專利名稱：檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的基因芯片及使用方法、試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種生物技術(shù)領(lǐng)域的基因芯片，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的基因芯片及使用方法、試劑盒。
背景技術(shù)：
遺傳性代謝病(inborn errors of metabolim, IEM)是因維持機(jī)體正常代謝所必需的由多肽和/或蛋白組成的酶、受體、載體及膜泵生物合成發(fā)生遺傳性缺陷及編碼這類多肽(蛋白)的基因發(fā)生突變而導(dǎo)致的一組疾病。大多為單基因病，屬常染色體隱性遺傳， 總的發(fā)病率約0. 5% 1%。隨著人們對(duì)此類疾病認(rèn)識(shí)的加深及實(shí)驗(yàn)分析技術(shù)的發(fā)展，該病的診斷率明顯上升，目前已達(dá)四五千種。此類疾病種類繁多，涉及到糖類、氨基酸、脂類等的代謝紊亂，臨床癥狀多種多祥，目前臨床診斷主要依靠于生化檢查及氨基酸、有機(jī)酸分析等，只有少數(shù)醫(yī)院和研究機(jī)構(gòu)可以對(duì)其中的某些疾病進(jìn)行基因診斷。而患者出現(xiàn)臨床改變時(shí)往往已經(jīng)嚴(yán)重影響了其生存質(zhì)量，所以常規(guī)的檢查方法無(wú)法對(duì)遺傳代謝病進(jìn)行早期診斷和產(chǎn)前診斷。高苯丙氨酸血癥(hyperphenylalaninemia，ΗΡΑ)是最常見(jiàn)的常染色體隱性遺傳的氨基酸代謝紊亂疾病，主要由四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin deficiency, BH4)缺乏所致。四氫生物蝶呤缺乏癥是由于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸羥化酶的輔助因子BH4合成或代謝障礙所致，不但影響苯丙氨酸羥化酶的活性，引起苯丙氨酸代謝障礙而在體內(nèi)蓄積，同時(shí)影響腦內(nèi)單胺神經(jīng)遞質(zhì)，如多巴胺、5-羥色胺的合成，患兒出現(xiàn)嚴(yán)重的精神系統(tǒng)損害癥狀和體征，如運(yùn)動(dòng)障礙、肌張カ異常、頑固性抽痙、肢體震顫、智能障礙等。如果僅給予低/無(wú)苯丙氨酸飲食治療，血苯丙氨酸濃度雖然能降至正常，但神經(jīng)系統(tǒng)癥狀日趨嚴(yán)重，預(yù)后極差。所以將四氫生物蝶呤缺乏癥與經(jīng)典型PKU進(jìn)行區(qū)分具有重要的臨沐思義。BH4是由三磷酸鳥(niǎo)苷在三磷酸鳥(niǎo)苷環(huán)化水解酶(GTPCH)、6_丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶(PTPS)和墨蝶呤還原酶(SR)的作用下合成，參與芳香族氨基酸羥化酶的催化反應(yīng)后，BH4被氧化為蝶呤-4a-ニ甲醇胺，再由蝶呤-4a-ニ甲醇胺脫水酶(P⑶)和ニ氫蝶呤還原酶(DHPR)還原為具有活性的BH4。上述任一種酶的缺乏均可導(dǎo)致BH4缺乏癥，而6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶(PTPS)缺乏是BH4缺乏中最常見(jiàn)的類型。編碼6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶(PTPS)的基因是PTS基因，定位于llq22. 3-23. 3，mRNA長(zhǎng)921bp，包含6個(gè)外顯子，具有功能的PTPS是由兩個(gè)三聚體構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，有6個(gè)活性中心，其催化BH4的合成需要鎂離子和鋅離子的共同作用。目前已報(bào)道44種PTS基因突變類型，包括40種錯(cuò)義/ 無(wú)義突變，5種剪切突變，7種插入/缺失。目前對(duì)HPA進(jìn)行分型的方法一般是BH4負(fù)荷試驗(yàn)、尿蝶呤譜分析、DHPR活性測(cè)定等。隨著編碼6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶和ニ氫蝶呤還原酶基因分別于1992年和1987年克隆定位，使用6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶基因診斷HPA的報(bào)道也越來(lái)越多。然而，現(xiàn)在尚無(wú)ー種快速、低成本、大通量和自動(dòng)化檢測(cè)PTS基因突變的方法。因此，需要一種新的技術(shù)方案來(lái)克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷和不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的基因芯片及使用方法、試劑盒。本發(fā)明的基因芯片操作步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)特異性高，穩(wěn)定性好，時(shí)間短，成本低，適用于臨床患者基因突變檢測(cè)和正常人雜合子攜帯者檢測(cè)。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，第一方面，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡核苷酸探針，所述探針為SEQ ID NO. 1づ4所示的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述固相載體選自載玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚苯乙烯中的ー種。第二方面，本發(fā)明還涉及應(yīng)用前述基因芯片檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的方法，包括多重PCR擴(kuò)增，所述的多重PCR擴(kuò)增特異性引物為SEQ ID NO. 59-60 所示的核苷酸，SEQ ID NO. 61-62 所示的核苷酸，SEQ ID NO. 63-64 所示的核苷酸，SEQ ID NO. 65-66 所示的核苷酸，SEQ ID N0. 67-68 所示的核苷酸，SEQ ID N0. 69-70 所示的核苷酸。