專利名稱：：植原體探針、基因芯片以及檢測(cè)植原體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植原體的檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是指植原體探針、包含該探針的高通檢測(cè)基因芯片以及利用該基因芯片檢測(cè)植物樣品中是否含有植原體的方法。
背景技術(shù)：
：1967年，日本科學(xué)家首次利用電子顯微鏡觀察有叢枝癥狀的桑樹(shù)、矮牽牛、馬鈴薯和泡桐等4種植物韌皮部篩管細(xì)胞中存在形態(tài)結(jié)構(gòu)類似動(dòng)物菌原體的微生物，但不能用菌原體培養(yǎng)基人工培養(yǎng)及不能感染動(dòng)物，將其稱之為類菌原體(Mycoplasma-likeorganism，ML0)。在1992年的第九屆國(guó)際菌原體組織(IntemationalOrganizationforMycoplasmology，I0M)大會(huì)上，首次提出了用植原體(phytoplasma)作為這類原核生物的新名稱和暫定的屬名(Phytoplasmasp)。是一類無(wú)細(xì)胞壁，不能人工培養(yǎng)，存在于植物韌皮部篩管細(xì)胞中類似細(xì)菌的原核生物，隸屬于軟壁菌門(mén)，柔膜菌綱，植原體屬。主要由韌皮部取食的昆蟲(chóng)傳播，包括葉蟬、飛虱和蚜蟲(chóng)，常常引起植株黃化、變?nèi)~、叢枝，而且被它侵染的植物一旦發(fā)病無(wú)特效藥可治，嚴(yán)重危害糧食、棉花、油料、花卉、藥材、蔬菜、果樹(shù)、橡膠、桑、竹等許多糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物以及林木和特種珍貴樹(shù)種，對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失，對(duì)人類生活造成重大影響。自1967年發(fā)現(xiàn)由植原體引起的病害以來(lái)，全世界已報(bào)道有多種植物(其中主要是木本植物)受到該類病原物的侵染，它所引起的病害已遍布世界各地。目前世界各地先后報(bào)道的植原體病害達(dá)700多種，我國(guó)也報(bào)道了70余種，且有不斷增加的趨勢(shì)。在我國(guó)，由植原體引起的植物黃化型病害已早有記載，江南流行的桑樹(shù)萎縮病，古時(shí)稱“桑癃”，在明末的《沈氏農(nóng)書(shū)·運(yùn)田地法》中即有“凡桑一癃，在無(wú)醫(yī)法，斷不可留者”的記載，證明我國(guó)勞動(dòng)人民對(duì)這類病害的性質(zhì)很早就有所認(rèn)識(shí)，我國(guó)是發(fā)現(xiàn)植原體病害較多的國(guó)家，最近統(tǒng)計(jì)的中國(guó)植原體類病共有74種植原體，上世紀(jì)50-70年代，桑樹(shù)萎縮病嚴(yán)重危害了江蘇、浙江兩省的桑樹(shù)種植，造成養(yǎng)蠶業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失，據(jù)調(diào)查，我國(guó)現(xiàn)有11個(gè)省的250萬(wàn)畝桑園受此病害為害，約占全國(guó)桑園總面積的25%，每年造成桑樹(shù)約10%的經(jīng)濟(jì)損失。在河南、山東等地發(fā)生的泡桐叢枝病，曾使人工種植林難以發(fā)展，1989年泡桐主產(chǎn)區(qū)河南省的叢枝病發(fā)病面積達(dá)504萬(wàn)畝，致使桐樹(shù)木材年生長(zhǎng)量減少約23萬(wàn)立方米。1990年通過(guò)對(duì)河南、山東等8省的調(diào)查顯示，我國(guó)泡桐叢枝病發(fā)病面積達(dá)88萬(wàn)公頃，每年造成直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)億元。棗瘋病一直是棗樹(shù)上一種難防治的毀滅性病害，據(jù)1989年統(tǒng)計(jì)，全國(guó)已有18個(gè)省、市有棗瘋病的分布和為害，棗樹(shù)主產(chǎn)區(qū)的河北、河南等五省發(fā)生最為普遍，感病棗樹(shù)結(jié)果小，果實(shí)品質(zhì)下降或不產(chǎn)棗，感病植株在幾年內(nèi)慢慢衰退死亡。植原體病害主要通過(guò)無(wú)性繁殖材料、種苗或昆蟲(chóng)介體傳播，很少或不能種子傳毒。帶病種苗能非常有效地通過(guò)高溫或抗菌素處理而脫掉病原。故及早發(fā)現(xiàn)感病植物中植原體的存在，及早采取相應(yīng)的措施，將帶毒植物予以鏟除，杜絕侵染來(lái)源，對(duì)該類病害的防治具有重要意義。帶毒植物的早期診斷是防治植原體病害的重要措施之一。近年，隨著城市發(fā)展建設(shè)和人們生產(chǎn)、生活的需要，我國(guó)每年都要從國(guó)外引進(jìn)大量花卉、種苗。在新修訂并公布的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中，就有14種植原體列入進(jìn)境檢疫性有害生物名錄，包括榿樹(shù)黃化植原體(Alderyellowsphytoplasma)、白賭樹(shù)黃化植原體(Ashyellowsphytoplasma)、藍(lán)莓矮化植原體(Blueberrystuntphytoplasma)、澳大禾0亞植原體{侯選禾中(CandidatusPhytoplasmaaustraliense)、^^Ι^^才直原(Grapevineflavescencedoreephytoplasma)、奧；^利亞植原體候選種、蘋(píng)果叢生植原體(App1epro1iferationphytoplasma)、梨衰退植原體(Peardeclinephytoplasma)、桃X病植原體(PeachX-diseasephytoplasma)、杏退綠卷葉植J^#(Apricotchloroticleafrollphtoplasma)^It^EH^ilJ^#(Coconutlethalyellowingphytoplasma)、愉韋刃皮部壞死植原體(Elmphloemnecrosisphytoplasma)、來(lái)樣叢枝植原體(Limewitches’broomphytopIasm)、馬鈴薯叢枝植原體(Potatowitches’broomphytoplasma)、草莓族生植原體(Strawberrymultiplierphytop1asma)。由于植原體既不象真菌、細(xì)菌那樣容易培養(yǎng)，也不象病毒易于提純，植原體自發(fā)現(xiàn)后的10多年里，其檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展一直沒(méi)有大的突破，嚴(yán)重阻礙了植原體的分類及診斷防治工作的進(jìn)程。在確定一種植物病害是否由植原體引起時(shí)，傳統(tǒng)方法一般先根據(jù)病害癥狀初步推測(cè)，然后對(duì)植物注射或噴灑植原體敏感的四環(huán)素類物質(zhì)，若癥狀受到抑制，就進(jìn)一步說(shuō)明病原物可能是植原體，最后均通過(guò)電子顯微鏡觀察加以確定。該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié)果往往也不是很可靠。80年代以來(lái)，隨著血清學(xué)、分子探針以及PCR技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，為植原體的檢測(cè)提供了相對(duì)簡(jiǎn)單、靈敏、可靠的檢測(cè)方法。Lin于1985年首次報(bào)道翠菊黃花病植原體的單克隆抗體制備成功之后，目前已經(jīng)成功制備了多種植原體的單克隆抗體，建立特異性和靈敏性較高的血清學(xué)檢測(cè)方法。但由于植原體在植株體內(nèi)含量低、大小不均一、易破碎、不能人工培養(yǎng)等自身的許多特點(diǎn)，導(dǎo)致很難制備出高效價(jià)的抗血清，國(guó)際上尚無(wú)商品化血清出售，多克隆抗體易與健康植株的抗原產(chǎn)生強(qiáng)烈的交叉反應(yīng)，這無(wú)疑大大限制了該法的推廣應(yīng)用。1987年KIRKPATRICK等利用重組DNA技術(shù)首次報(bào)道了西方X病植原體DNA成功的分離和克隆，并創(chuàng)立了靈敏的雜交(點(diǎn)雜交)分析法用于植原體的檢測(cè)。短短的幾年時(shí)間里，利用植原體DNA隨機(jī)克隆片段作為探針，建立靈敏、可靠的核酸雜交技術(shù)已成功用于多種植原體的檢測(cè)，也成功地應(yīng)用于植原體的區(qū)分及其分布和生態(tài)學(xué)的控制。PCR技術(shù)也即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)自90年代以來(lái)被廣泛用于生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，同樣也被用于植原體的檢測(cè)中來(lái)?；诒Ｊ匦蛄校?6SrRNA基因、核糖體蛋白基因、延伸因子、16S-23S間隔區(qū)域和其他保守的染色體基因或DNA序列而設(shè)計(jì)的通用引物或特異性引物可用來(lái)檢測(cè)與植原體相關(guān)的病害。而且近幾年，在此基礎(chǔ)上發(fā)展的巢式PCR、免疫-捕獲PCR、循環(huán)PCR、熒光實(shí)時(shí)PCR等技術(shù)提高了檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度。