專(zhuān)利名稱(chēng)：一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株硫桿菌及其應(yīng)用，尤其涉及一株具有較高亞鐵氧化能力的基因工 程菌嗜酸氧化亞鐵硫桿菌及其構(gòu)建與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)是在細(xì)菌浸礦過(guò)程中 起關(guān)鍵作用的菌種之一。嗜酸氧化亞鐵硫桿菌在Fe2+基質(zhì)中生長(zhǎng)時(shí)，F(xiàn)e2+被快速氧化成 Fe3+提供電子進(jìn)入細(xì)菌呼吸鏈，而Fe3+作為一種強(qiáng)氧化劑在生物浸礦等過(guò)程中起著關(guān)鍵的 作用。因此，嗜酸氧化亞鐵硫桿菌氧化Fe2+離子的能力是衡量其浸礦能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)。 經(jīng)檢索目前還沒(méi)有任何關(guān)于以轉(zhuǎn)基因的方式來(lái)提高嗜酸氧化亞鐵硫桿菌Fe2+離子氧化能 力的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌Fe2+離子氧化能力遺傳改良方法的空白， 本發(fā)明要解決的問(wèn)題是通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法將氧化亞鐵電子傳遞鏈蛋白CYCl基因?qū)胧人?氧化亞鐵硫桿菌提供一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌以提高其氧化Fe2+離子的能力， 使嗜酸氧化亞鐵硫桿菌更高效地發(fā)揮生物冶金的功能。本發(fā)明所述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌為高亞鐵氧化活性 A. ferrooxidanspTCYCl,該菌命名為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)，菌株已于2009年12月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，中國(guó)北京)，保藏中心編號(hào)為CGMCC NO. 3549。本發(fā)明的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)經(jīng)鑒定，具有 如下生物學(xué)特征革蘭氏陰性，有鞭毛，好氧，嗜酸，為化能自養(yǎng)細(xì)菌，短桿狀，大小為(0. 3 0. 5) μπιΧ (1 2) μπι ；能夠以二價(jià)鐵、元素硫或者還原態(tài)硫復(fù)合物作為能源，在含有硫酸亞鐵 和硫代硫酸鈉的固體培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)；菌落形態(tài)不規(guī)則，凹陷，邊緣呈鋸齒狀，酒紅色，不透 明；生長(zhǎng)最適溫度為25-30°C，生長(zhǎng)最適pH為1.5 2. 5。本發(fā)明所述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的構(gòu)建及在亞鐵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)及 應(yīng)用，涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC 19859 (Acidithiobacillus ferrooxidansATCC19859) ； ff 胃 DH5a (Escherica coli DH5 α )。(2)氧化亞鐵電子傳遞鏈蛋白CYCl高效表達(dá)載體的構(gòu)建CYC1蛋白編碼基因克隆 自嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC19859染色體DNA，所用引物為上游弓丨物cyclEU(GTACGAATTCAGGAGCCGATGCCATGACGACATACTT)，下游弓丨物 eye IXD (CCTCTCTAGATTA GTGGTGGTGGTGGTGGTG CAACGATGAAAGATAAGCCGCCACA)。上游引物引入EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物引入Xba I酶切位點(diǎn)以及6XHis標(biāo)簽以方便檢測(cè)cycl基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行EcoR I和Xba I雙酶切，回 收744bp大小的片段；同時(shí)對(duì)可移動(dòng)性的質(zhì)粒載體PJRD215進(jìn)行EcoRI和XbaI雙酶切，回 收約IOkb的載體片段；用T4連接酶將這兩個(gè)片段連接，以連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在 含有100yg/ml鏈霉素(Sm)的LB固體平板上37°C靜置培養(yǎng)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，挑取轉(zhuǎn)化 子進(jìn)行質(zhì)粒提取、酶切驗(yàn)證，構(gòu)建出中間質(zhì)粒PCYCl。