專利名稱：：一種通過(guò)代謝預(yù)測(cè)和虛擬篩選發(fā)現(xiàn)中藥活性成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥活性成分的研究方法，特別是涉及一種通過(guò)代謝預(yù)測(cè)和虛擬篩選發(fā)現(xiàn)中藥活性成分的方法。
背景技術(shù)：
：中藥成分復(fù)雜，作用機(jī)理復(fù)雜。弄清中藥的所有活性成分、并弄清作用機(jī)理是中藥現(xiàn)代化研究領(lǐng)域的兩個(gè)重要方面。弄清所有活性成分，需要最終全面弄清一味中藥或復(fù)方所含有的化學(xué)成分中，哪些成分與該中藥的功能主治或藥理作用有關(guān)，存在特定的生物活性。另外，中藥所含化學(xué)成分在進(jìn)入人體后，有可能經(jīng)過(guò)代謝后才產(chǎn)生活性，因此，全面弄清該中藥所含化學(xué)成分的各種代謝產(chǎn)物是否對(duì)其功能主治或藥理作用有所貢獻(xiàn)也是非常必要的。弄清作用機(jī)理，則必須首先明確中藥所含化學(xué)成分的作用部位，即對(duì)哪些靶點(diǎn)產(chǎn)生了作用。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于中藥活性成分的研究方法很多，也取得了很多成果，在一定程度上闡明了某些中藥的部分化學(xué)成分及其代謝產(chǎn)物的活性。但是，現(xiàn)有方法和技術(shù)也存在很多問(wèn)題第一，往往專注于一種或幾種成分或有效部位的研究，難以全面揭示中藥的活性成分；第二，難以全面揭示中藥化學(xué)成分的各種代謝產(chǎn)物的作用；第三，研究靶點(diǎn)往往較為單一，難以揭示中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用規(guī)律；第四，研究周期長(zhǎng)、花費(fèi)大、效率低。近年來(lái)，計(jì)算機(jī)輔助藥物研究方法的逐漸發(fā)展和完善，為研究中藥活性成分提供了新的手段。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)代謝預(yù)測(cè)和虛擬篩選發(fā)現(xiàn)中藥活性成分的方法，該方法能全面揭示中藥的活性成分。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的通過(guò)代謝預(yù)測(cè)和虛擬篩選方法來(lái)發(fā)現(xiàn)中藥活性成分的方法包括如下步驟預(yù)測(cè)中藥所含化學(xué)成分的代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)收集該中藥所含的已確證化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，通過(guò)軟件或根據(jù)藥物代謝理論來(lái)預(yù)測(cè)這些化學(xué)成分在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；建立分子庫(kù)用軟件將該中藥所含的已確證化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分和上述步驟中所得到的各種預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物構(gòu)建成分子庫(kù)；建立作用耙點(diǎn)的三維模型根據(jù)該中藥的功能主治或藥理作用，選擇相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行建模，對(duì)于待研究靶點(diǎn)，可以直接利用已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)的靶點(diǎn)三維結(jié)構(gòu)模型，也可運(yùn)用軟件通過(guò)同源建模方法建立其三維結(jié)構(gòu)模型；虛擬篩選3A.用軟件將上述步驟所建立的分子庫(kù)和所建立的靶點(diǎn)分子模型進(jìn)行虛擬對(duì)接，利用評(píng)分函數(shù)對(duì)分子庫(kù)中的每一分子的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，同一分子如果存在多個(gè)評(píng)分，以多個(gè)評(píng)分的均數(shù)為最終評(píng)分，所得最終評(píng)分的絕對(duì)值Si用于結(jié)果判斷，i為自然數(shù)；B.選擇對(duì)所研究靶點(diǎn)有明確活性的陽(yáng)性藥物或化合物作為參比分子，將其與該靶點(diǎn)分子模型進(jìn)行虛擬對(duì)接，并得到對(duì)接評(píng)分，該對(duì)接評(píng)分的絕對(duì)值R用于結(jié)果判斷。C.結(jié)果判斷Si>RXx^，結(jié)果為虛擬活性陽(yáng)性，Si<RXx^，結(jié)果為虛擬活性陰性，所述x^代表相對(duì)于參比分子對(duì)接評(píng)分的比例，根據(jù)不同靶點(diǎn)、不同參比分子取不同值，通常x^〉50%;生物活性驗(yàn)證對(duì)上述步驟篩選出來(lái)的虛擬活性陽(yáng)性的分子，用體內(nèi)或體外藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行生物活性驗(yàn)證，凡通過(guò)生物活性驗(yàn)證的分子即為該中藥所含有的活性成分或該中藥所含化學(xué)成分代謝后產(chǎn)生的活性成分。