專利名稱：制造具有固定化雙鏈核酸探針的微陣列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
日J(rèn)
鏈核酸探針的微陣列的方法<
背景技術(shù)：
使用光刻法制造核酸陣列的方法(也稱為光引導(dǎo)合成法)是公知的。這些 方法包括將基底的預(yù)先限定的區(qū)域活化，然后使基底與預(yù)先選定的單體溶液 接觸。可通過光源，典型地經(jīng)過掩模，將預(yù)先限定的區(qū)域活化?；椎氖Ｓ?部分被掩模阻擋不受光源的作用并且被化學(xué)保護(hù)，因而是惰性的。因而，可 根據(jù)基底的哪個區(qū)域被光圖案照射來確定基底的哪個區(qū)域與單體發(fā)生反應(yīng)。 重復(fù)進(jìn)行預(yù)先限定的區(qū)域的活化以及基底與另外的單體溶液的接觸以在基 底上形成多種核酸陣列。如果有必要，可進(jìn)行其它過程，包括從基底洗掉未 反應(yīng)的單體溶液。
現(xiàn)在更詳細(xì)地描述使用光引導(dǎo)合成法制造核酸陣列的方法的實例。通過 光刻掩模照射固體載體的表面，由此將照射的區(qū)域中的反應(yīng)性基團(tuán)(通常為
羥基)曝光，其中所述固體載體的表面用具有對光不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)如6-硝 基藜蘆基氧羰基(NVOC)或甲基-6-硝基胡椒基氧羰基(MeNPOC)的間隔體選 擇性地改性。然后，將在5'-羥基用對光不穩(wěn)定的基團(tuán)保護(hù)的3'-0-亞磷酰胺 活化的脫氧核香提供到固體載體表面上，并且在曝光的位點處發(fā)生化學(xué)偶 聯(lián)。在封端(capping)和氧化之后，清洗固體載體，并經(jīng)過第二掩模照射固體 載體的表面以將另外的幾基曝光用于偶聯(lián)。將第二5'-保護(hù)的3'-0-亞磷酰胺 活化的脫氧核苦提供到固體載體表面上。重復(fù)進(jìn)行選擇性的光去保護(hù)和偶聯(lián) 循環(huán)直至獲得所需核酸組。光引導(dǎo)合成法的另一實例公開了，使用對光不穩(wěn) 定的保護(hù)基團(tuán)和光刻法來實現(xiàn)核酸陣列的光引導(dǎo)的可空間尋址的平行化學(xué) 合成。在該方法中，可使用計算機(jī)工具來幫助形成陣列。
在核酸陣列的這種光引導(dǎo)合成中，可在可空間尋址的預(yù)先限定的區(qū)域中 平行地合成多個核酸探針。由于預(yù)先限定的區(qū)域是通過光限定的，因此可通
4過將預(yù)先限定的區(qū)域之間的間隔變窄，即增加預(yù)定區(qū)域的密度，來合成核酸 陣列。然而，該方法包括為基底的每一次循環(huán)制備新的掩模，因而就合成效
率而言對可合成的核酸的長度有限制。具有25nt或更短長度的核酸的合成在 商業(yè)上是已知的。
另外，使用點樣法制造核酸陣列的方法是已知的。在點樣法中，將反應(yīng) 物如預(yù)先合成的核酸或核酸單體轉(zhuǎn)移到基底上的選定區(qū)域，使得相對少的量 的反應(yīng)物直接沉積在選定區(qū)域上?？赏ㄟ^使用分配器在選定區(qū)域之間移動來 進(jìn)行沉積。分配器的實例包括用于將單體溶液轉(zhuǎn)移到基底上的微量移液器和 用于控制微量移液器相對于基底的位置的自動系統(tǒng)、或噴墨印刷機(jī)。另外， 分配器可為一系列的管、歧管、以及移液器陣列，其容許將多種試劑同時轉(zhuǎn) 移到反應(yīng)區(qū)域。在該方法中，將外來合成的核酸固定在基底上，因而可將相 對長的核酸固定在基底上。然而，固定是通過直接沉積進(jìn)行的，并且樣點密 度低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的示例性實施方式包括有效地制造具有高的樣點密度和其上固 定有長的探針的微陣列的方法。
