專利名稱：：單體速效胰島素及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和藥物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及新的胰島素B鏈、新的單體速效胰島素、以及含所述單體速效胰島素的藥物組合物。本發(fā)明還涉及所述的單體速效胰島素的制法。
背景技術(shù)：
：糖尿病發(fā)病率逐年上升，并能引發(fā)心血管疾病致死，是當(dāng)今威脅人類健康的主要疾病之一。根據(jù)theUnitedKingdomProspectiveDiabetesStudy的結(jié)果表明糖尿病的治療措施定位為實施精細(xì)血糖控制從而避免糖尿病綜合癥。盡管胰島素通常用于I型糖尿病，但是近期研究表明1/3的II型糖尿病人最終也是需要補充胰島素以控制血糖濃度。正常人體內(nèi)是以分泌胰島素來調(diào)控血糖濃度，一般是在進(jìn)餐后30-60分鐘血液生理胰島素濃度達(dá)到峰值，4-5小時后恢復(fù)到基礎(chǔ)濃度，這樣能夠保證血糖濃度不因進(jìn)餐而有大的波動。胰島素必須以單體形式才能與其受體結(jié)合，然后發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。而普通天然胰島素制劑在中性注射濃度是聚合體，吸收緩慢，不能模擬體內(nèi)胰島素正常的生物學(xué)時相。而單體胰島素由于在中性溶液高濃度不聚合而能很快吸收發(fā)揮作用(圖1)。因此單體速效胰島素成為治療糖尿病及其他疾病的新一代藥物。精細(xì)胰島素治療(intensiveinsulintreatment)模擬正常人體胰島素分泌時相。通過在餐前注射速效胰島素平穩(wěn)餐后血糖濃度，及注射中效或長效胰島素或胰島素泵以維持餐間和夜間血糖濃度，預(yù)防出現(xiàn)夜間高血糖，從而可以降低糖尿病所引起的綜合癥的發(fā)病率和致死率。目前速效胰島素主要通過基因工程方法獲得。EliLilly公司開發(fā)的單體胰島素Lyspro于1996年分別在歐洲和美國用于臨床，取得很好效果。皮下注射Lyspro后15分鐘起效。目前Novo公司研發(fā)的另一種單體胰島素Aspart也已上市。(Howey，D.C.，etal.，Diabetes,1994,43:396_402；Torlone,E.etal.，Diabetologia,1994,37:713_720；Rami,B.etal.,Eur.J.Pediatr.1999,156:838_840；Vajo,Ζ.etal.Pharmacologicalreviews.2000,52:1_9)。從豬胰臟提取的豬胰島素在臨床上已經(jīng)用了半個多世紀(jì)，其生產(chǎn)工藝已非常成熟，成本也較低。但近十年來，由于基因工程人胰島素的出現(xiàn)和應(yīng)用，豬胰島素的市場受到很大沖擊，出現(xiàn)過剩，最后可能完全被重組人胰島素代替而退出市場。如何利用這一資源是一個迫在解決的問題。綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)各種新的單體胰島素，尤其需要開發(fā)對豬胰島素(包括基因工程制備的豬胰島素)進(jìn)行再加工方法，以便簡便和低成本地提高豬胰島素的利用價值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的就是提供一種新的單體速效胰島素。本發(fā)明的另一目的是提供含有該單體胰島素的藥物組合物。本發(fā)明再一目的是提供所述單體胰島素的制法和用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種胰島素B鏈，所述的胰島素B鏈在對應(yīng)于天然胰島素B鏈第22位上為酸性氨基酸，所述的酸性氨基酸選自谷氨酸或天冬氨酸。在另一優(yōu)選例中，所述的胰島素B鏈具有以下氨基酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式I其中，X為Glu，Asp。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種胰島素或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述的胰島素由胰島素A鏈和B鏈構(gòu)成，所述的胰島素B鏈?zhǔn)潜景l(fā)明所述的胰島素B鏈。在另一優(yōu)選例中，所述的胰島素是單體胰島素，因而是速效胰島素。