專利名稱：一種細(xì)胞dna文庫及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種細(xì)胞DNA文庫的構(gòu)建方法以及由該方法制備得到的細(xì)胞DNA文庫。
背景技術(shù)：
表觀遺傳學(xué)是基于非基因序列改變所引起的基因表達(dá)水平的變化，組蛋白修飾 (Histone modification)和DNA甲基化(DNA methylation)是表觀遺傳的兩種主要形式。 組蛋白是染色體基本結(jié)構(gòu)單位，其末端可發(fā)生多種修飾作用從而引起染色體結(jié)構(gòu)的改變， 并調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。DNA甲基化則是在不改變DNA序列的情況下，通過被修飾堿基介導(dǎo)的DNA空間結(jié)構(gòu)的變化，引起相關(guān)基因的沉默或表達(dá)。組蛋白修飾與DNA甲基化修飾在生物體發(fā)育過程中共同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，并通過拮抗或協(xié)同等多種方式相互聯(lián)系，形成表觀遺傳作用網(wǎng)絡(luò)。通過組蛋白化學(xué)修飾的形式來確定特定的基因組區(qū)域在特定時(shí)間的表達(dá)情況及其它功能的調(diào)節(jié)方式稱為組蛋白密碼(Jenuwein Tand Allis C,Translating the histone code. Science, 2001,293 :1074 ；Cosgrove Mand Wolberger C, How does the histone code work ？ Biochemistry and CellBiology，2005，83 :468-476.)。對(duì)組蛋白密碼的深入研究有助于了解組蛋白修飾模式對(duì)染色體結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)的調(diào)控。組蛋白修飾生物學(xué)定義為在不同催化酶的作用下，如組蛋白甲基化酶、組蛋白乙?；傅仍诮M蛋白的N-末端或C-末端添加不同的化學(xué)基團(tuán)的過程。組蛋白的修飾作用是可逆的，主要包括甲基化(methylation)、乙?；?acetylation)、泛素化 (ubiquitination)、磷酸化(phosphorylation)等四種修飾方式(Strahl B and Allis C, The language of covalent histone modifications. Nature, 2000,403 :41-45.)四禾中修飾作用中，以甲基化和乙?；揎椦芯孔顬閺V泛與深入。泛素化修飾主要發(fā)生在組蛋白 H2A、H2B的賴氨酸殘基上，包括單泛素化(monoubiquitous)和多泛素化(ployubiquitous) 兩種形式，在細(xì)胞周期中起到重要的調(diào)節(jié)作用，并且與組蛋白甲基化修飾密切相關(guān)(Shukla A, Chaurasia P and Bhaumik SR, Histone methylation and ubiquitination with theircross-talk and roles in gene expression and stability. Cell Mol Life Sci, 2009,66 :1419-1433 ；Agus D,Matthew C and Matthew S,A modified cross talkbetween histone H2BK123 ubquitination and H3K79 methylation. JBC，2010.)。磷酸化修飾主要發(fā)生在組蛋白的絲氨酸Ger)殘基上，在干細(xì)胞分化過程中起調(diào)節(jié)作用。甲基化和乙?；揎椫饕l(fā)生在組蛋白H3、H4的賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)殘基上。其中甲基化修飾又包括單甲基化(monomethylation)、雙甲基化(dimethylation)和三甲基化 (trimethylation)三種形式，主要起到相關(guān)基因表達(dá)的激活或抑制作用(Rice JC and Allis CD, Histone methylationversus histone acetylation :new insights into epigenetic regulation.Curr Opin CellBiol, 2001,13 :263-273)。組蛋白修飾與DNA甲基化對(duì)染色質(zhì)穩(wěn)定性及基因表達(dá)模式均起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，兩者的調(diào)節(jié)作用并不是孤立的，而是通過DNA甲基化酶與組蛋白修飾相關(guān)酶類，以及眾多蛋白因子之間的相互作用而發(fā)生聯(lián)系的。通常情況下DNA甲基化是在DNA甲基化酶 (DNA methyltransferase，DWT)的催化下，以 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine， SAM)為甲基供體，將甲基基團(tuán)(-CH3)添加到DNA分子特定堿基上的過程。真核生物中DNA 甲基化發(fā)生于5’ -CpG-3’中胞嘧啶的第五位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。人類基因組中，70% 80%的CpG雙核苷酸處于DNA甲基化狀態(tài)，未甲基化的CpG —般聚集成簇，形成 CpG島。CpG島一般位于結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，約有60%以上基因的啟動(dòng)子含有CpG島。活性基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島是未甲基化的，但在特定的情況下也會(huì)發(fā)生甲基化作用，進(jìn)而導(dǎo)致基因的沉默，而去甲基化則可恢復(fù)基因表達(dá)。DNA甲基化對(duì)維持染色體結(jié)構(gòu)、X染色體失活、基因印記都起重要作用(Jones P and Takai D，The role of DNA methylation in mammalian 印igenetics. Science，2001，293 :1068)，合適的DNA 甲基化水平和甲基化位點(diǎn)對(duì)于細(xì)胞的正常發(fā)育、分化是必須的。與正常體細(xì)胞相比，在腫瘤細(xì)胞中， DNA甲基化水平顯著降低，腫瘤細(xì)胞基因組甲基化的程度與正常細(xì)胞相比僅為20-60%，低水平的DNA甲基化導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，多種致癌相關(guān)基因由表達(dá)抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚员磉_(dá)或過量表達(dá)狀態(tài)，同時(shí)伴隨局部區(qū)域的高甲基化，包括腫瘤抑制相關(guān)基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因、DNA修復(fù)基因等，造成抑癌基因表達(dá)的丟失，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生(Baylin S, DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical Practice Oncology, 2005,2 :S4-S11 ；De Marzo A, Marchi V, YangE, et al. , Abnormal regulation of DNA methyltransferase expression duringcolorectal careinogenesis. Caneer research, 1999,59 :3855.)。 組蛋白修飾與DNA甲基化相互聯(lián)系，在染色體變構(gòu)、干細(xì)胞分化、體細(xì)胞重編程， 癌癥發(fā)生等過程中發(fā)揮重要調(diào)控(cedar h and dergman y, LinkingDNA methylation and histone modification. Nuture review, 2009,10 :295-304) 如組蛋白 H3 第 4 位的賴氨酸(!KM)的甲基化修飾與基因活性表達(dá)相關(guān)，并對(duì)DNA甲基化有拮抗作用。H3K4的甲基化通過阻擾DNA甲基化酶(DNMT)的結(jié)合阻止DNA甲基化，從而促進(jìn)相關(guān)基因的高水平表達(dá)(BarskiA, Cuddapah S, Cui K, et al. , High-resolution profiling of histone methylations inthe human genome. Cell, 2007，129 :823-837)。