其它方面將在隨后的說明中部分闡述，部分可從該說明中明晰，或者可 通過所提供的實施方式的實踐而獲知。
固定化雙鏈核酸探針的微陣列的方法，該方法包括使用光刻法在固體基底 表面上的多個樣點區(qū)上合成核酸以將多個第 一單鏈核酸固定在所述多個樣 點區(qū)上；和將所述多個第一單鏈核酸中的每一個與第二單鏈核酸雜交以將所 述多個第一單鏈核酸轉(zhuǎn)化為包括雙鏈區(qū)域和單鏈區(qū)域的雙鏈核酸探針，所述 第二單鏈核酸包括與所述多個第一單鏈核酸互補(bǔ)的第一區(qū)域和與所述多個
第一單鏈核酸不互補(bǔ)的第二區(qū)域，其中當(dāng)所述第一單鏈核酸的5'端與所述基 底的表面連接時，所述第二區(qū)域位于所述第一區(qū)域的上游，和當(dāng)所述第一單 鏈核酸的3'端與所述基底的表面連接時，所述第二區(qū)域位于所述第一區(qū)域的下游。

圖1A和IB是說明在根據(jù)本發(fā)明實施方式的制造具有固定化雙鏈核酸
探針的微陣列的方法中制造單鏈微陣列的方法的圖。
圖2是說明將圖1中制備的單鏈微陣列轉(zhuǎn)化為雙鏈微陣列的方法的圖。
具體實施例方式
現(xiàn)在詳細(xì)介紹實施方式，其實例圖解于附圖中，在附圖中相同的附圖標(biāo) 記始終表示相同的元件。在這點上，本實施方式可具有不同的形式并且不應(yīng) 解釋為限于本文中所闡述的說明內(nèi)容。因此，下面通過參考附圖描述實施方 式僅用于解釋本說明的各方面。
—明買施方式的制造具有包抬^又鏈區(qū)i或和竿《連區(qū)i或的固定4b只又
鏈核酸
多個樣
汰巴孑左、aj
點區(qū)上合成核酸以將多個第 一單鏈核酸固定在樣點區(qū)上。
術(shù)語"光刻法，，包括將光敏表面選擇性地暴露于光束以在該表面上形成 曝光區(qū)域和未曝光區(qū)域的圖案和使分子與曝光區(qū)域反應(yīng)以使該分子與曝光 區(qū)域結(jié)合。該光敏表面可包括用可光除去基團(tuán)保護(hù)的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)，當(dāng)該 光敏表面曝光時，該表面可由于可光除去基團(tuán)的除去而變?yōu)榉磻?yīng)性。該反應(yīng) 物分子可包括在3'羥基或5'羥基處用可光除去基團(tuán)保護(hù)的活化的核苷、活化 的核苷酸、活化的寡核苷酸或活化的多核苷酸?？赏ㄟ^將物理光掩模置于用 于光活化的光的路徑中而將光敏表面選擇性地暴露于光束。其也可不使用物 理光掩模進(jìn)行，例如，通過使用無掩模的光刻系統(tǒng)進(jìn)行。無掩模的光刻系統(tǒng) 是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可包括使用與數(shù)字微鏡陣列結(jié)合的離軸 (off-axis)光源的系統(tǒng)。
"使用光刻法在基底上合成核酸"的操作意指基底上的僅一些區(qū)域被光 照射，由此在所述基底的僅一些區(qū)域上引入或產(chǎn)生活性反應(yīng)基團(tuán)，所述活性 反應(yīng)基團(tuán)與活化分子如核酸單體、寡聚體或多聚體反應(yīng)以在基底上延伸核酸 的核苷酸。其可包括通過在基底上一個一個地延伸核苷酸來合成單鏈多核苷 酸。核酸在基底上的光引導(dǎo)合成方法是本領(lǐng)域中公知的。例如，這些方法公 開于美國專利No. 5,143,854、 No. 5,744,305和No. 5,908,926中，將這些專利 的公開內(nèi)容全部？ 1入本文中作為參考。雙鏈核酸探針的雙鏈區(qū)域位于基底表 面上即鄰近基底表面，其單鏈區(qū)域位于距基底表面的遠(yuǎn)端。所述雙鏈區(qū)域可 包括第一單鏈核酸和第二單鏈核酸，所述單鏈區(qū)域可僅包括第二單鏈核酸。第二單鏈核酸可包括兩個區(qū)域，即通過和第一單鏈核酸雜交而形成雙鏈核酸 的區(qū)域及不參與和第一單鏈核酸的雜交并由此可保持為單鏈形式的區(qū)域。雙 鏈核酸探針可為其中雙鏈區(qū)域鄰近基底而單鏈區(qū)域在基底遠(yuǎn)端的部分雙鏈 核酸。雙鏈核酸探針的單鏈區(qū)域可與具有互補(bǔ)序列的輩巴核酸雜交，由此用作探針。
