專利名稱：一種可用于快速診斷的免疫膠體金顆粒制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在顆粒形態(tài)控制、顆粒尺寸控制、粒徑均一性等方面比背景技術(shù) 均有較大程度提升的一種可用于快速診斷的免疫膠體金顆粒制備方法，屬免疫膠體金顆粒 制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
膠體金技術(shù)的起源可追溯到1971年，F(xiàn)aulk等應(yīng)用電鏡免疫膠體金染色法(IGS) 觀察沙門菌，將膠體金首先引入免疫化學(xué)，此后免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法， 廣泛應(yīng)用于電鏡水平研究、光顯微細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀及蛋白質(zhì)染色等技術(shù)，并且被引進(jìn)免 疫診斷領(lǐng)域中，尤其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的快速診斷領(lǐng)域顯示出了巨大的發(fā)展前景。免疫膠體金技術(shù)在快速診斷領(lǐng)域的應(yīng)用主要由于該技術(shù)與其他檢測(cè)方法相比，具 有無可比擬的優(yōu)勢(shì)簡便快捷，不需要任何儀器和設(shè)備，并可在幾分鐘之內(nèi)出檢測(cè)結(jié)果；結(jié) 果可靠，靈敏準(zhǔn)確；成本低廉，需用樣本量少。膠體金技術(shù)已廣泛用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的快速診斷應(yīng)用中，如早孕檢測(cè)、傳染病的快速 診斷等，但醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)需要有較高的特異性與靈敏度，因此其應(yīng)用對(duì)膠體金的顆粒大小 和粒徑均一性要求較高。已有研究表明，膠體金顆粒粒徑在l(T40nm左右時(shí)，方法的特異性 與靈敏度較好，而現(xiàn)有膠體金顆粒制備普遍使用的工藝為檸檬酸三鈉還原法，所獲得的膠 體金顆粒在此粒徑范圍內(nèi)的尺寸大小不易控制，粒徑分布不夠均一，嚴(yán)重影響了其在快速 診斷中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
設(shè)計(jì)目的避免背景技術(shù)中的不足之處，設(shè)計(jì)一種顆粒形態(tài)控制、顆粒尺寸控制、 粒徑均一性等方面較現(xiàn)有方法均有較大程度提升的一種可用于快速診斷的免疫膠體金顆 粒制備方法。設(shè)計(jì)方案為了實(shí)現(xiàn)上述設(shè)計(jì)目的。本申請(qǐng)用氯金酸作為還原原料進(jìn)行金顆粒的 制備。用硼氫化鈉作為強(qiáng)還原劑，在較短的時(shí)間內(nèi)快速還原氯金酸，形成小粒徑的金種。用 十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)作為保護(hù)劑，控制金種形成過程，以保證膠體金顆粒均勻生 長。大粒徑(>30nm)膠體金顆粒的合成用鹽酸羥胺和抗壞血酸作為還原劑，因其還原條件 較為溫和，可促進(jìn)金離子在金種上緩慢沉積，較易形成均一的膠體金顆粒。本申請(qǐng)針對(duì)背景 技術(shù)存的不足，設(shè)計(jì)了一種可用于快速診斷的免疫膠體金顆粒制備方法，主要包括以下步 驟