而組蛋白 H3第 9位賴氨酸 (H3K9)的甲基化卻可以吸引DNA甲基化酶的結(jié)合，從而與DNA甲基化發(fā)生協(xié)同作用，抑制相關(guān)基因的表達(dá)(Rosenfeld JA, Wang Z, Schones DE, et al. , Determination of enriched histone modifications in non-genic portions of thehuman genome. BMC Genomics, 2009,10 :143.)。活性表達(dá)基因一般是未甲基化的，但在內(nèi)環(huán)境改變或外界因素刺激情況下，基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島可以發(fā)生甲基化，并引起組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的結(jié)合， 從而發(fā)生組蛋白的去乙?；M(jìn)一步引起基因編碼區(qū)的甲基化，引起染色質(zhì)的高度折疊，最終形成異染色質(zhì)，導(dǎo)致基因永久性沉默(Baylin S，DNA methylation and genesilencing in cancer. Nature Clinical Practice Oncology，2005，2 :S4_S11)。在胚胎發(fā)育過程中， 多能干細(xì)胞通過關(guān)閉某些基因進(jìn)而分化成為體細(xì)胞，表達(dá)基因的關(guān)閉即是由組蛋白修飾和DNA甲基化，以及相關(guān)蛋白因子共同作用導(dǎo)致和維持的(Meissner A，Mikkelsen T，Gu H, et al. , Genome-scale DNAmethylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature, 2008,454 :766-770)。因此，深入了解細(xì)胞分化過程中的組蛋白修飾模式與DNA甲基化修飾途徑后，通過向體細(xì)胞中添加特殊誘導(dǎo)因子anduction factor)，改變細(xì)胞內(nèi)組蛋白修飾模式和去除DNA甲基化，可以使體細(xì)胞發(fā)生重編程，重新形成全能或多能干細(xì)胞(Takahashi K and Yamanaka S, Induction ofpluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures bydefined factors. Cell,2006,126 663-676 ；Maherali N,Sridharan R,Xie W,et al·,Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling andwidespread tissue contribution. Cell Stem Cell,2007,1 :55-70.)。人工誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem cells iPS) 在疾病治療，尤其是癌癥治療方面具有重要意義。 鑒于組蛋白修飾與DNA甲基化在胚胎發(fā)育，個(gè)體發(fā)育，疾病發(fā)生過程中的重要作用，尤其是將組蛋白修飾與DNA甲基化相聯(lián)系，在基因組水平上構(gòu)建生物的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)于人類的疾病研究具有十分重要的意義。因此相關(guān)檢測技術(shù)的發(fā)展在一定程度上左右了研究者對(duì)表觀遺傳的相關(guān)研究。研究蛋白質(zhì)和DNA作用的傳統(tǒng)方法有凝膠阻滯技術(shù)， DNase I足跡法，以及染色質(zhì)免疫沉淀的方法。凝膠阻滯技術(shù)(Electrophoretic Mobility ShiftAssay, EMSA)是研究蛋白質(zhì)-DNA的經(jīng)典方法，可以對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定性和定量分析 (Hellman L and Fried Μ,Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols, 2007, 2 :1849-1861.)。該技術(shù)的原理是蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體的電泳遷移率受到蛋白質(zhì)大小、電荷等因素影響，將顯著低于游離DNA，在凝膠電泳過程中條帶相對(duì)滯后。EMSA實(shí)驗(yàn)通常是將純化的蛋白或細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA探針一同孵育，反應(yīng)產(chǎn)物在非變性的聚丙烯凝膠上進(jìn)行電泳， 蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物由于較慢的遷移率形成滯后的條帶。凝膠阻滯技術(shù)簡單易行，并且放射性同位素標(biāo)記可以保證實(shí)驗(yàn)的高靈敏度，僅需要少量蛋白和DNA即可以完成實(shí)驗(yàn)。隨著技術(shù)的發(fā)展以及不同的實(shí)驗(yàn)需求，凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了相應(yīng)的改進(jìn)，可采用熒光、化學(xué)發(fā)光或免疫組化等檢測手段，避免同位素對(duì)環(huán)境身體有害的缺點(diǎn)。但凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)也存在局限性，最主要的是影響蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體遷移率的因素較多，并且根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法直接得到DNA的包括位置和序列的相關(guān)信息。DNase I足跡法的基本原理是用DNase I對(duì)末端標(biāo)記的待測DNA酶切，使在DNA上形成隨機(jī)切口，而與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA由于空間阻隔，受到蛋白質(zhì)的保護(hù)，不會(huì)受到DNase I酶切，因此產(chǎn)物中未被酶切的DNA片段分離純化后，進(jìn)行電泳和放射自顯影，可與對(duì)照組相比得到足跡部位的核苷酸序列(Res N, Biol P， Biotechnol N, et al.,1.GalasDJ, Schmitz A :DNAse footprinting :a simple method for the detection ofprotein-DNA binding specificity. Journal of Computer and System Sciences，2002，65 :73-96)。DNase I足跡實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼致远ㄎ荒繕?biāo)蛋白結(jié)合的DNA 并得到其堿基序列，提供大量的有效信息，但對(duì)蛋白質(zhì)的純度和量要求較高。以上兩種方法均為基于體外的蛋白質(zhì)-DNA研究方法，其局限性是不能充分反映生理情況下DNA與蛋白相互作用的真實(shí)情況，而且很難捕捉到在染色質(zhì)水平上基因表達(dá)調(diào)控的動(dòng)態(tài)瞬時(shí)反應(yīng)。 而ChIP (Chromatin Immunoprecipitation，染色質(zhì)免疫沉淀)是一種直接反映細(xì)胞內(nèi)蛋白和DNA相互作用的重要技術(shù)，在組蛋白修飾以及轉(zhuǎn)錄因子研究中應(yīng)用十分廣泛(Im H， Grass J, Johnson K, et al. , Measurement of protein—DNA interactions in vivo by chromatinimmunoprecipitation. METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY-CLIFT0NTHEN T0T0WA-, 2004，284 :129-146)。該技術(shù)是在活細(xì)胞狀態(tài)下，采用甲醛固定蛋白質(zhì)和DNA的結(jié)合，然后通過超聲波打斷得到理想大小的染色質(zhì)片段后，再與特異性抗體進(jìn)行抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合反應(yīng)，從而獲得與目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA進(jìn)行后續(xù)研究。廣泛使用的ChIP方法還可以通過MNase I的特異性酶切獲得單核小體并通過特異的抗體富集與目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA片段，進(jìn)而分析目標(biāo)蛋白和DNA相互作用關(guān)系。