于GE公司)吸附，經(jīng)0.15M的氫氧化鈉溶液洗脫得到放大的單鏈核酸序列文庫(kù)I，用于第二輪的篩選。(2)第二輪篩選取200prao1步驟(1)得到的放大的單鏈核酸序列文庫(kù)I溶于300uL結(jié)合緩沖液中與1X1(T個(gè)離體的CCRF-CEM細(xì)胞在冰上孵育30分鐘，離心去除上清液，洗滌，得到結(jié)合有核酸分子的細(xì)胞；將結(jié)合有核酸分子的細(xì)胞懸浮于300!iL結(jié)合緩沖液中，加熱至95'C，洗脫結(jié)合于細(xì)胞表面的核酸分子，離心去除疾病細(xì)胞，得到核酸序列文庫(kù)II;將所述核酸序列文庫(kù)II與5乂106個(gè)離體的淋巴瘤細(xì)胞Ramos(反篩細(xì)胞)于冰上孵育30分鐘，離心除去Ramos細(xì)胞及其結(jié)合的序列，上清液脫鹽，得到核酸序列文庫(kù)III;將核酸序列文庫(kù)m進(jìn)行PCR擴(kuò)增放大(所用的引物序列為熒光素標(biāo)記的ATACCAGCTTATTCAATT(序列1)、生物素標(biāo)記的AGATTGCACTTACTATCT)(序列2)后，用鏈親和素包被的瓊脂糖微球(購(gòu)于GE公司)吸附，經(jīng)O.15M的氫氧化鈉溶液洗脫得到放大的單鏈核酸序列文庫(kù)III，用于下一輪的篩選。(3)重復(fù)篩選按照步驟2的方法，重復(fù)篩選10次，每次都用上一次篩選得到的文庫(kù)作起始文庫(kù)，最后得到含特異性結(jié)合于CCRF-CEM細(xì)胞的核酸文庫(kù)；經(jīng)TA克隆、測(cè)序。在每一次重復(fù)步驟2的過(guò)程中用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)與細(xì)胞結(jié)合的核酸序列的量，以判斷文庫(kù)中與細(xì)胞特異性結(jié)合的序列的量以及結(jié)合的強(qiáng)度(富集的程度)。(4)核酸適體分子的表征根據(jù)測(cè)序結(jié)果，合成核酸適體序列，標(biāo)記熒光分子制成分子探針，分別取0.5、1、2、4、10、40、200、500nM的分子探針溶液，與5X105個(gè)離體的CCRF-CEM細(xì)胞于冰上孵育20分鐘，用結(jié)合緩沖液洗滌兩遍后用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)探針濃度作圖，用公式7=(Kd+i)計(jì)算平衡解離常數(shù)Kd。選取平衡解離常數(shù)小于1X10—4mol/L的核酸適體備用。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，篩選得到7條核酸適體分子，其中l(wèi)條的核苷酸序列如下GATAGTAAGTGCAATCT(序列3)(平衡解離常數(shù)為0.8nM)。(二)將核酸適體制備成探針1、修飾經(jīng)篩選得到的核酸適體分子鏈較長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)分析后設(shè)計(jì)系列截短的核酸適體分子，合成截短后的核酸適體分子，用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡表征核酸適體分子親和力，以平衡解離常數(shù)最低的序列為最優(yōu)化的序列，最后挑選得到如下核酸適體分子scl(解離常數(shù)為0.78nM)，其核苷酸序列為ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA(序列4)。2、標(biāo)記將核酸適體分子scl標(biāo)記上羅丹明B，制成分子探針scl-pro-B。(三)檢測(cè)分子探針的功能取1uM的分子探針scl-pro-B與表1中的病變細(xì)胞、病人組織(取病變組織均經(jīng)過(guò)病人的同意)和正常細(xì)胞共同孵育30分鐘，離心，洗滌2次，用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)scl-pro-B對(duì)不同疾病細(xì)胞的響應(yīng)，同時(shí)以羅丹明B標(biāo)記的隨機(jī)DNA序列為對(duì)照(ATACCAGCTTATTCAATT-52-nt-AGATAGTAAGTGCAATCT)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如表l所示。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下設(shè)置一個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度閾值，使99Q/。的與對(duì)照DNA孵育的細(xì)胞熒光強(qiáng)度低于該值，以與scl-pro-B孵育細(xì)胞的熒光強(qiáng)度高于該閾值的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表示分子探針與細(xì)胞的結(jié)合能力++++:〉85%;+++:60-85%;++:35-60%;+:10-35%;0:<10%。結(jié)果表明，分子探針scl-pro-B對(duì)T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病具有特異性的響應(yīng)，說(shuō)明與分子探針scl-pro-B結(jié)合的靶分子為潛在的T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的疾病標(biāo)志物。表1、分子探針scl-pro-B結(jié)合血液腫瘤細(xì)胞和正常骨髓細(xì)胞及病變組織的情況<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>T-ALL:T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血??；B-ALL:B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血??