1、在溫度為35°C的水浴條件下，先后加入氯金酸(HAuC14)、十六烷基三乙基溴化銨 (CTAB)和超純水，使得溶液中氯金酸濃度為0. 25mmol/L,CTAB濃度為75mmol/L，攪拌混勻， 4^6min后，再加入終濃度為0. 6mmol/L的NaBH4,快速攪拌2 3min，然后緩慢攪拌；
2、繼續(xù)水浴2 12h，使溶液中NaBH4揮發(fā)完全，即完成3 4nm金顆粒的合成；
3、當(dāng)合成粒徑在30nm以下的膠體金顆粒時(shí)，以已合成的3、nm金顆粒為金種進(jìn)行合成以1:200的比例稀釋金種溶液，依次添加CTAB和氯金酸，使得溶液中的CTAB濃度為 16mmol/L,氯金酸濃度為0. θΠ. llmmol/L,定容至略少于目標(biāo)體積，然后加入終濃度為 6mmol/L抗壞血酸，最后加入占最終合成的膠體金溶液總體積1/1000的金種稀釋液，此步 驟中氯金酸加入量的不同可合成30nm以下不同尺寸范圍的金顆粒；
4、當(dāng)合成粒徑在30nm以上的膠體金顆粒時(shí)，以已合成的30nm金顆粒為金種進(jìn)行合成 以1:200的比例稀釋金種溶液，依次加入鹽酸羥胺(NH3OH ·Ηα)和氯金酸，使得溶液中的鹽 酸羥胺濃度為7. 76 18. lOmmol/L，氯金酸濃度為0. 78 1. 81mmol/L，攪拌混勻；
5、待反應(yīng)5 8h后，每隔Ih加入少許氯金酸，加三次；
6、繼續(xù)反應(yīng)2h，得到膠體金溶液。本發(fā)明與背景技術(shù)相比，一是所獲得的金顆粒粒徑大小較均一、形態(tài)均保持正球 形，可滿足膠體金快速診斷試劑應(yīng)用所需的較高特異性和較高靈敏度要求；二是制備條件 較容易控制，批間重復(fù)性較好；三是制備方法步驟簡單，容易進(jìn)行放大；四是不僅克服了傳 統(tǒng)制備方法所獲得的膠體金顆粒形態(tài)不規(guī)則、大小不均一的缺陷，同時(shí)對(duì)工藝技術(shù)進(jìn)行改 進(jìn)，使得所制備膠體金顆粒能自由調(diào)整顆粒大小，以適用于不同的檢測(cè)項(xiàng)目，使得檢測(cè)結(jié)果 更加準(zhǔn)確可靠。


圖1是本發(fā)明方法制備制備的30nm膠體金顆粒電鏡圖。圖2是檸檬酸三鈉還原法制備的30nm膠體金顆粒電鏡圖。圖3是本發(fā)明方法制備制備的40nm膠體金顆粒電鏡圖。圖4是檸檬酸三鈉還原法制備的40nm膠體金顆粒電鏡圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 一種可用于快速診斷的免疫膠體金顆粒制備方法，主要包括以下步驟 ⑴在溫度為35°C的水浴條件下，先后加入氯金酸(HAuCl4)、十六烷基三乙基溴化銨(CTAB) 和超純水，攪拌混勻，4-6min后，再加入NaBH4,快速攪拌2 3min，然后緩慢攪拌；⑵繼續(xù)水 浴2 12h，使溶液中NaBH4揮發(fā)完全，即完成3 4nm金顆粒的合成；⑶當(dāng)合成粒徑在30nm 以下的膠體金顆粒時(shí)，以已合成的3 4nm金顆粒為金種進(jìn)行合成以1:200的比例稀釋金 種溶液，依次添加CTAB和氯金酸，定容至略少于目標(biāo)體積，然后加入抗壞血酸，最后加入金 種，此步驟中氯金酸加入量的不同可合成30nm以下不同尺寸范圍的金顆粒；⑷當(dāng)合成粒徑 在30nm以上的膠體金顆粒時(shí)，以已合成的30nm金顆粒為金種進(jìn)行合成以1:200的比例稀 釋金種溶液，依次添加鹽酸羥胺(NH3OH · HCl)和氯金酸，攪拌混勻；(5)待反應(yīng)5 8h后，每 隔Ih加入少許氯金酸，加三次；繼續(xù)反應(yīng)2h，得到膠體金溶液。例1 膠體金種顆粒的合成首先，配制氯金酸和CTAB的混合溶液，使得溶液中氯 金酸濃度為0. 25mmol/L, CTAB濃度為75mmol/L ；然后，一次性加入終濃度為0. 