ChIP技術(shù)可以充分反映生理狀態(tài)下DNA與蛋白質(zhì)作用的真實(shí)情況，是目前用于研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用常用的方法。ChIP實(shí)驗(yàn)可以記錄活細(xì)胞狀態(tài)下蛋白質(zhì)和DNA的相互作用，甚至能夠捕捉到發(fā)生在染色體水平上基因表達(dá)調(diào)控的瞬時(shí)事件。免疫沉淀中使用的特異性的抗體能夠精確的富集所研究的靶蛋白-DNA復(fù)合體。ChIP可以與生物芯片技術(shù)以及新一代測序技術(shù)結(jié)合，高通量的篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA在基因組上的分布。在ChIP基礎(chǔ)上發(fā)展起來的ChIP on chip技術(shù)是 ChIP和芯片相結(jié)合的技術(shù)，可高通量的分析活體細(xì)胞中蛋白質(zhì)和基因組DNA之間的相互作用(Kuras L, Characterization of protein-DNAassociation in vivo by chromatin immunoprecipitation. METHODS I匪OLECULAR BIOLOGY-CLIFTON THEN T0T0WA，2004，284 : 147-162)。ChIP on chip的核心流程是染色體DNA進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)富集，緊接著與標(biāo)記好的芯片雜交，從芯片數(shù)據(jù)的分析得到與目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA序列信息。ChIP on chip盡管能獲得高分辨率的基因組圖譜，并可以確定與研究對(duì)象(如組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子)相互作用的 DNA序列信息，但芯片價(jià)值不菲，導(dǎo)致ChIPon chip技術(shù)成本昂貴，除此之外，海量的數(shù)據(jù)分析也是一個(gè)挑戰(zhàn)。 隨著DNA甲基化研究的深入，檢測DNA甲基化的方法也不斷涌現(xiàn)。其中一種常見的方法是基于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶，該方法依賴于特定限制性內(nèi)切酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感，對(duì)甲基化區(qū)域不切割的特性，將DNA切割成大小不一的片度， 進(jìn)一步通過二維電泳或者PCR技術(shù)分析。該技術(shù)包括甲基化敏感的限制性指紋技術(shù) (MethyIation-sensitive restriction fingerprinting，MSRF)(Huang T，Laux D，Hamlin B，et al.，Identification of DNA methylationmarkers for human breast carcinomas using the methylation-sensitive restrictionfingerprinting technique. Cancer research，1997，57 :1030.)、限制性標(biāo)記基因組掃描技術(shù)(Restriction landmark genomic scanning，RLGS) (Costello J，F(xiàn)riihwaIdM, Smiraglia D，et al.，Aberrant CpG-island methylation has non-random andtumour-type-specific patterns. Nature genetics， 2000，24:132-138.)、甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增技術(shù)(Amplification of intermethylated sites，AIMS)(Frigola J，Ribas M，Risques R，et al.，Methylome profiling of cancer cells by amplification ofinter-methylated sites (AIMS). Nucleic Acids Research， 2002,30 :e28)0依賴于限制性酶切的甲基化檢測技術(shù)雖然成本低廉，并可以檢測到全基因組所有的CpG島的甲基化情況，但由于限制性內(nèi)切酶本身的限制，可能會(huì)出現(xiàn)某些位點(diǎn)被遺漏或者不完全消化導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性，除此之外，由于試驗(yàn)方法和儀器設(shè)備的限制，基于酶切的限制性內(nèi)切酶的分析方法不能夠進(jìn)行高通量的樣本分析。另外一種甲基化檢測方法基于亞硫酸氫鹽對(duì)甲基化和非甲基化胞嘧啶的不同作用，在亞硫酸氫鹽的作用下，甲基化修飾的胞嘧啶保持不變，而非甲基化修飾的胞嘧啶將發(fā)生脫氨基作用，轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)。因此，利用亞硫酸氫鹽處理的反轉(zhuǎn)堿基的作用，可以檢測到每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，精確勾畫出某個(gè)基因或全基因組的甲基化全貌。傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化直接測序((Bisulfite sequencing)的方法隨著測序技術(shù)的改進(jìn)，與新一代測序技術(shù)結(jié)合，可快速準(zhǔn)確的得出大量的有效數(shù)據(jù)(Frommer M, McDonald L, MillarD, et al.，A genomic sequencing protocolthat yields a positive display of5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America, 1992,89 :1827)。傳統(tǒng)甲基化檢測方法和芯片技術(shù)的結(jié)合解決了通量問題。這種技術(shù)基于寡核苷酸微陣列雜交，可以在基因組中尋找甲基化位點(diǎn)，包括用于全基因組甲基化水平檢測的差異化雜交(Differential methylation hybridization usingCGI array, DMH) (Huang Τ, Perry M and Laux D, Methylation profiling of CpGislands in human breast cancer cells. Human molecular genetics, 1999,8 :459.),差異化雜交的芯片是CpG島微陣列，是依賴于甲基化敏感性限制性酶切和PCR技術(shù)的雜交法，能夠快速簡捷地富集高甲基化的CpG島。該方法可用于多樣本和多位點(diǎn)的甲基化分析，但由于仍不能解決酶切導(dǎo)致的假陽性問題。以及用于檢測單個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化特異性微陣列 ((Methylation specificoligonucleotide, MS0)(Gitan R, Shi H, Chen C, et al. , Methy lation-specificoligonucleotide microarray -.a new potential for high-throughput methylationanalysis. Genome research, 2002,12 :158)。甲基化特異性微陣列是針對(duì) CpG 二核苷酸位點(diǎn)的寡核苷酸微陣列，芯片的設(shè)計(jì)采用甲基化特異性PCR的原理，按照亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后非甲基化位點(diǎn)和甲基化位點(diǎn)的差異設(shè)計(jì)兩個(gè)寡核苷酸探針，采用亞硫酸氫鹽對(duì)目標(biāo)DNA處理后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并標(biāo)記產(chǎn)物3’端后雜交，根據(jù)雜交后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度判斷目標(biāo)DNA甲基化水平。甲基化特異性微陣列和其他基于芯片的甲基化檢測技術(shù)一樣，在通量方面有極大的提高，但芯片的成本阻礙了其廣泛的應(yīng)用。