專利名稱：全基因組mRNA3′末端基因文庫(kù)的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因文庫(kù)的構(gòu)建方法，尤其涉及一種適用于高通量測(cè)序的全基因組mRNA 3'末端文庫(kù)的制備方法。
背景技術(shù)：
3’非翻譯區(qū)(簡(jiǎn)稱3’UTR)是信使RNA(mRNA)的一個(gè)特殊部分，位于基因編碼區(qū)的 3’末端。3’UTR是mRNA功能的重要調(diào)控元件，具有如下調(diào)控序列多聚腺苷酸化位點(diǎn)，通常為AAUAAA ；蛋白結(jié)合位點(diǎn)和miRNA靶標(biāo)位點(diǎn)等。3’ UTR不僅可以控制mRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性和降解速率、調(diào)節(jié)mRNA亞細(xì)胞定位和翻譯水平，還能決定其所表達(dá)的細(xì)胞種類、控制mRNA 的利用效率、協(xié)助辨認(rèn)特殊密碼子。3’UTR的突變可以影響一或多個(gè)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。人類基因往往有多個(gè)多聚腺苷酸化位點(diǎn)，在不同位點(diǎn)發(fā)生多聚腺苷酸化從而產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的3’ UTR是人類基因轉(zhuǎn)錄中的普遍現(xiàn)象，也被認(rèn)為是可選擇性剪切的類型之一-串聯(lián)3，UTRs (tandem 3，UTRs)。3，UTR長(zhǎng)度受到精確的調(diào)控，一個(gè)基因3，UTR長(zhǎng)度的改變會(huì)引起多個(gè)基因的表達(dá)改變，會(huì)對(duì)細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及生理功能造成重大影響。對(duì)酵母、 果蠅及人類基因組的3’UTR多態(tài)性長(zhǎng)度已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，如Sandberg等通過基因芯片技術(shù)對(duì)mRNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，增殖的CD4+淋巴細(xì)胞中存在較多的具有短的3’ UTR的轉(zhuǎn)錄本，強(qiáng)迫表達(dá)全長(zhǎng)的3’UTR會(huì)造成蛋白表達(dá)量的減少。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，具有短的3’UTR 的轉(zhuǎn)錄本的大量存在可能是由于較短的3’ UTR含有比較少的microRNA結(jié)合位點(diǎn)而減弱了 microRNA的調(diào)控作用造成，暗示了我們3’ UTR長(zhǎng)度多態(tài)性可能參與調(diào)控了細(xì)胞的增殖?；蛐酒按笠?guī)模測(cè)序技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于全基因組3’ UTR長(zhǎng)度多態(tài)性研究。但是，基因芯片受到技術(shù)本身的限制，對(duì)研究3’UTR長(zhǎng)度多態(tài)性有一些不利因素1)基因芯片技術(shù)過于依賴于現(xiàn)有的基因組信息，無法發(fā)現(xiàn)新的多聚腺苷酸化位點(diǎn)、3’UTR區(qū)域序列的突變；2)由于基因芯片熒光信號(hào)采集的需要，如需要較多的RNA樣本，不利于較難獲得的樣本的研究；3)基因芯片的雜交信號(hào)易被背景干擾、檢測(cè)基因表達(dá)量有上限和下限，限制了其敏感度，因此使用基因芯片進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差。大規(guī)模測(cè)序技術(shù)也被廣泛應(yīng)用在轉(zhuǎn)錄組研究中，但對(duì)于UTR區(qū)域的研究來說，依然存在一定缺陷。首先，RNA-seq獲得的序列包括了整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的信息，而UTR區(qū)域只是其中一部分，故利用RNA-seq直接對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序無法獲得足夠的3’UTR的序列信息。其次，在常用的RNA-seq方案中，由于測(cè)序技術(shù)讀長(zhǎng)的限制，所獲得均為打斷后的轉(zhuǎn)錄本序列，在后期的數(shù)據(jù)處理中，需要對(duì)其進(jìn)行拼接后估計(jì)基因的表達(dá)變化，存在一定局限性。鑒于此，利用大規(guī)模測(cè)序技術(shù)的檢測(cè)全基因組的3’ UTR區(qū)域是非常必要的。最簡(jiǎn)單方法是利用mRNA的polyA尾進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后直接進(jìn)行測(cè)序，獲得mRNA3’最末端的序列。 但由于大規(guī)模測(cè)序技術(shù)原理本身的限制，這種直接測(cè)序的方法較難實(shí)現(xiàn)。如大規(guī)模測(cè)序技術(shù)的代表之一 454的GS FLX系統(tǒng)采用的是焦磷酸測(cè)序技術(shù)，是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號(hào)，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。