6mmol/L的 NaBH4，攪拌混勻，即可得到平均粒徑為3 4nm的膠體金種顆粒，用以合成其它粒徑的顆粒。例2 :10nm粒徑膠體金顆粒的合成首先，以1:200比例稀釋金種溶液；然后，依 次添加CTAB、氯金酸、抗壞血酸和占最終合成的膠體金溶液總體積1/1000的金種稀釋液的 混合溶液，使得溶液中的CTAB濃度為16mmol/L，氯金酸濃度為1. llmmol/L，抗壞血酸濃度為6mmol/L ；最后，每隔Ih加入少許氯金酸，分三次添加，使得最終溶液中氯金酸濃度增加 0. 25mmol/L,即可反應(yīng)得到平均粒徑為IOnm的膠體金顆粒。例3 :15nm粒徑膠體金顆粒的合成首先，以1:200比例稀釋金種溶液；然后，依 次添加CTAB、氯金酸、抗壞血酸和占最終合成的膠體金溶液總體積1/1000的金種稀釋液的 混合溶液，使得溶液中的CTAB濃度為16mmol/L，氯金酸濃度為0. 32mmol/L，抗壞血酸濃度 為6mmol/L;最后，每隔Ih加入少許氯金酸，分三次添加，使得最終溶液中氯金酸濃度增加 0. 25mmol/L,即可反應(yīng)得到平均粒徑為15nm的膠體金顆粒。例4 :20nm粒徑膠體金顆粒的合成首先，以1:200比例稀釋金種溶液；然后，依 次添加CTAB、氯金酸、抗壞血酸和占最終合成的膠體金溶液總體積1/1000的金種稀釋液的 混合溶液，使得溶液中的CTAB濃度為16mmol/L，氯金酸濃度為0. 13mmol/L，抗壞血酸濃度 為6mmol/L ；最后，每隔Ih加入少許氯金酸，分三次添加，使得最終溶液中氯金酸濃度增加 0. 25mmol/L,即可反應(yīng)得到平均粒徑為20nm的膠體金顆粒。例5 :25nm粒徑膠體金顆粒的合成首先，以1:200比例稀釋金種溶液；然后，依 次添加CTAB、氯金酸、抗壞血酸和占最終合成的膠體金溶液總體積1/1000的金種稀釋液的 混合溶液，使得溶液中的CTAB濃度為16mmol/L，氯金酸濃度為0. 07mmol/L,抗壞血酸濃度 為6mmol/L;最后，每隔Ih加入少許氯金酸，分三次添加，使得最終溶液中氯金酸濃度增加 0. 25mmol/L,即可反應(yīng)得到平均粒徑為25nm的膠體金顆粒。例6 :30nm粒徑膠體金顆粒的合成首先，以1:200比例稀釋膠體金種溶液；然后， 依次添加CTAB、氯金酸、抗壞血酸和占最終合成的膠體金溶液總體積1/1000的金種稀釋液 的混合溶液，使得溶液中的CTAB濃度為16mmol/L，氯金酸濃度為0. 04mmol/L，抗壞血酸濃 度為6mmol/L ；最后，每隔Ih加入少許氯金酸，分三次添加，使得最終溶液中氯金酸濃度增 加0. 25mmol/L,即可反應(yīng)得到平均粒徑為30nm的膠體金顆粒，見附圖1和2。例7 :35nm粒徑膠體金顆粒的合成首先，以1:200比例稀釋膠體金種溶液；然后， 依次加入鹽酸羥胺和氯金酸，使得溶液中的鹽酸羥胺濃度為18. lOmmol/L，氯金酸濃度為 l.Slmmol/L;最后，每隔Ih加入少許氯金酸，分三次添加，使得最終溶液中氯金酸濃度增加 0. 25mmol/L,即可反應(yīng)得到平均粒徑為35nm的膠體金顆粒。例8 :40nm粒徑膠體金顆粒的合成首先，以1:200比例稀釋膠體金種溶液；然 后，依次加入鹽酸羥胺和氯金酸，使得溶液中的鹽酸羥胺濃度為7. 76mmol/L，氯金酸濃度為 0. 78mmol/L ；最后，每隔Ih加入少許氯金酸，分三次添加，使得最終溶液中氯金酸濃度增加 0. 25mmol/L,即可反應(yīng)得到平均粒徑為40nm的膠體金顆粒，見附圖3和4。比較例