除上述技術(shù)外，還有基于抗原抗體反應(yīng)的甲基化DNA免疫沉淀技術(shù)(Methylated DNA Immunoprecipitation，MeDIP)和甲基化 DNA 結(jié)合蛋白的(Methylated DNA Binding Domain) WfF(Shiraishi Μ, Sekiguchi A, Oates A, et al. ，Methyl-CpG binding domain column chromatography as a tool forthe analysis of genomic DNA methylation. Analytical biochemistry, 2004, 329 :1)。這兩種方法都是依賴特異性的抗體或者特異性蛋白對(duì)甲基化DNA的富集作用，結(jié)合新一代測序技術(shù)，可以得出全基因組水平上DNA甲基化情況。這兩種方法與因?yàn)闇y序之前對(duì)基因組甲基化區(qū)域進(jìn)行了富集，所以與亞硫酸氫鹽處理直接測序相比，測序成本較低，但只能得到基因組中甲基化情況的概況或者高度甲基化區(qū)域的情況，而不能精確到基因組單個(gè)堿基的甲基化情況。因此亞硫酸氫鹽處理技術(shù)仍然是繪制精細(xì)基因組甲基化圖譜必須的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠同時(shí)用于組蛋白修飾和DNA 甲基化研究的細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法以及由該方法制備得到的細(xì)胞DNA文庫。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法，所述方法包括，對(duì)同一細(xì)胞樣本依次進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀處理及亞硫酸氫鹽處理，并對(duì)處理后產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增得到所述細(xì)胞 DNA文庫。優(yōu)選的，所述方法包括步驟a、在活體細(xì)胞狀態(tài)下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，使DNA與DNA上結(jié)合的蛋白質(zhì)交聯(lián)固定；
b、將交聯(lián)固定后的染色質(zhì)打斷至片段長度為200 500bp ；C、采用染色質(zhì)免疫共沉淀的方法從打斷后的染色質(zhì)中分離得到與目的蛋白質(zhì)相結(jié)合的DNA片段；d、將分離的DNA片段采用亞硫酸氫鹽處理使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?。進(jìn)一步的，所述在步驟c之后及步驟d之前還包括步驟c+1，將分離的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，使其成為平末端，并在DNA片段3’末端加上“A”堿基，使其形成“T-A”粘性末端，然后連接甲基化測序接頭；在步驟d之后還包括步驟d+Ι，使用與甲基化測序接頭相匹配的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到所述細(xì)胞DNA文庫。更進(jìn)一步地，所述步驟a中，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)的活體細(xì)胞起始量為不低于10E6數(shù)量級(jí)，所述交聯(lián)反應(yīng)為甲醛交聯(lián)反應(yīng)，交聯(lián)反應(yīng)所用甲醛的終濃度為0. 8-1. 2 %優(yōu)選1 %，甲醛交聯(lián)時(shí)間為5-20min優(yōu)選IOmin。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟b中，染色體打斷采用非接觸式超聲破碎儀進(jìn)行超聲波打斷，且超聲頻率為200w 320w，打斷條件為超聲25-35秒on/0. 5-3min off,共6-8個(gè)循環(huán)，優(yōu)選30秒on/2min off,共7個(gè)循環(huán)，；所述步驟c中，染色質(zhì)免疫共沉淀方法選用目的蛋白的特異性抗體及免疫磁珠來分離DNA片段，所述步驟c包括，將免疫磁珠與特異性抗體混合制備磁珠-抗體反應(yīng)物，然后將步驟b打斷的染色質(zhì)與磁珠-抗體反應(yīng)物混合進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，之后進(jìn)行反交聯(lián)反應(yīng)，并純化得到與蛋白質(zhì)分離的DNA。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述特異性抗體為H3Mme3，所述免疫磁珠為分別包被有protein A和protein G的protein A磁珠和protein G磁珠。所述抗體H3K4me3 的用量為3 4.5 μ g優(yōu)選4yg，protein A磁珠和protein G磁珠的用量為300 600 μ g 優(yōu)選600 μ g且兩者的用量比為1 1。所述反交聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間為2 1 優(yōu)選池。在本發(fā)明另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述步驟d的亞硫酸氫鹽處理包括使用可溶性亞硫酸氫鹽使胞嘧啶磺酸化，對(duì)苯二酚脫氨基，再在堿性環(huán)境下，使磺基消失，成為尿嘧啶。本發(fā)明還公開了采用上述構(gòu)建方法制備得到的細(xì)胞DNA文庫。由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明的細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法，通過將研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)和精確檢測甲基化位點(diǎn)的亞硫酸氫鹽處理直接測序的技術(shù)相結(jié)合，可以直接有效的檢測出與特定組蛋白修飾相結(jié)合的DNA甲基化狀況，通過對(duì)數(shù)據(jù)的分析從而得出特定組蛋白修飾和與DNA甲基化直接或間接地相互關(guān)系，從而深入研究組蛋白修飾及DNA甲基化在生物體內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)作用，構(gòu)建表觀遺傳調(diào)控圖譜；本發(fā)明的方法通過優(yōu)化，解決了傳統(tǒng)做法的染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)得到的產(chǎn)物量較少、無法用于常規(guī)亞硫酸氫鹽處理的問題，本發(fā)明通過優(yōu)化染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)方法增加其產(chǎn)物量，使其能夠達(dá)到亞硫酸氫鹽處理實(shí)驗(yàn)的最低起始量的要求。


圖1為本發(fā)明染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)結(jié)合亞硫酸氫鹽(Bilsufite)處理的文庫構(gòu)建技術(shù)流程圖。主要的實(shí)驗(yàn)步驟依次為細(xì)胞處理(染色質(zhì)固定)、染色體的片段化、 染色質(zhì)免疫共沉淀、DNA片段末端處理與甲基化修飾接頭連接、亞硫酸氫鹽處理、PCR擴(kuò)增
處理產(chǎn)物等。圖2為本發(fā)明實(shí)施例的樣品打斷效果檢測的電泳圖像。
具體實(shí)施例方式染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)和亞硫酸氫鹽處理技術(shù)已經(jīng)分別成為研究組蛋白修飾和DNA甲基化的經(jīng)典方法。單獨(dú)的使用ChIP技術(shù)或是亞硫酸氫鹽處理技術(shù)只能從一個(gè)方面了解在研究對(duì)象體內(nèi)修飾組蛋白與DNA的結(jié)合區(qū)域或者是這個(gè)研究對(duì)象全基因組 DNA甲基化的狀況，而隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，為了更加透徹的系統(tǒng)的理解細(xì)胞內(nèi)表觀作用網(wǎng)絡(luò)，需要將表觀現(xiàn)象作為一個(gè)整體進(jìn)行研究。因此，為了研究組蛋白修飾和DNA甲基化的相互關(guān)系，我們將研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)和精確檢測甲基化位點(diǎn)的亞硫酸氫鹽處理直接測序的技術(shù)相結(jié)合，可以直接有效的檢測出與特定組蛋白修飾相結(jié)合的DNA甲基化狀況，通過對(duì)數(shù)據(jù)的分析從而得出特定組蛋白修飾和與DNA甲基化直接或間接地相互關(guān)系，從而深入研究組蛋白修飾及DNA甲基化在生物體內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)作用，構(gòu)建表觀遺傳調(diào)控圖譜。