在"使用光刻法在基底上合成核酸"的操作中，可在基底上的多個預(yù)先 限定的區(qū)域(在下文中稱為"樣點")上平行地同時合成多個不同核酸序列。
本文中使用的術(shù)語"樣點"是指表面上被活化、被預(yù)先活化、或期望被 活化以用于形成聚合物的一些區(qū)域，即"預(yù)先限定的區(qū)域"。所述樣點可具 有方便的形狀，例如，圓形、四邊形、橢圓形、或楔狀形狀。
本文中使用的術(shù)語"基底"是指具有固體或半固體表面的材料。盡管基 底的表面可基本上是平坦的，但至少基底表面的一部分可作為合成區(qū)域通過
阱(well)、升高的區(qū)域、或蝕刻槽等相對于其它核酸合成區(qū)域物理隔離。
本文中使用的"光，，可為y射線、X射線、紫外線、可見光線、或紅外 線，并且可根據(jù)所用可光除去的保護(hù)基團(tuán)的類型適當(dāng)選擇。
操作(a)包括用光經(jīng)過圖案化的掩模選擇性地照射基底表面、選擇性地活 化基底表面上的一些區(qū)域、以及使活化的區(qū)域與核酸單體反應(yīng)，由此在基底 表面上延伸核苷酸。當(dāng)在基底表面上活性基團(tuán)被可光除去的保護(hù)基團(tuán)保護(hù) 時，可通過光照射進(jìn)行基底表面上的所述一些區(qū)域的選擇性活化。另外，可 通過用于除去可光除去的保護(hù)基團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行該活化過程。
操作(a)可包括用光經(jīng)過掩模照射連接有可光除去的保護(hù)基團(tuán)的基底表 面以從該表面選擇性地除去該保護(hù)基團(tuán)，由此形成反應(yīng)性區(qū)域和光保護(hù)區(qū)域
單體反應(yīng)，由此將核酸單體延伸到基底上的反應(yīng)性區(qū)域?？蓮谋还庹丈涞恼?射區(qū)域的表面除去可光除去的保護(hù)基團(tuán)，由此暴露出活性反應(yīng)基團(tuán)。因而，
單體可為核苷或核苷酸。
體。例如，連接體可為聚乙二醇、或核酸單體如核苷和核苷酸。本文中使用的術(shù)語"保護(hù)基團(tuán)"是指與單體單元化學(xué)結(jié)合并且可通過選 擇性地暴露于活化劑如電磁輻射而除去的基團(tuán)。本文中使用的術(shù)語"可光除 去的保護(hù)基團(tuán)"是指可通過光除去的保護(hù)基團(tuán)?？晒獬サ谋Ｗo(hù)基團(tuán)是本領(lǐng)
域技術(shù)人員公知的?？晒獬サ谋Ｗo(hù)基團(tuán)的實例可包括，但不限于，6-硝基 藜蘆基氧羰基(NVOC)、 6-硝基胡椒基(NP)、 6-硝基胡椒基氧羰基(NPOC)、 6-硝基藜^基(NV)、曱基-6-硝基藜蘆基(MeNV)、曱基-6-硝基藜,基氧羰基 (MeNVOC)、曱基-6-硝基胡椒基(MeNP)和曱基-6-硝基胡椒基氧羰基 (MeNPOC)。
如下式1所示，可光除去的保護(hù)基團(tuán)可在5'-羥基上連接到活化的核苷
酸
OPR (1)
其中B是結(jié)合到糖環(huán)上的堿基；當(dāng)該糖為脫氧核糖時R為氫原子，或 者當(dāng)該糖為核糖時R為羥基；P為活化磷酸基團(tuán)；和X為可光除去的保護(hù)基 團(tuán)?？晒獬サ谋Ｗo(hù)基團(tuán)X可為如上所述的NV、 NP、 MeNV或MeNP?；?化磷酸基團(tuán)P可為具有高的偶聯(lián)效率的反應(yīng)性衍生物，如磷酸三酯或亞磷酰 胺。反應(yīng)條件和其它活化磷酸基團(tuán)是公知的(參見例如美國專利No. 5,143,854、 No. 5,744,305和No. 5,卯8，926)。另夕卜，該堿基的反應(yīng)性基團(tuán)被保 護(hù)基團(tuán)遮蔽，堿基的遮蔽和非遮蔽是本領(lǐng)域中已知的。該堿基可為尿嘧啶、 腺嘌呤、鳥。票呤、胸腺嘧啶、胞嘧咬或肌苷。