上述方案中所述中藥包括復(fù)方中藥和單味中藥。上述方案中建立作用耙點(diǎn)的三維模型這一步驟可位于預(yù)測(cè)中藥所含化學(xué)成分的代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)這一步驟之前。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)針對(duì)待研究中藥的所有已知結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分進(jìn)行分析，能夠較為全面地揭示該中藥的對(duì)特定靶點(diǎn)的活性成分；(2)不僅考慮中藥所含有的化學(xué)成分本身的作用，同時(shí)考慮它們代謝產(chǎn)物的作用，從而能夠闡明該中藥所含有的化學(xué)成分是直接產(chǎn)生藥效還是經(jīng)過(guò)代謝之后產(chǎn)生藥效；(3)先通過(guò)虛擬篩選獲得潛在的活性成分，再進(jìn)行生物活性測(cè)試，與傳統(tǒng)的研究方法相比，避免了篩選的盲目性；(4)該方法能夠在短時(shí)間內(nèi)完成大量化學(xué)成分的多靶點(diǎn)潛在活性評(píng)價(jià)，與傳統(tǒng)研究方法相比，效率更高；(5)該方法的大部分實(shí)施步驟是通過(guò)計(jì)算機(jī)運(yùn)算完成的，與傳統(tǒng)研究方法相比，研究成本更低。圖1是軟件預(yù)測(cè)得到的中藥桑白皮所含化學(xué)成分的代謝產(chǎn)物分子。圖2是中藥桑白皮所含化學(xué)成分及其預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物組成的分子庫(kù)。圖1、圖2都只畫出了全圖的部分。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1(1)預(yù)測(cè)桑白皮所含化學(xué)成分的代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過(guò)檢索有關(guān)化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研，獲得中藥桑白皮所含的已確證結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分分子共計(jì)238個(gè)，運(yùn)用軟件PALLAS對(duì)桑白皮化學(xué)成分的可能代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物分子，見(jiàn)圖l，共計(jì)3293個(gè)；(2)建立桑白皮化學(xué)成分及其預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物分子庫(kù)用Chemsketch軟件繪制桑白皮所含化學(xué)成分及它們的預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，用CORINA軟件進(jìn)行構(gòu)象優(yōu)化，建立桑白皮化學(xué)成分及其預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物分子庫(kù)，見(jiàn)圖2;(3)建立中藥桑白皮利尿作用的靶點(diǎn)分子三維結(jié)構(gòu)模型根據(jù)桑白皮"利水消腫"的功效，選擇利尿作用的重要靶點(diǎn)鹽皮質(zhì)激素受體進(jìn)行建模。鹽皮質(zhì)激素受體的三維結(jié)構(gòu)來(lái)自ProteinDataBank,編號(hào)為2AA2，用文本編輯器除去水禾口配體，用MolegroVirtualDocker軟件進(jìn)行優(yōu)化；(4)對(duì)中藥桑白皮化學(xué)成分及其代謝產(chǎn)物的活性成分進(jìn)行虛擬篩選在MolegroVirtualDocker軟件中進(jìn)行對(duì)接運(yùn)算，由評(píng)分函數(shù)MolDockScore給出每個(gè)分子的對(duì)接評(píng)分，具體步驟是A.啟動(dòng)MolegroVirtualDocker軟件，導(dǎo)入已優(yōu)化的靶點(diǎn)鹽皮質(zhì)激素素受體的三維結(jié)構(gòu)模型；B.檢測(cè)耙點(diǎn)的活性區(qū)域本實(shí)驗(yàn)總共檢測(cè)出耙點(diǎn)的活性區(qū)域共有5個(gè)，選取其中與自帶配體AS4—201綁定的一個(gè)活性區(qū)域作為對(duì)接位點(diǎn)；C.導(dǎo)入桑白皮化學(xué)成分及代謝產(chǎn)物分子庫(kù)，選擇靶點(diǎn)自帶配體AS4—201作為參比分子；D.設(shè)置MolegroVirtualDocker軟件對(duì)接模塊的各種運(yùn)行參數(shù)；E.運(yùn)行對(duì)接模塊進(jìn)行虛擬對(duì)接運(yùn)算；F.