在另一優(yōu)選例中，所述胰島素的結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式II其中，X為Glu，Asp。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有本發(fā)明第二方面中所述的胰島素或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物的劑型是片劑、針劑、顆粒劑、溶液劑。在本發(fā)明第四方面，提供了一種單體胰島素表達(dá)前體，從氨基端至羧基端分別含有第1方面所述的胰島素B鏈、連接肽、和胰島素A鏈。在另一優(yōu)選例中，所述的連接肽是Ala-Ala-Lys。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發(fā)明上述的所述的胰島素B鏈，或編碼本發(fā)明上述的所述的單體胰島素表達(dá)前體。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸是DNA。在另一優(yōu)選例中，所述的編碼單體胰島素表達(dá)前體的多核苷酸的序列是ttcgtt3-3-CCQ-Q-C3.CttgtgcggttcccacttggttgaggetttgtacttRRtttRCRRtRaaRaaRRtttcttctacactcctaaggetgetaagggtattgtcgaacaatgctgtacctccatetgctccttgtaccaattggaaaactactgcaac。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種表達(dá)載體，它含有第五方面中所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種宿主細(xì)胞，它含有第六方面中所述的表達(dá)載體。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種制備胰島素的方法，包括以下步驟(a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有編碼單體胰島素表達(dá)前體的DNA，從而表達(dá)出所述的單體胰島素表達(dá)前體；其中所述的單體胰島素表達(dá)前體從氨基端至羧基端分別含有胰島素B鏈、連接肽、和胰島素A鏈，其中胰島素B鏈具有以下氨基酸序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEXGFFYTPK,式中，X為Glu，Asp，而且，連接肽為Ala-Ala-Lys；(b)分離出所述的單體胰島素表達(dá)前體；(c)用胰蛋白酶酶切割所述的單體胰島素表達(dá)前體，從而切下連接肽，形成由胰島素A鏈和胰島素B鏈構(gòu)成的胰島素；(d)分離出單體胰島素。在另一優(yōu)選例中，所述的單體胰島素具有式II所示結(jié)構(gòu)GIVEQCCTSICSLYQLENYCN式IIFVNQHLCGSHLVEALYLVCGEXGFFYTPK其中，X為Glu，Asp。在本發(fā)明第九方面，提供了一種單體胰島素或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述的胰島素由胰島素A鏈和胰島素B鏈構(gòu)成，所述的胰島素B鏈在B鏈羧基端去除8個氨基酸并且在對應(yīng)于天然胰島素B鏈的23和24位上添加了氨基酸GX’，其中X’為Phe或Phe-NH2。在另一優(yōu)選例中，所述的胰島素具有以下結(jié)構(gòu)GIVEQCCTSICSLYQLENYCNιI式(III)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGRGX'式中，X，為Phe、Phe-NH2或Phe-OH。在本發(fā)明的第十方面，提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明第九方面中所述的單體胰島素的制備方法，包括步驟(1)在胰蛋白酶催化下，將去B鏈羧端八肽胰島素(DOI)與GX’接觸，從而在去B鏈羧端八肽胰島素(DOI)的羧基端與GX’之間形成肽鍵，形成權(quán)利要求1所述的單體胰島素；或者，在胰蛋白酶催化下，將胰島素或其前體與過量GX’接觸，從而在胰島素B22位上發(fā)生酶促轉(zhuǎn)肽，形成權(quán)利要求11所述的單體胰島素；(2)分離出所形成的權(quán)利要求11所述的單體胰島素。