以質(zhì)粒 pMMB24DNA 為模板，設(shè)計(jì)引物 Ptae-I (5，-GTACAAGCTTATCGACTGCACGGTGCAC C-3，)和 Pta。-2 (5，-GTACGAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3，)擴(kuò)增不含調(diào)控區(qū)域的 Tac 啟動(dòng) 子，命名為Ptac。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HindIII和EcoR I雙酶切，連接至pCYCl質(zhì)粒中cycl基因上 游HindlIl-Ec0R I位點(diǎn)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。在含有Sm(100 μ g/ml)的LB固體平 板上37°C靜置培養(yǎng)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取、酶切驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)所插 入的外源基因Ptac以及cycl基因進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建了可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTCYCl。從經(jīng)測(cè)序驗(yàn) 證準(zhǔn)確無(wú)誤的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒PTCYC1，轉(zhuǎn)化至含RP4質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α，命名為大腸 桿菌DH5 α (RP4/pTCYCl)，為下一步的接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備。(3)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的制備以大腸桿菌DH5 α (RP4/pTCYCl)作 為供體菌，嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC19859作為受體菌在濾膜上進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。供體菌和 受體菌分別離心收集菌體，洗滌液洗滌至少三次，用洗滌液分別懸浮供體菌和受體菌至相 同密度，然后按一定比例混合后取適量的菌懸液(0. 1 0. 3ml)加到無(wú)菌硝酸纖維素濾膜 上，濾膜置于接合平板上30 35°C培養(yǎng)24 72h，使之接合。取濾膜用Iml無(wú)機(jī)鹽洗滌 液洗下菌體，稀釋成一系列不同濃度=IoqUo-1UO-2UO-3UO-4UO-5UO-6UO-7,分別取100 μ 1 涂布含相應(yīng)抗生素的2 2選擇平板及相應(yīng)的不含抗生素的對(duì)照平板。同時(shí)在選擇性平板 上分別涂布供體菌和受體菌作為對(duì)照。放置25 30°C溫箱中培養(yǎng)7 10d，直至板上形成 明顯菌落。(4)接合子的種子培養(yǎng)挑取步驟(3)中選擇性平板上形成的接合子菌落，在無(wú)菌 條件下用接種環(huán)接于30mL 9K-FeS04培養(yǎng)基(Sm 300 μ g/ml)中，25_30°C條件下，160rpm震 蕩培養(yǎng)3 5d，制得種子液；(5)接合轉(zhuǎn)移子擴(kuò)大培養(yǎng)以5 %體積比的接種量，將種子液接種于 200mL9K-FeS04 培養(yǎng)基(Sm 300 μ g/ml))中，25_30°C條件下，160rpm 振蕩培養(yǎng) 3 5d ；(6)接合轉(zhuǎn)移子的質(zhì)粒提取驗(yàn)證將步驟(5)所得的培養(yǎng)液真空抽濾出去培養(yǎng)液 中的高鐵沉淀；離心收集菌體，用9K無(wú)機(jī)鹽溶液洗滌至少3次直至菌泥中沒(méi)有可見(jiàn)的高鐵 沉淀，再用PBS緩沖液洗菌體2次，然后按照常規(guī)的堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒抽提。質(zhì)粒提取驗(yàn)證結(jié)果陽(yáng)性的接合子命名為A. ferrooxidans pTCYCl ；(7) A. ferrooxidans pTCYCl中重組質(zhì)粒所攜帶cycl基因在嗜酸氧化亞鐵硫 桿菌中的表達(dá)將步驟(5)所得的培養(yǎng)液真空抽濾出去培養(yǎng)液中的高鐵沉淀；離心收集 菌體，用9K無(wú)機(jī)鹽溶液洗滌至少3次直至菌泥中沒(méi)有可見(jiàn)的高鐵沉淀，收集足夠量的 A. ferrooxidans pTCYCl菌體，洗滌后重懸于裂解緩沖液，超聲破碎細(xì)胞。