專利名稱：特異性結(jié)合epo的dna適配體、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)學(xué)、分子生物學(xué)以及組合化學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及蛋白新型識(shí)別元件-DNA適配體(Aptamer)、其制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，ΕΡ0)是一種促進(jìn)人體紅細(xì)胞生成的功能性糖蛋白。當(dāng)人體處于低血氧濃度時(shí)，腎臟分泌產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素通過激活紅祖細(xì)胞膜上的促紅細(xì)胞生成素受體，使之增殖分化成成熟的紅細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)外周紅細(xì)胞的數(shù)量，因此 EPO是一種強(qiáng)有力的紅細(xì)胞生成刺激劑(Jelkmann W. Erythropoietin structure, control of production, and function. Physiol Rev,1992,72(2) :449_489)。1985年，人們利用基因重組技術(shù)合成生成了重組人促紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)。 目前商品化的rhuEPO主要有四種，rHuEPO- α，rHuEPO- β，新型紅細(xì)胞生成刺激蛋白 Darb印oetin(商品名Aranesp)和持續(xù)性的促紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑(Continuous ErythropoietinReceptor Activator, CERA)。rHuEPO在臨床上主要用于治療腎性貧血以及腫瘤等各種慢性疾患所伴發(fā)的貧血。同時(shí)，由于EPO具有可促進(jìn)紅細(xì)胞產(chǎn)生，從而增加機(jī)體的攜氧能力，改善耐受力的特性，因此在人類體育競(jìng)技和馬術(shù)比賽中經(jīng)常被濫用作興奮劑以提高比賽成績(jī)。據(jù)估計(jì)在耐力比賽中，約有3-7%的運(yùn)動(dòng)員使用重組EP0(Wilber RL, Detection of DNA-recombinant human epoetin—alpha as apharmacological ergogenic aid. Sports Med, 2002，32 :125-142.)。在2009年的禁用藥物清單中，S2項(xiàng)下的第一項(xiàng)以促紅細(xì)胞生成刺激劑代替促紅細(xì)胞生成素，以便更清晰的標(biāo)明近年出現(xiàn)的各類新的EPO類似物(The World Anti-Doping Code-THE 2009 PROHIBITED LISTINTERNATIONAL STANDARD, http: //www. wada-ama. org)。因此如何對(duì)EPO進(jìn)行有效的檢測(cè)是當(dāng)前人們關(guān)注的熱點(diǎn)。在臨床檢測(cè)中，近年發(fā)展起來的免疫測(cè)定法是目前應(yīng)用最廣泛的EPO檢測(cè)方法。 免疫測(cè)定法以抗原、抗體反應(yīng)的特異性和親和性為基礎(chǔ)，主要包括放射免疫法、酶免分析法、熒光免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。在EPO作為興奮劑的檢測(cè)方面，2000年以來，國際奧委會(huì)使用等電聚焦-免疫雙印跡法檢測(cè)運(yùn)動(dòng)員是否注射過重組EPO產(chǎn)品，并將該方法作為人類體育比賽中濫用EPO的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，其每條印跡譜帶的檢出靈敏度為1. 7pg。另外，MALDI-T0F-MS和ESI-MS等各類質(zhì)譜技術(shù)也為rHuEPO的檢出提供了靈敏的方法(Guan F et al，Differentiation andldentification of Recombinant Human Erythropoietin andDarbepoetin Alfa in Equine Plasma by LC-MS/MS for Doping Control. Anal. Chem，2008，80(10) :3811-3817)。 2009 年 Guan i果題組在癌癥病人血漿中檢出 NESP(novel erythropoiesis stimulating protein),最低檢出限為 0. Ing/mL(Guan F et al, Identification ofDarbepoetin Alfa in Human Plasma by Liquid ChromatographyCoupled to Mass Spectrometry for Doping Control, Int. J. Sports. Med.，2009 ；30 :80-86.)。綜上所述，無論是在EPO的臨床檢測(cè)還是作為興奮劑的檢測(cè)中，都是基于免疫抗體捕獲富集的技術(shù)。