而上述這些方法都難以實(shí)現(xiàn)高通量、快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，難以實(shí)現(xiàn)大批量樣品的檢測(cè)、多類植原體的比較分析以及植原體蛋白質(zhì)相互作用的分析?；蛐酒哂懈咄刻匦裕梅线@一需要。基因芯片技術(shù)被譽(yù)為具有劃時(shí)代意義的“革命性技術(shù)”，作為一種檢測(cè)手段，其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和高通量等特性?；蛐酒糜跈z測(cè)已有不少理論和應(yīng)用成果，但主要集中在人類疾病診斷等方面，將基因芯片用于植物植原體檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道。目前，我國(guó)檢驗(yàn)檢疫部門(mén)對(duì)進(jìn)境植原體尚未建立有效的檢測(cè)方法，在入境口岸的檢疫實(shí)踐中，還無(wú)法對(duì)相關(guān)檢疫物進(jìn)行植原體的檢測(cè)，因此，在一線入境口岸建立植原體的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，把好植檢關(guān)口極其重要。而把好植檢關(guān)口的關(guān)鍵在于建立準(zhǔn)確快速，大批量貨物的集成化檢測(cè)的方法以滿足快速通關(guān)的要求。能夠在第一時(shí)間將為國(guó)家?guī)?lái)嚴(yán)重?fù)p失的植原體拒之國(guó)門(mén)之外。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供多種植原體探針，包含該探針的基因芯片，以及利用該基因芯片檢測(cè)植原體的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)不能同時(shí)、迅速、高通量地檢測(cè)多種植原體問(wèn)題。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案探針，針對(duì)選自序列表中SEQIDNO.1-11的11種植原體中至少一種植原體的16sRNA核苷酸序列，所述的探針序列選自表1中對(duì)應(yīng)植原體的至少一條特異性探針序列。對(duì)應(yīng)所述每種植原體的特異性探針為2-9條，每種植原體的特異性探針序列及熔解溫度如表1?；蛐酒?，包含如上所述的探針。所述芯片還包含陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照探針選取一段人類基因的保守序列如序列表中SEQIDNO.17-20，與植原體序列沒(méi)有同源性，陰性對(duì)照探針如表1中H28302128、H34916057、H4504152、H47060296對(duì)應(yīng)的序列；外參照陽(yáng)性對(duì)照探針?lè)謩e來(lái)自于5個(gè)小鼠管家基因序列如序列表中SEQIDNO.12-16，所述陽(yáng)性對(duì)照探針如表1中M3116F01、M3116F10、M3116E05、M3116D01、M3157F03對(duì)應(yīng)的序列。該基因芯片包括上下兩個(gè)重復(fù)的點(diǎn)樣區(qū)，每個(gè)獨(dú)立的點(diǎn)樣區(qū)包括四個(gè)小矩陣，每個(gè)矩陣包括8行19列共152個(gè)探針點(diǎn)，其中每一列為同一個(gè)探針的重復(fù)。每個(gè)獨(dú)立的點(diǎn)樣區(qū)中探針點(diǎn)樣如圖2及表3所示，所述芯片基質(zhì)選自玻片、硅片、金屬片或膜中的一種。一種利用上述基因芯片檢測(cè)植原體的方法，包括以下步驟(1)植物DNA樣品提取；(2)利用通用引物對(duì)樣品特異性片段擴(kuò)增并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記；(3)雜交將待測(cè)標(biāo)記的樣品加入雜交緩沖液中，混勻成雜交混合液，將混合液滴加入基因芯片的雜交區(qū)域，放入雜交盒雜交；(4)取出雜交后的芯片并干燥后，進(jìn)行掃描及數(shù)據(jù)分析，判斷樣品中有無(wú)植原體的存在。檢測(cè)植原體的方法中，第(2)步擴(kuò)增及標(biāo)記包括以下工藝步驟1)PCR擴(kuò)增其中特異性擴(kuò)增反應(yīng)體系DNA樣品0.Iyg擴(kuò)增引物對(duì)IyL10XPCRBuffer2μL2.5mMd(AGT)TPmix2μL0.25mMdCTP2μL25μMCy3-dCTP2μLrTaqase0.3μL加滅菌水至終體積20L特異性擴(kuò)增反應(yīng)條件95°CX5分鐘；95°CX15秒，55°CX15秒，72°CX15秒共40個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘，4°C冷卻；2)采用QIAquickPCRPurificationKit純化擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物，步驟如下a)加入5倍體積的BufferPB,混勻后，轉(zhuǎn)移到minispin純化柱中；b)離心13000rpmX1分鐘，棄收集套管中的液體；c)加入500μL緩沖液PE，離心13000rpmXlmin，棄收集套管中的液體；d)重復(fù)操作c)一次；e)不加試劑，離心13000rpmXlmin,棄去收集套管，換成1.5ml的離心管；f)加入BufferEB40μL,離心13000rpmXlmin；g)再加入BufferEB20μL，離心13000rpmXlmin，合并純化產(chǎn)物。檢測(cè)植原體的方法中，步驟(2)中所用擴(kuò)增引物結(jié)構(gòu)如表2所示的通用引物，其中針對(duì)序列表SEQIDN0.1-2，以及SEQIDNO.4_11的10種植原體的6對(duì)通用擴(kuò)增弓I物為Sensel、AntisenseKSense2、Antisense2、Sense3、Antisense3、Sense4、Antisense4>Sense5>Antisense5>Sense6>Antisense6；SEQIDNO.3白勺罾胃金黃色植原體，編號(hào)AY197663的擴(kuò)增引物為76631sense、76631antisense、76632sense、76632antisense；陽(yáng)性對(duì)照為外參照通用引物1和2。檢測(cè)植原體的方法中，第(3)步驟雜交工藝進(jìn)一步包括以下步驟1)預(yù)雜交或預(yù)處理將芯片放入盛有預(yù)雜交緩沖液的染色缸中進(jìn)行預(yù)處理20-30分鐘，之后取出芯片并吹干表面；2)雜交將標(biāo)記好的樣品抽干后重溶于3μL滅菌水，95°C水浴變性5分鐘，冰上冷卻5分鐘，加入32μL雜交緩沖液，混勻成雜交混合液，將混合液滴加入基芯片的雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，將芯片放入雜交盒進(jìn)行雜交處理；3)洗片雜交結(jié)束后取出芯片，放入盛有去離子水的染色缸中洗片，再放入盛有洗脫液的染色缸中洗片，之后取出芯片并吹干表面。本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明的特異性探針針對(duì)11種植原體具有較強(qiáng)的特異性，利用所述探針點(diǎn)樣制用基因芯片，能快速、高效、高通量檢測(cè)植原體，有效地解決了現(xiàn)有檢測(cè)方法存在的問(wèn)題，彌補(bǔ)了現(xiàn)有檢測(cè)方法的缺陷。本發(fā)明的基因芯片及其檢測(cè)方法，具有高度的特異性，檢出率可高達(dá)99.99%，一次雜交可檢測(cè)2種以上，最多達(dá)11種待檢植原體，能夠適應(yīng)高通量檢測(cè)的要求。利用該芯片可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成對(duì)待測(cè)樣品中多種植原體的雜交檢測(cè)。另外，基于芯片檢測(cè)結(jié)果的分析容易與計(jì)算機(jī)圖像處理和定量分析軟件結(jié)合，對(duì)檢測(cè)結(jié)果輸出規(guī)范化。圖1是本發(fā)明基因芯片上一個(gè)小矩陣示意圖。圖2是本發(fā)明基因芯片一個(gè)點(diǎn)樣區(qū)的探針排列模式圖。圖3是本發(fā)明基因芯片檢測(cè)廣州桑樹(shù)植原體探針混合雜交信號(hào)掃描圖。圖4是本發(fā)明芯片針對(duì)廣州桑樹(shù)植原體的多條探針雜交檢測(cè)結(jié)果比較。