經(jīng)Bradford法測(cè) 定樣品中的蛋白濃度后，取等量蛋白與等體積的2XLaemmli緩沖液混合，煮沸5min后進(jìn)行 Western blotting檢測(cè)，驗(yàn)證質(zhì)粒pTCYCl上所攜帶cycl基因是否能在嗜酸氧化亞鐵硫桿 菌中正常表達(dá)；(8)基因工程菌A. ferrooxidans pTCYCl亞鐵離子氧化活性測(cè)定將步驟(5)所得的培養(yǎng)液真空抽濾出去培養(yǎng)液中的高鐵沉淀；離心收集菌體，用TE緩沖液洗菌體三次后 將重懸于TE緩沖液中。取細(xì)菌懸浮液加入反應(yīng)緩沖液中，30°C振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)的不同時(shí) 間取培養(yǎng)液以鄰菲啰啉法測(cè)定培養(yǎng)液中剩余Fe2+的濃度；(9)重組質(zhì)粒pTCYCl在A(yíng). ferrooxidans ATCC19859的穩(wěn)定性檢測(cè)在固體平板 上挑取A. ferrooxidans陽(yáng)性接合轉(zhuǎn)移子菌落一個(gè)，接種到不含有篩選標(biāo)記的9K_FeS04液 體培養(yǎng)基中，在沒(méi)有選擇壓力條件下30°C振蕩培養(yǎng)5d，然后按照1 1000的比例轉(zhuǎn)接，如 此連續(xù)轉(zhuǎn)接5次(> 50代)，稀釋后分別涂布含有抗生素的2 2選擇平板以及不含抗生 素的2 2固體平板，25-35°C培養(yǎng)10d。通過(guò)計(jì)算抗生素抗性菌落占總菌落的比例，測(cè)出重 組質(zhì)粒在嗜酸氧化亞鐵硫桿菌中的穩(wěn)定性。其中，步驟(3)中所述的菌體接合培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選是48h，接合培養(yǎng)溫度優(yōu)選30°C ； 固體培養(yǎng)溫度優(yōu)選是30°C，培養(yǎng)時(shí)間是7d ；其中，步驟(4)、(5)中所述的菌體培養(yǎng)溫度優(yōu)選是30°C ；上述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC 19859 (Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC19859)購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心；大腸桿菌DH5a (Escherica coll DH5 α )購(gòu)自 原平皓(天津)生物技術(shù)有限公司。上述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的制備中，PJRD215質(zhì)粒構(gòu)建見(jiàn)Davison J, Heusterspreute Μ, Chevalier N, Ha-Thi V, Brunei F. Vectors with restriction site banks. V. pJRD215, a wide-host-range cosmid vector with multiple cloning sites. Gene. 1987, 51 (2-3) 275-80 ；pMMB24 M14I^lMB Miroslawa Μ. Bagdasarian, Egon Amann, Rudo1fLurz, Beate Ruckert and Michael Bagdasarian. Activity of the hybrid trp-lac(tac)promoter ofEscherichia coli in Pseudomonas putida. Construction of broad-host-range, controlled-expression vectors, 1983, Gene, 26 :273_282 ;RP4 質(zhì)粒 I^jMB Datta, N. ， R. W. Hedges, Ε. J. Shaw, R. B. Sykes and M. H. Richmond. Properties of an R factor fromPseudomonas aeruginosa, 1971, J. Bacteriol,108 :1244_1249。上述質(zhì)粒的構(gòu)建中，培養(yǎng)大腸桿菌DH5 α使用的LB液體培養(yǎng)基，配方為每IOOOml蒸餾水中添加蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，用2N NaOH溶液調(diào)pH 至7. O 7. 5，15磅/寸2高壓蒸汽滅菌20min，37°C培養(yǎng)。上述LB固體培養(yǎng)基為上述LB液體培養(yǎng)基中加入1. 8%瓊脂粉，pH 7. O 7. 5。在上述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌培養(yǎng)使用的液體9K_FeS04無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，配方為每IOOOml 蒸餾水中添加(NH4) 2S043g，K2HPO4O. 5g，KCl 0. lg，MgSO4 · 7H20 0. 5g， Ca(NO3)2O. 01 g，用濃 H2SO4 調(diào) pH 2. 0，121°C條件下滅菌 20min ；配置 44. 8% 的 FeSO4. 7H20 濃 溶液，過(guò)濾除菌，使用前按按1 9的比例與9K無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液混合。上述2 2固體培養(yǎng)基配方為A :2g Na2S2O3 · 5H20 溶解于 IOml 蒸餾水中；B :2g FeSO4. 7H20溶解于IOmlpH值預(yù)調(diào)為2. 0的酸性水中；C 4. 5g (NH4)2SO4jO. 15g KCl，0. 75g MgSO4 · 7H20 溶解于 500ml 蒸餾水中；D :6g瓊脂溶于480ml蒸餾水；其中，組分A與B過(guò)濾除菌，C與D 121°C條件下滅菌20min，待C與D組分冷卻至 45°C左右時(shí)，將四種組分混合，傾倒平板備用。