但是傳統(tǒng)做法的染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)得到的產(chǎn)物量較少 (很多時(shí)候都不到10ng，對(duì)于某些珍貴的材料來說，由于細(xì)胞樣品的量有限，得到的ChIP產(chǎn)物量更少)，而為了保證測序數(shù)據(jù)質(zhì)量亞硫酸氫鹽處理的起始量必須保證在IOOng以上，因此本發(fā)明為了將此兩種技術(shù)相結(jié)合，通過優(yōu)化染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)方法步驟增加其產(chǎn)物量使其能夠達(dá)到亞硫酸氫鹽處理實(shí)驗(yàn)的最低起始量的要求。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)步驟如圖1所示，詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟依次進(jìn)行說明。一細(xì)胞處理根據(jù)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的要求(Hoffman B and Jones S, Genome-wide identification of DNA-protein interactions usingchromatin immunoprecipitation coupled with flow cell sequencing. Journal of Endocrinology, 2009, 201 :1),首先要在活體細(xì)胞狀態(tài)下將蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)固定，從而達(dá)到捕捉生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)與DNA作用情況的目的。采用甲醛處理細(xì)胞的方法可以使蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)，其原理是在甲醛的作用下，DNA堿基上的氨基或亞氨基和蛋白質(zhì)上的α-氨基及賴氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸的側(cè)鏈氨基與另外的DNA和蛋白質(zhì)上的氨基或亞氨基交聯(lián)在一起形成蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體 (Merk 0 and Speit G,Significance of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks formutagenesis. Environmental and molecular mutagenesis, 1998, 32 :260-268),防止細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組分的重新分布，從而便于進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。甲醛交聯(lián)反應(yīng)是可逆的，便于在后續(xù)步驟中分別對(duì)DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。交聯(lián)反應(yīng)所用甲醛的終濃度為1%，而交聯(lián)時(shí)間需要分析確定。交聯(lián)時(shí)間如果太長，交聯(lián)后的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體難以被超聲破碎儀打斷，并且可能造成抗原表位丟失，影響后續(xù)免疫沉淀結(jié)果；交聯(lián)時(shí)間過短，則蛋白質(zhì)與 DNA無法形成較穩(wěn)定的結(jié)合，容易導(dǎo)致ChIP反應(yīng)沉淀下來的DNA量不足以構(gòu)建文庫，造成假陰性。本發(fā)明優(yōu)化的甲酸交聯(lián)時(shí)間為IOmin(Kim A,Kiefer CM andDean A,Distinctive signatures of histone methylation in transcribed coding andnoncoding humanbeta-globin sequences. Mol Cell Biol，2007，27 :1271-1279)。二染色體片段化根據(jù)免疫共沉淀與高通量測序的要求，需要將交聯(lián)固定后的染色體打斷到合適的片段長度以便于后續(xù)文庫構(gòu)建與測序。本發(fā)明采用超聲方法打斷染色體，超聲打斷過程中會(huì)產(chǎn)生大量的熱引起樣品溶液溫度升高，容易造成蛋白質(zhì)變性不利于后續(xù)的免疫共沉淀操作。因此為了保證蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)，整個(gè)超聲打斷過程樣品均需處于冰浴狀態(tài)，且采用間斷超聲的方式，即超聲打斷與停止冷卻反復(fù)進(jìn)行。超聲打斷的時(shí)間需要根據(jù)不同超聲破碎儀的參數(shù)與研究目的來確定，打斷時(shí)間太短會(huì)造成DNA片段太大，使得與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)抗原表位難以暴露，不利于抗體識(shí)別且不符合測序文庫要求；而打斷時(shí)間太長則會(huì)導(dǎo)致 DNA片段偏小，與蛋白質(zhì)的結(jié)合過于松散不利于免疫沉淀反應(yīng)。除此之外，超聲時(shí)間過長還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性失活，無法與采用的抗體結(jié)合，導(dǎo)致DNA無法被沉淀下來。本發(fā)明使用Bioruptor超聲破碎儀，功率輸出設(shè)置為“H”，打斷條件設(shè)定為30s on/2min off，共7個(gè)循環(huán)。細(xì)胞打斷后不進(jìn)行離心(以避免染色體損失)，直接用dilution buffer稀釋，以得到更過的IP產(chǎn)物。三染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)免疫共沉淀是通過抗原抗體的特異性結(jié)合富集與目的蛋白質(zhì)相結(jié)合的DNA片段。 染色質(zhì)DNA片段后，根據(jù)研究選擇合適的組蛋白抗體，并根據(jù)抗體對(duì)ftOtein A與ftOtein G的親和力選擇合適的磁珠與用量比例。除了選擇合適的磁珠外，ChIP反應(yīng)體系中抗體的量也是至關(guān)重要的。ChIP反應(yīng)體系中抗體的量需要提前確定。若體系中抗體不足會(huì)造成 DNA不能完全沉淀，從而導(dǎo)致結(jié)果的假陰性或者DNA量達(dá)不到建庫要求；反之，若體系中抗體量過大，則過量的抗體會(huì)與部分非目標(biāo)蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。本發(fā)明進(jìn)行以下改進(jìn)單個(gè)ChIP反應(yīng)體系采用4 μ g鼠來源的H;3Mme3 (abl012)抗體，磁珠采用protein A與protein G各20 μ 1 (包被好的磁珠的濃度30ug/ul)進(jìn)行混合。在做 ChIP實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要做好實(shí)驗(yàn)對(duì)照，因?yàn)闆]有對(duì)照，很難對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性進(jìn)行評(píng)估。陽性抗體和陰性抗體對(duì)照是最基本的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。陽性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體，陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG。通過陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的設(shè)置可以檢測ChIP實(shí)驗(yàn)的效果，從而保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程的有效性。另外，還應(yīng)考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結(jié)合的可能，所以通常還會(huì)選擇一對(duì)陰性引物，即目的蛋白肯定不會(huì)結(jié)合的DNA序列，作為該抗體的陰性對(duì)照。除了設(shè)置陽性和陰性對(duì)照外，在進(jìn)行免疫沉淀前，需要取一部分?jǐn)嗔押蟮娜旧|(zhì)做Input對(duì)照。