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的基因芯片可以用于以下11種植原體的檢測(cè)椰子致死黃化類菌原體CoconutlethalyellowingMLO(LethalyellowingdiseaseofcoconutPlant),編號(hào):DQ645636；蘋(píng)果叢生植原體appleproliferationPhytoplasma，編號(hào)AF248958；榆樹(shù)黃化植原體ElmyellowPhytoplasma，編號(hào)AF122910；葡萄金黃色植原體Grapevineflavescencedore'ePhytoplasma,編號(hào)AY197663；桃X植原體PeachXPhytoplasma,編號(hào):L33733；梨衰退植原體PeardeclinePhytoplasma，編號(hào)DQ011588；甘蔗白葉植原體SugarcanewhiteleafPhytoplasma,編號(hào)AB052874；番茄頑固植原體TomatostolburPhytoplasma；tomatobig-buddisease,DQ387052；ttftoJUililJ^^CitrusstubborrmSpiroplasma,編號(hào):AM157769；廣州桑豐對(duì)才直原體Mulberrydwarfphytoplasma16SribosomalRNAgene,partialsequence;16S—23SintergenicspacerandtRNA—Ilegene,completesequence；and23SribosomalRNAgene,partialsequence,編^:AY685056；g胃夕包ffiii豐支_才直帛#Paulowniawitches'-broomphytoplasmac1onePaffB-Qujing16SribosomalRNAgene,partialsequence,編號(hào)AY647460。該11種植原體的16sRNA序列具體參照系列表SEQIDNO.1_11。本發(fā)明的基因芯片包含至少一種植原體的特異性探針，也可包含上述十一種植原體的特異性探針，以下實(shí)例中以包含上述11種植原體的特異性探針。本發(fā)明的基因芯片還包含陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照探針選取了一段人類基因的保守序列，與植原體序列沒(méi)有同源性；外參照陽(yáng)性對(duì)照探針?lè)謩e來(lái)自于5個(gè)小鼠管家基因序列。請(qǐng)同時(shí)參照?qǐng)D1及圖2，本發(fā)明的基因芯片規(guī)格為上下兩個(gè)重復(fù)的點(diǎn)樣區(qū)，可以同時(shí)完成兩次樣品檢測(cè)。每個(gè)獨(dú)立的點(diǎn)樣區(qū)包括四個(gè)小的矩陣，每個(gè)矩陣包括8行19列共152個(gè)探針點(diǎn)，其中每一列為同一個(gè)探針的重復(fù)(即8次重復(fù))，本實(shí)施例中，探針的具體點(diǎn)樣排列見(jiàn)表3，但不限于表3的位置分布，可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行排列。本發(fā)明的基因芯片基質(zhì)選自玻片、硅片、金屬片和膜，優(yōu)選為玻片。本發(fā)明的實(shí)施例中采用Fullmoon公司生產(chǎn)的PowerMatrixoligo芯片片基。本發(fā)明通過(guò)Genebank獲得上述11種植原體的16sRNA核苷酸序列，進(jìn)而進(jìn)行保守序列分析，從而對(duì)每種植原體設(shè)計(jì)相應(yīng)的1對(duì)引物和2-9條特異性探針來(lái)制備本發(fā)明的基因芯片。這些探針選自根據(jù)包含上述11種植原體的16sRNA的核苷酸序列進(jìn)行保守性序列分析而設(shè)計(jì)的探針，其中針對(duì)11種植原體(以對(duì)應(yīng)的編號(hào)來(lái)描述)的特異性探針為AB052874的特異性探針有AB052874-1、AB052874-2、AB052874-5、AB052874-6、AB052874-7、AB052874-8的核苷酸序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1_2的第2_3列，矩陣3-4的第2列；針對(duì)AF122910有AF122910-2、AF122910-5、AF122910-6、AF122910-7的核苷酸序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1-2的第4列，矩陣3-4的第3列；針對(duì)AF248958的特異性探針序列有AF248958-2、AF248958-5、AF248958-6、AF248958-7、AF248958-8、AF248958-9、AF248958-10的核苷酸序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1的第5_6列，矩陣2的第5列，矩陣3-4的第4-5列；針對(duì)AM157769的特異性探針有AM157769_2、AM157769_4、AM157769-5、AM157769-6、AM157769-7、AM157769-8的核苷酸序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1的第7列，矩陣2-3的第6-7列，矩陣4的第6列；針對(duì)AY197663的特異性探針序列有AY197663-11、AY197663-12、AY197663-21、AY197663—22的核苷酸序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1-3的第8列，矩陣4的第7列；針對(duì)AY647460的特異性探針序列有AY647460-2、AY647460-4、AY647460-5、AY647460-6、AY647460-7的核苷酸序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1-3的第9列，矩陣4的第8-9列；針對(duì)AY685056的特異性探針序列有AY685056-1、AY685056-2、AY685056-4、AY685056-5、AY685056-6、AY685056-8、AY685056-9、AY685056-10、AY685056-11的核苷酸序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1的第10-12列，矩陣2-4的第10-11列；針對(duì)DQ011588的特異性序列有DQ011588-2、DQ011588-5、DQ011588-6、DQ011588-7、DQ011588-8、DQ011588-9、DQ011588-11的核苷酸序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1的第13列，矩陣2-4的第12-13列；針對(duì)DQ387052的特異性探針序列有DQ387052-1、DQ387052-2、DQ387052-5、DQ387052-6、DQ387052-7、DQ387052-8的核苷酸序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1-2的第14-15列，矩陣3-4的第14列；針對(duì)DQ645636的特異性探針序列有DQ645636-4、DQ645636-5、DQ645636-7、DQ645636-8、DQ645636-9、DQ645636-10的核苷酸序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1_2的第16列，矩陣3_4的第15-16列；針對(duì)L33733的特異性探針序列有L33733-2、L33733-3、L337334、L33733-5、L33733-7、L33733-8的核苷酸序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1_2的第17-18列，矩陣3_4的第17列。這些特異性探針的核苷酸序列為其對(duì)應(yīng)的植原體核苷酸序列的一部分，具體見(jiàn)下表1所示；而陰性對(duì)照的人類基因的保守序列如序列表中SEQIDNO.17-20，陰性對(duì)照探針選自其對(duì)應(yīng)的人類保守序列中的一段，具體見(jiàn)表1中H28302128、H34916057、H4504152、H47060296對(duì)應(yīng)的序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1_4的第1列。陽(yáng)性對(duì)照的5個(gè)小鼠管家的基因序列如序列表中SEQIDM).12-16，陽(yáng)性對(duì)照的探針選自其對(duì)應(yīng)的5個(gè)小鼠管家的基因序列中的一段，具體見(jiàn)表1中M3116F01，M3116F10,M3116E05,M3116D01,M3157F03對(duì)應(yīng)的序列，點(diǎn)樣位置如表3中所示矩陣1-2的第19列，矩陣3的第18-19列，矩陣4的第1列。矩陣4的第19列為空白孔。