5
上述2 2接合培養(yǎng)基為上述2 2固體培養(yǎng)基中加入0. 的酵母粉，pH 4. 8 5. 0。其中，步驟(3)中所述的菌體洗滌液為上述2 2培養(yǎng)基C組分中加入等體積的 蒸餾水作為菌體洗滌液。上述步驟(6)中的PBS緩沖液配方為每IOOOml 蒸餾水中添加=NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4L 44g, KH2PO4O. 24g，用 HCl 調(diào)pH值至7. 4，加H2O定容至1L，15磅/cm2,滅菌20min。上述步驟(7)中的裂解液配方為每1000 毫升蒸溜水各成分含量為50mmol/L Tris-Cl (pH 8. 0), 150mmol/L NaCl, 100mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。上述步驟(7)中2 X Laemmli緩沖液配方為4% SDS，29%甘油，10% β -巰基乙醇，0. 04%溴酚藍(lán)；0. 125Μ Tris-HCl ；上述步驟(8)中的TE緩沖液配方為10mM Tris-HCl, ImM EDTA0本發(fā)明所述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌在生物浸出、煙氣脫硫、酸性礦井水 的處理以及污泥中重金屬的去除中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明所述的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌(A. ferrooxidans pTCYCl)與野生型嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(A. ferrooxidans ATCC19859)相比較，其氧化亞鐵 離子的能力提高了 13%，這對(duì)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌在生物浸出中的應(yīng)用有著重要的意義。 此外，因嗜酸氧化亞鐵硫桿菌在除生物浸出以外其它方面的應(yīng)用，如煙氣脫硫、酸性礦井水 的處理以及污泥中重金屬的去除等，也是基于嗜酸氧化亞鐵硫桿菌氧化二價(jià)鐵離子的能 力，因此該發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 重組質(zhì)粒pTCYCl的構(gòu)建及鑒定。(1)將含有cycl基因以及6XHis標(biāo)簽編碼基因與穿梭性質(zhì)粒PJRD215連接后，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5 α，在含有Km的LB固體平板篩選得到含有Km抗性質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α， 經(jīng)提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化子中攜帶的質(zhì)粒確實(shí)含有插入片段。(2)將Ptac基因片段與中間載體pCYCl連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在含有Km 的LB固體平板篩選得到含有Km抗性質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 α，經(jīng)提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，轉(zhuǎn)化子 中攜帶的質(zhì)粒確實(shí)含有插入片段。將驗(yàn)證過(guò)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，選取測(cè)序正確的克隆，提 取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α (RP4)在含有Sm的LB固體平板上篩選得到接合轉(zhuǎn)移所用的 供體菌大腸桿菌DH5 α (RP4/pTCYCl)。上述LB篩選培養(yǎng)基中，卡那霉素(Km)或鏈霉素(Sm)的篩選濃度為100 μ g/ml。實(shí)施例2 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的構(gòu)建及鑒定。(1)分別收集指數(shù)生長(zhǎng)中期的大腸桿菌DH5 α (RP4/pTCYCl)作為供體菌，指數(shù)生 長(zhǎng)中期的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC19859作為受體菌，無(wú)機(jī)鹽洗滌液洗滌3次，按相同菌體 濃度懸浮于洗滌液中備用。