在另一優(yōu)選例中，將胰島素或其前體與過量GX’之間的摩爾比為110至1100。在另一優(yōu)選例中，所述的胰島素或其前體或去B鏈羧端八肽胰島素來源于人、或豬。在本發(fā)明的第十一方面，提供了一種藥物組合物，它含有本發(fā)明第九方面中所述的所述單體胰島素或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物的劑型是片劑、針劑、顆粒劑、或溶液劑。圖1是生理分泌胰島素、單體胰島素、天然藥劑胰島素注射后血液濃度的時相圖。橫坐標(biāo)為時間，縱坐標(biāo)為血液中三種胰島素的濃度。圖2顯示了B22Glu-desB30胰島素的HPLC制備結(jié)果。C18柱(Beckman，4.6x250mm)，流動相B為含0.08%TFA的70%乙腈，流動相A為含0.1%TFA的水，梯度(流動相B30-50%/30min)，流速為2ml/min。橫坐標(biāo)為流出時間，縱坐標(biāo)為A28(lnm。圖3顯示了pH8.3聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。膠濃度為15%，考馬斯亮蘭染色。從左到右分別為泳道1單鏈胰島素前體(上)，豬胰島素(下)；泳道2:B22Glu-desB30胰島素。圖4顯示了在中性溶液中的脫鋅豬胰島素濃度對其凝膠層析行為的影響。Superdex75柱，流動相為pH7.4的磷酸緩沖液，流速為0.5ml/min；多肽濃度從低到高分別為38μM(0.22mg/mL)、75μM(0.43mg/mL)、150μM(0.86mg/mL)、300μΜ(1·73mg/mL)、600(3.46mg/mL)μΜ。橫坐標(biāo)為保留時間(單位分鐘)，縱坐標(biāo)為A230nm0圖5顯示了在中性溶液中B22GlU-desB30胰島素的濃度對其凝膠層析行為的影響。SuperdeX75柱，流動相為pH7.4的磷酸緩沖液，流速為0.5ml/min；多肽濃度從低到高分別為2，5，10mg/mL。橫坐標(biāo)為保留體積(單位毫升)，縱坐標(biāo)為A28(lnm。圖6顯示了B22GlU-desB30胰島素的遠(yuǎn)紫外(上)和近紫外(下)圓二色譜分析。實線表示樣品B22GlU-desB30胰島素，虛線表示樣品去B鏈羧端丙氨酸胰島素。樣品濃度為35μM，緩沖液為20毫摩ρΗ7.4磷酸鉀。圖7顯示了在中性溶液中DHI-NH2的濃度對其凝膠柱層析行為影響。SuperdeX75柱，流動相為PH7.4的磷酸緩沖液，流速為0.5ml/min;多肽濃度從低到高分別為38μM(0.19mg/mL)、75μΜ(0·38mg/mL)、150μM(0·76mg/mL)、300μM(1·52mg/mL)、600μM(3.04mg/mL)。橫坐標(biāo)為保留時間(單位分鐘)，縱坐標(biāo)為A23(lnm。圖8顯示了脫鋅胰島素和DHI-NH2在中性溶液下SuperdeX75柱層析所得到的分配系數(shù)(Kd)值與多肽濃度關(guān)系曲線。橫坐標(biāo)為多肽濃度，縱坐標(biāo)為Kd值。具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)胰島素B鏈C端肽段，對胰島素的自身聚合具有重要影響。更出乎意料的是，將去B30胰島素B22位由堿性氨基酸突變?yōu)樗嵝园被岷缶尤豢梢缘玫揭葝u素類似物B22E去B30胰島素，該胰島素不僅具有單體胰島素(生理pH值、較高濃度時不聚合)的性質(zhì)，而且整體生物活力為正常胰島素的50%。此外，替換掉這一堿性氨基酸，還減少蛋白酶酶切位點，從而降低生產(chǎn)過程中的風(fēng)險，便于重組生產(chǎn)。目前已知道去B鏈羧端八肽胰島素(DOI)和去B鏈羧端七肽胰島素(DHpI)幾乎沒有胰島素活性。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，胰島素B鏈C端肽段對胰島素的結(jié)構(gòu)與功能都起著非常重要的作用。胰島素晶體結(jié)構(gòu)分析證明B21-B23形成β-轉(zhuǎn)折，而B24-B26形成分子間的反平行結(jié)構(gòu)。這些對胰島素形成二聚體極其重要。本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，在B鏈羧端八肽胰島素(DOI)基礎(chǔ)上，在胰島素B鏈的羧基端通過胰蛋白酶酶促合成或胰蛋白酶酶促轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，可以極其方便低廉地添加氨基酸GX’，從而形成既具有較高活性的小胰島素分子(具有約40%天然活性)，而且不會形成二聚體，因而是一種具有較高活性的單體胰島素分子。