；認(rèn)L:急性骨髓白血病。細(xì)胞系CCRF-CEM(CCL-119)，Ramos(CRL-1596),Jurkat(TIB-152)，Molt-4(CRL-1582，)，Sup-Tl(CRL-1942)Kasumi-l(CRL-2724)，U266(TIB-196)，SUP-B15(CRL-1929)和Toledo(CRL-2631)購(gòu)于ATCC(AmericanTypeCultureCollection);Mo2058，NB-4和UF1購(gòu)于佛羅里達(dá)大學(xué)病理系。臨床病人細(xì)胞樣品以及正常骨髓細(xì)胞的制備所用的新鮮人淋巴組織，骨髓和外周血樣品來(lái)源于佛羅里達(dá)大學(xué)病理系臨床檢驗(yàn)所用的樣品(均經(jīng)過(guò)患者的同意)。組織樣品在RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基(購(gòu)于ATCC)中切碎，用80目篩子過(guò)濾即得細(xì)胞樣品。骨髓細(xì)胞和外周血中的紅血球用9倍體積的氯化銨分散液(購(gòu)于BDBiosciences)于室溫分散10分鐘，離心(500g)分離細(xì)胞后用PBS緩沖液(購(gòu)于BDBiosciences)洗滌兩次，然后將細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清和抗生素的RPMI培養(yǎng)基(購(gòu)于ATCC)中即得。實(shí)施例2、用白血病相關(guān)核酸適體制備白血病標(biāo)志物一、標(biāo)志物的制備將核酸適體分子scl標(biāo)記上生物素，制成分子探針scl-pro-bio。取10X108個(gè)CCEM細(xì)胞以50mMTris-鹽酸緩沖液在冰上裂解20分鐘，離心去除上清液，沉淀以含0.3%Triton-100的磷酸鹽緩沖液在冰上裂解1小時(shí)，離心取上清液。將上清液與lnmol的分子探針scl-pro-bio在冰上孵育30分鐘后，加入200uL鏈親和素標(biāo)記的磁粒子(l微米，DynalBiotechASA，Oslo,Norway))孵育5分鐘，用磁鐵吸附磁粒子，除去上清液；用磷酸鹽緩沖液洗滌磁粒子3次，將磁粒子加入30uL聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的上樣緩沖液中，加熱至10(TC，保持3分鐘后，加到12y。PAGE電泳上，電泳分離后，切割目的特異性電泳條帶，酶解后，以LC-MS進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒別。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，表明與分子探針sc1-pro-bio結(jié)合的分子為蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)(即膜蛋白PTK7)，即膜蛋白PTK7為分子探針scl-pro-bio的耙分子。二、疾病標(biāo)志物的進(jìn)一步鑒定PE熒光標(biāo)記的PTK7的抗體購(gòu)自MiltenyiBiotec，Inc.(Auburn,CA,USA)，產(chǎn)品目錄號(hào)為anti-PTK7-PE，human;正常骨髓細(xì)胞(按照實(shí)施例1中所述方法制備)；細(xì)胞系CCRF-CEM(CCL-119)，Ramos(CRL-1596)，Jurkat(TIB-152)，Molt-4(CRL-1582，)，Sup-Tl(CRL-1942)andToledo(CRL-2631)購(gòu)于ATCC(AmericanTypeCultureCollection);NB-4和UFl夠于佛羅里達(dá)大學(xué)病理系。將PE熒光標(biāo)記的PTK7的抗體按說(shuō)明書的要求與CCRF-CEM細(xì)胞、Ramos細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞、Molt-4細(xì)胞、S叩-Tl細(xì)胞和Toledo細(xì)胞、正常骨髓細(xì)胞分別孵育，檢測(cè)抗體與不同細(xì)胞的結(jié)合情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果表明，PTK7表達(dá)于急性骨髓細(xì)胞白血病的一個(gè)亞型以及T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的一個(gè)亞型中，正常骨髓細(xì)胞、B細(xì)胞均沒(méi)有明顯的PTK7的表達(dá)。說(shuō)明PTK7可以用作潛在的疾病標(biāo)志物用于急性白血病的診斷以及相關(guān)的醫(yī)學(xué)研究中。序列表〈110〉譚蔚說(shuō)〈120〉一種篩選疾病標(biāo)志物的方法〈130〉CGGNAC92239〈160〉4<210〉1<211>18<212〉腿<213〉人工序列〈220〉〈223〉<400〉1at3ccagctt3ttc33tt18<210〉2<211〉15<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223><400〉2agattgcacttactatct15〈210〉3<211〉88〈212>薩<213〉人工序列<220〉<223><400〉3ataccagcttattcaattagtcacacttagagttctaactgctgcgccgccgggaaaata60ctgtacggttagatagtaagtgcaatct88<210〉4〈211〉41<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉<400〉4atctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttaga4權(quán)利要求1、一種篩選疾病標(biāo)志物的方法，包括如下步驟(a)用離體的靶疾病細(xì)胞對(duì)核酸文庫(kù)進(jìn)行篩選，得到與靶疾病相關(guān)的核酸適體；所述核酸文庫(kù)為單鏈的隨機(jī)核苷酸序列的文庫(kù)；(b)將所述與靶疾病相關(guān)的核酸適體與所述離體的靶疾病細(xì)胞上的靶分子結(jié)合，得到所述核酸適體和所述靶分子的復(fù)合物，再分離所述復(fù)合物，得到所述靶疾病細(xì)胞上的靶分子，即為靶疾病標(biāo)志物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在所述步驟(a)后、步驟(b)前，包括將所述核酸適體標(biāo)記的步驟。