但抗體自身對(duì)于環(huán)境溫度和PH變化的敏感性與不耐受性以及產(chǎn)品批間重復(fù)性較低等這些局限性均影響免疫分析的穩(wěn)定性并且阻礙其靈敏度的進(jìn)一步提高。 且有報(bào)道稱用于制備EPO單克隆抗體AE 7A5的抗原氨基酸序列中含有的中心四肽在500 多種人體蛋白和185種大腸桿菌蛋白中廣泛存在，因此導(dǎo)致抗體AE7A5會(huì)與真核生物、菌類蛋白和哺乳動(dòng)物組織，例如膀胱上皮組織產(chǎn)生明顯的交叉反應(yīng)(Franke W W等，errors and risks of false-positiveresults in urinary EPO drug tests. Clinica Chimica Acta. 2006,373 :189-190.)。因此，亟需高穩(wěn)定性、高靈敏度、低交叉反應(yīng)且方便、快捷的 EPO檢測(cè)元件和檢測(cè)方法的開發(fā)。適配體的概念在1990年由Tuerk等首次提出，是指利用指數(shù)富集的配體進(jìn)化技術(shù) (systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)從特定的寡核苷酸庫中篩選出對(duì)目標(biāo)靶有特異性相互作用的寡核苷酸(DNA或RNA)。適配體與靶分子之間分子識(shí)別功能與抗體極為相似，但與傳統(tǒng)的抗體相比，適配體具有以下特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)(1)對(duì)目標(biāo)靶分子具有與抗體相當(dāng)甚至更高的親和性；( 可以大量、快速的在體外合成，制備方法更為簡(jiǎn)單快捷；C3)可以針對(duì)不同種類的目標(biāo)靶進(jìn)行篩選，包括生物毒性的分子以及只具有半抗原性的分子，拓寬了其應(yīng)用范圍；(4)穩(wěn)定性優(yōu)于抗體，利于儲(chǔ)存；(5)易功能化修飾與標(biāo)記?；谶m配體的上述優(yōu)良特性，其在疾病檢測(cè)、藥物研發(fā)、臨床治療、分析化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究等多個(gè)領(lǐng)域都有著良好的應(yīng)用前景。但是目前國內(nèi)外尚無采用SELEX技術(shù)針對(duì)rHuEPO-α篩選特異性寡核苷酸適配體的研究工作。

發(fā)明內(nèi)容
為此，發(fā)明人鑒于EPO分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了改良的親和樹脂篩選策略，借助基于SELEX技術(shù)的組合化學(xué)技術(shù)，篩選得到能特異性結(jié)合EPO的DNA適配體。該適配體是除抗體以外的新的EPO結(jié)合劑，可以特異性捕獲和富集血漿和尿液中EPO分子，并且相對(duì)于抗體具有穩(wěn)定、方便、快捷的優(yōu)勢(shì)。其中，本發(fā)明內(nèi)容中所提到的EPO蛋白，均指天然EPO蛋白、 rHuEPO- α蛋白和rHuEPO-β蛋白中的一種或多種，還包括去糖基化的上述EPO蛋白，特別說明的除外。同時(shí)，發(fā)明人利用寡陰離子型適配體和特定金屬陽離子間的靜電作用，通過改變特定的離子濃度，能夠有效地篩選得到結(jié)合性良好的DNA適配體，由此提供了新的DNA適配體的篩選方法。具體地，本發(fā)明提供了1.特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體及其片段，其選自SEQ ID NO 1 120所示的序列中的一個(gè)或者多個(gè)，其中，SEQ ID NO :61-120在結(jié)構(gòu)上均符合下述通式I所示的結(jié)構(gòu)特征，5，-C TTCTGCCCGCCTCCTTCC-N39-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3'(通式 I)。通式 I 中 N代表堿基A、G、C、T中的任一個(gè)，代表隨機(jī)片段長(zhǎng)度為39個(gè)堿基。也就是說SEQ ID N0 61-120所示序列在5，末端的序列為5，-CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-3，，在3，末端的序列為 5，-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3，；SEQ ID NO 1-60 是上述序列中的 N^3 隨機(jī)片段，其保留截短前的全序列對(duì)EPO的結(jié)合能力。上述序列均以單鏈形式存在。其中，EPO蛋白選自天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白和rHuEPO-β蛋白中的一種或多種，還包括去糖基化的上述EPO蛋白。
在SEQ ID NO :1 120 所示的序列中，優(yōu)選 SEQ ID NO :53、56、60、113、116 和 120