具體地，在本發(fā)明的第一部分提供了新的胰島素B鏈(B22為酸性氨基酸)、含該B鏈的單體胰島素、含所述單體胰島素的藥物組合物。本發(fā)明的胰島素類似物B22E去B30胰島素(B22EDes-B30胰島素)或B22D去B30胰島素(B22DDes-B30胰島素)，用甲醇酵母表達(dá)其前體，經(jīng)酶切得到高純度的樣品。并證明其具有單體胰島素(生理PH值、較高濃度時不聚合)的性質(zhì)，整體生物活力為正常胰島素的50%。第二部分提供了新的B鏈羧端縮短的去六肽胰島素(DHI)及其衍生物(DHI-NH2)。它們是以(1)人或豬胰島素的大片段，即去B鏈C端八肽胰島素(DOI)為原料經(jīng)與甘氨酸·苯丙氨酸二肽或二肽酰胺酶促合成或(2)豬胰島素、人胰島素或單鏈胰島素前體為原料與二肽或二肽酰胺經(jīng)胰蛋白酶在B22位酶促轉(zhuǎn)肽而得。實驗證明這類胰島素類似物在中性溶液中和較高濃度時仍為單體胰島素，并具有40%胰島素體內(nèi)活力。術(shù)語如本文所用，術(shù)語“B22Glu-desB30胰島素”指B鏈22位氨基酸為谷氨酸的去B鏈羧端丙氨酸胰島素。其中胰島素B鏈的基本結(jié)構(gòu)如下FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEXGFFYTPK式I(SEQIDNO1)其中，X為Glu，Asp。更佳地，所述的胰島素B鏈如下所示FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEEGFFYTPK(SEQIDNO2)如本文所用，術(shù)語“DHI”是指去B鏈羧端六肽后所形成的胰島素。一種優(yōu)選的DHI的基本結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式中，X，為Phe、Phe-NH2、Phe-0H、或其他能使其成為單體的基團(tuán)。在式III中，RGX，分別對應(yīng)于天然胰島素B鏈的第22、23和24位。如本文所用，“本發(fā)明的多肽”指B22Glu-desB30、含B22Glu-desB30的胰島素和DHI,DHI-NH2以及它的衍生物(包括藥學(xué)上可接受的鹽)。如本文所用，術(shù)語“D0I”是指胰島素B鏈C端截去八個氨基酸所形成的胰島素類似物。本發(fā)明多肽及其制備方法本發(fā)明的多肽可以是重組多肽或酶促合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是酶促合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。以B22Glu-desB30胰島素為例，本發(fā)明的B22Glu-desB30胰島素核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。本發(fā)明中，B22Glu-desB30胰島素多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含B22Glu-desB30胰島素編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的Iac或trp啟動子真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS細(xì)胞等動物細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)I=IO在一優(yōu)選例中，本發(fā)明的B22GlU-desB30胰島素是先以單體胰島素表達(dá)前體形式表達(dá)，然后在經(jīng)酶切處理得到B22GlU-desB30胰島素。從氨基端至羧基端，單體胰島素表達(dá)前體分別含有本發(fā)明的胰島素B鏈、連接肽、和胰島素A鏈。連接肽沒有特別限制，只要起連接作用，并且在與A鏈相連的氨基酸殘基為Lys或Arg即可。一類連接肽例子是(Ala)2_5Lys，例如Ala-Ala-Lys。酶切處理可以用任何切割Lys和/或Arg的酶，例如胰蛋白酶。酶切條件可根據(jù)選用的酶而變化。一種優(yōu)選的酶切條件是溶劑=IOOmM碳酸氫銨緩沖液，pH:7-8，底物濃度，約10mg/ml，胰蛋白酶用量，約為底物質(zhì)量1/100，4-25°C，1_6小時。