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(a)中篩選的方法包括如下步驟(1)以所述核酸文庫(kù)為起始核酸文庫(kù)；(2)將所述起始核酸文庫(kù)的溶液與所述離體的靶疾病細(xì)胞孵育，得到所述靶疾病細(xì)胞與起始核酸文庫(kù)中部分核酸分子的復(fù)合體，分離復(fù)合體，得到與所述離體的靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫(kù)；(3)將所述與所述離體的靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫(kù)的溶液與離體的非靶疾病細(xì)胞孵育，分離去除與所述離體的非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子，剩余沒(méi)有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子；(4)得到與靶疾病相關(guān)的核酸適體。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，在所述得到與所述離體的靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫(kù)后，包括如下步驟PCR擴(kuò)增所述與離體的耙疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫(kù)，并制備成單鏈。5、根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，在所述剩余沒(méi)有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子后，包括如下步驟PCR擴(kuò)增所述沒(méi)有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子，并制備成單鏈。6、根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(a)中篩選的方法中，在所述步驟(3)之后、步驟(4)之前，包括至少l次以下操作以所述沒(méi)有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子為起始核酸文庫(kù)，重復(fù)步驟(2)和(3)，每次操作均以前一次操作中得到的沒(méi)有與所述非靶疾病細(xì)胞結(jié)合的核酸分子為起始核酸文庫(kù)。7、根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(a)中，在所述得到與靶疾病相關(guān)的核酸適體后、所述將所述核酸適體標(biāo)記前，包括對(duì)所述核酸適體進(jìn)行修飾的步驟；所述修飾的方法為對(duì)所述核酸適體進(jìn)行剪切、對(duì)所述核酸適體中的核苷酸單元進(jìn)行替換、對(duì)所述核酸適體中的堿基、核糖或磷酸骨架進(jìn)行修飾。8、根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(b)中，將所述與靶疾病相關(guān)的核酸適體與所述離體的靶疾病細(xì)胞上的靶分子結(jié)合的方法為將所述與靶疾病相關(guān)的核酸適體與所述靶疾病細(xì)胞的裂解液共同孵育。9、根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述疾病為白血病。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述疾病標(biāo)志物為蛋白酪氨酸激酶7。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選疾病標(biāo)志物的方法。該方法包括如下步驟(a)用離體的靶疾病細(xì)胞對(duì)核酸文庫(kù)進(jìn)行篩選，得到與靶疾病相關(guān)的核酸適體；所述核酸文庫(kù)為單鏈的隨機(jī)核苷酸序列的文庫(kù)；(b)將所述與靶疾病相關(guān)的核酸適體與所述離體的靶疾病細(xì)胞上的靶分子結(jié)合，得到所述核酸適體和所述靶分子的復(fù)合物，再分離所述復(fù)合物，得到所述靶疾病細(xì)胞上的靶分子，即為疾病標(biāo)志物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的制備疾病標(biāo)志物的方法既適用于膜蛋白標(biāo)志物的分離又適用于非膜蛋白標(biāo)志物的分離，克服了現(xiàn)有技術(shù)中蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)膜蛋白標(biāo)志物難以分離的缺陷；另外，本發(fā)明方法還可以分離非蛋白類細(xì)胞膜表面的疾病標(biāo)志物分子，如糖類、脂類等。文檔編號(hào)C40B30/04GK101538614SQ20091008307公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2009年4月28日優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日發(fā)明者上官棣華,方曉紅,楊朝勇,王柯敏,譚蔚泓申請(qǐng)人:譚蔚泓