所示的序列。SEQ ID NO :1 120所示的序列，其修飾方式選自以下方式中的一種或幾種全硫化、端基封閉和PEG修飾。2.用于EPO檢測(cè)的組合物、試劑盒和芯片，其中含有SEQ ID NO 1 120中所示任一項(xiàng)序列的適配體及其經(jīng)過上述方式修飾的適配體。3.含有SEQ ID NO :1 120所示任一項(xiàng)序列的適配體及其經(jīng)過上述方式修飾的適配體，用于EPO檢測(cè)的用途。4.篩選特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體的方法，包括步驟(a)-(l)(a)提供下述(i)-(iv)(i)篩選文庫其選自包括雙鏈DNA文庫、單鏈DNA(ssDNA)文庫和RNA文庫在內(nèi)的核酸文庫，優(yōu)選ssDNA文庫，更優(yōu)選經(jīng)過標(biāo)記的ssDNA文庫，所述標(biāo)記可以是熒光素或是生物素，還優(yōu)選長(zhǎng)度為80個(gè)堿基的如下述通式I所示的隨機(jī)ssDNA文庫5，-CTTCTGCCCGC CTCCTTCC-N39-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3 ’ ；(ii)靶蛋白ΕΡ0蛋白，其中的EPO蛋白選自天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白和 rHuEPO-β蛋白中的一種或多種，還包括去糖基化的上述EPO蛋白，優(yōu)選rHuEPO-α蛋白；(iii)親和樹脂偶聯(lián)有對(duì)EPO有特異性親和力的物質(zhì)的樹脂，優(yōu)選偶聯(lián)有麥胚凝集素的瓊脂糖樹脂；和(iv)偶聯(lián)有EPO的的親和樹脂(iii)；(b)使步驟(a)中的篩選文庫和親和樹脂(iii)在適宜的條件下接觸，所述接觸可以包括溫育、洗滌，所述“適宜的條件”是指足以使篩選文庫中的成員能夠和親和樹脂特異性結(jié)合的結(jié)合的條件，該條件可以涉及溫度、作用時(shí)間、結(jié)合緩沖液的成分、PH值；例如溫育溫度為37°C，作用時(shí)間為lh，篩選液的1 X儲(chǔ)液配方為20mM Tris-HCl, 140mM NaCl、5mM MgCl2、5mM KCl，其中Mg2+的工作濃度保持在0. l_50mM，優(yōu)選Mg2+的工作濃度為 0. l、5、10、20、50mM，最優(yōu)選 5mM。然后收集未與親和樹脂(iii)結(jié)合的ssDNA文庫；(c)使步驟(b)中未與親和樹脂(iii)結(jié)合的ssDNA文庫和親和樹脂(iv)在適宜的條件下接觸，所述接觸可以包括溫育、洗滌；所述“適宜的條件”是指足以使篩選文庫中的成員能夠和親和樹脂特異性結(jié)合的結(jié)合的條件，該條件可以涉及溫度、作用時(shí)間、結(jié)合緩沖液的成分、PH值；例如溫育溫度為37°C，作用時(shí)間為lh，篩選液的IX儲(chǔ)液配方為20mM Tris-HCl、 140mM NaCl、5mM MgCl2、5mM KCl，其中Mg2+的工作濃度保持在0. l_50mM，優(yōu)選Mg2+的工作濃度為 0. l、5、10、20、50mM，最優(yōu)選 5mM。(d)用N-乙酰葡萄糖胺洗脫，收集經(jīng)步驟(C)處理的與親和樹脂結(jié)合的文庫成員；(e)任選地對(duì)步驟(d)的文庫成員進(jìn)行擴(kuò)增處理，所述擴(kuò)增處理可以是PCR擴(kuò)增、 RNA文庫的轉(zhuǎn)錄等；
(f)將步驟(d)或者(e)中的文庫成員與步驟(a)中的(iv)在適宜的條件下接觸，所述“適宜的條件”是指足以使步驟⑷或者(e)中的文庫成員能夠和EPO特異性結(jié)合的條件，該條件可以涉及溫度、作用時(shí)間、結(jié)合緩沖液的成分、PH值等；例如溫育溫度為37°C，作用時(shí)間為lh，篩選液的1 X儲(chǔ)液配方為20mM Tris-HCl, 140mM NaCl、5mM MgCl2、5mM KCl，其中Mg2+的工作濃度保持在0. l_50mM，優(yōu)選Mg2+的工作濃度為 0. l、5、10、20、50mM，最優(yōu)選 5mM。(g)任選地，在步驟(f)中進(jìn)行條件嚴(yán)格化，例如減少靶蛋白EPO的用量，在接觸步驟后增加洗滌步驟，在接觸步驟中加入非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑等，只要是能夠去除與EPO特異性結(jié)合性弱的文庫成員的步驟均可使用；其中的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑可以是tRNA ；(h)收集在步驟(f)或(g)中與(iv)特異性結(jié)合的文庫成員，該步驟可以采用洗脫方式進(jìn)行；(j)重復(fù)步驟(e)-(h)，重復(fù)次數(shù)為1、2、3、4、5、6、7、8次，優(yōu)選重復(fù)6-8次，最優(yōu)選重復(fù)8次；(k)對(duì)(h)步驟獲得的文庫成員進(jìn)行確認(rèn)，如序列測(cè)定等；和(1)任選地，對(duì)獲得的文庫成員進(jìn)行結(jié)合功能檢測(cè)等，例如進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)等。本發(fā)明通過靶分子有效固定、借助金屬陽離子(如Mg2+)增加適配體與靶分子間相互作用力、采用熒光標(biāo)記文庫與電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)四方面協(xié)同改進(jìn)現(xiàn)有的親和柱層析篩選方法，經(jīng)8輪篩選后得到了解離常數(shù)可達(dá)nM級(jí)的適配體，由此提供了特異性結(jié)合EPO的DNA適配體、其制備方法及其用途。