Input是斷裂后的基因組DNA， 需要與沉淀后的樣品DNA —起經(jīng)過逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及最后的PCR或其他方法檢測。 Input對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)hput中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，檢測ChIP反應(yīng)的富集效率。本發(fā)明取1/50的染色體打斷后樣品作為Input對(duì)照，與ChIP反應(yīng)樣品一起進(jìn)行反交聯(lián)處理，純化DNA片段，將純化后的 Input與ChIP樣品稀釋成相同濃度，取相同的量作為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測，通過比較 ChIP樣品和Input的Ct值可以計(jì)算出ChIP反應(yīng)的富集效率(Schemittgen TD,Livak KJ, Analyzing real-time PCR data by thecomparative Ct method,Nature protocol,2008, 13 :1101-1108.)，計(jì)算方法為富集效率=2" (Ct_Input_Ct_Sample)。四ChIPed DNA片段末端處理與甲基化接頭連接
由于ChIP沉淀下來的DNA片段是通過超聲的方法打斷的，需要對(duì)DNA末端進(jìn)行修復(fù)，使其成為平末端。末端修復(fù)的目的是將雙鏈DNA片段損傷的5’端進(jìn)行磷酸化，損傷的 3’端進(jìn)行羥基化。末端修復(fù)完成后，通過向DNA片段3’末端加上一個(gè)“A”堿基，使其形成 “T-A”的粘性末端以便進(jìn)行接頭連接。根據(jù)PCR擴(kuò)增和測序的要求需要對(duì)DNA片段加上合適的接頭。一般情況下ChIP文庫只需要連接常規(guī)的測序接頭，但在本發(fā)明中要對(duì)得到的 DNA片段進(jìn)行亞硫酸氫鹽翻轉(zhuǎn)處理，以研究DNA的甲基化情況，因此測序接頭的所有胞嘧啶位點(diǎn)必須都經(jīng)過甲基化修飾以防止亞硫酸氫鹽處理后無法進(jìn)行PCR擴(kuò)增與文庫構(gòu)建。即連接的甲基化接頭可以保證DNA片段經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后接頭序列不變，但仍可與測序引物匹配，從而使染色質(zhì)免疫共沉淀與亞硫酸氫鹽處理有效的結(jié)合。五亞硫酸氫鹽翻轉(zhuǎn)處理亞硫酸氫鹽翻轉(zhuǎn)是采用亞硫酸氫鹽對(duì)單鏈DNA分子進(jìn)行化學(xué)修飾，導(dǎo)致未甲基化胞嘧啶(C)可被亞硫酸氫鹽脫去氨基而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)，而5mC不能被修飾，仍保持為 5mC，在PCR反應(yīng)過程中，尿嘧啶與腺嘌呤(A)配對(duì)，尿嘧啶則被胸腺嘧啶(T)取代。這一化學(xué)反應(yīng)過禾呈首先由 Frommer 等A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosineresidues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A 89(1992) 1827-31)報(bào)導(dǎo)。具體過程為第一步，亞硫酸氫鈉使胞嘧啶磺酸化；第二步，對(duì)苯二酚脫氨基；第三步，在堿性環(huán)境下，磺基消失，成為尿嘧啶。例如，該實(shí)驗(yàn)可由EZ DNA甲基化試劑盒-Gold(ZYM0 D5006)進(jìn)行實(shí)施。六PCR擴(kuò)增在DNA經(jīng)過亞硫酸氫鹽翻轉(zhuǎn)之后，PCR的目的是將單鏈的DNA片段變成雙鏈，同時(shí)擴(kuò)增DNA的量。PCR擴(kuò)增所用引物和亞硫酸氫鹽處理之后的接頭的序列相匹配。PCR擴(kuò)增之后通過凝膠電泳回收的方式回收合適大小的DNA片段用于測序。膠回收采用Qiagen公司的QIAquick凝膠回收試劑盒。通過對(duì)上述步驟的終產(chǎn)物各項(xiàng)數(shù)據(jù)的進(jìn)行分析后，可以直接有效的檢測出與特定組蛋白修飾相結(jié)合的DNA甲基化狀況，從而得出特定組蛋白修飾和與DNA甲基化直接或間接地相互關(guān)系，有助于闡明蛋白質(zhì)與DNA甲基化之間相互作用的機(jī)制以及基因表達(dá)抑制的調(diào)控關(guān)系。從而深入研究組蛋白修飾及DNA甲基化在生物體內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)作用，構(gòu)建表觀遺傳調(diào)控圖譜。下面通過具體實(shí)施方式
結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例一材料和方法實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。培養(yǎng)健康人外周血細(xì)胞，命名為YH細(xì)胞。YH細(xì)胞培養(yǎng)使用 RPMI1640 (C22400500BT, Invitrogen)培養(yǎng)基(含 10% FBS (IO437OlO, Invitrogen))，YH 細(xì)胞屬于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)瓶選用T-75。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)基顏色變化進(jìn)行傳代，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變?yōu)槠S時(shí)進(jìn)行傳代。按照?qǐng)D1的流程進(jìn)行細(xì)胞處理、 文庫構(gòu)建與相應(yīng)的測序，詳細(xì)操作步驟如下1.細(xì)胞處理與交聯(lián)反應(yīng)
用pH7. 4的PBS緩沖液(10010-031，Invitrogen)新鮮配制濃度為的甲醛溶液，37°C水浴鍋預(yù)熱待用。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，并旋緊培養(yǎng)瓶蓋。在生物安全柜中進(jìn)行以下操作用巴斯德吸管將培養(yǎng)瓶壁上的細(xì)胞吹勻，直接補(bǔ)充等體積的培養(yǎng)基進(jìn)行傳代，后置于37°C，5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)收集細(xì)胞的時(shí)候，直接吹勻，并將細(xì)胞搜集到新的50ml離心管中，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過優(yōu)化后可以采用10E6 數(shù)量級(jí)細(xì)胞量起始，富集產(chǎn)物的量即能滿足進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理所需量。將收集的細(xì)胞在 4°C下850g離心5min，棄除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入預(yù)熱的新鮮配制的甲醛溶液25ml，吹勻細(xì)胞，37°C細(xì)胞水浴鍋孵育10分鐘；立即在4°C下850g離心5min，棄除甲醛溶液，分別用預(yù)冷的 IOml PBS-BSA (用 PBS 配制，BSA 濃度為 5mg/ml。BSA 貨號(hào)為 0332_100g，AMRESC0)緩沖液及預(yù)冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞各一次；加入2ml冰預(yù)冷的PBS完全液(PBS-PIC，PIC即 protease inhibitor cocktail，Roche)，將細(xì)胞收集到2ml離心管中。850g離心1分鐘；移除上清，輕彈管壁使收集的細(xì)胞重懸于殘余的PBS中(可以在此步驟將處理好的細(xì)胞_80°C 凍存)。2.抗體準(zhǔn)備根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)所用抗體Histone H3(tri methyl K4)antibody [mAbcaml012] (abl012，Abeam)，選擇 DynalBeads protein A(100. OlDInvitrogen)禾口 DynalBeads protein G(100. 03D, Invitrogen)(包被好的磁珠的濃度30ug/ul)，各取20 μ 1到新的 1. 5ml離心管中；加入500 μ 1冰預(yù)冷的PBS+BSA混合液，輕彈管壁，使磁珠重懸，并顛倒混勻；將離心管置于磁力架上2min，待磁珠吸附到磁力架上、上清變得澄清后，在磁力架上移除上清液。按上述步驟處理磁珠兩次，最后重懸磁珠于500 μ 1冰預(yù)冷的PBS+BSA混合液， 并加入 4yg Histone H3(tri methyl K4) [H3K4me3]抗體(ab8580，Abeam)，4°C垂直混合器上孵育反應(yīng)5h。