B22Glu-desB30胰島素前體酶切后，用反向疏水層析等方法分離酶切產(chǎn)物，即可獲得本發(fā)明第一部分的B22Glu-desB30胰島素。本發(fā)明式III所示的單體胰島素，可以用人胰島素、豬胰島素或其前體或去B鏈羧端八肽胰島素為原料，用本領(lǐng)域常規(guī)的胰蛋白酶酶促合成或胰蛋白酶酶促轉(zhuǎn)肽反應(yīng)制備。一種優(yōu)選方法方法是在胰蛋白酶催化下，將去B鏈羧端八肽胰島素(DOI)與GX’接觸，從而在去B鏈羧端八肽胰島素(DOI)的羧基端與GX’之間形成肽鍵，從而形成式III所示的單體胰島素。然后，分離出所述的單體胰島素。在優(yōu)選例中，所述的胰蛋白酶酶促合成條件通常為PH6-8.5，溫度30°C-37°C，時間6_24小時。另一種優(yōu)選方法是在胰蛋白酶催化下，將胰島素或其前體與過量GX’接觸，從而在胰島素B22位上發(fā)生酶促轉(zhuǎn)肽，形成式II所示的單體胰島素。然后，分離出所述的單體胰島素。較佳地，胰島素或其前體與過量GX’的摩爾比為110至1100。在優(yōu)選例中，所述的胰蛋白酶酶促轉(zhuǎn)肽條件通常為PH6.5-8.5，溫度30°C_37°C，時間6_20小時。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明單體胰島素或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。適用于本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。本發(fā)明藥物組合物可用于治療糖尿病及其并發(fā)癥。使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發(fā)明所述的單體速效胰島素或其藥學(xué)上可接受的鹽施用于哺乳動物(如人)，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的單體胰島素不僅可以單獨使用，還可以與其他治療糖尿病的藥物(如其他胰島素)一起使用。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)本發(fā)明的胰島素具有強的單體性質(zhì)，即在中性pH(如生理pH)下，較高濃度時仍不會聚合。(2)含有該結(jié)構(gòu)的胰島素的藥物組合物用于注射以外的給藥途徑，有很高的生物利用度。(3)將國際市場豐富而又瀕臨被淘汰的豬胰島素通過酶促方法轉(zhuǎn)變?yōu)楦郊又蹈叩膯误w速效胰島素類似物，改善了使用天然胰島素必須通過解聚過程而帶來的滯后效應(yīng)，同時制法簡便、低廉。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1基因工程表達(dá)B22Glu_desB30胰島素在本實施例中，將B22Glu-desB30胰島素的B鏈C端用連接肽(如Ala-Ala-Lys)與其A鏈N端相連構(gòu)成表達(dá)前體(EPIP)，因為前體的結(jié)構(gòu)有利于胰島素在生物合成后折疊并形成正確的二硫鍵。步驟如下用DNA合成方法得到前體基因，序列如下所示；ttcgttaaccaacacttgtgcggttcccacttggttgaggetttgtacttggtttRCRRtRaaRaaRRtttcttctacactcctaaggetgetaagggtattgtcgaacaatgctgtacctccatetgctccttgtaccaattggaaaactactgcaac(SEQIDNO:3)兩端添加BamHl和EcoRl酶切位點后，利用BamHl和EcoRl酶切位點克隆到PPIC9K(購自INVITR0GEN公司)質(zhì)粒中得到pPIC9K/EPIP。pPIC9K/EPIP，經(jīng)BglII線性化處理后轉(zhuǎn)化到常規(guī)的甲醇酵母P.pastoris(購自INVITR0GEN公司)中，用高濃度G418選出轉(zhuǎn)入前體基因的菌株，得到多個表達(dá)EPIP的甲醇酵母工程菌。對選出的工程菌通過高密度發(fā)酵，得到發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)疏水層析得到EPIP。結(jié)果表明，EPIP經(jīng)胰蛋白酶酶切(溶劑100mM碳酸氫銨緩沖液，pH:7.8，4°C，2小時)處理后，經(jīng)分子篩層析，HPLC(圖2)純化得到高純度的B22GlU-desB30胰島素(圖3)。質(zhì)譜測定分子量為5677.8，與理論值相一致。