圖1. SELEX法篩選特異性結(jié)合重組人促紅細(xì)胞生成素rHuEPO- α的寡核苷酸適配體示意圖。提供合成的ssDNA文庫和重組人促紅細(xì)胞生成素rHuEPO-α，在篩選前進(jìn)行親和樹脂反篩，然后使之相互作用，去除未結(jié)合的寡核苷酸文庫，同時(shí)在每輪篩選中加入非特異性競(jìng)爭(zhēng)抑制劑tRNA，增加篩選的特異性，共篩選8輪。圖2.連有重組人促紅細(xì)胞生成素rHuEPO- α的偶聯(lián)有WGA的瓊脂糖樹脂與各輪篩選后得到的ssDNA文庫結(jié)合能力比較示意圖。篩選完成后，取160pmol經(jīng)5、羧基熒光素標(biāo)記的每輪篩選后得到的ssDNA文庫與500pmol rHuEPO- α作用，用N-乙酰葡萄糖胺洗脫，測(cè)定洗脫液的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第6、7、8輪文庫與rHuEPO-α的親和力較強(qiáng)，其中第 8輪文庫與rHuEPO- α的親和力最強(qiáng)。圖3. EMSA實(shí)驗(yàn)測(cè)定經(jīng)放射性同位素[Y -32PlATP標(biāo)記的各輪篩選后的ssDNA文庫與rHuEPO-α的結(jié)合情況。其中Α:原始文庫(25nM)+rHuEPO-α (1 μ Μ) ；B :4th 文庫 (25nM) +rHuEPO-α (1 μ Μ) ；C :6th 文庫(25nM)+r HuEPO- α (1 μ Μ) ；D :7th 文庫 (25nM) +rHuEPO- α (1 μ Μ) ；E :8th 文庫(25ηΜ) +rHuEPO- α (1 μ Μ)。篩選完成后，分別取每輪篩選后得到的寡核苷酸文庫經(jīng)[Y -32PlATP標(biāo)記后濃度為25ηΜ，與1 μ M的rHuEPO- α相互作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著篩選的進(jìn)行寡核苷酸文庫與 rHuEPO-α的親和力逐漸增加，直至第八輪篩選后親和力達(dá)到最強(qiáng)。
圖4. EMSA實(shí)驗(yàn)測(cè)定經(jīng)放射性同位素[Y -32P] ATP標(biāo)記的寡核苷酸適配體與 rHuEPO- α的解離常數(shù)的擬合曲線，其中圖如，4b，如分別對(duì)應(yīng)適配體813，828，850。圖5. EMSA實(shí)驗(yàn)測(cè)定經(jīng)放射性同位素[、-32PlATP標(biāo)記的寡核苷酸適配體828與 rHuEPO- α，人血清白蛋白HSA，人血紅蛋白(hemoglobin)，牛血清白蛋白(BSA)，溶菌酶 (lysozyme)，人IgG結(jié)合的特異性電泳圖。其中，A:a(25nM)；B :a(25nM)+rHuEPO-α (1 μ Μ) ；C :a(25ηΜ)+HSA(1 μ Μ) ；D a (25ηΜ)+hemoglobin(1 μ Μ) ；E:a (25ηΜ)+BSA (1 μ Μ) ；F :a (25ηΜ)+lysozyme(1 μ Μ) ；F 828 (25ηΜ) +IgG(IyM) ；M 為核酸分子量 Marker，單位為 bp。寡核苷酸序列828經(jīng)[γ -32P] ATP標(biāo)記后，調(diào)整濃度為25nM，與(IOOOnM)的 rHuEPO- α，人血清白蛋白HSA，人血紅蛋白，牛血清白蛋白，溶菌酶，人IgG相互作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)寡核苷酸序列擬8不與上述除rHuEPO-α以外的非特異性蛋白相互作用，說明其特異性較好。圖6.熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)實(shí)驗(yàn)測(cè)定Mg2+離子對(duì)適配體與rHuEPO間特異性結(jié)合的影響。圖7. EMSA實(shí)驗(yàn)測(cè)定寡核苷酸適配體828與商品化rHuEPO注射液的結(jié)合電泳圖。 其中，A :aptamer 828(1 μ Μ) ；B :aptamer 828 (1 μ Μ) + 益比奧注射液(rHuEPO- α ) (1 μ Μ)； C :aptamer 828 (1 μ Μ) +羅可曼注射液(rHuEPO- β ) (1 μ Μ) ；M為核酸分子量Marker，單位為bp。圖8. EMSA實(shí)驗(yàn)測(cè)定經(jīng)放射性同位素[Y -32P] ATP標(biāo)記的寡核苷酸適配體828 的完全隨機(jī)片段(^8r，SEQ ID NO :56，注本文所提到的828r均指SEQ ID NO 56)與 rHuEPO-的解離常數(shù)的擬合曲線。圖9. EMSA實(shí)驗(yàn)測(cè)定寡核苷酸適配體828的完全隨機(jī)片段(8^r)與商品化rHuEPO 注射液的結(jié)合電泳圖。其中，A :aptamer 828r(lyM) ；B :aptamer 828r (1 μ Μ) +益比奧注射液(rHuEPO- α ) (1 μ Μ) ；C :aptamer828r (1 μ Μ) + 羅可曼注射液(rHuEPO- β ) (1 μ Μ)。