以現(xiàn)有普遍使用的檸檬酸三鈉還原法作對(duì)照，比較兩種方法制備所得的膠體金顆粒質(zhì) 量。檸檬酸三鈉還原法反應(yīng)條件為在煮沸條件下，加入氯金酸，同時(shí)立即加入2%檸 檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸5分鐘。膠體金顆粒鏡檢結(jié)果顯示(圖廣4)，本發(fā)明所制備的膠體金 顆粒均一性較好，均保持正球形態(tài)，而對(duì)照方法制備的膠體金顆粒均一性較差，形態(tài)較不規(guī) 則。可見本發(fā)明所提供的免疫膠體金制備方法能夠合成出形態(tài)規(guī)則、均一性較好的膠體金 顆粒，結(jié)果穩(wěn)定可靠。需要理解到的是上述實(shí)施例雖然對(duì)本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路作了比較詳細(xì)的文字描 述，但是這些文字描述，只是對(duì)本發(fā)明設(shè)計(jì)思路的簡單文字描述，而不是對(duì)本發(fā)明設(shè)計(jì)思路
5的限制，任何不超出本發(fā)明設(shè)計(jì)思路的組合、增加或修改，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種可用于快速診斷的免疫膠體金顆粒制備方法，主要包括以下步驟⑴在溫度為35℃的水浴條件下，先后加入氯金酸(HAuCl4)、十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)和超純水，攪拌混勻，4 6min后，再加入NaBH4，快速攪拌2~3min，然后緩慢攪拌；⑵繼續(xù)水浴2～12h，使溶液中NaBH4揮發(fā)完全，即完成3~4nm金顆粒的合成；⑶當(dāng)合成粒徑在30nm以下的膠體金顆粒時(shí)，以已合成的3~4nm金顆粒為金種進(jìn)行合成以1:200的比例稀釋金種溶液，依次添加CTAB和氯金酸，定容至略少于目標(biāo)體積，然后加入抗壞血酸，最后加入金種，此步驟中氯金酸加入量的不同可合成30nm以下不同尺寸范圍的金顆粒； ⑷當(dāng)合成粒徑在30nm以上的膠體金顆粒時(shí)，以已合成的30nm金顆粒為金種進(jìn)行合成以1:200的比例稀釋金種溶液，依次添加鹽酸羥胺(NH3OH·HCl)和氯金酸，攪拌混勻；⑸待反應(yīng)5～8h后，每隔1h加入少許氯金酸，加三次；⑹繼續(xù)反應(yīng)2h，得到膠體金溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用于快速診斷的免疫膠體金顆粒制備方法，在溫度為35℃的水浴條件下,先后加入氯金酸、十六烷基三乙基溴化銨和超純水,攪拌混勻,4-6min后，再加入NaBH4,快速攪拌2-3min,然后緩慢攪拌；繼續(xù)水浴2～12h,使溶液中NaBH4揮發(fā)完全,即完成3-4nm金顆粒的合成；當(dāng)合成粒徑在30nm以下的膠體金顆粒時(shí)，以已合成的3~4nm金顆粒為金種進(jìn)行合成以1:200的比例稀釋金種溶液,依次添加CTAB和氯金酸,定容至略少于目標(biāo)體積,然后加入抗壞血酸,最后加入金種,此步驟中氯金酸加入量的不同可合成30nm以下不同尺寸范圍的金顆粒；當(dāng)合成粒徑在30nm以上的膠體金顆粒時(shí),以已合成的30nm金顆粒為金種進(jìn)行合成以1:200的比例稀釋金種溶液,依次添加鹽酸羥胺和氯金酸,攪拌混勻；待反應(yīng)5～8h后,每隔1h加入少許氯金酸,加三次；繼續(xù)反應(yīng)2h,得到膠體金溶液。
文檔編號(hào)B22F9/24GK101934380SQ20101050697
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者奚建宏, 康俊, 李國強(qiáng), 王銳 申請(qǐng)人:杭州啟泰生物技術(shù)有限公司