另外，如下式2所示，可光除去的保護(hù)基團(tuán)可在3'-羥基上連接到活化核 香酸。其中3'-羥基被可光除去的保護(hù)基團(tuán)遮蔽的活化的核苷酸可為由下式2 表示的化合物
YO R (2)
其中，B為其中結(jié)合到糖環(huán)上的活性基團(tuán)被遮蔽的堿基；當(dāng)該糖為脫氧核糖時R為氫原子，或者當(dāng)該糖為核糖時R為羥基；Y包括安息香基碳酸 酯(benzoinyl carbonate)如二烷氧基安息香基碳酸酯、二(C廣C4)烷氧基安息香 基碳酸酯、或者3'，5'-二曱氧基安息香基碳酸酯或2',3'-二曱氧基安息香基碳 酸酯；和Z為亞磷酰胺。該堿基可為尿嘧啶、腺噪呤、鳥。票呤、胸腺嘧啶、 胞嘧啶或肌苷。
連接體可選自核苷和核苷酸，其中核苷和核苷酸之一的3'-端與基底連接 且核苷和核香酸之一的5'-端與可光除去的保護(hù)基團(tuán)連接，或者5'-端與基底 連接且3'-端與可光除去的保護(hù)基團(tuán)連接。另外，核苷酸包括在在前過程中合 成的或者外來引入的多核苷酸。
可重復(fù)進(jìn)行圖案的形成和核酸單體的延伸。在這種情況下，可在圖案的 形成與核酸單體的延伸之間以及在核酸單體的延伸與圖案的形成之間進(jìn)行 一般的洗滌過程。另外，在圖案的形成中，可根據(jù)在各樣點中待引入的核苷 酸的類型形成彼此相同或不同的圖案。在該過程中， 一個掩模可用于一個核 脊酸。因而，當(dāng)合成25聚體(mer)核酸時，可使用最多達(dá)100個掩模。因此， 利用IOO次的如下循環(huán)制備掩模、照射光、分離可光除去的保護(hù)基團(tuán)、添 加具有可光除去的保護(hù)基團(tuán)的活化的單體和偶聯(lián)反應(yīng)。
第一單鏈核酸可選自DNA、 RNA、 PNA和其雜合分子。當(dāng)?shù)谝粏捂満?酸為PNA時，雜交產(chǎn)物的離解常數(shù)低，因而雙鏈區(qū)域是穩(wěn)定的。
第一單鏈核酸的長度可為可提供第一單鏈核酸與第二單鏈核酸之間的 結(jié)合力的長度，其通過將第一單鏈核酸與第二單鏈核酸的第一區(qū)域雜交而獲 得。例如，該長度可為約4nt~約25nt、約5nt 約10nt、或約10nt~約25nt。
第一單鏈核酸在其上延伸的樣點的密度可為150,000樣點/cm"或更大。 核酸的光引導(dǎo)合成法利用通過使用圖案化的光例如在光的路徑中使用光掩 模的表面的選擇性活化，由此可以高密度排列樣點。然而，使用大量的掩模 和許多步驟，因此對待合成的長度存在限制。
制造具有包括雙鏈區(qū)域和單鏈區(qū)域的固定化雙鏈核酸探針的微陣列的 方法進(jìn)一步包括存儲第 一單鏈核酸的序列和其上固定所述序列的樣點在基 底上的位置。第一單鏈核酸的序列是已知的，并且鑒定其在基底上的位置， 由此可確認(rèn)第二單鏈核酸雜交的位置。由此，可鑒定雙鏈核酸探針的位置， 并且可對每一個樣點分析由微陣列分析所得到的雜交結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明的實施方式，操作(a)可進(jìn)一步包括(a-l)選擇性地用光照射基底表面上的樣點區(qū)的第一區(qū)域和不用光照射該表面上的樣點區(qū)的第二區(qū)