圖10. EMSA實(shí)驗(yàn)測(cè)定寡核苷酸適配體828的完全隨機(jī)片段(8^r)與去糖基化 rHuEPO- α 的結(jié)合電泳圖。其中，A :aptamer 828r(lyM) ；B :aptamer 828r (1 μ Μ) + 去糖基化 rHuEPO-(1 μ Μ) ；C :aptamer828r(1 μ Μ)+rHuEPO-α (1 μ Μ)。圖11.寡核苷酸適配體828的完全隨機(jī)片段與細(xì)胞結(jié)合的熒光共聚焦圖像。其中Cell TM為人膀胱癌上皮細(xì)胞，Cell HEL為人晶狀體正常上皮細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中，所有解釋、定義和術(shù)語如下SELEX 技術(shù)是指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment)， dj 5ft 20 it I己 90 $ ft tS (Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands byexponential enrichment :RNA ligands to bacteriophage T4 DNApolymerase. Science, 1990，249 :505-510.)，其基于組合化學(xué)原理同時(shí)結(jié)合體外PCR擴(kuò)增的方法，經(jīng)反復(fù)分離和擴(kuò)增，得到針對(duì)靶分子特異結(jié)合序列的單條適配體?；谠摷夹g(shù)， 同時(shí)依據(jù)適配體與靶分子作用關(guān)系及后期檢測(cè)和藥物設(shè)計(jì)等目的考慮，將全長(zhǎng)的序列進(jìn)行適當(dāng)剪裁，除去和靶分子結(jié)合無關(guān)的堿基，以適當(dāng)提高親和力和特異性并降低合成成本。通常經(jīng)數(shù)輪篩選后可獲得高親和力，高特異性的寡核苷酸適配體，其解離常數(shù)(Kd)可達(dá)nmol/ L甚至pmol/L。目前已成功運(yùn)用該技術(shù)篩選獲得金屬離子、有機(jī)小分子、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、甚至細(xì)胞的各自特異性適配體。適配體是指能夠特異性結(jié)合EPO的蛋白的寡核苷酸分子，優(yōu)選自富集文庫中具有高親和力的單克隆寡核苷酸分子，包括經(jīng)序列剪裁后的寡核苷酸分子。其核苷酸的個(gè)數(shù)為10-90， 優(yōu)選 20、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90 個(gè)，更優(yōu)選 37-48,78-89 個(gè)核苷酸，特別優(yōu)選38、39、40、79、80、81個(gè)核苷酸。寡核苷酸的修飾方式可以為全硫代、端基封閉和PEG 修飾等等。適配體較抗體相比具有可體外合成，穩(wěn)定性好，易于化學(xué)修飾及無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為抗體領(lǐng)域外研究蛋白質(zhì)的新型功能分子。篩詵文庫的片段長(zhǎng)度由于通式I中的片段為隨機(jī)合成片段，因此片段長(zhǎng)度略有參差，本發(fā)明篩選到的SEQ ID NO :1-60長(zhǎng)度在37-48個(gè)堿基之間，相應(yīng)地，SEQ ID NO :61-120長(zhǎng)度在78-89個(gè)堿基之間。固定EPO的親和樹脂的詵擇EPO的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是含有大約40 %的糖基，具有三個(gè)N連接和一個(gè)0連接的糖基化位點(diǎn)，分布有三天線和四天線型低聚糖且末端以α 2 —3連接方式唾液酸化，唾液酸平均含量約占17%。麥胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)可特異性地與β 1-4或β 1-2連接的 N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸發(fā)生親和作用，考慮到重組EPO中的多分支糖能夠通過親和作用與麥胚凝集素結(jié)合，發(fā)明人選擇偶聯(lián)有或者包被有WGA的載體例如樹脂來實(shí)現(xiàn)重組EPO的固定。篩選條件的改進(jìn)考慮到重組EPO例如rHuEPO-α結(jié)構(gòu)中具有較高含量的唾液酸，在篩選緩沖條件下與寡核苷酸文庫會(huì)發(fā)生相同電荷相互排斥作用，因此在篩選緩沖溶液中添加了適當(dāng)濃度的Mg2+，由此屏蔽核酸骨架上的負(fù)電荷，有助于帶負(fù)電荷的重組EPO更易接近寡核苷酸分子的表面。rHuEPO-α與適配體間作用力在無Mg2+存在時(shí)下降50%。EPO的選擇本發(fā)明中的EPO蛋白可以是天然EPO蛋白、rHuEPO- α蛋白和rHuEPO- β蛋白中的一種或多種。