但是如果遇到連續(xù)的幾個(gè)甚至十幾個(gè)堿基，可見光信號(hào)會(huì)過強(qiáng)，無法分辨摻入的核苷酸數(shù)目，甚至影響其他臨近孔內(nèi)的可見光信號(hào)的檢測(cè)，造成測(cè)序失敗。同樣是大規(guī)模測(cè)序技術(shù)，Illumina的Genome Analyzer 系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測(cè)序(Sequencing By Synthesis)的原理。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。這些核苷酸是“可逆終止子”，因?yàn)?’羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個(gè)循環(huán)摻入單個(gè)堿基。此時(shí)，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3'端粘性， 繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板DNA片段的序列。與454的GS FLX類似，如果遇到連續(xù)的幾個(gè)甚至十幾個(gè)堿基，相同位置過強(qiáng)的熒光信號(hào)，也會(huì)影響測(cè)序的過程和結(jié)果
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用組織或細(xì)胞總RNA構(gòu)建全基因組mRNA 3’末端的基因文庫(kù)的方法，以進(jìn)行高通量的深度測(cè)序，獲得全基因組mRNA 3'末端的真實(shí)數(shù)據(jù)。本發(fā)明一種全基因組mRNA 3’末端基因文庫(kù)的構(gòu)建方法，包括以下步驟(a)將基因組的核酸采用DNase消化；(b)將消化后的總RNA高溫94_95°C加熱，隨機(jī)片段化至約 200-500bp的片段；(c)利用模板轉(zhuǎn)換技術(shù)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第一鏈，所述的cDNA 第一鏈的兩端連有高通量測(cè)序引物；(d)利用在cDNA第一鏈兩端接上的測(cè)序引物通過高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(e) PCR產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，選擇200_300bp 或300-500bp的大小進(jìn)行回收，得到目的片段。本發(fā)明全基因組mRNA 3'末端文庫(kù)的制備方法制得的文庫(kù)數(shù)據(jù)產(chǎn)出量大，樣品準(zhǔn)備步驟簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，便于后期生物信息學(xué)分析，易于大規(guī)模應(yīng)用。本發(fā)明步驟(C)中，利用模板轉(zhuǎn)換技術(shù)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用的反轉(zhuǎn)錄酶 SuperScriptII能在合成的cDNA —鏈的末端加上3_6個(gè)胞嘧啶(C)，再加入一端接有3個(gè)鳥嘌呤(GGG)的Solexa或454測(cè)序引物，鳥嘌呤序列(GGG)錨定到cDNA —鏈的胞嘧啶序列(CCC)，再在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下通過堿基互補(bǔ)原理在cDNA —鏈上的(CCC)的另一端合成與其互補(bǔ)配對(duì)的測(cè)序引物。作為本發(fā)明全基因組mRNA 3’末端基因文庫(kù)的構(gòu)建方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述構(gòu)建方法還包括以下步驟(f)對(duì)(e)步驟得到的目的片段進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)可以為將文庫(kù)與載體連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選50個(gè)陽性克隆提取質(zhì)粒測(cè)序，看其兩端是否帶有高通量測(cè)序的接頭序列。將測(cè)出的序列在基因組中進(jìn)行檢索，統(tǒng)計(jì)測(cè)出序列為已知3’ UTR的比例大于60%。測(cè)出序列為過長(zhǎng)的ployA的比例小于5%。作為本發(fā)明全基因組mRNA 3’末端基因文庫(kù)的構(gòu)建方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟 (c)中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄弓丨物為 gccttgccag cccgctcagt tttttttttt tttttttttv η, 或 gccttgccag cccgctcagt tttttctttt ttcttttttv η,或 gcctccctcg cgccatcagg g, 或 gcctccctcg cgccatcaga gg, 或 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttttttt tttttttttt ttvn, 或 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctcttccgatcttt tttctttttt cttttttvn, caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctgcctcc ctcgcgccat cagaggo作為本發(fā)明全基因組mRNA 3’末端基因文庫(kù)的構(gòu)建方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟 (c)反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系中含有山梨醇、GCbuffer和海藻糖。