域，由此形成亮暗區(qū)域的圖案，其中基底表面具有可光除去的保護(hù)基團(tuán)；(a-2) 使基底表面樣點區(qū)的第 一 區(qū)域和第二區(qū)域與第 一核苷酸接觸以使所述第一 核苷酸與第 一 區(qū)域的多核苷酸連接且不使所述第 一核苷酸與第二區(qū)域連接， 其中所述第一核苷酸具有可光除去的保護(hù)基團(tuán)；(a-3)選擇性地用電磁輻射照 射選自以下的至少一部分基底表面的第一區(qū)域的至少一部分和基底表面的 第二區(qū)域的至少一部分，以從那里除去可光除去的保護(hù)基團(tuán)；和(a-4)使基底 表面的第一區(qū)域和第二區(qū)域與第二核苷酸接觸以使所述第二核苷酸與除去 可光除去的保護(hù)基團(tuán)的部分的多核苷酸連接。
根據(jù)本發(fā)明的實施方式，操作(a)可包括(a-l)將包括可光除去的3'羥基 保護(hù)基團(tuán)的核苷與載體連接，其中該連接是經(jīng)由該核苷的5'羥基；(a-2)照射 所獲得的與載體結(jié)合的核苦，使得除去可光除去的保護(hù)基團(tuán)和由此使3'羥基 自由；和(a-3)使與載體結(jié)合的核苷與包括5'亞磷酰胺的核苷酸接觸以使5'亞 磷酰胺與該自由3'羥基反應(yīng)，從而形成二核苷酸。
另外，制造具有包括雙鏈區(qū)域和單鏈區(qū)域的固定化雙鏈核酸探針的微陣 列的方法包括(b)將第 一單鏈核酸各自與第二單鏈核酸雜交以將所述第 一單 鏈核酸轉(zhuǎn)化為包括雙鏈區(qū)域和單鏈區(qū)域的雙鏈核酸探針，所述第二單鏈核酸 包括與所述第 一單鏈核酸互補(bǔ)的第 一 區(qū)域和與所述第 一單鏈核酸不互補(bǔ)的 第二區(qū)域。當(dāng)所述第一單鏈核酸的5'端與基底表面連接時，所述第二區(qū)域位 于所述第一區(qū)域的上游，和當(dāng)所述第一單鏈核酸的3'端與基底表面連接時， 所述第二區(qū)域位于所述第一區(qū)域的下游。術(shù)語"上游"或"下游"是指在核 酸中對于參比位置的相對位置。例如，當(dāng)序列對于參比位置位于5'羥基側(cè)時， 該序列位于上游位置，和當(dāng)序列對于參比位置位于3'羥基側(cè)時，該序列位于 下游位置。
在操作(b)中，雜交可在本領(lǐng)域中已知的條件下進(jìn)行，例如，在緩沖液中 在4。C下進(jìn)行14小時。
第二單鏈核酸的第 一 區(qū)域與第 一單鏈核酸互補(bǔ)，因而第二單鏈核酸可因 雜交而固定在第一單鏈核酸上。本文中使用的術(shù)語"互補(bǔ)"是指核酸之間85% 或更多、90%或更多、95%或更多、或者100%的序列彼此互補(bǔ)。另外，第二 單鏈核酸的第二區(qū)域包括與第 一單鏈核酸非互補(bǔ)的序列。本文中使用的術(shù)語 "非互補(bǔ)，，意指第二區(qū)域基本上與第一單鏈核酸不互補(bǔ)，因而不干擾第一區(qū)
10域與第一單鏈核酸之間的雜交。第二區(qū)域可包括與第一單鏈核酸互補(bǔ)的5個
核苷酸或更少、4個核苷酸或更少、3個核苷酸或更少、或者2個核苷酸或 更少的鄰接序列(contiguous sequence)。第二單鏈核酸的第一區(qū)域可以100% 的同一性與第一單鏈核酸互補(bǔ)，第二單鏈核酸的第二區(qū)域可不含有與第一單 鏈核酸互補(bǔ)的序列。
第二單鏈核酸可在與其中合成第 一單鏈核酸的固體基底不同的介質(zhì)中 合成或者得自天然核酸。在不同介質(zhì)中第二單鏈核酸的合成是本領(lǐng)域中公知 的。
結(jié)合到固體基底上的寡聚體的5'羥基偶聯(lián)?？墒褂脙煞N化學(xué)方法誘導(dǎo)該偶聯(lián) 反應(yīng)磷酸三酯法和亞磷酰胺法(Gait, "Oligonucleotide Synthesis": A practical Approach", 1984， IRL， Press, London)。