(2)按供體菌與受體菌的體積比為1 1，將懸浮液進(jìn)行混合，取200 μ 1放于孔徑 為0.45 μ m的硝酸纖維素濾膜(光面朝上)上，30°C于接合平板上培養(yǎng)48h;lml洗滌液將濾膜上的菌體洗下，稀釋為10-1、10-2、10-3、10_4，分別取10(^1涂布2 2篩選平板，30°C靜 置培養(yǎng)10d。篩選平板中抗生素Km濃度為200 μ g/ml。(3)挑取篩選平板上的抗性菌落，接種于30ml9K-FeS04培養(yǎng)基(Km 300 μ g/ml) 中，30°C條件下，160rpm震蕩培養(yǎng)5d.，制得種子液；以5%體積比的接種量，將種子液接種 于200mL 9K-FeS04培養(yǎng)基(Km 300 μ g/ml))中，30°C條件下，160rpm震蕩培養(yǎng)4d后收集菌 液進(jìn)行質(zhì)粒提取驗(yàn)證。(4)經(jīng)質(zhì)粒提取驗(yàn)證，從篩選平板上挑取的接合子能夠提取出分子量大小正確的 質(zhì)粒，而從作為對(duì)照的A. ferrooxidans ATCC19859中則未能提取出質(zhì)粒。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒通過(guò)濾膜接合的方式成功地從大腸桿菌DH5 α (RP4/pTCYCl) 轉(zhuǎn)移至了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC19859中，提示已成功獲得了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因 工禾呈菌 A. ferrooxidans pTCYCl。實(shí)施例3 重組質(zhì)粒pTCYCl所攜帶cycl基因在嗜酸氧化亞鐵硫桿菌中的表達(dá)(1)菌種選擇:A. ferrooxidans pTCYCl, A. ferrooxidans ATCC19859 ；(2)種子培養(yǎng)將A. ferrooxidans pTCYC 1 及A. ferrooxidans ATCCl9859在無(wú)菌 條件下用接種環(huán)接一環(huán)于30mL QK-FeSO4液體培養(yǎng)基中，30°C條件下，振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期， 制得種子液；(3)擴(kuò)大培養(yǎng)以5 %的體積比的接種量，將兩株菌的種子液接種于 200mL9K-FeS0df體培養(yǎng)基中，30°C條件下，振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期(約4d)；(4)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌總蛋白SDS-PAGE電泳將步驟(3)中得到的培養(yǎng)液抽濾 去除高鐵沉淀，離心收集菌體，將菌體重懸于裂解緩沖液中，超聲破碎細(xì)胞，待樣品中完整 細(xì)胞的數(shù)目不超過(guò)細(xì)胞總數(shù)的10%時(shí)(鏡檢確定)，停止超聲，13000rpm離心IOmin去除細(xì) 胞碎片。Bradford法測(cè)定 A. ferrooxidans pTCYCl 及 A. ferrooxidansATCC19859 樣品中蛋 白濃度后，取相同量的蛋白以15%的變性聚丙烯酰胺凝膠分離；(5)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌總蛋白的Western-blotting檢測(cè)將步驟(4)中在聚丙 烯酰胺凝膠中得到有效分離的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌總蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，分別進(jìn)行一 抗(Anti-His Antibody)及二抗(Poly Rabbit Anti-mouse immunoglobulins/HRP)孵育 后，進(jìn)行ECL發(fā)光檢測(cè)；(6)經(jīng)Western-blotting檢測(cè)驗(yàn)證，質(zhì)粒pTCYCl上所攜帶的cycl基因在嗜酸氧 化亞鐵硫桿菌中得到了有效的表達(dá)。實(shí)施例4 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的菌種鑒定及保藏信息。本發(fā)明構(gòu)建的高亞鐵氧化活性A. ferrooxidans pTCYCl菌株已于2009年12月28 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，中 國(guó)北京)，保藏中心編號(hào)為=CGMCC N0. 3549。上述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌，經(jīng)鑒定，具有如下生物學(xué)特征革蘭氏陰性，有鞭毛，好氧，嗜酸，為化能自養(yǎng)細(xì)菌，短桿狀，大小為(0. 3 0. 5) μπιΧ (1 2) μπι ；能夠以二價(jià)鐵、元素硫或者還原態(tài)硫復(fù)合物作為能源，在含有硫酸亞鐵 和硫代硫酸鈉的固體培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)；菌落形態(tài)不規(guī)則，凹陷，邊緣呈鋸齒狀，酒紅色，不透 明；生長(zhǎng)最適溫度為25-30°C，生長(zhǎng)最適pH為1.5 2. 5。實(shí)施例5 :A. ferrooxidans pTCYCl亞鐵離子氧化活性的測(cè)定