所用的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序能高效地使引物錨定到RNA3’ UTR的末端上，反應(yīng)體系中的山梨醇增加了反應(yīng)體系的粘稠度， 山梨醇和GCbuffer的使用可以增加反應(yīng)的特異性，海藻糖保持了反轉(zhuǎn)錄酶的活性。
作為本發(fā)明全基因組mRNA 3’末端基因文庫(kù)的構(gòu)建方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟 (c)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的3’弓丨物在20個(gè)A中每隔6個(gè)A插入1個(gè)C。這樣能夠避免高通量測(cè)序無法讀出多個(gè)連續(xù)的A。本發(fā)明配對(duì)雙末端文庫(kù)構(gòu)建方法，包括以下步驟(a)將經(jīng)過DNase消化基因組的總RNA高溫隨機(jī)片段化至具有預(yù)期尺寸的片段；(b)利用模板轉(zhuǎn)換技術(shù)(Template Switching Technology)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第一鏈，此時(shí)在第一鏈的兩端連上高通量測(cè)序引物；(c)利用在cDNA第一鏈兩端接上的測(cè)序引物通過高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；(d)PCR產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離，選擇200-300bp (用于454測(cè)序)或300-500bp (用于Solexa測(cè)序)的大小進(jìn)行回收，得到目的片段；(e)利用上述建設(shè)的mRNA3’末端文庫(kù)經(jīng)過質(zhì)量控制后，可進(jìn)行高通量基因組測(cè)序。本發(fā)明的mRNA 3’末端高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法，包括以下步驟⑴提取組織或細(xì)胞中的總RNA; (ii)按權(quán)利要求1的方法構(gòu)建所述mRNA 3’末端高通量測(cè)序文庫(kù)；以及 (iii)對(duì)mRNA 3’文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序。通過對(duì)全基因組mRNA 3'末端區(qū)域的測(cè)序，能夠研究3' UTR對(duì)mRNA穩(wěn)定、細(xì)胞增殖、分化的影響。將經(jīng)過DNase消化基因組的總RNA通過高溫打斷成隨機(jī)片段，利用模板轉(zhuǎn)換技術(shù)(Template Switching Technology)，通過反轉(zhuǎn)錄將含有Solexa或454測(cè)序接頭序列的 Oligo d(T)引物錨定到mRNA的Poly (A)尾，使用的反轉(zhuǎn)錄酶Super ScriptII能在合成的 cDNA 一鏈的末端加上3-6個(gè)胞嘧啶(C)，再加入一端接有3個(gè)鳥嘌呤(GGG)的Solexa或454 測(cè)序引物，鳥嘌呤序列(GGG)錨定到cDNA—鏈的胞嘧啶序列(CCC)，再在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下通過堿基互補(bǔ)原理在cDNA —鏈上的(CCC)的另一端合成與其互補(bǔ)配對(duì)的測(cè)序引物。利用在cDNA —鏈兩端接上的測(cè)序引物通過高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增(見圖1)。PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，選擇特定大小進(jìn)行回收。得到的PCR產(chǎn)物即構(gòu)成mRNA 3' 末端測(cè)序文庫(kù)，可以進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序。本發(fā)明的mRNA 3'末端測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法中，經(jīng)過篩選得到的目的片段的大小是根據(jù)后續(xù)使用的測(cè)序儀器所允許的合適的片段大小確定，使用不同的測(cè)序儀可能需要不同的合適大小的目的片段。如有的測(cè)序儀優(yōu)選300-500bp大小的片段，則就篩選300-500bp 大小的目的片段。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)合成測(cè)序文庫(kù)所需的cDNA —鏈的通用引物，以及PCR反應(yīng)的通用引物，修飾改進(jìn)了反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體系以增加引物對(duì)mRNA的錨定效率，最大限度的保證cDNA 的完整性。本發(fā)明的制備方法中的PCR擴(kuò)增，所用的引物是同樣的，其5'端為測(cè)序引物， 序列由之后選擇的測(cè)序儀及試劑決定，3'為引入突變的特異擴(kuò)增引物。PCR的循環(huán)數(shù)設(shè)為使PCR反應(yīng)停留在指數(shù)期的最小循環(huán)數(shù)，目的使避免高豐度的基因過度擴(kuò)增掩蓋低豐度的基因，可大大提高測(cè)序結(jié)果的精確性。