可在不使用光刻法的情況下在固體介質(zhì)中合成第二單鏈核酸。另外，第 二單鏈核酸可為cDNA或得自通過核酸擴(kuò)增方法例如PCR擴(kuò)增的核酸。由 于第二單鏈核酸可不在多個位置上例如經(jīng)過掩模平行合成，因此可以高效率 合成相對長的核酸。第二單鏈核酸可具有50nt或更大、約50nt~約3000nt、 或者約50nt 約1000nt的長度。另外，第二單鏈核酸可使用細(xì)胞合成，或 者通過用限制酶消化天然核酸而獲得。第二單鏈核酸的第二區(qū)域可具有25nt 或更大、約25nt~約2975nt、或者約25nt ~約975nt的長度。
操作(b)可進(jìn)一步包括設(shè)定雙鏈核酸探針在基底上的位置以對應(yīng)于與第 二單鏈核酸的第 一 區(qū)域互補(bǔ)的第 一單鏈核酸的位置和存儲該雙鏈核酸探針 的位置。該存儲過程可在計算機(jī)可讀的介質(zhì)中進(jìn)行。因而，可使用計算機(jī)確 認(rèn)和分析探針的位置和/或靶核酸與探針之間的雜交結(jié)果。即，可將第一單鏈 核酸或第二單鏈核酸的第一區(qū)域的序列用作可確認(rèn)探針的位置或雜交的分 析結(jié)果的易得到的信息。
第二單鏈核酸的第 一 區(qū)域和第 一單鏈核酸之一可為PNA,它們中的另一 個可為DNA或RNA。 PNA與DNA或RNA之間的雜交強(qiáng)度相對強(qiáng)于DNA 之間、RNA之間或DNA與RNA之間的雜交強(qiáng)度，由此第二單鏈核酸可穩(wěn) 定地固定在第 一單鏈核酸上。
方法可進(jìn)一 步包括(c)使雙鏈核酸探針和與該雙鏈核酸探針的雙鏈區(qū)域特異性結(jié)合的物質(zhì)反應(yīng)，由此增強(qiáng)第二單鏈核酸與第 一單鏈核酸之間的雜交結(jié) 合。
該雙鏈特異性結(jié)合嵌入劑可為SYBR Green I。雙鏈特異性結(jié)合嵌入劑更好地 穩(wěn)定雙鍵，由此降低在分析雙鏈核酸探針的過程中單鏈核酸離解的可能性。 另夕卜，基底表面上第二單鏈核酸的近端可通過共價鍵或非共價鍵固定在第一 單鏈核酸或基底上。
圖IA和IB是說明根據(jù)本發(fā)明實施方式制造具有固定化雙鏈核酸探針 的單鏈核酸微陣列的方法的圖。在圖1A和1B中，M1 M7表示掩模，10 表示基底，20表示固定在基底IO表面上的可光除去的保護(hù)基團(tuán)。參照圖1A 和1B，在掩模M1 M7中，亮的部分為光透射穿過的區(qū)域，陰影線部分為 光未透射穿過的區(qū)域。可光除去的保護(hù)基團(tuán)20可連接到連接體、核酸單體、 或寡聚體上。另外，x-G、 x-A、 x-C和x-T中的x表示其中G、 A、 C和T 分別為堿基鳥。票呤、腺。票呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的可光除去的保護(hù)基團(tuán)。首 先，參照圖1A，當(dāng)用光經(jīng)過掩模M1照射基底10時，固定于基底10上的 可光除去的保護(hù)基團(tuán)20從被光照射的預(yù)先限定的區(qū)域除去，結(jié)果，暴露出 活性基團(tuán)。然后，使具有暴露的活性基團(tuán)的基底10的表面與具有可光除去 的保護(hù)基團(tuán)的第一活化的核酸單體反應(yīng)以使第一活化的核酸單體與基底10 的表面連接。通過洗滌除去未反應(yīng)的第一活化的核酸單體，然后用光經(jīng)過掩 模M2照射基底IO表面上的預(yù)先限定的區(qū)域，并且使基底IO的表面與具有 可光除去的保護(hù)基團(tuán)的第二活化的核酸單體反應(yīng)，由此將第二活化的核酸單 體與第一活化的核酸單體連接。通過使用掩模M3 M7重復(fù)進(jìn)行這樣的過 程，制得單鏈核酸微陣列，在該微陣列上四個不同的單鏈核酸探針分別固定 在四個樣點區(qū)上。在具有可光除去的保護(hù)基團(tuán)的第一和第二活化的核酸單體 中，可光除去的保護(hù)基團(tuán)可如上式1或2所示在5'-羥基或3'-羥基上連接到 活化的核苷酸。參照圖1A和圖1B,可光除去的保護(hù)基團(tuán)在5'-羥基上連接 到活化的核苷酸。如圖1A和圖1B中所示，當(dāng)通過經(jīng)過掩模M1-M7活化 基底10進(jìn)行在多個預(yù)先限定的區(qū)域上的單鏈核酸的光引導(dǎo)合成時，可使預(yù) 先限定的區(qū)域之間的間隔變窄。就是說，可增加預(yù)先限定的區(qū)域(樣點)的密 度。然而，在該情況中制備的多個掩模使制造過程變復(fù)雜。