實施例2脫鋅胰島素自聚合性質(zhì)的測定在本實施例中，用常規(guī)方法測定對脫鋅胰島素的自聚合性質(zhì)。在中性溶液中較高濃度的胰島素以單體、二體、六體的混合物形式存在。用分子篩層析Superdex75(HR10/30)柱，流動相為磷酸鹽緩沖液，pH7.4，流速為0.5ml/min,上樣量為40微升，室溫，230nm檢測，多肽濃度從低到高分別為38μΜ(0.22mg/mL)、75μM(0.43mg/mL)、150μM(0.86mg/mL)、300μΜ(1·73mg/mL)、600(3.46mg/mL)μΜ。用分配系數(shù)Kd描述混合物的平均分子量。Kd=(Vr-VtlV(Vc-Vtl),其中Vr為流出體積，Vtl為外水體積，Vc為總的柱床體積。結(jié)果表明，隨著脫鋅胰島素濃度的上升，其在Superdex75柱上的保留時間縮短、峰的不對稱性增強，Kd值不斷減小(圖4，表1，圖8)，說明較高濃度的胰島素在中性溶液中是不均一的含有多種聚合體的混合物。天然胰島素藥劑濃度為250μM(l.5mg/ml)，根據(jù)上述結(jié)果在注射濃度下胰島素是以聚合物的形式存在。表1天然胰島素在分子篩Superdex75(HR10/30)柱層析上的Kd值<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例3B22Glu-des-B30胰島素自聚合性質(zhì)在分子篩柱層析上的測定在本實施例中，對實施例1制備的單體胰島素用常規(guī)方法測定其自聚合性質(zhì)。除多肽濃度以外，實施條件同實施例2。多肽濃度為2mg/ml，5mg/ml，10mg/ml.隨著多肽的濃度的上升，B22Glu-desB30胰島素的出峰時間，峰形和Kd值不隨多肽濃度變化而變化(圖5，表2)。這說明在注射濃度500μΜ(3π^/πι1)Β2261ιι-(Θ8Β30胰島素是以單體的形式存在。表2B22Glu-desB30胰島素在分子篩柱Superdex75(HR10/30)柱層析上的Kd值<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例4B22Glu-desB30胰島素自聚合性質(zhì)在圓二色譜儀上的測定一、方法pH7.4磷酸鉀緩沖液，樣品濃度35μM，室溫，Jasco-715旋光分光計，遠(yuǎn)紫外光譜在0.Icm寬的樣品池中從250nm掃描到190nm，，近紫外光譜在l.Onm寬的樣品池中從245nm掃描到300nm。二、結(jié)果B22Gludes-B30胰島素與同濃度的去B鏈羧端丙氨酸胰島素相比，在208nm和273nm的吸收負(fù)值明顯減少(圖6)，表明在中性溶液即使較低的多肽濃度下，B22GlU-des-B30胰島素溶液中的單體含量也要高于同濃度的去B鏈羧端丙氨酸胰島素。去B鏈羧端丙氨酸胰島素的聚合性質(zhì)與天然胰島素相同。實施例5B22Glu-desB30胰島素體內(nèi)生物活性測定一、方法小鼠驚厥法(中國藥典，1985)雄性昆明小鼠，體重為18_22g，按體重隨機分四組，每組10只，實驗前禁食2小時。樣品用鹽酸調(diào)至PH值為2.5的生理鹽水溶解，當(dāng)多肽濃度為lmg/ml時，280nm吸收值為1。估計樣品效價為標(biāo)準(zhǔn)品的50%，高劑量為0.27U/ml，低劑量為0.135U/ml，溶劑為鹽酸調(diào)節(jié)PH為2.5的生理鹽水。25°C，15分鐘內(nèi)每只小鼠皮下注射0.2ml，置于37°C觀察90分鐘，驚厥的、死亡的、使其仰臥后3秒內(nèi)不能自行翻身者均認(rèn)為是陽性反應(yīng)。數(shù)據(jù)按質(zhì)反應(yīng)測定法計算。二、結(jié)果小鼠驚厥法測得活性為13.5U/mg，可信限率FLV0^23.5%(<30%)(表3)；實驗中所用的標(biāo)準(zhǔn)品為中檢所提供的27U/mg的胰島素。B22GlU-desB30胰島素的活性為天然胰島素的50%。表3小鼠驚厥法測定B22Glu-desB30胰島素的生物活性(中國藥典，1985版)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例6以DOI為原料酶促合成DHI-NH2或DHI60mgDOI(去B鏈羧端八肽豬胰島素)和120mg的H-Gly-Phe-NH2溶于2毫升含0.2MTris,70%1.4-丁二醇和10%DMSO中，pH調(diào)至7.6，加入TPCK-處理的胰蛋白酶，溶液在37°C下反應(yīng)20小時，酶總共用6mg，分三次加入，即0，2和6小時。