第三方面，本發(fā)明還涉及ー種用于檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的試劑盒，所述試劑盒包括前述基因芯片，所述基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡核苷酸探針，所述探針為SEQ ID N0. 1づ4所示的核苷酸序列。本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明的基因芯片操作步驟簡(jiǎn)単，只需要進(jìn)行一次多重PCR反應(yīng)和連接酶反應(yīng)，雜交掃描即可；檢測(cè)特異性高，穩(wěn)定性好，該芯片可正確區(qū)分各個(gè)位點(diǎn)的純合子和雜合子，多次試驗(yàn)重復(fù)性高；時(shí)間短，從樣本抽提到得到掃描結(jié)果可在一天內(nèi)完成；采用通用芯片技木，固相載體也可通用于其他芯片，有效降低了成本，適用于臨床患者基因突變檢測(cè)、產(chǎn)前診斷和正常人雜合子攜帯者檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解為這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)見(jiàn)New York Cold Spring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1、基因芯片及其制造方法本實(shí)施例的基因芯片，所述基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡核苷酸探針，所述探針為SEQ ID N0. 1づ4所示的核苷酸序列，其中固相載體為載玻片。
所述基因芯片的制備方法，包括如下步驟(1)將玻片用雙蒸水洗浄，在堿液中浸泡過(guò)夜，取出后用雙蒸水清晰3遍，再于體積分?jǐn)?shù)為的HCl中浸泡30分鐘，清洗后置于玻片缸中待用。將清潔后的玻片經(jīng)過(guò)4-氨丁基三乙氧基硅烷溶液氨基化處理，再經(jīng)苯異硫氰酸酯溶液進(jìn)行異硫氰基化處理，用氮?dú)獯蹈珊?，放?°C避光保存；(2)芯片Zip探針(SEQ ID NO. 1-54所示的核苷酸序列)是隨機(jī)組合的長(zhǎng)度為 24bp的寡核苷酸片段，將這些寡核苷酸序列利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST功能與目的基因組序列進(jìn)行同源性比較，選擇其中同源性程度最低的一組作為Zip探針序列。位點(diǎn)特異性探針長(zhǎng)度不等，需保證其Tm值基本保持一致，以確保后續(xù)反應(yīng)的均一性；(3)將合成好的Zip探針溶解于點(diǎn)樣液中，將探針溶液轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)的96孔板內(nèi)，使用GMS417點(diǎn)樣儀，運(yùn)行相應(yīng)程序?qū)⑻结橖c(diǎn)到活化好的固相載體上，置于37°C，90%濕度的恒溫恒濕箱中過(guò)夜，使探針與玻片充分交聯(lián)。固定好的固相載體在氨水中封閉反應(yīng)的活性基團(tuán)，可以儲(chǔ)存于4°C以備下步雜交實(shí)驗(yàn)用。2、基因芯片的使用方法使用前述的基因芯片進(jìn)行6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的檢測(cè)，包括如下步驟(1)突變檢測(cè)位點(diǎn)的選擇，需要進(jìn)行檢測(cè)的18個(gè)突變位點(diǎn)及探針核心序列如表1。表 權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡核苷酸探針，其特征在干，所述探針為SEQ ID NO. 1づ4所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的基因芯片，其特征在于，所述固相載體選自載玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚苯乙烯中的ー種。
3.ー種應(yīng)用權(quán)利要求1所述基因芯片檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的方法，包括多重PCR擴(kuò)增，其特征在干，所述的多重PCR擴(kuò)增特異性引物為SEQ ID NO. 59-60所示的核苷酸， SEQ ID NO. 61-62所示的核苷酸， SEQ ID NO. 63-64所示的核苷酸， SEQ ID NO. 65-66所示的核苷酸， SEQ ID NO. 67-68所示的核苷酸， SEQ ID NO. 69-70所示的核苷酸。
4.ー種用于檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的試劑盒，其特征在干，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的基因芯片，所述基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡核苷酸探針，所述探針為SEQ ID NO. 1づ4所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物領(lǐng)域的檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的基因芯片及其檢測(cè)方法和試劑盒，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡核苷酸探針，其中探針為SEQ ID NO.1-54所示的核苷酸序列，檢測(cè)方法中包括多重PCR擴(kuò)增，其中特異性引物為SEQ ID NO.59-70所示的核苷酸序列。本發(fā)明的基因芯片操作步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)特異性高，穩(wěn)定性好，從樣本抽提到得到掃描結(jié)果可在一天內(nèi)完成，成本低，適用于臨床患者基因突變檢測(cè)、產(chǎn)前診斷和正常人雜合子攜帶者檢測(cè)。
文檔編號(hào)C40B40/06GK102533988SQ20111044064
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者沈陸, 秦勝營(yíng), 許姍姍, 賀林, 顧學(xué)范 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)