圖2是說明根據(jù)本發(fā)明實施方式將圖1中制備的單鏈微陣列 化為雙鏈微陣列的方法的圖。在圖2中，S1 S4表示基底上的樣點區(qū)。將不同序列 的單鏈核酸分別固定在樣點區(qū)S1 S4上。另外，在圖2中，R1和R2分別 表示雙鏈核酸探針的雙鏈區(qū)域和單鏈區(qū)域。參照圖2,在基底上以3' —5'的 方向合成雙鏈核酸探針的第 一單鏈核酸，由此該雙鏈核酸探針的包括與第一 單鏈核酸互補(bǔ)的序列的第二單鏈核酸從基底以5' —3'的方向排列。然而，相 反的情況也是可能的，其中在基底上以5' —3'的方向合成第一單鏈核酸，并 且包括與第一單鏈核酸互補(bǔ)的序列的第二單鏈核酸從基底以3' —5'的方向排 列。第二單鏈核酸可在不使用掩模的情況下通過已知的固相核酸合成獲得或 者通過用限制酶消化天然核酸獲得，由此第二單鏈核酸可相對地長。例如， 單鏈區(qū)域R2可具有約30nt~約lOOOnt的長度。另夕卜，盡管未圖解于圖2中， 但可用與雙鏈區(qū)域R1特異性結(jié)合的物質(zhì)處理雙鏈區(qū)域R1以增強(qiáng)雜交結(jié)合。 例如，該物質(zhì)可為雙鏈特異性結(jié)合嵌入劑化合物如SYBR Green I。另外，基 底上第二單鏈核酸的近端可通過共價鍵或非共價鍵固定在第一單鏈核酸或 基底上。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的上述示例性實施方式，通過使用制造其上固定
備具有高的樣點密度且其上固定長的雙鏈核酸探針的微陣列。
應(yīng)理解，本文中所述的示例性實施方式應(yīng)僅在描述性的意義上考慮并且 不用于限制的目的。本發(fā)明各實施方式中的特征或方面的描述通常應(yīng)認(rèn)為可 用于本發(fā)明其它實施方式中的其它類似特征或方面。
權(quán)利要求
1.制造具有包括雙鏈區(qū)域和單鏈區(qū)域的固定化雙鏈核酸探針的微陣列的方法，該方法包括使用光刻法在固體基底表面上的多個樣點區(qū)上合成核酸以將多個第一單鏈核酸固定在所述多個樣點區(qū)上；和將所述多個第一單鏈核酸各自與第二單鏈核酸雜交以將所述多個第一單鏈核酸轉(zhuǎn)化為雙鏈核酸探針，所述第二單鏈核酸包括與所述多個第一單鏈核酸互補(bǔ)的第一區(qū)域和與所述多個第一單鏈核酸不互補(bǔ)的第二區(qū)域，所述雙鏈核酸探針各自包括雙鏈區(qū)域和單鏈區(qū)域，其中當(dāng)所述第一單鏈核酸的5′端與所述基底的表面連接時，所述第二區(qū)域位于所述第一區(qū)域的上游，和當(dāng)所述第一單鏈核酸的3′端與所述基底的表面連接時，所述第二區(qū)域位于所述第一區(qū)域的下游。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸的合成包括用光經(jīng)過掩模照射連接有可光除去的保護(hù)基團(tuán)的基底表面以從所述表面選擇性地除去所述保護(hù)基團(tuán)，由此形成反應(yīng)性區(qū)域和光保護(hù)區(qū)域的圖案，以及使所述反應(yīng)性區(qū)域的表面與具有可光除去的保護(hù)基團(tuán)的活化的核酸單體反應(yīng)，由此使所述核酸單體延伸至所述基底上的反應(yīng)性區(qū)域。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述與基底連接的可光除去的保護(hù)基團(tuán)通過連接體與所述基底連接，所述連接體的距所述基底表面遠(yuǎn)端的活性基團(tuán)被所述可光除去的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中所述連接體選自核苷和核苷酸，所述核苷和核苷酸的3'-端與所述基底連接且5'-端與所述可光除去的保護(hù)基團(tuán)連接、或者所述核苷和核苷酸的5'-端與所述基底連接且3'-端與所述可光除去的保護(hù)基團(tuán)連接。