(1)菌種選擇:A. ferrooxidans pTCYCl, A. ferrooxidans ATCC19859 ；(2)種子培養(yǎng)將 A. ferrooxidans pTCYCl 及 A. ferrooxidans ATCC19859 在無(wú)菌 條件下用接種環(huán)接一環(huán)于30mL QK-FeSO4液體培養(yǎng)基中，30°C條件下，振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期， 制得種子液；(3)擴(kuò)大培養(yǎng)以5 %的體積比的接種量，將兩株菌的種子液接種于 200mL9K-FeS0df體培養(yǎng)基中，30°C條件下，振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期(約4d)；(4)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌亞鐵氧化活性的測(cè)定將步驟(3)中得到的培養(yǎng)液抽濾 去除高鐵沉淀，離心收集菌體，用TE緩沖液懸浮至相同濃度，取一定量的細(xì)胞懸液抽提細(xì) 胞總蛋白，以bradford法進(jìn)行蛋白定量。取相同體積懸浮接入3ml反應(yīng)緩沖液中，在反應(yīng) 不同時(shí)間從反應(yīng)體系中取出0. 2ml反應(yīng)液，12000g離心2min后，確定反應(yīng)液中剩余的Fe2+ 濃度，根據(jù)Fe2+濃度的變化確定嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的亞鐵氧化酶活性；(5)本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的基因工程菌A. ferrooxidans pTCYCl較野生型 A. ferrOOXidansATCC19859，亞鐵氧化能力得到了一定的提高實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的基因工程菌 A. ferrooxidansATCC19859 亞鐵氧化活性為 5. 3ymol Fe2+ oxidized/mg Protein/min，而 基因工程菌亞鐵氧化活性為6. 0 μ mol Fe2+oxidized/mg Protein/min,相對(duì)于野生型，本實(shí) 驗(yàn)所構(gòu)建的基因工程菌亞鐵氧化活性提高了 13%。上述A. ferrooxidans pTCYCl在進(jìn)行種子培養(yǎng)及擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中加入濃度 為300 μ g/ml的卡那霉素(Km)。
權(quán)利要求
一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌，為高亞鐵氧化活性A.ferrooxidans pTCYC1；其特征在于該菌命名為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)，菌株已于2009年12月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心編號(hào)為CGMCC NO.3549。
2.權(quán)利要求1所述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌在生物浸出、煙氣脫硫、酸性礦井 水的處理以及污泥中重金屬的去除中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌，為高亞鐵氧化活性A.ferrooxidans pTCYC1；其特征在于該菌命名為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans)，菌株已于2009年12月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心編號(hào)為CGMCC NO.3549。本發(fā)明的基因工程菌較野生型的氧化亞鐵硫桿菌在亞鐵氧化活性方面有一定的提高，且性能穩(wěn)定，在生物浸出、煙氣脫硫、酸性礦井水的處理以及污泥中重金屬的去除等領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C22B3/18GK101935621SQ20101010537
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月4日
發(fā)明者劉瑋, 劉相梅, 林建強(qiáng), 林建群, 顏望明 申請(qǐng)人:山東大學(xué)