表111種植原體及陰陽(yáng)對(duì)照的特異性探針序列探針代號(hào)探針序列K度解鏈溫度TmAB052874--1TACATGCAAGTCGAACGGAAATCTTCGGATTTTAGTGGCGAACGGGTGAGTAAC54754AB052874--2CTGGATAGGAAATAAAAAGGCATCTTTTTATTTTTAAAAGACCTTTTTCGGAAGGTATGCTT60705AB0528745TACTAAGTGTCGGGATTACTCGGTAGTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTC55731AB0o287-1--6GTTTMTTCGAAGATACACGAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCTGCAAAG55712AB052874--7GCTGTTACAMGAGTAGCTGAAACGCAAGTTTATAGCCAATCTCATAAAAGCAGTCTC58727AB0528748CCCGTCAAACCACGAAAGTTGGTAATACTCA/IAAACGGTAGCCTAACTTCTTCG54739AF122910--2GATAGGAAACAGAAAGGCATCTTTTTGTTTTTAAAAGACCTTCTTCGGAGGGTAT557丄2AF122910--5TACTAAGTGTCGGGGAAAACTCGGTACTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCC5473.6AF1229106GTTTAATTCGAAGATACACGAAAAACCTTACCAGGTCTTCACATACTCTCCAAA5471AK122910--7TACAAAGAGTAGCTCAAACGCGAGTTTTTAGCCAATCTCAAAAAGGTAGTCTCAGT5673AF248958--10AGACTTAAAAAAGTTTTTTATTTTTTAAGATAAAAATAAATAATGGTCCGGGGCCT5667.3AF2489582CTGGATAGGAAGTTTTAAGGCATCTTGAAACTTTTMAAGACCCGCAAGGCTAT5472AF248958--5TGTTGGGTTAAACCAGTGCTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTA5573.5AF248958--6GTTTAATTCGAAGATACACGAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCTGCAAA5471AF248958--7TACAATGGCTGTTACAAAGAGTAGCTGAAGCGTGAGTTTTTAGCAAATCTCAAAAA5672.1AF248958-8CCCGTCAAACCATGAAAGTTGACAATACTCGAAACCAGTAGCCTAACTTGTAAA5472.7AF248958--9GTGAGGTCGATGGTTCGAGTCCATTTAGGCCCACCAAGGTATTTATCTTAAGAAA5573.8AM157769--2ATACGACATTTTCTGGCATCAGAGAATGTTAAAAGGTCCGTTTGGATCACTAATGGA5773AM157769-4GTTTAACAAGTTTGGGGTCAAATCCTGGAGCTCAACTCCAGTTCGCCTTGAAAA5475AM157769-5TGAGTACTAAGTGTCGGACTAAGTTCGGTGCTGCAGCTAAC(;CAT'rAAGTACTC54745AM157769--BG'nTAATTCtlAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATCCAGTGCAAA54753AM157769--7TACAATGGTCGGTACAAACAGTTGCGATCTCGTAAGAGGGAGCTAATCTGAAAA54737AM157769--8CACACCATGAGAGCT(iATAATACCAGAAGTCGGTATTCTAy\CCGCAAGGAGGAA54744AY197663--11AAAAGTGCTGTTGCAAATGCTGTTCATAATTTTAATTTTAATAAAGATGATTTATTTGT59674AY197663-12AAAAAAGAATGAGTCGTG'IAAAAATATTTCTTTCTTCATTTAAAAAAGAAATTCAGGAGAT61674AY197663--21GGAGCTGAAAAAtiCTAGAAGAGATTCTATTTCTATGGGAGTTGTTCCTTTGAA53706AY197663--22TTAAAGTAATTATTAATCATGGTGAGGTTTTACCTAATAAAACCATCGCAGAT53671AY647460-2GGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGG6173AY647460--4GTAGGCGGTTAAATAAGTTTGTGGTCTAACTGCAATGCTCAACATTGTGATGCTAT5673A.Y647460--5CGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTASS73AY647460--6TTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGCTCTTGACATGCTTCTGCAAAG5574.2AY647460--7TACAATGGCTGTTACGAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAA5575.7AY685056--1CAAGTCGAACGGAAGTTTAAGCAATTAAACTTTAGTGGCGAACGGGTGAGTAAC5473.4ATO85056-’10TTCAGTTTTGAGAGACTTAAGAAAGTTTTTCATTGTAACTTCCTTGCAAATTGT5469.3AY685056--11TTTGAAAAGTAGATAAACGAAGGTTAAAAAATCAAAGGAACTAAGGGCGCACA5370.6AY685056--2CTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTT6072.6AY685056-4GTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCA.A.TGCTCAACATTGTGATGCT5472.3AY685056--5CGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTA5573AY685056--6TTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAA5474.6<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本發(fā)明的基因芯片可以通過(guò)以下步驟制備首先通過(guò)Genebank獲得上述11種植原體的16sRNA核苷酸序列，進(jìn)而進(jìn)行保守序列分析，從而針對(duì)11種植原體分別合成2-9條特異性探針，探針序列見(jiàn)上表1。將合成好的探針溶解于IX點(diǎn)樣緩沖液(購(gòu)自Fullmoonbiosystems)中，探針濃度為20iiM。芯片生產(chǎn)使用Amershampharmacia公司生產(chǎn)的芯片點(diǎn)樣儀(GenlllArrayspotter),片基采用Fullmoon公司生產(chǎn)的PowerMatrixoligo芯片片基，按照標(biāo)準(zhǔn)的oligo芯片生產(chǎn)工藝生產(chǎn)。各條探針重復(fù)點(diǎn)樣；點(diǎn)樣完畢之后，干燥，之后用SDS漂洗，再用雙蒸水漂洗，最后室溫涼干。制備好的芯片放于4攝氏度冰箱保存?zhèn)溆谩＞唧w各探針在基片上的排列模式、排列方式見(jiàn)圖1、圖2以及下頁(yè)表3。另外，根據(jù)11種植原體的16sRNA核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)除葡萄金黃色植原體(編號(hào)AY197663)外其他10種植原體的6對(duì)通用擴(kuò)增引物為Sensel、Antisensel、Sense2、Antisense2、Sense3、Antisense3、Sense4、Antisense4、Sense5、Antisense5、Sense6、Antisense6；針對(duì)AY197663的擴(kuò)增弓丨物為76631sense、76631antisense、76632sense,76632antisense0陽(yáng)性對(duì)照為外參照通用引物1和2。引物的具體序列見(jiàn)下表2表211種植原體及陽(yáng)性對(duì)照的通用弓|物序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>用本發(fā)明基因芯片測(cè)樣品中植原體的方法，主要包括以下步驟1)植物RNA提取取1－2g發(fā)病葉片，剪成小段，用液氮研磨成粉末狀，移入滅菌的1.5mL離心管中，用常規(guī)CTAB法提取樣品總RNA，具體操作步驟如下(a)檢測(cè)樣品置于液氮中進(jìn)行研磨，加入預(yù)熱至65°C的適當(dāng)體積的CTBA裂解液，溫育60分鐘，不時(shí)混勻；(b)向裂解液中加入等體積的氯仿/異戊醇(241)抽提，4°C、7500g離心5分鐘。(c)回收上層水相加入1/10體積預(yù)熱至65°C的CTBA/NaCl溶液混勻，用等體積的氯仿/異戊醇(241)抽提，4°C、7500g離心5分鐘，回收上清液。(d)加入等體積CTBA沉淀液，65°C溫育30分鐘，4°C、500g離心5分鐘。(e)去上清，以高鹽TE緩沖液重懸沉淀，待沉淀溶解后加入0.6體積的異丙醇沉淀，4°C、7500g離心15分鐘。(f)加入1毫升75%乙醇懸起沉淀，7500g離心5分鐘，棄上清，室溫晾干。(g)加入適量滅菌水溶解沉淀，測(cè)定DNA樣品濃度和總量，樣品保存于-20°C歸檔。