反應(yīng)完后經(jīng)S印hadexG50凝膠過濾除去酶及多余小肽，主峰凍干后經(jīng)DEAE-S印haroseCL-6B柱層析分離，得到純的DHI-NH2。DHI-NH2的質(zhì)譜鑒定為5067，符合理論分子量5068。以DOI為原料用GlyPhe和胰蛋白酶酶促縮合可得DHI，DHI的質(zhì)譜測定為5069，符合理論分子量5069.6。按實施例5的條件測得DHI和DHI-NH2整體生物活力為10.8IU/mg,為天然胰島素的40%。實施例7胰蛋白酶酶促轉(zhuǎn)肽方法制備DHI和DHI-NH2豬胰島素，人胰島素或者它們的前體在過量GX’存在下，通過胰蛋白酶在B22位上的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)而得到DHI或DHI-NH2?，F(xiàn)以人胰島素前體為例人胰島素前體凍干粉用DMSO溶解，加入10倍過量的GX’(克分子比，其中V=Phe)。加入1，4-丁二醇，用氨水調(diào)pH至6.5-7.0，加水至DMSO水1，4_丁二醇=151570(體積比)。前體的濃度為20-30mg/ml，然后加入前體1/5重量的胰蛋白酶。35攝氏度下反應(yīng)過夜。反應(yīng)液用酸丙酮沉淀，離心，去上清液，沉淀除去丙酮后用離子交換或HPLC分離，得目的產(chǎn)物。結(jié)果與實施例6相同，DHI的質(zhì)譜測定為5069，符合理論分子量5069.6。按實施例5的條件測得DHI和DHI-NH2整體生物活力為10.9IU/mg,為天然胰島素的40%。實施例8DHI-NH2胰島素自聚合性質(zhì)的測定實施條件完全同實施例2。隨著多肽濃度的上升，DHI-NH2胰島素的出峰時間，峰形和Kd值幾乎不隨多肽濃度的變化而變化(圖7，表4，圖8)。這說明DHIX系列胰島素為單體胰島素。表4DHI_NH2在分子篩Superdex75(HR10/30)柱層析上的Kd值<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例9藥物組合物按以下配方混合各組分，制得胰島素B22Glu-Des30(式II)和DHI(式III)的注射劑。配方A<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>配方B<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求一種單體胰島素或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述的胰島素由胰島素A鏈和胰島素B鏈構(gòu)成，其特征在于，所述的胰島素B鏈在B鏈羧基端去除8個氨基酸并且在對應(yīng)于天然胰島素B鏈的23和24位上添加了氨基酸GX’，其中X’為Phe或Phe-NH2。2.如權(quán)利要求1所述的胰島素或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，所述的胰島素具有以下結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式(III)式中，X’為Phe、Phe-NH2或Phe-OH。3.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的單體胰島素的制備方法，其特征在于，包括步驟(1)在胰蛋白酶催化下，將去B鏈羧端八肽胰島素(DOI)與GX’接觸，從而在去B鏈羧端八肽胰島素(DOI)的羧基端與GX’之間形成肽鍵，形成權(quán)利要求1所述的單體胰島素；或者，在胰蛋白酶催化下，將胰島素或其前體與過量GX’接觸，從而在胰島素B22位上發(fā)生酶促轉(zhuǎn)肽，形成權(quán)利要求1所述的單體胰島素；(2)分離出所形成的權(quán)利要求1所述的單體胰島素。4.一種藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述單體胰島素或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明涉及新的胰島素B鏈、單體速效胰島素、以及含所述單體速效胰島素的藥物組合物。本發(fā)明還涉及所述的單體速效胰島素的制法和用途。文檔編號C07K14/62GK101817878SQ20101012712公開日2010年9月1日申請日期2006年4月29日優(yōu)先權(quán)日2006年4月29日發(fā)明者崔大敷,張友尚,朱尚權(quán),石嘉豪,費儉,都海娟,陸怡申請人:上海生物泰生命科技研究有限公司