3.樣品打斷通過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，選擇Bioruptor超聲破碎儀作為染色質(zhì)打斷的儀器，與其他超聲儀相比，Bioruptor超聲破碎儀的穩(wěn)定性好，由于利用水波振蕩進(jìn)行打斷，因此條件相對(duì)溫和，更加利于ChIP實(shí)驗(yàn)，并且與探頭式超聲儀相比，Bioruptor打斷在封閉的離心管中進(jìn)行，可以避免由于探頭浸入樣品中造成污染。提前半小時(shí)將向Bioruptor超聲破碎儀操作室中加入超純水，將冷循環(huán)儀打開， 使其降溫。新鮮制備 lysis buffer 完全液(1% SDS，IOmM EDTA, pH8. 150mM Tris-HCl, 1XPIC)，向步驟1中處理好的細(xì)胞中加入200μ1 lysis buffer完全液，輕彈管壁，使細(xì)胞重懸，冰置10-15min使細(xì)胞裂解；然后將其安裝到Bioruptor超聲破碎儀的適配器上 (Bioruptor UCD-200)。使用Biorupter超聲破碎儀打斷將功率輸出設(shè)置為“H” (該檔位功率為320w)，在控制旋鈕上將“On”時(shí)間設(shè)置為30s，“Off”時(shí)間設(shè)置為2min，共7個(gè)循環(huán)。此打斷條件可以使打斷的片段分布于200-500bp之間，取出1/50的量作為input，常規(guī) ChIP實(shí)驗(yàn)一般是取用1/10的打斷樣品作為hput，用Input來檢測打斷的效果，本實(shí)驗(yàn)由于起始細(xì)胞量少，所以只取出很少量的細(xì)胞作為hput，而用ChIP反應(yīng)后的上清DNA用于檢測打斷效果，用 Dilution buffer (1 % triton, 2mMEDTA, 150mM NaCl,pH8. 120mM Tris-HCl) 將打斷后產(chǎn)物稀釋6-9倍，置于冰上備用。4.免疫共沉淀反應(yīng)
取出Dynal beads與抗體反應(yīng)物，置于磁力架上2分鐘，棄除上清液；加入500ul 冰預(yù)冷的PBS-BSA混合液，輕彈管壁重懸磁珠，并顛倒混勻；置于磁力架上anin ；在磁力架上移除上清液，重復(fù)處理一次，此處理的目的在于除去未與磁珠結(jié)合的抗體；將步驟3中處理好的樣品轉(zhuǎn)移加入磁珠中；4°C旋轉(zhuǎn)混合IP反應(yīng)過夜。5.樣品反交聯(lián)取出染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)過夜的樣品，置于磁力架上2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移；力口入 500 μ 1 RIPA buffer(50mM HEPES(H4034-25G，Sigma)，ImMEDTA(EB0185_500g，BBI)， 0.7 % Na Deoxycholate (D6750-100G，Sigma)，1 % NP-40(NDB0385-100ml, BBI),0.5M LiCl (LDB0307-250g, BBI))，輕彈管壁重懸磁珠，并顛倒混勻；置于磁力架上2min，棄除上清液；再加入500 μ 1 RIPAbuffer,輕彈管壁重懸磁珠，并在4°C旋轉(zhuǎn)混合20min ；置于磁力架上2min，棄除上清液；重復(fù)步驟兩次；加入500 μ 1 TE (ΑΜ9858，Ambion)，輕彈管壁重懸磁珠，并顛倒混勻；置于磁力架上2min，棄除上清液；再加入500 μ 1 TE (pH 8. 0)，輕彈管壁輕彈管壁重懸磁珠，并在4°C旋轉(zhuǎn)混合20min ；置于磁力架上aiiin，將上清液棄除干凈；將磁珠重懸于200 μ 1的反交聯(lián)buffer (1% SDS, 0. IM NaHCO3)中，將ChIP反應(yīng)后上清，ChIP樣品與^iput同時(shí)65°C反交聯(lián)，反交聯(lián)時(shí)間由過夜縮短為3h，使整個(gè)建庫流程縮短1天，上清 DNA用于電泳檢測打斷的效果，結(jié)果如圖2顯示，本實(shí)驗(yàn)打斷的主帶位于250-500bp之間。6.純化ChIP產(chǎn)物將反交聯(lián)樣品置于磁力架上aiiin，取出樣品，并用200 μ 1的純水洗磁珠，轉(zhuǎn)移出洗液與樣品混合。加入等體積的酚氯仿異戊醇05 24 1)抽提，HOOOrpm離心IOmin ；離心后吸取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇，1/10體積的3Μ NaAc, 1 μ 1的 20ug/ul的糖原，_80°C超低溫冰箱放置20min，然后HOOOrpm離心lOmin，棄上清液；70% 乙醇清洗沉淀一次，HOOOrpm離心5min ；棄除上清，晾干沉淀，溶于25 μ 1 EB溶液中。抽取 Ιμ 樣品采用Qubit (Quant-it dsDNA HS Assary Kit)檢測樣品濃度，本實(shí)驗(yàn)ChIP產(chǎn)物總量為83ng。7.末端修復(fù)預(yù)先從_20°C 保存的凍存盒中取出 lOXPolynucleotide Kinasebuffer (B904, Enzymatics)和IOmM dNTPs mix(N201L，Enzymatics)，將其置于冰上融解并充分混勻 10 XPolynucleotide Kinase buffer。取出 KlenowFragment (P706L, Enzymatics),用一新的PCR管取1 μ 1 Klenow Fragmen并按1 10稀釋成濃度為IU/ μ 1的工作液。在1. 5ml 的離心管中配制末端修復(fù)反應(yīng)體系ChIP樣品DNA 20 μ 1 ； 10 XPolynucleotide Kinase BufferlOy 1 ； IOmM dNTPs mix 2μ 1 ； T4DNA Polymerase (P708L, Enzymatics) 1 μ 1 ；## 10 倍白勺 Klenow Fragmen 1 μ 1 ；Τ4 Polynucleotide Kinase(Y904L, Enzymatics)1 μ 1 ；辛卜水至總體系100 μ 1。將離心管在Iliermomixer中20°C溫浴30min后，用酚氯仿異戊醇 (25 4 1)抽提一次，并用乙醇沉淀DNA，最后溶于34 μ 1 EB中。8.末端加A預(yù)先從-20°C保存的凍存盒中取出IOXblue buffer (B011, Enzymatics)和 ImM dATP，將其置于冰盒上溶解并充分混勻。在1. 5mL的離心管中配制加“Α”反應(yīng)體系末端修復(fù)的樣品 32 μ 1，IOXblue buffer (Β011，Enzymatics) 5 μ 1，dATP (28406501, Sigma) 10 μ 1 禾口 3μ 1 Klenow (3 ‘ -5，exo_) (P701-LC-L，Enzymatics),反應(yīng)體系總體積為 50 μ 1。在Thermomixer中在37°C溫浴30min，用氯仿異戊醇抽提，乙醇沉淀，最后DNA溶于45 μ 1的 EB中。9.連接甲基化接頭預(yù)先從-20°C 保存的凍存盒中取出 2XRapid ligation buffer (ΒΙΟΙ, Enzymatics)禾口 PE Methylated Adapter (illumina methylated adapterME-100-0010, 其置于冰上融解并充分混勻2XRapid Iigationbuffer0取出PE Adapter用一新的PCR 管取IyL Adapter oligo mix按1 10稀釋成工作液。在1. 5mL離心管中配置如下反應(yīng)體系加 A 后的樣品 45 μ L ;2 X Rapid ligation buffer 50 μ 1;稀釋 10 倍 PE Methylated Adapter 1 μ 1 ；H20 2μ L ； T4DNA Ligase (L603-HC-L, Enzymatics) 4 μ 1 ；總體積 100 μ 1。在在Thermomixer中在20°C溫浴15min，用氯仿異戊醇抽提，乙醇沉淀，最后DNA溶于45 μ 1 的超純水中。10.亞硫酸氫鹽處理本實(shí)驗(yàn)使用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，實(shí)驗(yàn)步驟如下1)在PCR管中添加 130 μ 1 的CT Conversion Reagent 到每20 μ IDNA樣品中.如果DNA樣品的體積小于20 μ 1，則用水來彌補(bǔ)差量.通過輕彈試管或移液器操作來混合樣
P