2)植原體特異性片段擴(kuò)增提取的樣品DNA采用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行標(biāo)記，外參照陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒樣品按等量混合后，利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在PCR擴(kuò)增過(guò)程加入標(biāo)記的Cy3_dCTP同時(shí)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，采用QIAquickPCRPurificationKit純化擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物，即得待測(cè)樣品(I)PCR擴(kuò)增特異性擴(kuò)增反應(yīng)體系(20μL)DNA樣品0.Iyg擴(kuò)增弓丨物對(duì)(5μΜ)IuL10XPCRBuffer2μL2.5mMd(AGT)TPmix2μL0.25mMdCTP2μL25μMCy3-dCTP2μLrTaqase0.3μL加滅菌水至終體積20μL特異性擴(kuò)增反應(yīng)條件95°CX5分鐘；95°CX15秒，55°CX15秒，72°CX15秒共40個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘，4°C冷卻。具體地講PCR反應(yīng)采用40循環(huán)，雜交前變性反應(yīng)條件為95度變性5min，退火溫度為55°C，退火時(shí)間為15S，72°C延伸15S，循環(huán)結(jié)束后72°C延伸反應(yīng)5min。(2)采用QIAquickPCRPurificationKit純化擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物，步驟如下a)加入5倍體積的BufferPB,混勻后，轉(zhuǎn)移到minispin純化柱中；b)離心13000rpmX1分鐘，棄收集套管中的液體。c)加入500μL緩沖液PE，離心13000rpmXlmin，棄收集套管中的液體。d)重復(fù)操作(c)一次。e)不加試劑，離心13000rpmXlmin，棄去收集套管，換成1.5ml的離心管。f)加入BufferEB40μL,離心13000rpmXImin；g)再加入BufferEB20μL，離心13000rpmXlmin，合并純化產(chǎn)物。3)雜交(1)預(yù)雜交或預(yù)處理將芯片放入片夾(小片夾最多能放6張玻片)，向染色缸中倒入200-250毫升預(yù)雜交緩沖液，將片夾放入染色缸，置于搖床上于室溫緩慢搖晃20-30分鐘；取出片夾，取出玻片立刻甩干，同時(shí)用氣罐輕輕吹干表面直至玻片完全干燥。預(yù)雜交緩沖液是市售的產(chǎn)品，本發(fā)明的預(yù)雜交緩沖液購(gòu)自Fullmoonbiosystems，其主要成分是6XSSC，0.5%SDS,5XDenhardt，100ug/ml鮭魚(yú)精DNA。預(yù)雜交目的是封閉芯片上能與DNA非特異性結(jié)合位點(diǎn)，阻斷檢測(cè)樣本中可能與芯片上探針產(chǎn)生非特異性結(jié)合的位點(diǎn)。(2)雜交將標(biāo)記好的待測(cè)樣品(檢測(cè)樣品，陽(yáng)性對(duì)照或混合樣品)抽干后重溶于3μL滅菌水，95°C水浴變性5分鐘，冰上冷卻5分鐘，加入32μL雜交緩沖液，混勻成雜交混合液，將混合液滴加入芯片的雜交區(qū)域，芯片上每個(gè)獨(dú)立的雜交區(qū)域可以加上15μL雜交混合液，蓋上蓋玻片，將芯片放入雜交盒，并在底部加上少量滅菌水保濕，用封口膜密封雜交盒，置于48°C孵箱中水平搖床上緩慢搖晃2小時(shí)。交緩沖液是市售的產(chǎn)品，本發(fā)明所用的雜交緩沖液也是購(gòu)自Fullmoonbiosystems，其主要成分是6XSSC，0.01mol/l的EDTA，0.5%SDS,5XDenhardt,100ug/ml鮭魚(yú)精DNA。(3)洗片雜交結(jié)束后，取出玻片放于片夾上，將片夾放入預(yù)先放滿去離子水的染色缸中，讓蓋玻片垂直并自然滑落；取出片夾，迅速放入另一個(gè)預(yù)先盛有200-250毫升洗脫液I(0.1%SSC)的染色缸中，將染色缸置于搖床上于室溫緩慢搖晃20分鐘；取出片夾，再重復(fù)洗滌一次后，取出玻片立刻甩干，同時(shí)用氣罐輕輕吹干表面直至玻片完全干燥。4)掃描玻片完全干燥后，放入掃描片夾中，利用掃描儀(晶芯LuxScan3.0，北京博奧)進(jìn)行掃描，掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強(qiáng)度的數(shù)字信號(hào)(GenePixPro6.0)，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。Cy3標(biāo)記用532nm激光管掃描，Cy5標(biāo)記用635nm激光管掃描，PMT為900。5)數(shù)據(jù)分析，判斷樣品中有無(wú)植原體的存在。例一以檢測(cè)廣州桑樹(shù)植原體為例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的基因芯片檢測(cè)樣品步驟，樣品檢測(cè)步驟如下1)植物RNA提取取l_2g發(fā)病葉片，剪成小段，用液氮研磨成粉末狀，移入滅菌的1.5mL離心管中，用常規(guī)CTAB法提取樣品總RNA。2)植原體特異性片段擴(kuò)增提取的樣品DNA采用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行標(biāo)記，外參照陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒樣品按等量混合后利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和標(biāo)記(I)PCR擴(kuò)增特異性擴(kuò)增反應(yīng)體系(20μL)DNA樣品0.Iyg擴(kuò)增引物對(duì)(5μΜ)IuL10XPCRBuffer2μL2.5mMd(AGT)TPmix2μL0.25mMdCTP2μL25μMCy3-dCTP2μLrTaqase0.3μL加滅菌水至終體積20μL特異性擴(kuò)增反應(yīng)條件95°CX5分鐘；95°CX15秒，55°CX15秒，72°CX15秒共40個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘，4°C冷卻。(2)采用QIAquickPCRPurificationKit純化擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物，步驟如下a)加入5倍體積的BufferPB,混勻后，轉(zhuǎn)移到minispin純化柱中；b)離心13000rpmXl分鐘，棄收集套管中的液體。c)加入500μL緩沖液PE，離心13000rpmXlmin，棄收集套管中的液體。d)重復(fù)操作(c)一次。e)不加試劑，離心13000rpmXlmin，棄去收集套管，換成1.5ml的離心管。f)加入BufferEB40μL，離心13000rpmXImin；g)再加入BufferEB20μL，離心13000rpmXlmin，合并純化產(chǎn)物。3)雜交(1)預(yù)雜交或預(yù)處理將芯片放入片夾(小片夾最多能放6張玻片)，向染色缸中倒入200-250毫升預(yù)雜交緩沖液，將片夾放入染色缸，置于搖床上于室溫緩慢搖晃20-30分鐘；取出片夾，取出玻片立刻甩干，同時(shí)用氣罐輕輕吹干表面直至玻片完全干燥。(2)雜交將標(biāo)記好的探針抽干后重溶于3μL滅菌水，95°C水浴變性5分鐘，冰上冷5分鐘，加入32yL雜交緩沖液(Fullmoon公司提供)，混勻。芯片上每個(gè)獨(dú)立的雜交區(qū)域可以加上15μL雜交混合液，蓋上蓋玻片，將芯片放入雜交盒，并在底部加上少量滅菌水保濕，用封口膜密封雜交盒，置于48°C孵箱中水平搖床上緩慢搖晃2小時(shí)。(3)洗片雜交結(jié)束后，取出玻片放于片夾上，將片夾放入預(yù)先放滿去離子水的染色缸中，讓蓋玻片垂直并自然滑落；取出片夾，迅速放入另一個(gè)預(yù)先盛有200-250毫升洗脫液I(0.1%SSC)的染色缸中，將染色缸置于搖床上于室溫緩慢搖晃20分鐘；取出片夾，再重復(fù)洗滌一次后，取出玻片立刻甩干，同時(shí)用氣罐輕輕吹干表面直至玻片完全干燥。4)掃描玻片完全干燥后，放入掃描片夾中，利用掃描儀(晶芯LuxScan3.0，北京博奧)進(jìn)行掃描，掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強(qiáng)度的數(shù)字信號(hào)(GenePixPro6.0)，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。Cy3標(biāo)記用532nm激光管掃描，Cy5標(biāo)記用635nm激光管掃描，PMT為900。5)數(shù)據(jù)分析掃描結(jié)果見(jiàn)圖3，其中圖3(A)是雜交混合液中無(wú)添加桑樹(shù)樣品，雜交信號(hào)顯示的只是陽(yáng)性對(duì)照樣品(小鼠基因)的雜交信號(hào)，對(duì)應(yīng)芯片中陽(yáng)性對(duì)照探針的點(diǎn)樣陣列(結(jié)合表3)有四條熒光信號(hào)顯示。圖3(B)是雜交混合液中既有陽(yáng)性對(duì)照也有桑樹(shù)樣品，對(duì)應(yīng)基因芯片中針對(duì)廣州桑樹(shù)植原體AY685056的9條特性探針的點(diǎn)樣區(qū)有6條顯示較強(qiáng)雜交信號(hào)。