5. 權(quán)利要求2的方法，其中重復(fù)進(jìn)行所述合成和反應(yīng)。
6. 權(quán)利要求2的方法，其中所述核酸單體為核苷或核苷酸。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述多個第一單鏈核酸選自DNA、 RNA、PNA及其雜合分子。
8. 權(quán)利要求l的方法，其中所述多個第一單鏈核酸各自具有約4nt 約25nt的長度。
9. 權(quán)利要求1的方法，其中，其上固定所述多個第一單鏈核酸的樣點區(qū) 的密度大于或等于約150,000個樣點/cm2。
10. 權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括存儲所述多個第一單鏈核酸的序列 和其上固定所述序列的樣點在所述基底上的位置。
11. 權(quán)利要求l的方法，其中，在所述多個第一單鏈核酸各自的雜交中， 在與在其上合成所述多個第一單鏈核酸的所述固體基底不同的介質(zhì)中合成 所述第二單鏈核酸。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述第二單鏈核酸是在不使用光刻法的情 況下在固體介質(zhì)中合成的。
13. 權(quán)利要求11的方法，其中所述第二單鏈核酸包括cDNA或得自通 過核酸擴(kuò)增獲得的核酸的DNA。
14. 權(quán)利要求11的方法，其中所述第二單鏈核酸具有50nt或更大的長度。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述第二單鏈核酸具有約50nt~約lOOOnt的長度。
16. 權(quán)利要求l的方法，其中所述多個第一單鏈核酸各自的雜交進(jìn)一步 包括設(shè)定所述雙鏈核酸探針在所述基底上的位置以對應(yīng)于與所述第二單鏈 核酸的第一區(qū)域互補(bǔ)的所述多個第一單鏈核酸的位置和存儲所述雙鏈核酸 探針的位置。
17. 權(quán)利要求1的方法，其中所述多個第一單鏈核酸和所述第二單鏈核 酸的第一區(qū)域之一為PNA,且它們中的另一個為DNA或RNA。
18. 權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括使所述雙鏈核酸探針和與核酸的雙 鏈區(qū)域特異性結(jié)合的物質(zhì)反應(yīng)，由此增強(qiáng)所述第二單鏈核酸與所述多個第一 單鏈核酸之間的雜交結(jié)合。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述與核酸的雙鏈區(qū)域特異性結(jié)合的物質(zhì) 包括雙鏈特異性結(jié)合嵌入劑。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述嵌入劑包括SYBR Green I。
全文摘要
本發(fā)明涉及制造具有固定化雙鏈核酸探針的微陣列的方法，包括通過使用光刻法合成核酸而固定核酸和使核酸雜交?？芍苽渚哂懈邩狱c密度和固定化長探針的微陣列。
文檔編號C40B50/18GK101660211SQ20091016963
公開日2010年3月3日 申請日期2009年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月27日
發(fā)明者李周遠(yuǎn) 申請人:三星電子株式會社