ΡΠ O2)將樣品管放到循環(huán)變溫器并按以下步驟操作98°C放置10分鐘，64°C放置2. 5 小時(shí)，立刻進(jìn)行下述操作或者在4°C下存儲(chǔ)(最多20小時(shí)).3)添加 600 μ 1 的 M-Binding Buffer 到 Zymo-Spin Column 中，并將柱放如試劑盒所提供的Collection Tube中.4)裝填樣品(從步驟2)到Zymo-Spin Column含有M-Binding Buffer.蓋上蓋將柱顛倒數(shù)次來混合樣品。5)全速(> 10，OOOxg)離心30秒.去除流出液。6)添加200 μ 1的M-Wash Buffer到柱中.全速離心30秒。7)添加 200 μ 1 的 M-Desulphonation Buffer 到柱中并且在室溫(20°C _30°C下放置15-20分鐘.在培養(yǎng)后，全速離心30秒。8)添加200 μ IM-Wash Buffer到柱中·全速離心30秒·再添加200 μ 1的M-Wash Buffer并且離心30秒·。9)直接添加20 μ 1的M-Elution Buffer到柱基質(zhì)中.將柱放置在1. 5ml的管中.全速離心來洗脫DNA。11. PCR從-20°C 保存的凍存盒中取出 PCR PE Primer 1. 1 禾口 PCR PE Primer 2. 1(Paired-End DNA Sample Pr印 Kit，PE-102-1001)，MgSO4(C11708-021，Invitrogen)， IOmM dNTP mix, IOXPfx amplication buffer (Cl 1708-021, Invitrogen)將其置于冰上化凍并充分混勻。在0. 2mL的PCR管中配制PCR反應(yīng)體系樣品20μ 1 ； 10 X Pfx amplication buffer 5 μ 1 ；platinum PfxDNA Polymerase(C11708-021, Invitrogen)0. 5 μ 1 ；primer 1. l(10pmol/y 1)5μ 1 ；primer 2. 1 (lOpmol/μ 1) 5 μ 1 ；補(bǔ)水至總體積 50ul。配置完成后，首先在熱循環(huán)儀中94°C下反應(yīng)2min，然后進(jìn)行18個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性15sec，62°C退火30sec，72°C延伸30sec，最后在72°C保持5min。反應(yīng)結(jié)束及時(shí)將樣品取出放入4°C冰箱保存并按要求退出或關(guān)閉儀器。通過瓊脂糖凝膠電泳，選取合適大小的PCR 產(chǎn)物膠回收純化，用于Illumina公司HiSeq2000測序儀測序。本實(shí)驗(yàn)中選取插入片段約為 150bp的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收與文庫構(gòu)建。二結(jié)果1、Sanger法測序庫檢對(duì)用本次發(fā)明的測序庫樣本制備技術(shù)所制備的測序庫進(jìn)行克隆處理并使用 Sanger法進(jìn)行小范圍的測序檢測。文庫檢測結(jié)果中有91 %的reads能比對(duì)回基因組區(qū)，且其甲基化化率為45% ；而99%的轉(zhuǎn)化率說明亞硫酸氫鹽(磺酸化)處理的效果(表1)非常顯著。因此，通過抗體富集與亞硫酸氫鹽處理可得到有效的序列信息。文庫檢測合格并構(gòu)建Illumina公司Hiseq高通量測序的I^aired End DNA文庫與進(jìn)行相應(yīng)的測序。表2 1細(xì)胞H3Mme3抗體ChIP文庫Sanger法測序結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法，所述方法包括，對(duì)同一細(xì)胞樣本依次進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀處理及亞硫酸氫鹽處理，并對(duì)處理后產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增得到所述細(xì)胞DNA文庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于所述方法包括步驟a、在活體細(xì)胞狀態(tài)下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，使DNA與DNA上結(jié)合的蛋白質(zhì)交聯(lián)固定；b、將交聯(lián)固定后的染色質(zhì)打斷至片段長度為200 500bp；c、采用染色質(zhì)免疫共沉淀的方法從打斷后的染色質(zhì)中分離得到與目的蛋白質(zhì)相結(jié)合的DNA片段；d、將分離的DNA片段采用亞硫酸氫鹽處理使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぁ?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于所述在步驟c之后及步驟d之前還包括步驟c+1，將分離的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，使其成為平末端，并在DNA片段3’末端加上“A”堿基，使其形成“T-A”粘性末端，然后連接甲基化測序接頭；在步驟d之后還包括步驟d+Ι，使用與甲基化測序接頭相匹配的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到所述細(xì)胞DNA文庫。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟a中，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)的活體細(xì)胞起始量為不低于10E6數(shù)量級(jí)，所述交聯(lián)反應(yīng)為甲醛交聯(lián)反應(yīng)，交聯(lián)反應(yīng)所用甲醛的終濃度為0. 8-1. 2%優(yōu)選1%，甲醛交聯(lián)時(shí)間為5-20min優(yōu)選lOmin。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟b中，染色體打斷采用非接觸式超聲破碎儀進(jìn)行超聲波打斷，且超聲頻率為200w 320w，打斷條件為超聲 25-；35 秒 on/0. 5_3min off,共 6-8 個(gè)循環(huán)，優(yōu)選 30 秒 on/2min off,共 7 個(gè)循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟c中，染色質(zhì)免疫共沉淀方法選用目的蛋白的特異性抗體及免疫磁珠來分離DNA片段，所述步驟c包括，將免疫磁珠與特異性抗體混合制備磁珠-抗體反應(yīng)物，然后將步驟 b打斷的染色質(zhì)與磁珠-抗體反應(yīng)物混合進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，之后進(jìn)行反交聯(lián)反應(yīng)，并純化得到與蛋白質(zhì)分離的DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于所述特異性抗體為 H;3K4me3，所述免疫磁珠為分別包被有protein A和protein G的protein A磁珠和protein G磁珠，所述抗體H3Mme3的用量為3 4. 5 μ g優(yōu)選4 μ g，protein A磁珠和protein G磁珠的用量為300 600 μ g優(yōu)選600 μ g且兩者的用量比為1 1。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于所述反交聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間為2 IMi優(yōu)選池。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟d的亞硫酸氫鹽處理包括使用可溶性亞硫酸氫鹽使胞嘧啶磺酸化，對(duì)苯二酚脫氨基，再在堿性環(huán)境下，使磺基消失，成為尿嘧啶。
10.采用權(quán)利要求1 9任意一項(xiàng)所述的細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法制備得到的細(xì)胞DNA 文庫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細(xì)胞DNA文庫構(gòu)建方法，包括對(duì)同一細(xì)胞樣本依次進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀處理及亞硫酸氫鹽處理，并對(duì)處理后產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增得到所述細(xì)胞DNA文庫。本發(fā)明的方法，可以直接有效的檢測出與特定組蛋白修飾相結(jié)合的DNA甲基化狀況，從而深入研究組蛋白修飾及DNA甲基化在生物體內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)作用，構(gòu)建表觀遺傳調(diào)控圖譜。
文檔編號(hào)C40B50/06GK102534812SQ201010619688
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者卓著, 葉明芝, 張秀清, 楊煥明, 郜趙偉, 韓旭 申請(qǐng)人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司