在實(shí)施例中發(fā)明人選擇rHuEPO-α作為代表進(jìn)行篩選，在篩選完成后，采用 rHuEPO-a、rHuEPO-β進(jìn)行結(jié)合力驗(yàn)證，結(jié)果證明以rHuEPO-α為靶篩選得到的適配體同樣對(duì)rHuEPO-β具有相似的結(jié)合活性，同時(shí)以膀胱癌細(xì)胞中的天然EPO為例進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的適配體對(duì)于天然EPO蛋白與rHuEPO- α蛋白和rHuEPO-β的結(jié)合效果相似。篩選文庫的選擇發(fā)明人在篩選全程采用熒光標(biāo)記的寡核苷酸文庫，以結(jié)合率實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，并采用[Y -32PlATP標(biāo)記的寡核苷酸文庫與rHuEPO- α相互作用的電泳遷移率變動(dòng)分析實(shí)驗(yàn)(electrophoreticmobility shift assay，EMSA)，從不同的技術(shù)手段角度進(jìn)行富集率等指標(biāo)的考察。電泳遷移率變動(dòng)分析實(shí)騎該試驗(yàn)是基于適配體與蛋白發(fā)生相互作用形成復(fù)合物后，導(dǎo)致其原有的電泳遷移速度變緩，表現(xiàn)為與游離適配體不同的電泳遷移速率，從而表征適配體與蛋白之間的相互作用力。下面通過實(shí)施例闡述說明本發(fā)明，不過下述實(shí)施例僅僅用來解釋本發(fā)明，其不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，任何本領(lǐng)域已知的本發(fā)明的產(chǎn)品、方法的等價(jià)的變體都包括在本發(fā)明中。實(shí)施例^MM 1.隨機(jī)單 車DNA(ssDNA) 1) 引物的構(gòu)律(a)構(gòu)建長(zhǎng)度為80個(gè)堿基的隨機(jī)ssDNA文庫5’ -CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-N39-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3’ 其中 N 代表堿基 A， G, C, T 中的ft —f ( B Berezovski Μ, MusheevM, Drabovich A, Krylov SN. Non-SELEX Selection of Aptamers. J. Am. Chem. Soc. 2006,128 :1410-1411),該文庫的容量為 IO13-IO150(b)合成5’端標(biāo)記熒光素(FAM)的正向引物5，-FAM-CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-3，(SEQ ID NO :121)，(c)合成5，端標(biāo)記生物素(biotin)的反向引物5，-生物素-AGTGTCCGCCTATCTCGTCTCC-3，(SEQ ID NO :122)。隨機(jī)ssDNA文庫和引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)施例2.特異性識(shí)別rHuEPO- α的DNA適配體的篩選為篩選出與rHuEPO- α結(jié)合特異性強(qiáng)的DNA適配體，用SELEX法共進(jìn)行了 8輪篩選(8個(gè)SELEX循環(huán)，見圖1)，以下以第1輪篩選為例詳細(xì)說明此過程。(1) SELEX法篩選與rHuEPO- α特異性結(jié)合的ssDNA文庫(a)麥胚凝集素偶聯(lián)樹脂與ssDNA文庫的反篩處理取2000pmol所述隨機(jī)ssDNA文庫溶于300 μ L IXSELEX篩選緩沖液(1 XSELEX 篩選緩沖液20mM Tris-HCl, 140mM NaCl,5mM MgCl2, 5mM KCl, PH = 7.4)中，并置于 95°C 水浴5分鐘后立即置于冰浴10分鐘。然后加入220 μ L偶聯(lián)了麥胚凝集素(WGA)的瓊脂糖樹脂(粒徑200-300 μ m，購自 Sigma-Aldrich公司，ImL樹脂懸浮于2. 2mL懸浮液)，37°C緩慢振蕩溫育1小時(shí)，然后收集未與所述偶聯(lián)了 WGA的瓊脂糖樹脂結(jié)合的ssDNA文庫。 (b) rHuEPO- α偶聯(lián)樹脂對(duì)經(jīng)反篩處理后文庫的篩選取2000 11101純1^此 0-(1蛋白(深圳賽寶爾生物制藥有限公司提供)溶于300μ L 1 X SELEX篩選緩沖液中，并向其中加入100 μ L所述偶聯(lián)了 WGA的瓊脂糖樹脂，于37°C緩慢振蕩溫育1小時(shí)，隨后用1 X SELEX篩選緩沖液清洗3次以除去未與所述偶聯(lián)了 WGA的瓊脂糖樹脂結(jié)合的rHuEPO- α后，再用結(jié)合緩沖液清洗3次。將收集到的所述未與所述偶聯(lián)了 WGA的瓊脂糖樹脂結(jié)合的ssDNA文庫(即，經(jīng)過反篩處理的文庫)加入所述結(jié)合于所述偶聯(lián)了 WGA的瓊脂糖樹脂的rHuEPO-中，同時(shí)以終濃度4μ M加入tRNA，并溫育1小時(shí)。棄去未與結(jié)合于所述偶聯(lián)了 WGA的瓊脂糖樹脂的rHuEPO- α結(jié)合的SSDNA文庫后，用結(jié)合緩沖液清洗3次。向所述與結(jié)合于所述偶聯(lián)了 WGA的瓊脂糖樹脂的rHuEPO- α結(jié)合的SSDNA文庫中加入300 μ L SELEX篩選洗脫液(0. 45Μ的N-乙酰葡萄糖胺溶液)，洗脫2次，每次10分鐘。