對(duì)運(yùn)算結(jié)果進(jìn)行分析，采用軟件內(nèi)置的BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立數(shù)學(xué)模型，分析各種參數(shù)的相互關(guān)系及對(duì)對(duì)接結(jié)果的貢獻(xiàn)，并給出各配體分子的各種取向(pose)的MolDockScore評(píng)分；G.根據(jù)MolDockScore評(píng)分對(duì)所有pose進(jìn)行排序，并與參比分子的評(píng)分進(jìn)行比較。參比分子AS4_201的MolDockScore評(píng)分為-153.904。以AS4_201為參比對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行判斷R二153.904，設(shè)定1%=85%，桑白皮化學(xué)成分及代謝產(chǎn)物分子庫(kù)中，Si>RXx%=153.904X85%=130.818的化學(xué)成分共20個(gè)，見(jiàn)表1，這些成分具有虛擬活性(理論活性)。表1針對(duì)鹽皮質(zhì)激素受體(2AA2)虛擬篩選的結(jié)果序號(hào)化學(xué)成分評(píng)分序號(hào)化學(xué)成分評(píng)分1桑呋喃(mulbeiTofuran)D-156.25411桑呋喃D05-135.4452桑呋喃D01-155.53612桑根酮(sanggenone)K10-135.0993桑呋喃D04-147.42913桑呋喃D03-134.1794桑呋喃D02-144.95614桑呋喃B-134.1355桑呋喃素(albafuran)A03-138.76615桑根酮K06-133.932<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注①表中化學(xué)成分名稱中的數(shù)字是指該化學(xué)成分的多個(gè)預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物的某一個(gè)結(jié)構(gòu)的編號(hào)。例如，桑呋喃D03表示桑呋喃D的預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物中編號(hào)為03的分子結(jié)構(gòu)。②由于成功的對(duì)接的一個(gè)前提是體系的能量較低以使相互作用保持穩(wěn)定，因而對(duì)接過(guò)程可視為放能過(guò)程，故MolDockScore評(píng)分為負(fù)值，MolDockScore評(píng)分的絕對(duì)值越大，則表明預(yù)測(cè)活性越強(qiáng)。(4)桑白皮利尿作用虛擬活性為陽(yáng)性的化學(xué)成分桑呋喃D的活性驗(yàn)證A..材料與方法a.禾才茅斗SD大鼠(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供)，體重200235g;大鼠代謝籠(配糞尿分離漏斗)。桑呋喃D(西華大學(xué)生物工程學(xué)院藥物化學(xué)研究室提供)，加少量吐溫80配成lmg/ml的生理鹽水溶液。b.方法動(dòng)物的篩選將大鼠置代謝籠中，禁食24h，以生理鹽水25ml/kg灌胃。收集2h內(nèi)尿液，尿量為灌胃量40%以上者為合格大鼠。利尿?qū)嶒?yàn)取篩選合格的雄性大鼠20只，隨機(jī)分為兩組，禁食不禁水24h后，均以生理鹽水25ml/kg灌胃給予水負(fù)荷。給藥前，先輕壓大鼠下腹，排盡余尿，隨后給藥。給藥組腹腔注射桑呋喃D，劑量10mg/kg;對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，劑量10ml/kg。收集尿液，記錄6h內(nèi)各鼠排出的總尿量。B.結(jié)果生理鹽水對(duì)照組總尿量為4.36±0.87ml;給藥組總尿量為5.68±0.72ml，與對(duì)照組有極顯著差異(P<0.01)，表明桑呋喃D具有利尿作用。實(shí)施例2本實(shí)施例的(1)、(2)步驟同實(shí)施例1，(3)步驟則是依據(jù)桑白皮的抗HIV的藥理作用建立篩選HIV抑制劑的靶點(diǎn)分子模型(1HVR)，(4)步驟中參比分子X(jué)K2263的評(píng)分為-239.872，R=239.872，設(shè)定x%=80%，桑白皮化學(xué)成分及其預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物分子庫(kù)中，Si>RXx%=239.872X80%=191.898的化學(xué)成分共15個(gè)，見(jiàn)表2。這些成分的虛擬活性為陽(yáng)性，具有潛在的HIV抑制活性。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，桑呋喃0對(duì)H9/HIV-1IIIB細(xì)胞中病毒6的復(fù)制有抑制作用，表明其有抗HIV的活性。