專利名稱：一株堿性類堅強芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于環(huán)境生物技術(shù)領域，具體涉及一株類堅強芽孢桿菌OfeciBm pseudofirmus )，及其在堿性厭氧條件下腐殖質(zhì)還原和鐵還原的應用。
背景技術(shù)：
腐殖質(zhì)呼吸是厭氧環(huán)境中普遍存在的微生物呼吸代謝形式。腐殖質(zhì)呼吸，又稱醌呼吸，指微生物以腐殖質(zhì)作為唯一末端電子受體，接受來自有機酸等物質(zhì)提供的電子，偶聯(lián)能量的產(chǎn)生，支持菌體生長的過程。腐殖質(zhì)呼吸與鐵還原關系密切。腐殖質(zhì)呼吸作用在元素的生物地球化學循環(huán)過程中具有重要意義，表現(xiàn)為1)微生物在進行腐殖質(zhì)呼吸的過程中， 可直接將環(huán)境中的有機質(zhì)或甲苯、氯乙烯等環(huán)境有毒物質(zhì)氧化，產(chǎn)生ω2 ；2)呼吸作用產(chǎn)生的還原態(tài)腐殖、質(zhì)能夠還原環(huán)境中的一些氧化態(tài)物質(zhì)，如!^e(III)、Mn (IV)、Cr(VI)、U(VI)、 硝基芳香化合物和多鹵代污染物。腐殖酸呼吸作用可影響環(huán)境中C、N、Fe、Mn以及一些痕量金屬元素的生物地球化學循環(huán)，并且能夠促進重金屬以及有機污染物的脫毒，在水體自凈、污染土壤原位修復、污水處理等方面具有積極作用，因此近年來腐殖質(zhì)呼吸有關的研究倍受關注。從上世紀90年代后期以來，多種以腐殖酸或腐殖酸模式物蒽醌_2，6- 二磺酸 (AQDS)為末端電子受體的細菌也相繼分離和鑒定。然而，堿性條件相對不利于微生物的生長，在此苛刻的條件下，微生物可能馴化出一套機制，以更好地應對惡劣的環(huán)境。目前，尚未發(fā)現(xiàn)具有狗(III)還原和腐殖酸還原活性的類堅強芽孢桿菌報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)一株厭氧腐殖質(zhì)和鐵氧化物的堿性高效還原菌。本發(fā)明的另一個目的是提供上述類堅強芽孢桿菌在鐵氧化物和腐殖質(zhì)還原中的應用。本發(fā)明所得的類堅強芽孢桿菌(Mcillus pseudofirmus )MC02，于2011年4月21 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC: 4772，并于同日鑒定菌種存活。本發(fā)明提供了一株新的具有!^e(III)呼吸和腐殖質(zhì)呼吸能力的菌株，所述菌株與已報道菌株相比，在堿性條件下，具有較強的Fe(III)還原和腐殖酸還原能力，電子利用譜較廣，能還原結(jié)晶度較高的鐵氧化物，例如纖鐵礦、赤鐵礦，具有廣泛的應用前景。


圖1是菌株MC02利用不同電子供體還原AQDS的效果圖； 圖2是菌株MC02利用不同電子供體還原!^e(III)的效果圖； 圖3是菌株MC02以葡萄糖為底物，還原不同鐵氧化物的效果圖； 圖4是菌株MC02以葡萄糖為底物，在不同電子穿梭體介導下，還原纖鐵礦的效果圖。
具體實施例方式菌株MC02的富集和分離
1)從PH為9.0的污泥微生物燃料電池中撕取陽極碳氈浸泡于50mL液體富集培養(yǎng)基中，(污泥微生物燃料電池的構(gòu)型如CN200910041235. 4所述)，液體富集分離培養(yǎng)基的組成是16g AQDS (電子受體)、0.25g NH4Cl、0.678g NaH2PO4 · 2Η20、0· Ig KCl、2.94g NaHCO3, 1.59g Na2CO3,10. OmL維生素溶液、10. OmL微量元素溶液(pH 9.0)。其中，維生素溶液是每升去離子水中含2. Omg生物素、2. Omg葉酸、VB6 10. Omg維生素、5. Omg硫胺素、5. Omg核黃素、5. Omg煙酸、5. Omg泛酸鈣、0. Img維生素B12、5. Omg對氨基苯甲酸、5. Omg硫辛酸； 微量元素溶液是每升去離子水中含1.5g氨三乙酸、3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4 · H2O、 1. Og NaCl、0. Ig FeSO4 · 7Η20、0· Ig CoCl2 · 6Η20、0· Ig CaCl2、0. Ig ZnSO4 · 7Η20、0· Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg AlK(SO4)2 · 12Η20、0· Olg H3BO3>0. Olg Na2MoO4 · 2Η20 ；
2)往已接種的富集培養(yǎng)基中充氮氣不少于30分鐘，鼓氣完畢蓋橡膠蓋加鋁蓋密封，置于厭氧工作站(隊/0)2=80/20)，30°C靜置培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況；
3)當培養(yǎng)液顏色從無色變?yōu)槌赛S色時，以10%的接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至另一新鮮的液體分離培養(yǎng)基，厭氧操作及厭氧培養(yǎng)條件同2 )，如此富集培養(yǎng)三次；
4)將第四代反應后的培養(yǎng)液采用稀釋平板法進行適當稀釋，將稀釋后的培養(yǎng)液0.1 mL 均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站(^/C02=80/20)30°C培養(yǎng)48h，挑取單菌落進行單菌落分離與純化，其中，所述LB固體培養(yǎng)基的組成是蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， NaCl 10 g/L，瓊脂粉 20 g/L，pH 為 9. 0。所得菌株即為類堅強芽孢桿菌UaciB^s pseudofirmus)mQ2,于2011年4月21 日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC 4772，并于同日鑒定菌種存活。菌株(^Bacillus pseudofirmus) MC02 的形態(tài)特征 1)菌體形態(tài)特性
菌株MC02革蘭氏陽性，桿狀，有芽孢且中生，菌體成對或鏈狀排列。)菌落形態(tài)特性
在有氧LB瓊脂平板培養(yǎng)4 后，菌落表面光滑不透明，邊緣不整齊，菌落直徑約2-3mm。菌株(^Bacilluspseudofirmus ) MC02 的生理生化特征
根據(jù)《伯杰細菌鑒定鑒定手冊》第九版所述的標準程序測試菌株的生理生化特征，其生化特征見表1。
權(quán)利要求
1.類堅強芽孢桿菌菌株MC02，其保藏號為CGMCC:4772。
2.權(quán)利要求1所述類堅強芽孢桿菌MC02在鐵氧化物和腐殖質(zhì)還原中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株類堅強芽孢桿菌CGMCC4772及其在鐵氧化物和腐殖質(zhì)還原中應用。本發(fā)明從運行良好的堿性污泥微生物燃料電池陽極生物膜中分離純化得到一株類堅強芽孢桿菌(BacilluspseudofirmusMC02)，其在堿性條件下，具有較強的Fe(III)和AQDS還原能力，且電子利用譜較廣，應用前景廣泛。
文檔編號C21B15/00GK102337236SQ20111025679
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者周順桂, 張雋, 楊貴芹, 馬晨 申請人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所