合并收集到的洗脫液后，用等體積的Tris飽和酚-氯仿(1 1)抽提，取上清，再用等體積的氯仿抽提以去除痕量酚，取上清，并加入無水乙醇-20°C沉淀過夜，從而得到用于下輪篩選的ssDNA文庫。(2)用干下輪SELEX法f帝詵的ssDNA f庫的制各在每輪篩選前，需通過PCR將上步所得ssDNA文庫擴(kuò)增為dsDNA文庫后，再將所得 dsDNA文庫經(jīng)鏈霉親和素磁珠(Promega公司，美國)提取后，經(jīng)堿解得到用于下輪篩選的 ssDNA文庫。具體過程如下取5μ L所述篩選出的ssDNA文庫，30pmol正向引物，30pmol反向引物，IOyL 10XPCR反應(yīng)緩沖液2，2 μ L 10mmol/L的dNTP，3U(活性單位)的DNA聚合酶，加入無菌水至100 μ L0然后進(jìn)行10-15個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序設(shè)定為94°C，5分鐘；94°C，30秒鐘；56°C，15秒鐘；72°C，15秒鐘；72°C，5分鐘?？梢酝ㄟ^改變循環(huán)數(shù)以獲得最佳的擴(kuò)增效果。PCR產(chǎn)物用10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。取1200 μ L所得dsDNA文庫加入到已清洗好的600 μ L鏈霉親和素磁珠中，將其于搖床上振搖6小時(shí)后置于磁力架上。棄去上清，并用PBS緩沖液清洗3次后，向其中加入 300 μ L 0. 15mol/L的NaOH溶液，作用1.5分鐘。吸出上清液并用30yL 10%乙酸中和，混合均勻。再向其中加入33yL 22%的高氯酸鋰溶液和ImL丙酮，并置于-20°C沉淀過夜。次日以HOOOrpm離心20分鐘后去除上清液，并將所述沉淀經(jīng)水溶解后得到用于下輪篩選的 ssDNA文庫。紫外測(cè)定所得ssDNA文庫的提取量。(3)第 2-8 輪 SELEX 法篩選重復(fù)上述步驟⑴和⑵進(jìn)行第2-8輪篩選，其中第2-3輪篩選使用了 IOOOpmol所述隨機(jī)ssDNA文庫，及300pmol純r(jià)HuEPO- α蛋白；第4-8輪篩選使用了 500pmol所述隨機(jī)ssDNA文庫，及IOOpmol純r(jià)HuEPO- α蛋白。在每輪篩選中，通過加入非特異性競(jìng)爭(zhēng)劑tRNA來增加篩選的特異性。⑷各輪篩選所得ssDNA文庫與rHuEPO- α的親和力間的比較用親和柱法比較各輪篩選所得ssDNA文庫與rHuEPO- α間的親和力，方法同步驟 ⑴。取各輪所得ssDNA文庫(均已經(jīng)FAM標(biāo)記)與結(jié)合有rHuEPO- α的偶聯(lián)了 WGA的瓊脂糖樹脂作用，去除未結(jié)合的ssDNA文庫。用結(jié)合緩沖液清洗3次后，向其中加入SELEX 洗脫緩沖液(0. 45M的N-乙酰葡萄糖胺)，測(cè)定各輪所得ssDNA文庫的洗脫緩沖液的熒光值。計(jì)算公式如下(樣品樹脂洗脫緩沖液熒光強(qiáng)度-空白樹脂洗脫緩沖液熒光強(qiáng)度)/初始熒光強(qiáng)度通過測(cè)定發(fā)現(xiàn)，第6、7、8輪篩選所得ssDNA文庫與rHuEPO- α的結(jié)合親和力較強(qiáng)， 而第8輪篩選所得ssDNA文庫與rHuEPO- α的親和力最強(qiáng)(見圖2)。因此，通過步驟(2)的方法將第6、7、8輪篩選所得ssDNA擴(kuò)增為dsDNA，經(jīng)T載體(Promega公司，美國)連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci中。然后進(jìn)行氨芐抗性篩選，分別挑取單個(gè)生長(zhǎng)菌落進(jìn)行測(cè)序，得到如下表1中SEQ ID N0:61-120所示的60條全長(zhǎng)寡核苷酸序列。后續(xù)隨機(jī)片段檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，來自60條全長(zhǎng)序列的隨機(jī)區(qū)片段獨(dú)立形成結(jié)合構(gòu)象或是與兩端固定的引物區(qū)互補(bǔ)共同參與結(jié)合構(gòu)象形成，此處將結(jié)合力較高的60條隨機(jī)區(qū)片段(SEQ ID NO 1-60)列于表 1。表1 與rHuEPO-α結(jié)合親和力較強(qiáng)的60條寡核苷酸序列
權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體，其選自SEQID NO :1 120所示的序列中的一個(gè)或者多個(gè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適配體，其選自SEQID NO :53、56、60、113、116和120所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的任一項(xiàng)適配體，其被能夠增強(qiáng)其半衰期、提高其穩(wěn)定性、防止核酸內(nèi)切酶或者外切酶切割的化合物所修飾。