圖4所示為針對(duì)AY685056的9條特異性探針的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度值，其中檢測(cè)出較強(qiáng)雜交信號(hào)的6條特異性探針是AY685056-1、AY685056-2、AY685056-5、AY685056-6、AY685056-10、AY685056-11。由圖3及圖4的結(jié)果可判斷樣品中有廣州桑樹(shù)植原體的存在。圖3(B)中其它位置的熒光信號(hào)為廣州桑樹(shù)植原體與是其它類植原體探針的非特異結(jié)合，不過(guò)信號(hào)相對(duì)較弱。序列表〈110〉深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院〈120〉植原體探針、基因芯片以及檢測(cè)植原體的方法<130>09F10566HL02<160>20<170>PatentInversion3.3<210>1〈211>1830<212>DNA〈213〉廣州桑樹(shù)植原體，編號(hào)AY685056，(Mulberrydwarfphytoplasma)〈220〉<221>genomicDNA〈222〉(1)·.(1830)<400>1aagagtttgatcctggctcaggattaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaa60cggaagtttaagcaattaaactttagtggcgaacgggtgagtaacgcgtaagcaatctgc120ccctaagacgaggataacagttggaaacgactgctaagactggataggagacaagaaggc180atcttcttgtttttaaaagacctagcaataggtatgcttagggaggagcttgcgtcacat240tagttagttggtggggtaaaggcctaccaagactatgatgtgtagccgggctgagaggtt300gaacggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaa360ttttcggcaatggaggaagctctgaccgagcaacgccgcgtgaacgatgaagtatttcgg420tacgtaaagttcttttattagggaagaataaatgatggaaaaatcattctgacggtacct480aatgaataagccccggctaactatgtgccagcagccgcggtaatacatagggggcaagcg540ttatccggaattattgggcgtaaagggtgcgtaggcggttaaataagtttatggtctaag600tgcaatgctcaacattgtgatgctataaaaactgtttagctagagtaagatagaggcaag660tggaattccatgtgtagtggtaaaatgcgtaaatatatggaggaacaccagtagcgaagg720cggcttgctgggtctttactgacgctgaggcacgaaagcgtggggagcaaacaggattag780ataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtactaaacgttgggtaaaaccagtgttg840aagttaacacattaagtactccgcctgagtagtacgtacgcaagtatgaaacttaaagga900attgacgggactccgcacaagcggtggatcatgttgtttaattcgaaggtacccgaaaaa960cctcaccaggtcttgacatgcttctgcaaagctgtagaaacacagtggaggttatcagtt1020gcacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgca1080acgagcgcaacccttattgttagttaccagcacgtaatggtggggactttagcaagactg1140ccagtgataaattggaggaaggtggggacgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctg1200ggctacaaacgtgatacaatggctgttacaaagggtagctgaagcgcaagtttttggcga1260atctcaaaaaaacagtctcagttcggattgaagtctgcaactcgacttcatgaagttgga1320atcgctagtaatcgcgaatcagcatgtcgcggtgaatacgttctcggggtttgtacacac1380cgcccgtcaaaccacgaaagttggcaatacccaaagccggtggcctaacttcgcaagaag1440agggaaccgtctaaggtagggtcgatgattggggttaagtcgtaacaaggtatccctacc1500ggaaggtggggatggatcacctcctttctaaggaaacaattatcatcttcagttttgaga1560gacttaagaaagtttttcattgtaacttgcttgcaaattgtatttgcaacattttaatct1620ttttaagattaagggcctatagctcagttggttagagcacacgcctgataagcgtgaggt1680cggtggttcaagtccatttaggcccaccataaccacaaataggcaaagtcttaaaaaagc1740tctttgaaaagtagataaacgaaggttaaaaaatcaaaggaactaagggcgcacagtgga1800tgccctggcactaagagccgatgaaggacg1830<210>2〈211>1249<212>DNA〈213〉云南泡桐叢枝病植原體，編號(hào)AY647460(Paulowniawitches‘-broomphytoplasma)〈220〉<221>genomicDNA〈222〉⑴··(1249)<400>2tacgactgctgctaagactggataggagacaagaaggcatcttcttgtttttaaaagacc60tagcaataggtatgcttaggtaggagcttgcgtcacattagttagttggtggggtaaagg120cctaccaagactatgatgtgtagccgggctgagaggttgaacggccacattgggactgag180acacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaattttcggcaatggaggaaactc240tgaccgagcaacgccgcgtgaacgatgaagtatttcggtacgtaaagttcttttattagg300gaagaataaatgatggaaaaatcattctgacggtacctaatgaataagccccggctaact360atgtgccagcagccgcggtaatacatagggggcaagcgttatccggaattattgggcgta420aagggtgcgtaggcggttaaataagtttgtggtctaagtgcaatgctcaacattgtgatg480ctataaaaactgtttagctagagtaagatagaggcaagtggaattccatgtgtagtggta540aaatgcgtaaatatatggaggaacaccagtagcgaaggcggcttgctgggtctttactga600cgctgaggcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgt660aaacgatgagtactaaacgttgggtaaaaccagtgttgaagttaacacattaagtactcc720gcctgagtagtacgtacgcaagtatgaaacttaaaggaattgacgggactccgcacaagc780ggtggatcatgttgtttaattcgaaggtacccgaaaaacctcaccaggtcttgacatgct840tctgcaaagctgtagaaacacagtggaggttatcagttgcacaggtggtgcatggttgtc900gtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattgtta960gttaccagcacgtaatggtggggactttagcaagactgccagtgataaattggaggaagg1020tggggacgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacaaacgtgatacaatgg1080ctgttacgaagggtagctgaagcgcaagtttttggcgaatctcaaaaaaacagtctcagt1140tcggattgaagtctgcaactcgacttcatgaagttggaatcgctagtaatcgcgaatcag1200catgtcgcggtgaatacgttctcggggtttgtacacaccgcccgtcaaa1249n<210>3<211>1198<212>DNA〈213〉葡萄金黃色植原體，編號(hào)AY197663(Grapevineflavescencedore‘ePhytoplasma)〈220〉<221>genomicDNA〈222〉⑴··(1198)<400>3aggcgataaaaaagtttcaaaaaaataatttaaagaaggtatttatatgaaagttaaagc60tgtaacaagtccaatacctattactcctagaaaagcacgtttagttgctgatttaatacg120tggtaagcatgttaaagaagcagaagctattttaatgtttacttctaaatcgtctgctcc180tgttatttttaaattattaaaaagtgctgttgcaaatgctgttcataattttaattttaa240taaagatgatttatttgttaaagaaatatttgtcgatgaaggtttacgtttacctcgttt300atttccgagagctaaaggtaaaacagataaagaatgagtcgtgtaaaaat360atttctttcttcatttaaaaaagaaattcaggagatgcaagtaaatgggtcaaaagagta420atcctaatggtttaagattaggaataattaggacttgggaatctaaatggtatgatgttg480ataaaaaagttccttttttagtcggtgaagattttaaaattagaactttaattaaaaatc540attatcctaaatcaactatttctcaaatagaaatcaaacgtttaaaaaaatcaaatgatg600aatttattgaaatagatttatatacttcaaaaataggtatcattcaaggtccggaaaata660agaataaaaatagtttaattaataaaatagaaaaattaattaataaaaaaattcaaatta720atatttttgaagtaaaagcaattaataaaattgctgttttagttgctcaaaatatcgcta780tgcaattgcaacaaagagctttttataaagctgttttaaaatcagctattcaaaaagctt840taaaaagcggtattaaaggtattaagattattattacaggtcgtttaggtggagctgaaa900aagctagaagagattctatttctatgggagttgttcctttgaatactttgagagctgata960ttgattacgcttttgaagaagcccatactacttatggtgttttaggtgttaaagtaatta1020ttaatcatggtgaggttttacctaataaaaccatcgcagatactagacaaatattttctt1080ctcaatatgaaaata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cagcctccttatttaacttaatagggacactattaaaaactgcaaagcaagcc180gggcgtggtggcgcatgcctttaatcccagcactcgggaggcagaggcaggtggatttct240gagttcgaggccagcctggtctacaaagtaagttccaggacagccagggctatacagaga300aaccctgtctcgaaaaacc319<210>14<211>258<212>DNA<213>陽(yáng)性對(duì)照的小鼠管家的基因序列，編號(hào)M3116E05(Mouse)<220><221>gene<222>(1)..(258)<400>14gctagacaagctggccagattagaggaaggacaagtctctgggaaaccaactaggtcagt60ctcaaaagccactgcctagatttttaccactcagaacatatgaaaggccctgtggctcct120tcttatggtctcacagtcaatgcagccaattacaacataattaactgtgcacagtgataa180cttttaacgaagccttcatcttcctggaaaggaagcaccttagattgtccccataatcaa240caagctcaatatgaagtg258<210>15<211>326<212>DNA<213>陽(yáng)性對(duì)照的小鼠管家的基因序列，編號(hào)M3116D01(Mouse)<220><221>gene<222>(1)..(326)<400>15tctatatttattttaattaggtaaaggaaattacagacttattgtagcttttgttttcaa60tcttaaaagtgaaattttatggaaatccaatgtattacttaatttttaactcaaatgatg120aatacaaggaatatatggatgctttctgcttttactgtttgtgtaaaatggtgtcatgac180atttaggagctgagacatgtacaggttaaatctgccttaagtgtgctgtgagtttactta240aagacaaacttgtgatataagagtgtaagagctattaccaagccaggattataaaacaaa300tactttaattaaaaacatgaaaacat326<210>16<211>324<212>DNA<213>陽(yáng)性對(duì)照的小鼠管家的基因序列，編號(hào)M3157F03(Mouse)<220><221>gene<222>(1)..(324)<400>16aaaggttctatattttattactggacaaacatcctaattcaagacacgaagagtctccag60gtttaaatgttgaaatccatctggtaggactgattgatgacaattcagtataaatcctca120gtcttgccattgtgtgaatccttacagacccagcttcgttctcctccagtgtcttctctt180agagttgtacctgattttgttaccagttttcatccggatccactgaggaatagggcgatt240ttgcttttgtttcttggccaggaatcgcttgattcggaaagtcttgtgagaagacatggc300gagaagccgaatcaagaatagcgc324<210>17<211>396<212>DNA<213>陰性對(duì)照的人類基因的保守序列，編號(hào)H28302128(Homosapiens)<220><22DmRNA<222>(1)..(396)<400>17gtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggac60aacctcaagggcacctttgccacactgagtgagctgcactgtgacaagctgcacgtggat120cctgagaacttcaggctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggc180aaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggctaat240gccctggcccacaagtatcactaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggtt300cctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatct360ggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgc396<210>18<211>565<212>DNA<213>陰性對(duì)照的人類基因的保守序列，編號(hào)H34916057(Homosapiens)<220><22DmRNA<222>(1)..(565)<400>18ttcgtgcacccacttgggcgctggaccccctctcagcaatggccaccggccggctgcaca60cgacttccccctggggcggcagctccccagcaggactaccccgaccctgggtcttgagga120agtgctgagcagcagggactgtcaccctgccctgccgcttcctcccggcttccatcccca180cccggggcccaattacccatccttcctgcccgatcagatgcagccgcaagtcccgccgct240ccattaccaagagctcatgccacccggttcctgcatgccagaggagcccaagccaaagag300gggaagacgatcgtggccccggaaaaggaccgccacccacacttgtgattacgcgggctg360cggcaaaacctacacaaagagttcccatctcaaggcacacctgcgaacccacacaggtga420gaaaccttaccactgtgactgggacggctgtggatggaaattcgcccgctcagatgaact480gaccaggcactaccgtaaacacacggggcaccgcccgttccagtgccaaaaatgcgaccg540agcattttccaggtcggaccacctc565<210>19<211>521<212>DNA<213>陰性對(duì)照的人類基因的保守序列，編號(hào)H4504152(Homosapiens)<220><22DmRNA<222>(1)..(521)<400>19ccgcccccagcaatccccggctcctgcgagtggcactgctgctcctgctcctggtagccg60ctggccggcgcgcagcaggagcgtccgtggccactgaactgcgctgccagtgcttgcaga120ccctgcagggaattcaccccaagaacatccaaagtgtgaacgtgaagtcccccggacccc180actgcgcccaaaccgaagtcatagccacactcaagaatgggcggaaagcttgcctcaatc240ctgcatcccccatagttaagaaaatcatcgaaaagatgctgaacagtgacaaatccaact300gaccagaagggaggaggaagctcactggtggctgttcctgaaggaggccctgcccttata360ggaacagaagaggaaagagagacacagctgcagaggccacctggattgtgcctaatgtgt420ttgagcatcgcttaggagaagtcttctatttatttatttattcattagttttgaagattc480tatgttaatattttaggtgtaaaataattaagggtatgatt521〈210>20<211>701<212>DNA〈213〉陰性對(duì)照的人類基因的保守序列，編號(hào)H47060296(Homosapiens)〈220〉<221>gene〈222〉(1)·.