表2針對(duì)抗HIV耙點(diǎn)1HVR虛擬篩選的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求一種通過(guò)代謝預(yù)測(cè)和虛擬篩選發(fā)現(xiàn)中藥活性成分的方法，其特征在于包括以下步驟預(yù)測(cè)中藥所含化學(xué)成分的代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)收集該中藥所含的已確證化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，通過(guò)軟件或根據(jù)藥物代謝理論來(lái)預(yù)測(cè)這些化學(xué)成分在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；建立分子庫(kù)用軟件將該中藥所含的已確證化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分和上述步驟中所得到的各種預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物構(gòu)建成分子庫(kù)；建立作用靶點(diǎn)的三維模型根據(jù)該中藥的功能主治或藥理作用，選擇相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行建模，對(duì)于待研究靶點(diǎn)，可以直接利用已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)的靶點(diǎn)三維結(jié)構(gòu)模型，也可運(yùn)用軟件通過(guò)同源建模方法建立其三維結(jié)構(gòu)模型；虛擬篩選A.用軟件將上述步驟所建立的分子庫(kù)和所建立的靶點(diǎn)分子模型進(jìn)行虛擬對(duì)接，利用評(píng)分函數(shù)對(duì)分子庫(kù)中的每一分子的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，同一分子如果存在多個(gè)評(píng)分，以多個(gè)評(píng)分的均數(shù)為最終評(píng)分，所得最終評(píng)分的絕對(duì)值Si用于結(jié)果判斷，i為自然數(shù)；B.選擇對(duì)所研究靶點(diǎn)有明確活性的陽(yáng)性藥物或化合物作為參比分子，將其與該靶點(diǎn)分子模型進(jìn)行虛擬對(duì)接，并得到對(duì)接評(píng)分，該對(duì)接評(píng)分的絕對(duì)值R用于結(jié)果判斷；C.結(jié)果判斷Si≥R×x％，結(jié)果為虛擬活性陽(yáng)性，Si＜R×x％，結(jié)果為虛擬活性陰性，所述x％代表相對(duì)于參比分子對(duì)接評(píng)分的比例，根據(jù)不同靶點(diǎn)、不同參比分子取不同值，通常x％＞50％；生物活性驗(yàn)證對(duì)上述步驟篩選出來(lái)的虛擬活性陽(yáng)性的分子，用體內(nèi)或體外藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行生物活性驗(yàn)證，凡通過(guò)生物活性驗(yàn)證的分子即為該中藥所含有的活性成分或該中藥所含化學(xué)成分代謝后產(chǎn)生的活性成分。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)代謝預(yù)測(cè)和虛擬篩選發(fā)現(xiàn)中藥活性成分的方法，其特征在于所述中藥包括復(fù)方中藥和單味中藥。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)代謝預(yù)測(cè)和虛擬篩選發(fā)現(xiàn)中藥活性成分的方法，該方法包括如下步驟(1)收集所研究中藥的所有已確證結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，并對(duì)這些化學(xué)成分在體內(nèi)可能產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)測(cè)；(2)將該中藥所含的已確證結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分和它們的預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物建立為分子庫(kù)；(3)根據(jù)該中藥的功能主治或藥理作用建立相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)作用靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)模型(4)用軟件將分子庫(kù)和靶點(diǎn)模型進(jìn)行虛擬對(duì)接，對(duì)分子庫(kù)中每一分子的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，并與參比分子相比較，篩選出虛擬活性為陽(yáng)性的分子；(5)將虛擬活性為陽(yáng)性的化學(xué)成分進(jìn)行生物活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從而發(fā)現(xiàn)代表該中藥功能主治或藥理作用的活性成分。本發(fā)明能全面揭示中藥的活性成分。文檔編號(hào)C40B30/06GK101736406SQ200910216138公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2009年11月4日優(yōu)先權(quán)日2009年11月4日發(fā)明者楊文宇申請(qǐng)人:西華大學(xué)