4.用于EPO蛋白檢測(cè)的組合物、試劑盒和芯片，其中含有權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的適配體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的適配體，其中的EPO蛋白選自天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白、rHuEPO- β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一種或多種。
6.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的適配體用于EPO蛋白檢測(cè)的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的適配體，其中的EPO蛋白選自天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白、rHuEPO- β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一種或多種。
8.篩選特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體的方法，包括步驟(a)-(l)(a)提供下述(i)-(iv)(i)篩選文庫ssDNA文庫；(ii)靶蛋白ΕΡ0蛋白，其中的EPO蛋白選自天然EPO蛋白、rHUEPO-α蛋白、rHUEPO-β 蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一種或多種，優(yōu)選rHUEPO-α蛋白；(iii)親和樹脂偶聯(lián)有對(duì)EPO有特異性親和力的物質(zhì)的樹脂，優(yōu)選偶聯(lián)有麥胚凝集素的瓊脂糖樹脂；和(iv)偶聯(lián)有EPO的親和樹脂(iii)；(b)使步驟(a)中的篩選文庫和親和樹脂(iii)在適宜的條件下接觸， 所述接觸可以包括溫育、洗滌，所述“適宜的條件”是指足以使篩選文庫中的成員能夠和親和樹脂特異性結(jié)合的結(jié)合的條件，該條件可以涉及溫度、作用時(shí)間、結(jié)合緩沖液的成分、PH值； 然后收集未與親和樹脂(iii)結(jié)合的ssDNA文庫；(c)使步驟(b)中未與親和樹脂(iii)結(jié)合的ssDNA文庫和親和樹脂(iv)在適宜的條件下接觸，所述接觸可以包括溫育、洗滌，所述“適宜的條件”是指足以使篩選文庫中的成員能夠和親和樹脂特異性結(jié)合的結(jié)合的條件，該條件可以涉及溫度、作用時(shí)間、結(jié)合緩沖液的成分、PH值；(d)收集經(jīng)步驟(c)處理的與親和樹脂(iv)結(jié)合的文庫成員；(e)任選地對(duì)步驟(d)的文庫成員進(jìn)行擴(kuò)增處理；(f)將步驟(d)或者(e)中的文庫成員與步驟(a)中的(iv)在適宜的條件下接觸，所述“適宜的條件”是指足以使步驟⑷或者(e)中的文庫成員能夠和EPO特異性結(jié)合的條件；(g)任選地，在步驟(f)中進(jìn)行條件嚴(yán)格化處理，所述處理選自減少靶蛋白EPO的用量、在接觸步驟后增加洗滌步驟和在接觸步驟中加入非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑tRNA中的一種或者多種；(h)收集在步驟(f)或(g)中與(iv)特異性結(jié)合的文庫成員； (j)重復(fù)步驟(e)-(h)，重復(fù)次數(shù)為1、2、3、4、5、6、7、8次，優(yōu)選重復(fù)6-8次，更優(yōu)選重復(fù) 8次；(k)對(duì)(g)步驟獲得的文庫成員進(jìn)行確認(rèn)，優(yōu)選序列測(cè)定；和(1)任選地，對(duì)獲得的文庫成員進(jìn)行功能檢測(cè)，優(yōu)選電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的篩選方法，其中適宜的條件是指溫育溫度為37°C，作用時(shí)間為 lh，篩選液的 IX 儲(chǔ)液配方為20mM Tris-HClU40mM NaCl、5mM MgCl2、5mM KCl，其中 Mg2+ 的工作濃度保持在0. l-50mM，優(yōu)選Mg2+的工作濃度為0. 1、5、10、20、50mM，最優(yōu)選5mM。
10.根據(jù)權(quán)利要求1和8所述的適配體，其中的EPO蛋白選自天然EPO蛋白、rHuEP0-α 蛋白、rHuEPO- β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合EPO的DNA適配體、其制備方法及其用途，具體地提供了能特異性結(jié)合EPO的DNA適配體及利用改良的SELEX技術(shù)篩選適配體的方法，提供了檢測(cè)穩(wěn)定性更好、靈敏度更高且方便、快捷的EPO檢測(cè)元件。
文檔編號(hào)C40B30/04GK102191250SQ20101013151
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者唐吉軍, 張朝陽, 謝劍煒, 郭磊 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所