(701)<400>20tgaactcctacttcgagcctccggtggaggagagcgccttggaacgccgacctgaaacca60tctctgagcccaagacctatgttgacctaaccaatgaagaaacaactgattccaccactt120ctaaaatcagcccatctgaagatactcagcaagaaaatggcagcatgttctctctcatta180cctggaatattgatggattagatctaaacaatctgtcagagagggctcgaggggtgtgtt240cctacttagctttgtacagcccagatgtgatatttctacaggaagttattcccccatatt300atagctacctaaagaagagatcaagtaattatgagattattacaggtcatgaagaaggat360atttcacagctataatgttgaagaaatcaagagtgaaattaaaaagccaagagattattc420cttttccaagtaccaaaatgatgagaaaccttttatgtgtgcatgtgaatgtgtcaggaa480atgagctttgccttatgacatcccatttggagagcaccagagggcatgctgcggaacgaa540tgaatcagttaaaaatggttttaaagaaaatgcaagaggctccagagtcagctacagtta600tatttgcaggagatacaaatctaagggatcgagaggttaccagatgtggtggtttaccca660acaacattgtggatgtctgggagtttttgggcaaacctaaa70權(quán)利要求探針，針對(duì)選自序列表中SEQIDNO.1-11的11種植原體中至少一種植原體的16sRNA核苷酸序列，所述的探針序列選自表1中對(duì)應(yīng)植原體的至少一條特異性探針序列。2.如權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于對(duì)應(yīng)所述每種植原體的特異性探針為2-9條，每種植原體的特異性探針序列及熔解溫度如表1。3.基因芯片，包含如權(quán)利要求1-2中所述的探針。4.如權(quán)利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述芯片還包含陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照探針選取一段人類基因的保守序列如序列表中SEQIDN0.17-20，與植原體序列沒(méi)有同源性，陰性對(duì)照探針如表1中H28302128、H34916057、H4504152、H47060296對(duì)應(yīng)的序列；外參照陽(yáng)性對(duì)照探針?lè)謩e來(lái)自于5個(gè)小鼠管家基因序列如序列表中SEQIDNO.12-16，所述陽(yáng)性對(duì)照探針如表1中M3116F01、M3116F10、M3116E05、M3116D01、M3157F03對(duì)應(yīng)的序列。5.如權(quán)利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述芯片包括上下兩個(gè)重復(fù)的點(diǎn)樣區(qū)，每個(gè)獨(dú)立的點(diǎn)樣區(qū)包括四個(gè)小的矩陣，每個(gè)矩陣包括8行19列共152個(gè)探針點(diǎn)，其中每一列為同一個(gè)探針的重復(fù)。6.如權(quán)利要求5所述的基因芯片，其特征在于所述每個(gè)獨(dú)立的點(diǎn)樣區(qū)中探針點(diǎn)樣如圖2及表3所示，所述芯片基質(zhì)選自玻片、硅片、金屬片或膜中的一種。7.一種利用如權(quán)利要求3-6所述的基因芯片檢測(cè)植原體的方法，包括以下步驟(1)植物DNA樣品提??；(2)利用通用引物對(duì)樣品特異性片段擴(kuò)增并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記；(3)雜交將待測(cè)標(biāo)記的樣品加入雜交緩沖液中，混勻成雜交混合液，將混合液滴加入基因芯片的雜交區(qū)域，放入雜交盒雜交；(4)取出雜交后的芯片并干燥后，進(jìn)行掃描及數(shù)據(jù)分析，判斷樣品中有無(wú)植原體的存在。8.如權(quán)利要求7所述的檢測(cè)植原體的方法，其特征在于所述第(2)步擴(kuò)增及標(biāo)記包括以下工藝步驟1)PCR擴(kuò)增其中特異性擴(kuò)增反應(yīng)體系DNA樣品0.Iyg擴(kuò)增引物對(duì)IyL10XPCRBuffer2μL‘2.5mMd(AGT)TPmix2μL’0.25mMdCTP2μL‘25μMCy3-dCTP2μLrTaqase0.3μL加滅菌水至終體積20L特異性擴(kuò)增反應(yīng)條件95°CX5分鐘；95°CX15秒，55°CX15秒，72°CX15秒共40個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘，4°C冷卻；2)采用QIAquickPCRPurificationKit純化擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物，步驟如下a)加入5倍體積的BufferPB，混勻后，轉(zhuǎn)移到minispin純化柱中；b)離心13000rpmXl分鐘，棄收集套管中的液體；c)加入500μL緩沖液PE，離心13000rpmXlmin，棄收集套管中的液體；d)重復(fù)操作c)一次；e)不加試劑，離心13000rpmXlmin，棄去收集套管，換成1.5ml的離心管；f)加入BufferEB40μL,離心13000rpmXImin；g)再加入BufferEB20μL，離心13000rpmXlmin，合并純化產(chǎn)物。9.如權(quán)利要求7所述的檢測(cè)植原體的方法，其特征在于所述步驟(2)中所用擴(kuò)增引物結(jié)構(gòu)如表2所示的通用引物，其中針對(duì)序列表SEQIDNO.1-2，以及SEQIDN0.4-11的10種植原體的6對(duì)通用擴(kuò)增引物為Sensel、AntisenseUSense2、Antisense2、Sense3、Antisense3、Sense4、Antisense4、Sense5、Antisense5、Sense6、Antisense6；針對(duì)序列表中SEQIDNO.3的葡萄金黃色植原體，編號(hào)AY197663的擴(kuò)增引物為76631sense、76631antisense、76632sense、76632antisense；陽(yáng)性對(duì)照為外參照通用引物1和2。10.如權(quán)利要求7所述的檢測(cè)植原體的方法，其特征在于所述第(3)步驟雜交工藝進(jìn)一步包括以下步驟1)預(yù)雜交或預(yù)處理將芯片放入盛有預(yù)雜交緩沖液的染色缸中進(jìn)行預(yù)處理20-30分鐘，之后取出芯片并吹干表面；2)雜交將標(biāo)記好的樣品抽干后重溶于3μL滅菌水，95°C水浴變性5分鐘，冰上冷卻5分鐘，加入32μL雜交緩沖液，混勻成雜交混合液，將混合液滴加入基芯片的雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，將芯片放入雜交盒進(jìn)行雜交處理；3)洗片雜交結(jié)束后取出芯片，放入盛有去離子水的染色缸中洗片，再放入盛有洗脫液的染色缸中洗片，之后取出芯片并吹干表面。全文摘要本發(fā)明涉及植原體探針，包含該探針的基因芯片以及利用該基因芯片檢測(cè)植原體的方法。該植原體探針為針對(duì)11種植原體的特異性探針，點(diǎn)樣制成基因芯片，檢測(cè)植原體包括以下步驟植物DNA樣品提?。焕猛ㄓ靡飳?duì)樣品特異性片段擴(kuò)增并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記；雜交將待測(cè)標(biāo)記的樣品加入雜交緩沖液中，混勻成雜交混合液，將混合液滴加入基因芯片的雜交區(qū)域，放入雜交盒雜交；取出雜交后的芯片并干燥后，進(jìn)行掃描及數(shù)據(jù)分析，判斷樣品中有無(wú)植原體的存在。利用本發(fā)明的探針制成的基因芯片可快速、高效、高通量檢測(cè)11種植原體。文檔編號(hào)C40B40/06GK101805783SQ200910188508公開(kāi)日2010年8月18日申請(qǐng)日期2009年11月30日優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日發(fā)明者吳曉明,張麗君,羅煥亮申請(qǐng)人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院