圖1 為本發(fā)明實(shí)施例1的SAPAS法制備全基因組mRNA 3'末端基因文庫(kù)流程圖； 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2經(jīng)過94°C高溫打斷40min的總RNA的1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳圖譜；圖 3為本發(fā)明實(shí)施例2PCR反應(yīng)終止的1. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜；圖4為本發(fā)明實(shí)施例2PCR 產(chǎn)物的10% PAGE凝膠電泳圖譜；圖5為本發(fā)明實(shí)施例2選擇300-500bp大小的片段回收其中的DNA作為文庫(kù)；圖6為本發(fā)明實(shí)施例2Agilent2100BioanalyZer測(cè)量DNA文庫(kù)片段大小的結(jié)果；圖7為本發(fā)明實(shí)施例2中3730測(cè)序結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)介紹本發(fā)明的mRNA3'末端的高通量測(cè)序文庫(kù)建立方法。如圖1所示，本發(fā)明的配對(duì)雙末端文庫(kù)構(gòu)建方法包括(a)將總RNA片段化至具有預(yù)期尺寸的片段；(b)利用模板轉(zhuǎn)換技術(shù)(Template Switching Technology)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第一鏈，同時(shí)在第一鏈的兩端接上高通量測(cè)序引物；(c)利用在cDNA第一鏈兩端接上的測(cè)序引物通過高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(d) PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，選擇200-300bp (用于454測(cè)序)或300_500bp (用于Solexa測(cè)序)的大小進(jìn)行回收，得到目的片段；利用上述建設(shè)的mRNA3’末端文庫(kù)經(jīng)過質(zhì)量控制后，可進(jìn)行高通量基因組測(cè)序。實(shí)施例1如圖1所示，為在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，mRNA 3’末端文庫(kù)構(gòu)建的流程圖，具體過程為⑴取lOug/lOul經(jīng)過DNase消化的總RNA，通過高溫片段化至具有預(yù)期尺寸的片段；(2)利用模板轉(zhuǎn)換技術(shù)(Template Switching Technology)，通過反轉(zhuǎn)錄將含有Solexa或454測(cè)序接頭序列的Oligo d(T)引物錨定到步驟(1)得到的總RNA中mRNA的 Poly(A)尾，反轉(zhuǎn)錄酶Super ScriptII在合成的cDNA —鏈的末端加上3_6個(gè)胞嘧啶(CCC)； (3)再加入一端接有3個(gè)核糖核酸鳥嘌呤(GrGrGr)的Solexa或454測(cè)序引物，鳥嘌呤序列 (GrGrGr)錨定到cDNA—鏈的胞嘧啶序列(CCC)，再在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下通過堿基互補(bǔ)原理在cDNA —鏈上的(CCC)的另一端合成與其互補(bǔ)配對(duì)的測(cè)序引物；(4)利用在cDNA—鏈兩端接上的測(cè)序引物通過高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，為避免高豐度的基因過度擴(kuò)增影響低豐度的基因被檢出，PCR反應(yīng)終止于指數(shù)增長(zhǎng)期；(5)PCR產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠 (PAGE)電泳分離，選擇200-300bp (用于454測(cè)序)或300_500bp (用于Solexa測(cè)序)的大小進(jìn)行回收，得到目的片段文庫(kù)；(6)mRNA3’末端文庫(kù)質(zhì)量控制。用TA克隆和ABI 3730 Analyzer測(cè)序檢驗(yàn)文庫(kù)的質(zhì)量。用Agilent2100 Bioanalyzer對(duì)文庫(kù)的大小進(jìn)行鑒定，用 Qubit Fluorometer (Invitrogen)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量；(7)高通量測(cè)序。上述方法中，其3，為測(cè)序引物 PrimerB-poly (A) 20_2cVN，5，為引物 PrimerA_GGG_ with_A，用3’測(cè)序引物可以直接用于高通量測(cè)序。發(fā)明人對(duì)以往的文庫(kù)制備方法進(jìn)行了較大的改進(jìn)，摸索和建立了 SAPAS(Sequencing alternative polyA sites)技術(shù)，可以特異性高通量的檢測(cè)全基因組范圍內(nèi)3’ UTR的長(zhǎng)度多態(tài)性。首先，由于真核生物的多聚腺苷酸(polyA)尾一般有 50-200bp，為了避免反轉(zhuǎn)錄出過長(zhǎng)的polyA尾，我們?cè)诜崔D(zhuǎn)錄過程中采用了錨定的oligod(T)作為反轉(zhuǎn)錄引物，增加了引 物的使用量，并在后面加上了適用于大規(guī)模測(cè)序技術(shù)的接頭。其次，我們改進(jìn)了反轉(zhuǎn)錄的試劑體系，加入了一些改進(jìn)反轉(zhuǎn)錄保真性和特異性的復(fù)合物。經(jīng)過以上兩步，可以保證3’末端只有20個(gè)左右連續(xù)的腺苷酸。第三，我們?cè)诤罄m(xù)的 PCR擴(kuò)增及合成雙鏈DNA的過程中，通過PCR引物的設(shè)計(jì)，在polyA區(qū)域引入突變，將20個(gè)連續(xù)的腺苷酸隔開，以適應(yīng)大規(guī)模測(cè)序。與此同時(shí)，國(guó)外的研究人員也采用了一些技術(shù)手段對(duì)3’UTR區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，其中最有代表性的就是3p-tag技術(shù)和HeliScopeTM的RNA直接測(cè)序。但是與這兩種方法比較，SAPAS技術(shù)具有一些無法取代的優(yōu)勢(shì)，如表一。表一四種3’ UTR長(zhǎng)度多態(tài)性研究策略的比較
權(quán)利要求
1.一種全基因組mRNA 3’末端基因文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將基因組的核酸采用DNase消化；(b)將消化后的總RNA高溫94-95°C加熱，隨機(jī)片段化至約200_500bp的片段；(c)利用模板轉(zhuǎn)換技術(shù)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第一鏈，所述的cDNA第一鏈的兩端連有高通量測(cè)序引物；(d)利用在cDNA第一鏈兩端接上的測(cè)序引物通過高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(e)PCR產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，選擇200-300bp或300_500bp的大小進(jìn)行回收，得到目的片段。
2.如權(quán)利要求1所述的全基因組mRNA3’末端基因文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，還包括以下步驟(f)對(duì)(e)步驟得到的目的片段進(jìn)行檢測(cè)。
3.如權(quán)利要求1所述的全基因組mRNA3’末端基因文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(c)中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物為 gccttgccag cccgctcagt tttttttttt tttttttttv η,或 gccttgccag cccgctcagt tttttctttt ttcttttttv η,或 gcctccctcg cgccatcagg g,或 gcctccctcg cgccatcaga gg,或 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttttttt tttttttttt ttvn, 或 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatcttt tttctttttt cttttttvn,或 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctgcctcc ctcgcgccat Cagagg0
4.如權(quán)利要求3所述的全基因組mRNA3’末端基因文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟 (c)反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系中含有山梨醇、GCbuffer和海藻糖。
5.如權(quán)利要求1所述的全基因組mRNA3’末端基因文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(c)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的3’引物在20個(gè)A中每隔6個(gè)A插入1個(gè)C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適用于高通量測(cè)序的全基因組mRNA3′末端文庫(kù)的制備方法，通過模板轉(zhuǎn)換合成cDNA一鏈及PCR引入突變，獲取全基因組mRNA3′非翻譯區(qū)DNA序列。本發(fā)明全基因組mRNA3′末端文庫(kù)的制備方法制得的文庫(kù)數(shù)據(jù)產(chǎn)出量大，樣品準(zhǔn)備步驟簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，便于后期生物信息學(xué)分析，易于大規(guī)模應(yīng)用。
文檔編號(hào)C40B50/06GK102181527SQ20111006241
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者萬諒, 付永貴, 孫雨, 徐安龍, 李宇新, 饒興薔 申請(qǐng)人:中山大學(xué)